Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

डबल मार्कर (एमएडीएम) के साथ मोज़ेक विश्लेषण का उपयोग करके सेरेब्रल कॉर्टेक्स विकसित करने में वंश ट्रेसिंग और क्लोनल विश्लेषण

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61147
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Science and Technology Austria

Summary

डबल मार्कर (एमएडीएम) के साथ मोज़ेक विश्लेषण का उपयोग करके एकल सेल स्तर पर उम्मीदवार जीन के वंश ट्रेसिंग और कार्यात्मक आनुवंशिक विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। MADM क्लोनल विश्लेषण उत्पादक व्यवहार, सेलुलर उत्पादन, और व्यक्तिगत जनक और उनकी बेटी कोशिकाओं के वंश संबंध को मापने के लिए एक मात्रात्मक ढांचा प्रदान करता है।

Abstract

जनकों के एक सीमित पूल से शुरू, स्तनधारी सेरेब्रल कॉर्टेक्स अत्यधिक संगठित कार्यात्मक तंत्रिका सर्किट बनाता है। हालांकि, अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) के वंश संक्रमण और विकासशील न्यूरोएपिथेलियम में न्यूरॉन्स और ग्लिया के अंतिम उत्पादन को विनियमित करने वाले अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र अस्पष्ट बने हुए हैं। एनएससी डिवीजन पैटर्न का पता लगाने और क्लोनली से संबंधित कोशिकाओं के वंश को मैप करने के तरीके नाटकीय रूप से उन्नत हुए हैं। हालांकि, कई समकालीन वंश अनुरेखण तकनीकों जनक कोशिका भाग्य है, जो जनक सेल विभाजन पैटर्न समझने के लिए आवश्यक है के सेलुलर संकल्प की कमी से पीड़ित हैं । प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल डबल मार्कर (MADM) के साथ पच्चीकारी विश्लेषण का उपयोग करने के लिए वीवो क्लोनल विश्लेषण में प्रदर्शन है । MADM सहवर्ती व्यक्तिगत जनक कोशिकाओं में हेरफेर और अभूतपूर्व एकल सेल संकल्प पर सटीक विभाजन पैटर्न और वंश प्रगति कल्पना । माइटोसिस के जी-एक्स चरण के दौरान एमएडीएम-आधारित इंटरक्रोमोमोमोमल पुनर्संयोजन घटनाओं, अस्थायी रूप से अपरिवर्तनीय क्रेयरटी 2के साथ, क्लोन की जन्म तिथि और उनके विभाजन पैटर्न के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करते हैं। इस प्रकार, एमएडीएम वंश ट्रेसिंग एकल सेल स्तर पर स्टेम सेल जनकों के प्रसार मोड के अभूतपूर्व गुणात्मक और मात्रात्मक ऑप्टिकल रीडआउट प्रदान करता है। एमएडीएम एनएससी वंश प्रगति में उम्मीदवार जीन के तंत्र और कार्यात्मक आवश्यकताओं की जांच के लिए भी अनुमति देता है। यह विधि नियंत्रण के तुलनात्मक विश्लेषण में अद्वितीय है और उत्परिवर्ती उपकमान वीवो में एक ही ऊतक वातावरण में किया जा सकता है। यहां, प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन किया गया है, और विकासशील सेरेब्रल कॉर्टेक्स में क्लोनल विश्लेषण और वंश अनुरेखण के लिए एमएडीएम को नियोजित करने के लिए प्रयोगात्मक प्रतिमान का प्रदर्शन किया जाता है। महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल को किसी भी मुरीन स्टेम सेल आला में MADM क्लोनल विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जब तक कि क्रेयरटी 2 ड्राइवर मौजूद है।

Introduction

सेरेब्रल कॉर्टेक्स एक अत्यधिक संगठित संरचना है जो छह अलग-अलग परतों से बना है। कॉर्टेक्स में न्यूरॉन्स और ग्लिया सहित सेल प्रकारों की एक विविध सरणी होती है, जो कार्यात्मक तंत्रिका सर्किट बनाने के लिए बातचीत करती है। अधिकांश, यदि सभी नहीं, कॉर्टिकल उत्तेजक प्रक्षेपण न्यूरॉन्स और ग्लिया तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) के एक आम पूल से प्राप्त होते हैं जिसे रेडियल ग्लियल प्रोजेनिटर (आरजीपी)1,,2,,3के रूप में जाना जाता है। आरजीपी स्वयं न्यूरोएपिथेलियल स्टेम सेल (एनएससी) से प्राप्त होते हैं जो प्रारंभिक भ्रूण न्यूरोएपिथेलियम की रचना करते हैं। चूहों में भ्रूणीय दिन 9 (E9) से, NESCs RGPs4में संक्रमण शुरू करते हैं । आरजीपी वंश प्रगति सटीक लौकिक और स्थानिक विनियमन की आवश्यकता है, और जब इस प्रक्रिया में रुकावट है, इस तरह के megalencephaly, माइक्रोसेफली, लिसेंसेफली, या एक प्रकार का पागलपन और आत्मकेंद्रित के रूप में हानि के रूप में गंभीर तंत्रिका संबंधी विकारों5,,6परिणाम कर सकते हैं । E10 में, अधिकांश आरजीपी सममित प्रोलिफेरेटिव डिवीजनों से गुजरते हैं, जिसके परिणामस्वरूप तंत्रिका जनक पूल4, 7,का विस्तारहोताहै। आरजीपी अंततः विषम रूप से विभाजित करना शुरू करते हैं, जो अस्थायी रूप से परिभाषित तरीके से कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स का उत्पादन करते हैं। न्यूरोजेनेसिस की लगातार तरंगों के माध्यम से, नवजात न्यूरॉन्स कॉर्टिकल प्लेट में स्थानांतरित हो जाते हैं, जिसमें प्रारंभिक जन्म वाले न्यूरॉन्स गहरी परतों पर कब्जा करते हैं और सतही परतों में रहने वाले स्वर्गीय जन्मे न्यूरॉन्स8,,9,,10। क्योंकि क्लोन रूप से संबंधित पिरामिड न्यूरॉन्स बहुत कम स्पर्शरेखा फैलाव के साथ कॉर्टेक्स में मूल रूप से स्थानांतरित हो जाते हैं, इसलिए बेटी की कोशिकाएं एक स्तंभ या शंकु के आकार की संरचना बनाती हैं जिसे न्यूरोनल रेडियल यूनिट 4,,11,12, 13के रूप में संदर्भित कियाजाताहै।11, E17 तक, भ्रूण न्यूरोजेनिक विस्तार चूहों14में पूरा हो गया है । आरजीपी एपेंडिमल कोशिकाओं और ग्लिया के कुछ वर्गों का उत्पादन भी कर सकते हैं, जिनमें एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेनड्रोसाइट्स1,15, 16,,,16,17, 18,,,19शामिल हैं।18 न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स दोनों को जन्म देने की आरजीपी की क्षमता सभी कॉर्टिकल क्षेत्रों में सुसंगत प्रतीत होती है18, न्यूरोजेनिक आरजीपी के लगभग 1/6 के साथ भी ग्लिया11का उत्पादन होता है ।

वर्तमान में, आनुवंशिक और एपीजेनेटिक अपने वंश के साथ एक स्टेम सेल की लौकिक प्रगति को विनियमित कारक ज्यादातर अज्ञात हैं । जीन अभिव्यक्ति के लौकिक पैटर्न का आरजीपीएस20 , 21 , 22,,,23,,24में वंश निर्णयों पर काफी प्रभाव पड़सकताहै .21 कैसे लौकिक और स्थानिक पैटर्निंग के बीच यह कसकर बुनना संबंध कॉर्टिकल क्षेत्रों में वयस्क न्यूरोनल प्रकार की आणविक विविधता की ओर जाता है ज्ञात नहीं है। इसी तरह, कैसे व्यक्तिगत स्टेम सेल क्षमता और उसके सेलुलर उत्पादन सेलुलर और आणविक स्तर पर संग्राहक है एक महत्वपूर्ण अनुत्तरित सवाल है । भविष्य के अध्ययन उम्मीद है कि इन सवालों में से कुछ का पता होगा, अंततः कार्यात्मक कॉर्टिकल सर्किट गठन की हमारी समझ का विस्तार.

विकासात्मक न्यूरोबायोलॉजी वंश संबंध को समझना चाहता है जो मस्तिष्क में कोशिकाएं एक-दूसरे के साथ साझा करती हैं। प्रारंभ में, इसके लिए बहुत कम शोध उपकरण उपलब्ध थे, और कई शुरुआती अध्ययनों ने पारदर्शी जीवों जैसे कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस25में विभाजन पैटर्न की दृश्य टिप्पणियों पर भरोसा किया। हाल के दशकों में उपलब्ध तकनीकों की संख्या और परिष्कार में नाटकीय वृद्धि देखी गईहै , 13,26,27,28,29,29. CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली के उद्भव27,,30विकसित डीएनए बारकोड शुरू करके सेल वंश संबंधों के सिंथेटिक पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है । बारकोडिंग रणनीतियों के दो हालिया उदाहरणों में होमिंग गाइड आरएनए का उपयोग शामिल है जो CRISPR-Cas9 को विशिष्ट डीएनए बारकोड लोकी या एक साइटिडीन डेमिनास को निर्देशित करता है जो एंडोजेनस इंटरप्रेड रिपीट क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए निक्स के साथ जुड़ा हुआ है31,,32। ये प्रौद्योगिकियां बारकोड की शुरूआत के माध्यम से अत्यधिक मल्टीप्लेक्स दृष्टिकोण प्रदान करती हैं जो उत्तरोत्तर और समय के साथ अद्वितीय उत्परिवर्तन जमा करती हैं। जीनोम संपादन दृष्टिकोण अत्यधिक मूल्यवान हैं क्योंकि वे इन बारकोड की साझा विरासत के आधार पर किसी भी दो कोशिकाओं के बीच संबंधों के पूर्वव्यापी विश्लेषण की अनुमति देते हैं। हालांकि, व्यक्तिगत कोशिकाओं में बारकोड पढ़ने के लिए, ऊतक आमतौर पर बाधित किया जाना चाहिए, और इसलिए एक व्यक्तिगत जनक से स्थिति, आकृति विज्ञान, और पूर्ण कोशिका संख्या के बारे में जानकारी खो जाती है।

संयोजन लेबलिंग प्रतिमान स्थानिक सूचनाओं को संरक्षित करते हैं और सैद्धांतिक रूप से33 , 34,क्लोन के बारीकी से स्थानीयकृत या ओवरलैपिंग क्लोन के बीच अंतर की अनुमति भीदेतेहैं । एक वंश अनुरेखण विधि के लिए जानकारीपूर्ण होने के लिए यह एक विरल और अमिट तरीके से व्यक्तिगत जनक और उनकी संतान लेबल होना चाहिए । विशेष रूप से, ब्रेनबो35 और कंफ़ेटी36,,37 दृष्टिकोण स्टोचस्टिक मल्टीकलर क्रे रिकॉम्बिनेज-आधारित रिपोर्टर्स का उपयोग करते हैं जो एक ही लोकस से फ्लोरोसेंट प्रोटीन का संयोजन व्यक्त करते हैं। वीवो में प्राप्त किए जा सकने वाले रंग संयोजनों की व्यापक संख्या कॉर्टिकल आरजीपी क्लोन और एस्ट्रोसाइट्स34का पता लगाते समय इसे एक शक्तिशाली उपकरण बनाती है। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को एन्कोडिंग करने वाले ट्रांसजीन के स्थिर जीनोमिक एकीकरण और कॉर्टिकल प्रोजेनिटर्स के वंश का पता लगाने की अनुमति प्रदान करने वाली ट्रांसपोसन आधारित प्रणालियों को भी विकसित किया गया है33,,38, 39,,40,,,41।40 ट्रांसपोसन आधारित प्रणालियों में एक अतिरिक्त लाभ है कि रिपोर्टर का निर्माण स्थिर जीनोम में एकीकृत है, और इस तरह मज़बूती से लाइनली संबंधित बेटी कोशिकाओं लेबल । विशेष रूप से एस्ट्रोसाइट वंश का पता लगाने के लिए, कई तरीके विकसित किए गए हैं जिनमें स्टार ट्रैकसहित पिग्गीबेक ट्रांसपोसेस का विद्युतपंचाल शामिल है, जो विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन40,,42को एन्कोडिंग करने वाले निर्माणों के संयोजन का उपयोग करता है। एक अन्य दृष्टिकोण, मैजिक मार्कर,ब्रेनबो वैक्टर को ट्रांसपोज़ेबल ट्रांसजीन के रूप में पेश करता है। इसका उपयोग भ्रूणीय तंत्रिका और एस्ट्रोसाइट जनकों का पता34,लगाने के लिए सफलतापूर्वक किया गयाहै। हाल ही में, दोहरी रिकॉम्बिनेंट-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (एमएडीआर) द्वारा मोज़ेक विश्लेषण को ठीक परिभाषित क्रोमोसोमल लोकी44से ट्रांसजेनिक तत्वों को व्यक्त करने वाले उत्परिवर्ती कोशिकाओं को स्थिर रूप से लेबल करने के लिए पाया गया था। वीवो एंव इंडिवेटोरियल लेबलिंग तकनीकों में ये शक्तिशाली जनक कोशिकाओं की वंश गतिशीलता में कई अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, ये विश्लेषण निश्चित ऊतक पर किए जाते हैं, जो एक परिभाषित विकासात्मक चरण में व्यक्तिगत क्लोन का स्नैपशॉट प्रदान करते हैं। समय के साथ एकल क्लोन की वंश गतिशीलता में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए, वयस्क दंतेट जाइरस में प्रदर्शन करने वालों के समान वीवो इमेजिंग विधियों में पुरानी45लागू करने की आवश्यकता है।

डबल मार्कर (एमएडीएम) के साथ मोज़ेक विश्लेषण एक शक्तिशाली दोहरी रंग लेबलिंग विधि है जो चूहों46, 47,47में व्यक्तिगत जनक कोशिकाओं के वीवो वंश ट्रेसिंग में सक्षम बनाता है। एमएडीएम लेबलिंग घटनाओं के लिए दो घटक आवश्यक हैं: सबसे पहले, एमएडीएम कैसेट को समरूप गुणसूत्रों पर समान लोकी के लिए लक्षित किया जाना चाहिए। कैसेट दो चिमरिक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन, eGFP (ग्रीन, [जी]) और मिलकर dimer टमाटर (लाल, टीडीटी [टी]) से मिलकर होते हैं । जीटी कैसेट में ईजीएफपी के एन-टर्मिनस और टीडीटी के सी-टर्मिनस होते हैं, जो एक लोक्सपी साइट वाले इंट्रॉन से अलग होते हैं। टीजी कैसेट का निर्माण टीडीटी के एन-टर्मिनस और ईजीएफपी के सी-टर्मिनस के साथ किया जाता है। दूसरा, लक्षित एमएडीएम कैसेट युक्त एक ही सेल में क्रे रिकॉम्बेमिने की अभिव्यक्ति आवश्यक है। क्रेकी अनुपस्थिति में, चिमरिक कैसेट कार्यात्मक ईजीएफपी या टीडीटी व्यक्त नहीं करते हैं क्योंकि उनके कोडिंग दृश्य बाधित होते हैं। लोक्सपी साइटें क्रे-मध्यस्थता इंटरक्रोसोमोमल पुनर्संयोजन के लक्ष्य के रूप में काम करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप दोनों अभिव्यक्ति कैसेट का पुनर्गठन एक साथ होता है। यदि कोशिका चक्र के जी-2 चरण के दौरान पुनर्संयोजन होता है और इसके बाद एक्स अलगाव (जी2-एक्स) होता है, तो दो बेटी कोशिकाएं प्रत्येक दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन में से एक को व्यक्त करेंगी। टैमोक्सिफेन (टीएम) का उपयोग करके क्रेयरटी - 2 गतिविधि का अस्थायी विनियमन एमएडीएम क्लोन की जन्म तिथि और उनकी संतान के विभाजन पैटर्न(चित्र 1ए)29,46,,47के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करता है।,

MADM संभावित रूप से व्यवस्थित रूप से पारंपरिक लेकिन गैर विशिष्ट और श्रमसाध्य तरीकों जैसे गोलगी धुंधला48 या डाई भरने49जैसे माउस मस्तिष्क में उच्च एकल सेल संकल्प के साथ व्यक्तिगत क्लोन लेबल कर सकते हैं। क्योंकि केवल प्रमोटर ड्राइविंग क्रेयरटी 2 क्लोनल एमएडीएम लेबलिंग की सेल प्रकार विशिष्टता निर्धारित करता है, MADM सैद्धांतिक रूप से किसी भी मुरीन अंग और ऊतक,47,50, 51, 52,51भर में क्लोनल वंश ट्रेसिंग के लिए लागू किया जा सकता है।,52 वास्तव में , अध्ययनों में पहले से ही एमएडीएम का उपयोग विविध ऊतकों,,55,47, 50 , 51 , 5257,,53,54,56,,,5258,58,59से प्राप्त क्लोनों में वंश संबंधों को प्रकट करने के लिए किया गया है ।5859 एमएडीएम के प्रायोगिक प्रतिमान विकसित नियोकॉर्टेक्स,62,7,,6111, 12,,,,,60, 61, 62, 63,6364,6465में कॉर्टिकल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स, ग्लियाऔर12प्रसवोत्तर स्टेम कोशिकाओं में वंश का अध्ययन करने के लिए लागू किए गए हैं।, एमएडीएम का उपयोग वयस्क डेंटेट जाइरस, थैलेसीमिया, सेरिबेलर ग्रेन्यूल कोशिकाओं और क्लोनल स्तर पर इंटरन्यूरॉन्स (पूरी सूची के लिए तालिका 1 देखें)47,53, 54,,54,56,57,,66में सेल वंश का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है।,,

एमएडीएम की एक अनूठी विशेषता आनुवंशिक रूप से म्यूटेशन को एक एमएडीएम कैसेट से जोड़ने की क्षमता है, जिससे एक आनुवंशिक मोज़ेक(चित्रा 1B और चित्रा 2)बना है। यह जंगली प्रकार की बेटी कोशिकाओं में एक फ्लोरोसेंट मार्कर (चित्रा 1 बीमें टीडीटी) और दूसरे के साथ होमोज़िगस उत्परिवर्ती भाई बहन (चित्रा 1 बीमें eGFP) एक अवेलेबल विषम वातावरण में लेबल में परिणाम है । MADM नियंत्रण के तुलनात्मक विश्लेषण में अद्वितीय है और उत्परिवर्ती उपकमान वीवो में एक ही ऊतक वातावरण में किया जा सकता है। मूल रूप से, MADM कैसेट Rosa26 लोकस47में लक्षित किया गया था, लेकिन जीन समारोह के MADM विश्लेषण लोकस के लिए डिस्टल जीन तक ही सीमित था। इस सीमा को दूर करने और एमएडीएम-आधारित जीन विश्लेषणों के लिए संभावनाओं का विस्तार करने के लिए, एमएडीएम कैसेट को Chr. 751,Chr. 1146,और Chr. 1251के सेंट्रोमर के करीब खटखटाया गया था। MADM कैसेट के साथ सभी 19 माउस autosomes लक्ष्यीकरण प्रगति पर है और लगभग किसी भी जीन के लिए भविष्य में अध्ययन करने की अनुमति होगी, कार्यात्मक आनुवंशिक विश्लेषण के साथ संयोजन में विकासात्मक वंश संबंधों के अध्ययन के लिए एक अद्वितीय मंच प्रदान करते हैं ।

Protocol

आईएसटी ऑस्ट्रिया में संस्थागत प्रीक्लिनिकल कोर फैसिलिटी (पीसीएफ) और आंतरिक नैतिक समिति द्वारा माउस प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई । सभी प्रजनन और प्रयोग ऑस्ट्रिया और यूरोपीय संघ के पशु कानूनों के अनुसार ऑस्ट्रिया के संघीय विज्ञान और अनुसंधान मंत्रालय द्वारा अनुमोदित लाइसेंस के तहत किया गया ।

1. MADM क्लोनल विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक चूहों का प्रजनन

  1. समय पर प्रयोगात्मक एमएडीएम संभोग की स्थापना (>P56; सीडी-1) देर से दोपहर में (5:00 बजे) और योनि प्लग के लिए जांच कार्यवाही सुबह (8:00 बजे) । सुबह प्लग वर्तमान दिन 0.5 के रूप में गिना जाता है। प्रायोगिक माउस संभोग सेटअप के अवलोकन के लिए चित्र 2 देखें। सुनिश्चित करें कि क्रेयरटी 2 गतिविधि और विश्लेषण के टीएम प्रेरण के लिए टाइमपॉइंट प्रायोगिक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए उपयुक्त हैं।
    नोट: अधिक जानकारी के लिए नीचे चित्रा 3 और प्रतिनिधि परिणामों का उल्लेख है।
  2. प्रसवोत्तर नमूने के लिए, समानांतर में पालक माताओं को उत्पन्न करने के लिए प्रजनन की स्थापना करें।
    नोट: इन्हें प्रायोगिक प्रजनन स्थापित करने से पहले 1−2 दिन तक शुरू किया जाना चाहिए।

2. एमएडीएम चूहों में टीएम इंडक्शन

  1. एक 15 मिलीग्राम या 50 एमएल शंकुकेंद्रितीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में मकई के तेल में भंग करके एक 20 मिलीग्राम/एमएल टीएम काम समाधान तैयार करें और इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर ~ 4 घंटे के लिए एक कमाल के मंच पर रखकर, यह सुनिश्चित करना कि टीएम पूरी तरह से भंग हो गया है। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर 4 डिग्री सेल्सियस पर काम कर समाधान स्टोर और 2 सप्ताह के भीतर उपयोग करें।
  2. एमएडीएम पुनर्संयोजन घटनाओं को प्रेरित करने के लिए, एक समय पर गर्भवती बांध में 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज और एक 25 जी सुई का उपयोग करके टीएम इंट्रापेरिटोनेली (आईपी) का एक इंजेक्शन वितरित करें। कॉर्टिकल न्यूरोजेनेसिस के चरण के आधार पर, 1−2 मिलीग्राम/गर्भवती बांध की खुराक पर E10−E15 के बीच टीएम इंजेक्ट करें। प्रारंभिक टाइमपॉइंट (यानी, E10) के लिएगर्भावस्थाके दौरान जटिलताओं को रोकने के लिए अधिकतम 1 मिलीग्राम/गर्भवती बांध (25 मिलीग्राम/किलो) का उपयोग करें । E11-E15 के बीच टाइमपॉइंट्स के लिए 2 मिलीग्राम/गर्भवती बांध (५० मिलीग्राम/किलो)7का उपयोग करें ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, टीएम को देर से गर्भधारण के लिए मौखिक गैवरेज के साथ प्रशासित किया जा सकता है।
  3. एमएडीएम क्लोनल विश्लेषण के लिए पोस्टनटल टाइमपॉइंट्स के लिए, सीजेरियन सेक्शन के माध्यम से E18−E19 में लाइव भ्रूण को ठीक करें, और फिर एक पालक मां के साथ पिल्ले उठाएं।
    नोट: गर्भवती महिला के स्वास्थ्य की स्थिति के आधार पर, यह एक सीजेरियन अनुभाग प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है, लेकिन एक पालक मां के साथ पिल्ले स्थापना अभी भी आवश्यक है क्योंकि मूल टीएम का इलाज मां मुसीबत स्तनपान कराने हो सकता है ।
  4. सीजेरियन सेक्शन द्वारा जीवित भ्रूण को ठीक करने या विश्लेषण के लिए भ्रूणीय टाइमपॉइंट को पुनः प्राप्त करने के लिए, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा गर्भवती बांध का बलिदान करना।
  5. जानवर को एक रीढ़ की स्थिति में रखें और 70% इथेनॉल के साथ फर कीटाणुरहित करें। सर्जिकल संदंश और कैंची का उपयोग कर गर्भाशय के ऊपर पेट के निचले हिस्से में त्वचा में एक छोटा सा चीरा बनाओ। पेरिटोनम प्रकट करने के लिए मांसपेशियों और पेट की मांसपेशियों की दीवार के माध्यम से एक दूसरा चीरा बनाएं।
  6. कैंची से आसपास के ऊतकों से अलग होकर गर्भाशय निकालें। भ्रूण जीवित रहने की दर को बढ़ाने के लिए गर्म पानी से भरे दस्ताने पर बरकरार गर्भाशय को स्थानांतरित करें जब तक कि प्रत्येक को व्यक्तिगत रूप से एमनियन से हटा नहीं दिया जाता है।
  7. भ्रूण को छोड़ने के लिए गर्भाशय की दीवारों को ध्यान से खोलने के लिए ठीक इत्तला दी कैंची और उंगलियों का उपयोग करें। व्यापक रक्त हानि को रोकने के लिए शरीर के बहुत करीब गर्भनाल को न काटें। यदि भ्रूण विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना है, ३.९ कदम के लिए आगे बढ़ें । यदि पिल्ले को बढ़ावा दिया जाना है, तो 2.8 चरण के लिए आगे बढ़ें।
  8. यदि बढ़ावा देने की आवश्यकता है, तो उन्हें पालक मां को स्थानांतरित करने से पहले पिल्ले को साफ करें। पिल्ले की सफाई करते समय सांस लेने की शुरुआत करने के लिए समय-समय पर धीरे-धीरे छाती दबाएं। जीवित रहने की दर में सुधार करने के लिए गर्म पानी से भरे दूसरे दस्ताने पर वापस रखें।
    नोट: यह धीरे से किसी भी शेष amnion और/या एक कागज तौलिया के साथ अपरा को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  9. पालक मां को पिल्ले स्थानांतरित करने से पहले, उसके पिंजरे से पालक मां को हटा दें, मूल पिल्ले को हटा दें, और प्रायोगिक पिल्ले के साथ बदलें। पालक मां को उसके पिंजरे में लौटा दें ।
    नोट: स्वीकृति दरों को बढ़ावा देने में सुधार करने के लिए अतिरिक्त सुझावों के लिए चर्चा देखें।
  10. यदि जेनोटाइपिंग की आवश्यकता है, तो P6−P8 के बीच अंगुली या पूंछ बायोप्सी एकत्र करें।
    नोट: इस कदम को तभी करें जब पशु प्रायोगिक लाइसेंस इस अभ्यास को मंजूरी दें।

3. मस्तिष्क में MADM क्लोन के लिए ऊतक की तैयारी

नोट: उन प्रयोगों के लिए जिनमें प्रसवोत्तर ऊतक (P4) शामिल हैं, 3.1 चरण के लिए आगे बढ़ें। भ्रूणीय टाइमपॉइंट और शुरुआती प्रसवोत्तर (पी0−पी 3) के लिए, 3.9 चरण जारी रखें।

  1. केटामाइन/जाइलाज़ीन/एसेप्रोमाजिन समाधान (क्रमशः 65 मिलीग्राम, 13 मिलीग्राम और 2 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) के आईपी इंजेक्शन के साथ प्रयोगात्मक एमएडीएम जानवर को एनेस्थेटाइज करें और इस बात की पुष्टि करें कि माउस हिंद पंजा को पिंच करके अनुत्तरदायी है।
    नोट: दोनों पुरुष और महिला MADM चूहों (सीडी-1 पृष्ठभूमि) विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है । यदि जीनोटाइपिंग की आवश्यकता है, तो इस बिंदु पर कान की बायोप्सी एकत्र करें।
  2. एनेस्थेटाइज्ड जानवर को परफ्यूजन सर्जरी ट्रे और कीटाणुरहित फर पर रीढ़ की स्थिति में 70% इथेनॉल के साथ रखें। सर्जरी शुरू करने के लिए, ध्यान से त्वचा की बाहरी परत के माध्यम से कैंची और सर्जिकल संदंश के साथ एक चीरा बनाने के लिए और फिर मांसपेशियों की परत के माध्यम से एक दूसरा चीरा। उरोस्थि की नोक उठाएं और संयोजी ऊतक को किनारों पर काट लें, जिगर को काटने से बचने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरतें। छाती गुहा दिखाई देगा।
  3. दिल को प्रकट करने के लिए डायाफ्राम को स्निप करें और लिफ्ट करें। ध्यान से रिब पिंजरे ट्रिम और शल्य चिकित्सा ट्रे के लिए पिन दिल का पर्दाफाश करने के लिए। पिल्ले के लिए, रिब पिंजरे को पूरी तरह से हटा दें।
  4. निचले बाएं वेंट्रिकल (पालर ऊतक) में फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ एक सुई डालें। छोटी आईरिस कैंची का उपयोग रक्त को निकालने के लिए सही एट्रियम (गहरे लाल ऊतक) के पीछे के छोर पर चीरा लगाते हैं।
  5. पीबीएस के साथ परफ्यूजन करें इसके तुरंत बाद पीबीएस में तैयार ताजा, बर्फ-ठंड 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) द्वारा किया जाता है। पिल्ले (P4−P10) के लिए परफ्यूजन करने के लिए सीरिंज का उपयोग करें। एक सिरिंज को पीबीएस की 10 एमएल और दूसरी में 4% पीएफए के 10 एमएल के साथ भरें। सुनिश्चित करें कि सीरिंज में सभी हवा के बुलबुले हटा दिए गए हैं। पुराने जानवरों के लिए, एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करें।
  6. पीबीएस (पिल्ले में 2−4 एमएल/मिनट में 10 एमएल) के साथ परफसिंग शुरू करें; पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके वयस्कों के लिए 4−6 एमएल/न्यूनतम पर 20 एमएल। यदि सुई सही ढंग से तैनात है तो यकृत स्पष्ट और पीला हो जाएगा।
  7. एक बार पूरा होने के बाद, पिल्ले से सुई निकालें और एक ही छेद में पीएफए युक्त सुई डालें। वयस्कों के लिए, बर्फ-ठंडे पीएफए के साथ पीबीएस समाधान का आदान-प्रदान करने से पहले पेरिस्टाल्टिक पंप को रोकें, जिससे तेज टयूबिंग में बुलबुले से बचना सुनिश्चित हो। पीएफए के साथ परफ्फसिंग फिर से शुरू करें (पिल्ले में 2−4 एमएल/मिनट में 10 एमएल; पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके वयस्कों के लिए 4−6 एमएल/न्यूनतम पर 30 एमएल) ।
  8. जब परफ्यूजन पूरा हो जाता है, तो माउस को काटना और सावधान विच्छेदन के माध्यम से मस्तिष्क को हटा दें। मस्तिष्क को 4% पीएफए में स्थानांतरित करें। ऊतक का पूर्ण निर्धारण सुनिश्चित करने के लिए पोस्टपरफ्यूजन निर्धारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर मस्तिष्क की मात्रा (यानी, ~ 5−10 एमएल पीएफए) का कम से कम 5x का उपयोग करें। 3.10 कदम जारी रखें।
  9. भ्रूणीय ऊतक और प्रारंभिक प्रसवोत्तर ऊतक (यानी, पी0−पी 3) के लिए, सीजेरियन सेक्शन करने के बाद, कैंची से भ्रूण को काटना। यदि जीनोटाइपिंग की आवश्यकता है, तो इस बिंदु पर भ्रूण की पूंछ एकत्र करें। तुरंत मस्तिष्क को काटना और 4% पीएफए/वेल के 2−3 एमएल युक्त 12 अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें। पोस्टफिक्सेशन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  10. अगली सुबह पीएफए को पीबीएस के 10 एमएल (वयस्क) या 2−3 एमएल (भ्रूण) के साथ एक्सचेंज करें और आरटी में 15 मिनट के लिए 3x को रिपीट करें। फॉस्फेट बफर (पीबी) में 30% सुक्रोज सॉल्यूशन में टिश्यू को ट्रांसफर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉकिंग प्लेटफॉर्म पर स्टोर करें जब तक कि टिश्यू सॉल्यूशन में डूब न जाए।
  11. मस्तिष्क को एक एम्बेडिंग मोल्ड में इष्टतम काटने के तापमान (OCT) यौगिक में एम्बेड करना, मस्तिष्क को कोरोनल या धनु खंड के लिए उन्मुख करने का ध्यान रखना। अक्टूबर पूरी तरह से अपारदर्शी (~ 10−15 मिनट) हो जाता है जब तक सूखी बर्फ पर एम्बेडिंग मोल्ड रखकर फ्रीज करें। आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक स्टोर करें।

4. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए एमएडीएम ऊतक तैयार करना

  1. डिस्क के लिए अक्टूबर की एक अंगूठी लागू करने और अक्टूबर में सीधे ब्लॉक रखने जब यह फ्रीज करने के लिए शुरू होता है द्वारा क्रायोस्टेट में नमूना डिस्क के लिए ऊतक ब्लॉक संलग्न करें । सुनिश्चित करें कि ब्लॉक वांछित काटने वाले विमान के लिए सही ढंग से उन्मुख है।
    नोट: यहां, कॉर्टिकल एमएडीएम क्लोन की जांच करने के लिए कोरोनल सेक्शनिंग का विस्तार से वर्णन किया गया है।
  2. क्रायोस्टेट में ब्लॉक तापमान को -20 डिग्री सेल्सियस और ब्लेड का तापमान -21 डिग्री सेल्सियस निर्धारित करें।
  3. ऊतक ब्लॉक नमूना धारक को नमूना डिस्क बढ़ते द्वारा कक्ष के तापमान को समायोजित करने के लिए अनुमति दें और खंडिंग शुरू करने से पहले ~ 5 मिनट के लिए क्रायोस्टेट में छोड़ दें।
  4. ब्याज के ऊतक क्षेत्र तक पहुंचने तक मोटी धाराओं (45−60 माइक्रोन) में ब्लॉक करें।
  5. एक बार कॉर्टेक्स का किनारा स्पष्ट रूप से दिखाई दे, तो सेक्शनिंग बंद करें और ब्लेड को लॉक करें। सुनिश्चित करें कि ब्लेड को ब्लॉक ट्रिम करने से पहले ढाल दिया गया है।
  6. एक ब्लेड के साथ ऊतक के आसपास अतिरिक्त OCT ट्रिम करें, मस्तिष्क के सभी पक्षों पर ~ 1−2 मिमी अक्टूबर छोड़ दें।
  7. अगला ब्लॉक उन्मुख करें ताकि कॉर्टेक्स के पार्श्व किनारों में से एक नीचे की ओर उन्मुख हो और दूसरा ऊपर की ओर (यानी, कॉर्टेक्स का सबसे रोस्ट्रल किनारा सही बताया गया है)।
  8. वयस्क क्लोन के लिए 45 माइक्रोन की मोटाई और भ्रूण क्लोन के लिए 30 माइक्रोन के साथ खंडित करना शुरू करें। प्रत्येक अनुभाग को व्यक्तिगत रूप से करें और ब्लॉक को ट्रिम करते समय छोड़े गए किसी भी मलबे के चाकू के नीचे के क्षेत्र को साफ रखने के लिए एक छोटे ब्रश का उपयोग करें।
    नोट: यदि ऐसा नहीं किया जाता है और एक अनुभाग गिरता है, तो स्लाइस के सही क्रम को निर्धारित करना मुश्किल हो सकता है।
  9. यदि अनुभाग कर्ल करना शुरू करते हैं, तो ब्लॉक के किनारों को ट्रिम करें और/या ध्यान से ग्लास एंटीरोल प्लेट को समायोजित करें ।
  10. भ्रूण क्लोन विश्लेषण के लिए, एक पाले से ओढ़लिया स्लाइड करने के लिए सीधे वर्गों माउंट । सीधे 5.6 चरण में आगे बढ़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग प्लेट पर सूखा।
    नोट: एक स्लाइड में कई अनुभाग जोड़े जा सकते हैं, लेकिन यह सुनिश्चित करें कि अनुक्रमिक आदेश बनाए रखा गया है।
  11. वयस्क क्लोन एकत्र करने के लिए, पीबीएस/वेल के 1 एमएल वाली 24 अच्छी प्लेटें तैयार करें (आमतौर पर, प्रति मस्तिष्क 5−6 प्लेटें)। पहले कुएं से शुरू होकर, ठंडे संदंश के साथ अनुभागिंग के क्रम में पीबीएस में व्यक्तिगत धारावाहिक अनुभाग एकत्र करते हैं।
    नोट: फ्लोटिंग सेक्शन विधि वयस्क ऊतक के लिए अपनाई जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई वर्ग छूट नहीं जाता है और घुड़सवार वर्गों में कोई झुर्रियां नहीं होती हैं।
  12. एक बार नियोकॉर्टेक्स के अंत तक पहुंच जाने के बाद सेक्शनिंग बंद करें।
  13. वयस्क क्लोन के लिए, बढ़ते फ्लोटिंग वर्गों के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: धाराओं को 24 घंटे तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में रखा जा सकता है।

5. इमेजिंग के लिए बढ़ते वयस्क ऊतक

नोट: निम्नलिखित उपकरणों की आवश्यकता है: छोटे पेंट ब्रश, पेट्री डिश, पीबीएस के साथ 0.5% ट्वीन (पीबीएस-टी), आसंजन स्लाइड(सामग्री की तालिका),बढ़ते माध्यम(सामग्री की तालिका),कवरस्लिप, और संदंश।

  1. पीबीएस-टी के साथ एक पेट्री डिश भरें।
    नोट: डिटर्जेंट बढ़ते प्रक्रिया में सहायता करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यदि अतिरिक्त एंटीजन के लिए धुंधला होना जो डिटर्जेंट (यानी ग्लाइकोप्रोटीन) के प्रति संवेदनशील हैं, तो ट्वीन के अलावा छोड़ना सबसे अच्छा है।
  2. पीबीएस-टी में एक आसंजन स्लाइड रखें ताकि यह लगभग लेबल तक कवर हो।
  3. पहले सेक्शन को पीबीएस-टी में ट्रांसफर करें।
  4. एक छोटे से पेंट ब्रश का उपयोग करना, स्लाइड पर अनुभाग पैंतरेबाज़ी और काटने के आदेश को संरक्षित करने के लिए यह व्यवस्था । आगे के सभी वर्गों के साथ उसी तरह आगे बढ़ें।
  5. एक बार जब सभी वर्ग स्थिति में होते हैं, तो स्लाइड (~ 12−16 सेक्शन/स्लाइड) को डार्क स्लाइड चैंबर में रखें । अनुभागों को पूरी तरह से सूखने की अनुमति देने के लिए ढक्कन को थोड़ा उठाएं (~ 10−20 मिनट), यह सुनिश्चित करते हुए कि वे बाद के चरणों में पालन करते रहें।
  6. यदि अतिरिक्त एंटीजन के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन करते हैं, तो सीधे सेक्शन 6 या 7 पर जाएं।
    नोट: भ्रूणीय टाइमपॉइंट्स के लिए, कम से कम जीएफपी और टीडीटी (धारा 6) के लिए इम्यूनोस्टेपिंग कदम रखना आवश्यक है। वयस्क क्लोन के लिए, यह केवल तभी आवश्यक है जब समानांतर (वर्ग 6 और 7) में अतिरिक्त एंटीजन के लिए धुंधला हो।
  7. अवशिष्ट पीबीएस-टी को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ 1x सेक्शन को रिहाइड्रेट और वॉश करें। स्लाइड में 1x पीबीएस (1 μg/ml) में पतला 4′,6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडल (DAPI) के ~ 1 एमसीएल को स्लाइड में लागू करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी वर्गों को कवर किया जाता है और 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया जाता है।
  8. डीएपीआई को ध्यान से हटा दें और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ 1x धोएं। बढ़ते माध्यम के 110 माइक्रोन में एम्बेड करने से पहले अतिरिक्त पीबीएस और सूखी को ~ 1−2 मिनट के लिए निकालें। 24 x 60 मिमी कवरलिप के साथ सील करें और इमेजिंग से पहले कम से कम 3 घंटे के लिए सूखने दें।

6. केवल जीएफपी और टीडीटी के लिए इम्यूनोस्टेटिंग

नोट: यह खंड भ्रूण क्लोन के लिए आवश्यक है।

  1. एक आर्द्रीकृत स्लाइड इनक्यूबेशन कक्ष में क्षैतिज स्लाइड रखें । आवश्यक बफर की मात्रा को कम करने के लिए एक मोम मार्कर के साथ स्लाइड सीमाओं को चिह्नित करें।
  2. 1x पीबीएस के साथ रिहाइड्रेट सेक्शन। धुंधला गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, हौसले से खंडित ऊतक के साथ काम करते हैं।
  3. ब्लॉकिंग बफर (0.5% ट्राइटन एक्स-100, 1x पीबीएस में 2−3% सामान्य गधा सीरम) प्रति स्लाइड के 250−400 माइक्रोन जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी वर्गों को कवर किया गया है। 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: डिटर्जेंट (ट्राइटन एक्स-100 या ट्वीन-20) की एकाग्रता अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के आधार पर भिन्न होगी क्योंकि कुछ एंटीजन दूसरों की तुलना में डिटर्जेंट के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं।
  4. अवरुद्ध बफर निकालें और स्लाइड (300−400 μL/स्लाइड) के लिए बफर अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें।
    नोट: विरोधी GFP/एंटी-टीडीटी (MADM) के लिए एक मानक प्राथमिक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया का एक उदाहरण चिकन विरोधी GFP (1:500) और खरगोश विरोधी RFP (1:500) का उपयोग कर सकते हैं ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट।
    नोट: स्लाइड सभी वर्गों को कवर बफर के साथ पूरी तरह से क्षैतिज रूप से इनक्यूबेटेड किया जाना चाहिए । अन्यथा, असमान या खराब धुंधला परिणाम हो सकता है।
  6. अगली सुबह पुष्टि करें कि प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध बफर अभी भी स्लाइड पर सभी वर्गों को शामिल करता है। यदि नहीं, तो आरटी में 3−4 घंटे के लिए इनक्यूबेशन कदम दोहराएं।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और आरटी में 10 मिनट के लिए 1x PBS के साथ 4x धोएं ।
  8. स्लाइड करने के लिए बफर अवरुद्ध में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (300−400 μL/स्लाइड): एलेक्सा फ्लोर ४८८ एंटी-चिकन आईजीजी (1:500) और Cy3 एंटी-रैबिट आईजीजी (1:500) ।
  9. 2 घंटे के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें फ्लोरोफोरस की ब्लीचिंग को रोकने के लिए स्लाइड्स को लाइट से कवर करते रहें ।
  10. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और 10 मिनट के लिए 1x PBS के साथ 2x धोएं।
  11. 15 मिनट के लिए पीबीएस (1:5,000) में DAPI पतला के साथ इनक्यूबेट।
  12. 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ 1x वर्गों को धोएं।
  13. बढ़ते माध्यम के 110 माइक्रोन में एम्बेड करने से पहले अतिरिक्त पीबीएस और सूखी को ~ 1−2 मिनट के लिए निकालें।
  14. 24 x 60 मिमी कवरलिप के साथ सील करें और इमेजिंग से पहले कम से कम 3 घंटे के लिए सूखने दें। इष्टतम संकेत सुनिश्चित करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करने के बाद 1−2 सप्ताह के भीतर इमेज स्लाइड्स।

7. जीएफपी, टीडीटी और अतिरिक्त एंटीजन के लिए इम्यूनोस्टेपिंग

  1. चरण 6.1−6.3 करें।
  2. अवरुद्ध बफर निकालें और स्लाइड (300−400 μL/स्लाइड) के लिए बफर अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें।
    नोट: जब तीन या अधिक एंटीजन (यानी, GFP, tdT, और ब्याज की एक प्रोटीन) के लिए धुंधला खरगोश में उठाया गया था, यह 1:500 के एक कमजोर पड़ने पर विरोधी टीडीटी (बकरी) प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की सिफारिश की है । वैकल्पिक टीडीटी धुंधला के साथ तीन एंटीजन के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया का एक उदाहरण चिकन एंटी-जीएफपी (1:500), बकरी विरोधी टीडीटी (1:500) का उपयोग कर सकता है, और ब्याज के प्रोटीन (यानी, खरगोश) के खिलाफ एंटीबॉडी।
  3. चरण 6.5−6.7 करें।
  4. स्लाइड करने के लिए बफर अवरुद्ध में पतला एक माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें (300−400 μL/स्लाइड): एलेक्सा फ्लोर ४८८ एंटी-चिकन आईजीजी (1:500), Cy3 एंटी-बकरी आईजीजी (1:500), और एलेक्सा फ्लोर ६४७ एंटी-रैबिट आईजीजी (1:500) ।
  5. चरण 6.9−6.14 करें।

8. कन्फोकल छवि अधिग्रहण और MADM क्लोन की मात्रा

  1. कॉर्टेक्स में क्लोन और उनके स्थानों वाले मस्तिष्क वर्गों की पहचान और दस्तावेज करें।
    नोट: क्लोन के समय, क्रेयरटी 2 ड्राइवर और विश्लेषण के समय के आधार पर क्लोन स्पैन के अनुभागों की संख्या भिन्न होगी। यह कदम या तो एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप या एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है।
  2. एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, सही लेजर लाइनों और फिल्टर का चयन और कॉन्फ़िगर करके शुरू करें। एमएडीएम दिमाग के लिए, डीएपीआई, जीएफपी और टीडीटी (उत्तेजन: क्रमशः 358 एनएम, 488 एनएम और 554 एनएम; पीक उत्सर्जन: क्रमशः 461 एनएम, 507 एनएम और 581 एनएम) का चयन करें। सुनिश्चित करें कि पिनहोल इष्टतम इमेजिंग गुणवत्ता के लिए 1 हवादार इकाई के लिए सेट है।
  3. कॉन्फोकल स्पेसिफिक सेटिंग्स के लिए, 20x ऑब्जेक्टिव और 1x जूम के साथ इमेज क्लोन। जिन छवियों का उपयोग परिमाणीकरण में किया जाएगा, उनके लिए स्कैनिंग स्पीड पिक्सेल का उपयोग 1.52−2.06 माइक्रो (छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में 7−8 मूल्य) का उपयोग करें, जिसमें कोई औसत नहीं है। लेजर तीव्रता को समायोजित करें और उपयुक्त के रूप में प्रत्येक चैनल के लिए सेटिंग्स हासिल करें।
    नोट: आवश्यक छवि गुणवत्ता के आधार पर, स्कैनिंग गति और औसत के लिए सेटिंग्स भिन्न हो सकते हैं।
  4. एक बार क्लोन स्पष्ट रूप से पहचान लिया है, क्लोन में सभी प्रासंगिक वर्गों को कवर करने के लिए इमेजिंग टाइल्स की व्यवस्था । जेड-स्टैक को समायोजित करें ताकि क्लोन में सभी एमएडएम लेबल कोशिकाओं को 1.5 माइक्रोन/जेड-स्टैक स्लाइस के अंतराल के साथ कैप्चर किया जाए। टाइल वाले क्षेत्र को समायोजित करें ताकि क्लोन (यानी, पायल सतह से कॉर्पस कैलोसम तक) इमेजिंग करते समय कॉर्टेक्स की पूरी चौड़ाई पर कब्जा कर लिया जा सके।
  5. इमेज कॉपीरइट क्लोन लगातार कई वर्गों में फैले हुए हैं, यह सुनिश्चित करते हुए कि क्लोन के भीतर कोशिकाओं के बिना किसी भी वर्ग को अभी भी 3डी पुनर्निर्माण और कोशिका स्थानिक जानकारी की सही व्याख्या के उद्देश्य से चित्रित किया गया है।
  6. एक MADM क्लोन की कोशिकाओं वाले प्रत्येक खंड का विश्लेषण करें जो रोस्ट्रल से कॉर्टेक्स के कौडल अंत तक क्रमिक रूप से होता है। उनके आकृति विज्ञान और/या मार्कर धुंधला के आधार पर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स और ग्लिया भेद । परमाणु धुंधला (DAPI) द्वारा परिभाषित संबंधित परत सीमाओं के आधार पर समानांतर में दर्ज स्थितीय जानकारी।
    नोट: भ्रूण विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि परिणामों के लिए चित्रा 4 देखें और वयस्क विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि परिणामों के लिए चित्रा 5।

9. क्लोन के धारावाहिक 3 डी पुनर्निर्माण

नोट: धारावाहिक मस्तिष्क वर्गों पर छवि वाले व्यक्तिगत क्लोनों का 3 डी पुनर्निर्माण दृश्य प्रदर्शन के साथ-साथ 3 डी क्लोनल आर्किटेक्चर के विश्लेषण के लिए उपयोगी है और निम्नलिखित चरणों के अनुसार किया जा सकता है।

  1. इमेज एक्विजिशन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अधिग्रहण मापदंडों के आधार पर सिलाई और फ्यूज कॉन्फोकल टाइल वाली छवियां। .czi फ़ाइल खोलें और फिर ज़ेन सॉफ्टवेयर (Zeiss) में प्रसंस्करण टैब के तहत सिलाई विधि चलाएं।
  2. निर्यात सिले छवि झगड़ा प्रारूप में व्यक्तिगत जेड विमानों के रूप में ढेर । सिले .czi फ़ाइल खोलें और फिर प्रोसेसिंग टैब के तहत छवि निर्यात विधि चलाएं। मल्टीचैनल छवियों के लिए, बाद की छवि प्रसंस्करण के लिए लाल/हरे/नीले रंग की छवियों के रूप में निर्यात करें ।
  3. क्लोन के प्रत्येक धारावाहिक मस्तिष्क अनुभाग के लिए चरण 9.1 और 9.2 दोहराएं।
    नोट: सटीक 3 डी पुनर्निर्माण के लिए, क्लोन के भीतर सभी मस्तिष्क अनुभाग, जिनमें लेबल की गई कोशिकाओं के बिना शामिल हैं, को भी संसाधित किया जाना चाहिए।
  4. इमेजजे/फिजी67, 68,68जैसे ओपन सोर्स इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सबसे अधिक कॉटल जेड-प्लेन से शुरुआत में व्यक्तिगत छवियों को एक ही स्टैक में संक्षिप्त करें।
    नोट: प्रत्येक मस्तिष्क अनुभाग के किनारों पर किसी भी खाली छवियों को इस बिंदु पर हटा दिया जाना चाहिए ।
  5. यदि आवश्यक हो, तो चरण 9.5.1−9.5.5 का पालन करके"मल्टीस्टैकग्रेग"नामक इमेजजे प्लगइन का उपयोग करके गलत संरेखण के लिए चरण 9.4 से प्राप्त छवि स्टैक को सही करें। यदि छवि संरेखण की आवश्यकता नहीं है, तो 9.6 चरण में आगे बढ़ें।
    नोट: यह प्लगइन चैनल के उच्चतम विपरीत (आमतौर पर DAPI) के साथ छवि संरेखण करता है और फिर अन्य चैनलों पर रिकॉर्ड किए गए परिवर्तन को लागू करता है, इस प्रकार मल्टीचैनल स्टैक के विश्वसनीय छवि संरेखण की अनुमति देता है। टर्बोरेगनामक एक सहायक प्लगइन को पूर्वस्थापित किया जाना चाहिए।
    1. इमेजजे में,"मल्टीस्टैक्रेग"और"टर्बोरेग"प्लगइन्स स्थापित करें।
    2. गठबंधन करने के लिए चरण 9.4 से प्राप्त क्लोन छवियों की छवि ढेर खोलें। इमेज टैब के तहत रंग विकल्प के भीतर चैनलों को DAPI (नीला), जीएफपी (हरा), और टीडीटी (लाल) में विभाजित करें।
    3. "कठोरशरीर"परिवर्तन द्वारा DAPI चैनल संरेखित करने और परिवर्तन फ़ाइल को बचाने के लिए"मल्टीस्टैक्रेग"प्लगइन चलाएं।
    4. "मल्टीस्टैक्रेग"का उपयोग करके सहेजे गए परिवर्तन फ़ाइल को अन्य दो चैनलों पर लागू करें।
    5. सभी तीन गठबंधन चैनलों को मर्ज करें और गठबंधन स्टैक को बचाएं।
  6. इमेजजे में क्लोन को उन्मुख करने के लिए शीर्ष पर पायल सतह और नीचे कॉर्पस कैलोसम के साथ ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में चरण 9.4 (या संरेखण के बाद चरण 9.5.5) से प्राप्त क्लोन छवियों के ढेर को घुमाएं। यदि आवश्यक हो तो जाय विमान में फसल।
  7. गुणात्मक प्रस्तुति और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों के लिए, अधिकतम जेड-प्रोजेक्शन छवि (चरण 9.8) उत्पन्न करें या क्लोन के 3डी रेंडरिंग (चरण 9.9) करें।
  8. ImageJ में, चरण 9.6 से छवि स्टैक खोलें और प्रोजेक्शन प्रकार मैक्स तीव्रता के साथ जेड-प्रोजेक्शन विकल्प का चयन करें। इससे एक ही प्लेन में अनुमानित पूरे क्लोन की इमेज जेनरेट होगी।
  9. ImageJ में, स्टेप 9.6 से इमेज स्टैक खोलें और क्लोन का 3डी विज़ुअलाइज़ेशन जेनरेट करने के लिए 3डी प्रोजेक्ट जेड-फंक्शन का चयन करें जिसे घुमाया जा सकता है।
    नोट: छवि अधिग्रहण के दौरान व्यक्तिगत जेड-स्टैक की मोटाई के बराबर सही स्लाइस अंतराल इनपुट करने के लिए इस चरण में महत्वपूर्ण है। स्लाइस के बीच अंतराल को दूर करने के लिए इंटरपोलेशन टूल का उपयोग किया जाना चाहिए।

Representative Results

MADM दो बेटी कोशिकाओं के साथ कार्यात्मक हरे और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के पुनर्गठन में परिणाम प्रत्येक G2-X गुणसूत्र अलगाव की घटनाओं(चित्रा 1ए)पर दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन में से एक व्यक्त । क्योंकि MADM घटनाओं के परिणामस्वरूप दो वंशज वंशियों की स्थायी और विशिष्ट लेबलिंग होती है, हरे और लाल बेटी सेल वंश (उपकबंध) का मात्रात्मक मूल्यांकन किया जा सकता है। मूल जनक के विभाजन पैटर्न (जैसे, सममित बनाम असममित) और मूल जनक के संभावित (जैसे, संतान की संख्या) सहित चर निर्धारित किया जा सकता है।  प्रत्येक फ्लोरोसेंटी लेबल वाले उपक्लोन को निर्धारित करना जानकारीपूर्ण है जब पूर्वव्यापी रूप से यह निर्धारित किया जाता है कि टीएम प्रेरण के समय मूल जनक कोशिका सममित प्रोलिफेरेटिव डिवीजनों, या असममित, न्यूरोजेनिक डिवीजनों से गुजर रही है या नहीं। पिछले अध्ययनों में Emx1-CreERT2 या नेस्टिन-क्रेयरटी 2 ,को दो व्यापकवर्गों 7,11,46में प्रांतस्था में उत्तेजक प्रक्षेपण क्लोन प्राप्त किया गया था।, पहला, "सममित प्रसार क्लोन" कहा जाता है, जो काफी संख्या में न्यूरॉन्स के औसत पर बना होता है, जिसमें हरे और लाल दोनों उपकमान होते हैं जिनमें चार या अधिक न्यूरॉन्स होते हैं। दूसरा समूह, "असममित क्लोन" क्लोन के एक वर्ग को परिभाषित करता है जहां "अल्पसंख्यक" उपक्लोन में तीन से कम न्यूरॉन्स और "बहुमत" उपक्लोन, चार या अधिक11होते हैं। ये परिभाषाएं कॉर्टिकल आरजीपी के लिए विशिष्ट हैं और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों और ऊतकों के लिए फिर से विचार करने की आवश्यकता हो सकती है। कॉर्टिकल क्लोन के दोनों वर्गों के लिए, संतति सतही और गहरी परतों भर में वितरित किया जाएगा ।

एमएडीएम क्लोनल अध्ययन डिजाइन करते समय कई पहलू हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए। जिस समय एमएडीएम की घटनाओं को टीएम प्रशासन द्वारा प्रेरित किया जाता है, वह एक महत्वपूर्ण विचार है(चित्र 3)। कॉर्टिकल उत्तेजक प्रक्षेपण न्यूरॉन एमएडीएम क्लोन (यानी, E10 में Emx1-CreERT2 या Nestin-CreERT2)का उपयोग करके, लगभग सभी आरजीपी अभी भी सममित डिवीजनों11से गुजर रहे थे । इसलिए, टीएम के साथ E10 में प्रेरण ने प्रोलिफेरेटिव आरजीपी प्रवर्धन के कई दौर पर कब्जा कर लिया और इसके परिणामस्वरूप उच्च न्यूरॉन संख्या के साथ क्लोन किया गया। हालांकि, E10 में आरजीपी की संख्या आम तौर पर छोटी थी और इस प्रकार टीएम प्रशासन ने बहुत कम एमएडीएम घटनाओं (कभी-कभी प्रति मस्तिष्क एक से कम) उत्पन्न किया। अधिकांश आरजीपी ने लगभग E12 में सममित से असममित न्यूरोजेनिक डिवीजनों में बंद कर दिया। कड़ाई से असममित न्यूरोजेनिक क्लोन को लक्षित करने के लिए, E12 या बाद में प्रेरित करना सबसे अच्छा था(चित्र 3)। टीएम इंडक्शन और कॉर्टेक्स में एमएडीएम पुनर्संयोजन घटनाओं को देखने के बीच का समय 24 घंटे से कम था आईपी इंजेक्शन इस विधि के लिए भ्रूणीय चरणों में टीएम के प्रशासन के लिए पसंदीदा तरीका था क्योंकि इससे क्लोनल इंडक्शन में अधिक प्रजनन क्षमता हुई। दो कारणों से टीएम डोज को कम से कम रखना भी जरूरी है। सबसे पहले, यदि एमएडीएम पुनर्संयोजन दर बढ़ जाती है, तो कई, शायद ओवरलैपिंग, क्लोन को प्रेरित करने की संभावना अधिक है। दूसरा, अगर बहुत ज्यादा टीएम दिया जाता है, तो गर्भपात की बढ़ी हुई दर, भ्रूण अवशोषण, और छोटे कूड़े के आकार देखे जा सकते हैं। सभी गर्भवती बांधों के लगभग आधे में गर्भपात देखा गया था जब टीएम इंजेक्शन E10 में दिया गया था । इस आवृत्ति E11 के बाद से कम हो गया और गर्भवती बांधों के लगभग 1/3 गर्भपात के लिए कम हो गया । पिछले एमएडीएम अध्ययनों में उपयोग की जाने वाली टीएम खुराक, प्रेरण समय और क्रेयरटी 2 ड्राइवरों के सारांश के लिए तालिका 1का उल्लेख करें। टीएम की अनुपस्थिति में रिपोर्टर गतिविधि कुछ टीएम-अकांक्षित क्रेयरटी 2 ड्राइवरों६९के साथ देखा गया था । टीएम की अनुपस्थिति में एक्टोपिक अभिव्यक्ति या एमएडीएम पुनर्संयोजन घटनाओं को नेस्टिन-क्रेयरटी-2 ड्राइवरों के Emx1-CreER T2 के साथ नहीं देखा गया था। यह आंशिक रूप से इस तथ्य के कारण हो सकता है कि टीएम-मध्यस्थता वाले क्रोमोसोमल ट्रांस-रिकॉम्बिनेशन सीआईएस-रिकॉम्बिनेशन की तुलना में लगभग 1:1,000 से 1:10,000 कम आवृत्ति पर होते हैं, जिससे एक्टोपिक एमएड लेबलिंग की संभावना कम हो जाती है।

एमएडीएम क्लोनल विश्लेषण प्रयोग की योजना बनाते समय विचार करने के लिए एक और कारक अध्ययन की अवधि है। टीएम प्रेरण के बीच के समय की लंबाई को अलग करता है और जब प्रयोग का विश्लेषण किया गया (ए) (समय खिड़की) समय64के साथ स्टेम सेल गतिशीलता प्रदर्शित करता है। कम भ्रूण समय खिड़कियां (यानी, टीएम/E11−A/E13; टीएम/E11−A/E16) भ्रूण न्यूरोजेनेसिस(चित्रा 4)की गतिशीलता पर कब्जा कर लिया । दो या अधिक समय खिड़कियों से क्लोन की तुलना करने से उत्पादित कोशिकाओं की संख्या में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि मिलती है और वंश प्रगति64के विभिन्न चरणों में न्यूरॉन वितरण कैसे भिन्न होता है । व्यक्तिगत क्लोन की पूरी क्षमता को पकड़ने के लिए, प्रसवोत्तर या वयस्क टाइमपॉइंट्स7,11, 12,12में विश्लेषण की गई समय खिड़की का विस्तार करना आवश्यक है।, भ्रूण में प्रेरित और वयस्क में विश्लेषण किए गए नियोकॉर्टिकल क्लोन के उदाहरण चित्र 5में दिखाए गए हैं । ध्यान दें, कॉर्टिकल न्यूरोजेनेसिस ज्यादातर पूरा हो जाता है और 17 से ग्लिओजेनेसिस बढ़ जाता है। लगभग 1/6 न्यूरोजेनिक आरजीपी भी एस्ट्रोसाइट्स और/या ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स11उत्पन्न करने के लिए आगे बढ़ें ।

सममित क्लोन तब होते हैं जब आरजीपी प्रोलिफेरेटिव डिवीजन11के एक या अधिक राउंड से गुजरते हैं । E10−E12 के बीच प्रेरित आरजीपी क्लोन आकार में औसत बड़े थे और अंतिम न्यूरॉन वितरण(चित्रा 4ए-सी)की अधिक स्थानिक विशेषताएं प्रदान की गई थीं। न्यूरॉन्स के साथ क्लोन अपेक्षाकृत समान रूप से गहरी और सतही परतों भर में वितरित एक "सिलेंडर" आकार पर ले लिया, जबकि न्यूरॉन्स के साथ क्लोन अधिक गहरी परतों की तुलना में सतही परतों में फैलाया एक "शंकु" आकार11विकसित की है । क्लोन की स्थानिक और रूपात्मक जानकारी को पूरी तरह से कैप्चर करने के लिए, अनुक्रमिक छवियों का उपयोग करके प्रत्येक क्लोन का पुनर्निर्माण करना आवश्यक था। क्लोनल फैलाव को मापने के लिए, क्लोन की सतही परतों (एलआई−VI) में अधिकतम पार्श्व फैलाव (सभी आयामों में मापा जाता है) की तुलना गहरी परतों (एलवी/एलआईवी) में न्यूरॉन फैलाव से की गई थी। इस अनुपात (वितरण ऊपरी: वितरण कम) समग्र क्लोन आकार का एक मात्रात्मक readout प्रदान की है ।

असममित क्लोन, जहां अल्पसंख्यक उपक्लोन तीन या उससे कम था, ने एक आरजीपी(चित्रा 4डी-एफ और चित्रा 5ए-एफ)D-F 7,11, 12,12के न्यूरोनल आउटपुट में अंतर्दृष्टि प्रदान की।, बहुमत की आबादी (बड़े उपक्लोन) को लाल या हरे रंग में लेबल किया जा सकता है, जिसमें प्रति क्लोन लगभग सात उत्तेजक प्रक्षेपण न्यूरॉन्स होते हैं, जब एक Emx1-CreERT2 या नेस्टिन-क्रेयरटी 2(चित्रा 5जी)7,11,,12का उपयोग करके प्रेरित किया जाता है।, एक MADM क्लोन में कोशिकाओं की कुल संख्या को सतही और गहरी परतों में बड़े उपकक्ष में न्यूरॉन्स के वितरण का विश्लेषण करके आगे विच्छेदित किया जा सकता है। अल्पसंख्यक आबादी (छोटे उपक्लोन) पारस्परिक रंग द्वारा लेबल किया गया था और क्लोन प्रति औसत 1−2 कोशिकाओं(चित्रा 5एच)पर था । कुल "इकाई आकार", जो औसतन 8−9 न्यूरॉन्स था, छोटे और बड़े उपकक्षों को एक साथ जोड़कर गणना की जा सकती है(चित्रा 5I)7,11,,12।, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जहां आरजीपी का न्यूरोनल आउटपुट अत्यधिक पूर्वानुमानित था, वहीं क्लोनल विषमता12,,70की डिग्री थी।

एमएडीएम कैसेट में उत्परिवर्तन डिस्टल का परिचय आनुवंशिक मोज़ेक की पीढ़ी को सक्षम बनाता है, स्टेम सेल वंश प्रगति के आणविक नियामकों को विच्छेदन करने के लिए एक अनूठी विधि प्रदान करता है। जैसे, एमएडीएम जीन के सेल-स्वायत्त कार्य का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है (उदाहरण के लिए, माइक्रोसेफली या मैक्रोसेफली के लिए इसका संघ)। एक नियंत्रण MADM में प्रेरित क्लोन करने के लिए एक MADM आनुवंशिक पच्चीकारी में प्रेरित क्लोन की तुलना करके, न्यूरॉन संख्या और वितरण में परिवर्तन का एक अत्यधिक मात्रात्मक readout उत्पन्न किया जा सकता है। पिछले MADM आधारित अध्ययन क्लोनल स्तर पर माइक्रोसेफली गठन में Otx1 के सेल स्वायत्त समारोह की मात्रा निर्धारित (एक प्रतिनिधि उदाहरण के लिए चित्रा 6ए-ई देखें)11। एक अन्य अध्ययन में, एमएडीएम क्लोनल विश्लेषण ने दिखाया कि Ndel1 कोशिका-स्वायत्त रूप से प्रक्षेपण न्यूरॉन संख्या को विनियमित नहीं करता है, बल्कि इसके बजाय नवजात न्यूरॉन्स की कॉर्टिकल प्लेट के भीतर प्रवेश करने या स्थानांतरित करने की क्षमता है, जो बाद में वयस्क कॉर्टेक्स46बनाता है। इन अध्ययनों ने कॉर्टिकल विकास को विनियमित करने वाले जीन के सेल-स्वायत्त कार्यों का अध्ययन करने में एमएडीएम क्लोनल विश्लेषण की अत्यधिक मात्रात्मक प्रकृति का प्रदर्शन किया। वर्तमान में क्लोनल स्तर पर मैक्रोसेफली में फंसा जीन का अध्ययन करने के लिए MADM का उपयोग कर साहित्य में कोई उदाहरण नहीं हैं । हालांकि, भविष्य के अध्ययनों में सामान्य रूप से कॉर्टिकल आकार के नियंत्रण के लिए प्रासंगिक जीन का विश्लेषण आणविक और सेलुलर स्तर पर अत्यधिक वांछनीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: एकल स्टेम सेल स्तर पर वंश अनुरेखण और क्लोनल विश्लेषण के लिए MADM सिद्धांत । (क)एमएडीएम के साथ वंश अनुरेखण और क्लोनल विश्लेषण करने के लिए दो घटक उपस्थित होने चाहिए । सबसे पहले, MADM कैसेट के मुताबिक़ गुणसूत्रों पर समान loci को लक्षित किया जाना चाहिए। कैसेट दो चिमरिक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन, eGFP (ग्रीन, [जी]) और मिलकर dimer टमाटर (लाल, टीडीटी [टी]) से मिलकर होते हैं । जीटी कैसेट में ईजीएफपी के एन-टर्मिनस और टीडीटी के सी-टर्मिनस होते हैं, जो एक लोक्सपी साइट वाले इंट्रॉन से अलग होते हैं। टीजी कैसेट का निर्माण टीडीटी के एन-टर्मिनस और ईजीएफपी के सी-टर्मिनस के साथ किया जाता है। दूसरा, क्रे रिकॉम्बेमिनेस की अभिव्यक्ति लक्षित एमएडीएम कैसेट युक्त कोशिका में होनी चाहिए। लोक्सपी साइटें क्रे-मध्यस्थता इंटरक्रोमोसोमल पुनर्संयोजन के लिए एक लक्ष्य के रूप में काम करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप दोनों अभिव्यक्ति कैसेट का पुनर्गठन एक साथ होता है। यदि कोशिका चक्र के जी-2 चरण के दौरान पुनर्संयोजन होता है और इसके बाद एक्स अलगाव (जी2-एक्स) होता है, तो दो बेटी कोशिकाएं दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन में से एक को व्यक्त करेंगी। (ख)एक ही क्लोन स्तर पर आनुवंशिक पच्चीकारी विश्लेषण के लिए MADM सिद्धांत । उत्परिवर्ती एलील्स (पॉइंट म्यूटेशन, विलोपन, सम्मिलन, लोक्सपी-फ्लैंक्ड सशर्त एलील्स जैसा कि चित्र 1 बी,आदि में दर्शाया गया है) को मीओटिक पुनर्संयोजन के माध्यम से टीजी-एमएड कैसेट में डिस्टल पेश किया जा सकता है (चित्र 2 और हिपपेनमेयर एट अल देखें।46 विवरण के लिए कि कैसे मैडम सिस्टम में उत्परिवर्ती एलील्स को पेश किया जाए)। यदि एक G2-X Cre recombinase-मध्यस्थता इंटरक्रोमोसोमल ट्रांस-पुनर्संयोजन MADM कैसेट के बीच होता है यह एक GFP + होमोज़िगस उत्परिवर्ती सेल(GeneX-/-)-/-ब्याज की जीन के लिए और एक tdT + समरूप जंगली प्रकार सेल(GeneX+/+)एक अवेलेबल heterozygous वातावरण मेंपरिणाम ४६,,४७,,७१। क्लोनल विश्लेषण (यानी पीली कोशिकाओं) में उपयोग नहीं किए गए वैकल्पिक लेबलिंग परिणामों को पहले विस्तार से11,46,,47में वर्णित किया गया है।, कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: वंश अनुरेखण के लिए प्रयोगात्मक MADM चूहों के उत्पादन के लिए प्रजनन योजनाएं। क्लोनल विश्लेषण के लिए नियंत्रण मदम(ए)और जीन एक्स एमएडीएम(बी)प्रायोगिक एमएडीएम चूहों के उत्पादन के लिए प्रजनन योजना। MADM प्रजनन प्रतिमान के बारे में अधिक जानकारी के लिए Beattie एट अल7 और Hippenmeyer एट अल देखें ।7,,४६। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: MADM आधारित क्लोनल वंश विश्लेषण के लिए समय पाठ्यक्रम प्रतिमान । प्रयोगात्मक डिजाइन समय खिड़कियों की योजनाबद्ध। देशांतर नमूना प्रतिमान के लिए, क्लोन प्रेरण का समय स्थिर रहा और विश्लेषण से पहले समय की लंबाई भिन्न रही। प्रगतिशील अंतराल नमूने में, विश्लेषण का समय स्थिर रहा, लेकिन प्रेरण का समय भिन्न रहा। संबोधित प्रश्नों के आधार पर एक या दोनों दृष्टिकोणों का संयोजन उपयोग किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विकासशील और वयस्क नियोकॉर्टेक्स में एमएडीएम क्लोनल विश्लेषण। टीएम-मध्यस्थता एमएडीएम क्लोन इंडक्शन सममित रूप से प्रोलिफेरेटिव (टीएम एट E10)(ए-सी)और विषम रूप से न्यूरोजेनिक (टीएम एट E12)(डी-एफ)विभाजित आरजीपी। चित्रित विकसित (टीएम/E10−A/E16 और TM/E12−A/E16)(B, E)और वयस्क (टीएम/E10−A/P21 और TM/E12−A/P21)(C, F)में वीवो में व्यक्तिगत एमएडीएमGT/TGक्लोन हैं । नेस्टिन-क्रेयरटी 2+/-(बी, ई)और एमएडीएम-11जीटी/टीजी; Emx1-CreERT2+/-(C, F)। न्यूरॉन आउटपुट उपक्लोन रंग से स्वतंत्र था और हरे रंग के बहुमत / अल्पसंख्यक उपकमान की तुलना नियंत्रण शर्तों के तहत लाल बहुसंख्यक / अल्पसंख्यक उपकक्षानों से की जा सकती है7,11. वयस्क क्लोन के लगभग 1/6 में एस्ट्रोसाइट्स और/या ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स भी शामिल थे, जो सफेद तारकों द्वारा इंगित किए गए थे । पैनल बी और एफ क्रमशः Hippenmeyer एट अलसे अनुमति के72साथ पुन: पेश कर रहे हैं । सीपी = कॉर्टिकल प्लेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एमएडीएम क्लोनल विश्लेषण आरजीपी-मध्यस्थता न्यूरॉन आउटपुट की मात्रा निर्धारित करने के लिए। एमएडीएम7,11का उपयोग करके क्लोनल स्तर पर व्यक्तिगत न्यूरोजेनिक आरजीपी द्वारा उत्तेजक न्यूरॉन (इकाई) उत्पादन का विश्लेषण । (A)विकासशील प्रांतस्था में ज्यादातर असममित MADM क्लोन उत्प्रेरण के लिए प्रयोगात्मक प्रतिमान । (ख)बहुमत उपक्लोन के साथ संभावित असममित क्लोन परिणाम या तो हरे या लाल में लेबल(C)प्रतिनिधि लगातार वर्गों में फैले एक ही न्यूरोजेनिक असममित क्लोन(D, E)3 डी पुनर्निर्माण छवियों के प्रतिनिधि असममित G2-X MADM क्लोन लाल में बहुमत आबादी के साथ(डी)या हरे रंग(ई) MADM-11GT/TGमें Emx1-CreERT2 +/-E12 पर टीएम इंडक्शन और P21 में विश्लेषण के साथ । ध्यान दें कि हरे और लाल लेबल की कोशिकाएं जंगली प्रकार की हैं। (एफ)योजनाबद्ध दो संभावित प्रयोगात्मक MADM क्लोन परिणामों का संकेत है । (जी)एमएडीएम-11 क्लोन में आरजीपी के नवीनीकरण से उत्पन्न बहुसंख्यक आबादी के आकार का परिमाणीकरण। (H)एमएडीएम-11 क्लोन में आरजीपी के नवीनीकरण से उत्पन्न होने वाली अल्पसंख्यक आबादी के आकार का मात्राकरण। (I)असममित न्यूरोजेनिक एमएडीएम-11 क्लोन के एकात्मक आकार का मात्राकरण। काल्पनिक मूल्यों का मतलब हो सकता है ± SEM. स्केल बार = 100 माइक्रोन(डी और ई)। टीएम = टैमोक्सिफेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एमएडीएम क्लोनल विश्लेषण जीन का अध्ययन करने के लिए जो माइक्रोसेफली और मैक्रोसेफली का कारण बनते हैं। काल्पनिक MADM क्लोनल विश्लेषण परिणाम जब उम्मीदवार जीन के कार्यात्मक आनुवंशिक विच्छेदन प्रदर्शन है कि माइक्रोसेफली या मैक्रोसेफली के लिए नेतृत्व । न्यूरॉन आउटपुट पर जीन ऑफ इंटरेस्ट(जीन एक्स)के सेल-स्वायत्त कार्यों को विच्छेदन करने के लिए, एमएडीएम को म्यूटेंट एलील्स को मेइटिक रिकॉम्बिनेशन के माध्यम से एमएडीएम कैसेट के लिए डिस्टल पेश करने की आवश्यकता होती है (विवरण के लिए कि एमएडीएम सिस्टम में उत्परिवर्ती एलील्स को कैसे पेश किया जाए, यह भी देखें चित्रा 2,हिपेनेयर एट अल46,और लॉकोटर एटअल।,73 (A,B) योजनाबद्ध क्लोनल आरजीपी इकाइयों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक MADM प्रतिमान का संकेत है। उत्परिवर्ती उपक्लोन या तो अल्पसंख्यक(ए)या बहुसंख्यक(बी)आबादी बना सकता है। (C-E) काल्पनिक MADM क्लोनल विश्लेषण परिणाम जब नियंत्रण MADM (सफेद सलाखों), जीन एक्स MADM माइक्रोसेफली (ग्रे सलाखों) और जीन एक्स MADM मैक्रोसेफली काले सलाखों) असममित क्लोन मात्रा । (ग)बहुसंख्यक आबादी के आकार का मात्राकरण । (घ)अल्पसंख्यक आबादी के आकार का मात्राकरण। (ई)असममित न्यूरोजेनिक क्लोन के एकात्मक आकार का मात्राकरण। काल्पनिक मूल्यों का मतलब हो सकता है ± SEM. S = काल्पनिक परिदृश्य जहां उपक्लोन सेल संख्या में अंतर महत्व तक पहुंच सकता है, नियंत्रण के सापेक्ष । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: साहित्य में एमएडीएम क्लोनल अध्ययन। क्रेयर टी 2 ड्राइवर का उपयोग, टीएम खुराक और इंजेक्शन के समय सहित एमएडीएम क्लोनल वंश प्रयोगों वाले साहित्य में अध्ययनों का सारांश। कृपया इस तालिका को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Discussion

विकासशील नियोकॉर्टेक्स में वीवो में व्यक्तिगत आरजीपी के सेल वंश को ट्रैक करने के लिए एमएडीएम का उपयोग करने की एक विधि का वर्णन किया गया है। जब टीएम-अक्षुण्ण क्रेयरटी 2के साथ संयुक्त किया जाता है, तो एमएडीएम घटनाओं को ठीक से समय पर किया जा सकता है, जो एकल सेल स्तर पर स्टेम सेल डिवीजन पैटर्न का अत्यधिक गुणात्मक और मात्रात्मक दृश्य रीडआउट प्रदान करता है। टीएम डिलीवर की खुराक को तितर-लिखे करके, एक आदर्श स्थिति में प्रति कॉर्टिकल गोलार्द्ध में एक से कम क्लोन का औसत प्राप्त किया जा सकता है, जो स्पष्ट रूप से व्यक्तिगत क्लोनों को अलग करने के लिए पर्याप्त स्थानिक पृथक्करण प्रदान करता है। ऊतक अखंडता को बनाए रखने के द्वारा, इस विधि भी स्थिति, आकृति विज्ञान, और निरपेक्ष सेल संख्या के बारे में आवश्यक जानकारी कब्जा । सीआर 7 51 पर सीएचआर 117,,11, 12,,46,,12,56,,57पर एमएडीएम कैसेट और रोसा2647,53,,59 में मूल एमएडीएम का उपयोग एमएडीएम क्लोनल विश्लेषण अध्ययन में किया गया है।,53 व्यक्तिगत कोशिकाओं का उच्च संकल्प आकृति विज्ञान और बेटी कोशिकाओं के क्लोनल संबंध दोनों में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और स्टेम कोशिकाओं और उभरते क्लोन46,,52के प्रसार की लाइव इमेजिंग की अनुमति देता है।

सीजेरियन सेक्शन और प्रसवोत्तर टाइमपॉइंट्स पर क्लोन के विश्लेषण के लिए पिल्ले को बढ़ावा देना प्रोटोकॉल में एक आवश्यक और महत्वपूर्ण कदम है। टीएम-इलाज गर्भवती बांध की स्वास्थ्य स्थिति के आधार पर, सीजेरियन सेक्शन करना आवश्यक नहीं हो सकता है। हालांकि, एक पालक मां के साथ पिल्ले स्थापना अभी भी आवश्यक है, क्योंकि टीएम इलाज मां मुसीबत स्तनपान हो सकता है । विभिन्न क्रेयरटी-2 ड्राइवरों के साथ बढ़ावा देने की आवश्यकता में कोई अंतर नहीं देखा गया है । दोनों MADM लाइनों और पालक माताओं एक outbred सीडी-1 पृष्ठभूमि पर बनाए रखा जाता है । यदि सीजेरियन सेक्शन आवश्यक नहीं है, तो प्रायोगिक पिल्ले उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले टीएम-इलाज गर्भवती बांध को 3R के सिद्धांतों के अनुसार अतिरिक्त प्रायोगिक प्रजनन के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है (ध्यान दें कि यह केवल तभी किया जा सकता है जब पशु प्रायोगिक लाइसेंस इस अभ्यास को मंजूरी दें)। पालक माताओं को जन्म देने के बाद 2 दिनों के भीतर पिल्ले को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन उच्च सफलता दर देखा गया है जब पालक माताओं प्रयोगात्मक चूहों कि प्रोत्साहित किया जाना चाहिए के रूप में एक ही दिन पर जंम देते हैं । इसलिए, चरण 1.1 में प्रयोगात्मक संभोग के समानांतर पालक माताओं के लिए समय पर संभोग स्थापित करना महत्वपूर्ण है। मूल पालक मां के कूड़े के रूप में एक समान कूड़े की संख्या को बनाए रखने को बढ़ावा पिल्ले के जीवित रहने की दर में सुधार कर सकते हैं, और इसलिए मूल कूड़े के सभी के लिए कुछ को हटाने के लिए आवश्यक हो सकता है । अतिरिक्त कदम है कि बढ़ावा देने में सुधार हो सकता है कूड़े और भोजन के साथ प्रयोगकर्ता के दस्ताने रगड़ शामिल है (दस्ताने की खुशबू को दूर करने के लिए); पालक मां के गंदे कूड़े और घोंसले के टुकड़ों के साथ सीजेरियन सेक्शन के बाद पिल्ले को धीरे से रगड़ना; और पालक माउस पिंजरे में उनके प्लेसमेंट से पहले पालक मां के पिल्ले के साथ निकट संपर्क में पिल्ले की नियुक्ति ।

अन्य रिपोर्टर-आधारित वंश ट्रेसिंग विधियों की तरह, एमएडीएम क्लोनल प्रयोगों के लिए इष्टतम क्रेयरटी-2 ड्राइवर का चयन करते समय सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, इस्तेमाल किए गए प्रमोटर को ब्याज की जनक आबादी में अस्थायी और स्थानिक दोनों को फिर से जोड़ना चाहिए। इस प्रमोटर ढूंढना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि कुछ प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न बदल सकते हैं या विकास के विभिन्न चरणों में खामोश हो सकते हैं। सेल प्रकार विशिष्टता में सुधार करने के लिए कई साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन, प्रत्येक अलग प्रमोटरों द्वारा संचालित, का उपयोग किया गया है। जब एक या दोनों पुनर्संयोजन एक ही कोशिका में व्यक्त किए जाते हैं, तो यह कोशिका और उसकी संतान को फ्लोरोसेंट रिपोर्टर74,75, 76,,,77के साथ लेबल करता है।,76 संक्षेप में, एक क्रेयरटी 2 ड्राइवर चुनना महत्वपूर्ण है जो जनकों की आबादी के लिए विशिष्ट है।

इस विधि में सबसे महत्वपूर्ण कदम क्लोन की पहचान है, क्योंकि सभी कोशिकाओं को एक पुनर्संयोजन घटना (चरण 8.1) से स्पष्ट रूप से प्राप्त किया जाना चाहिए। टीएम एकाग्रता का टिटरेशन मस्तिष्क गोलार्द्ध प्रति लाल/हरे रंग की कोशिकाओं के एक समूह से कम सुनिश्चित करता है और एक क्लोन (चरण 2.2)7,,11का विश्लेषण करने की संभावना को अधिकतम करता है। क्लोन को छोड़ दिया जाना चाहिए यदि कोशिकाओं के पड़ोसी समूह ब्याज के क्लोन के 500 माइक्रोन के भीतर होते हैं। इसलिए, क्लोन की उपस्थिति से पहले और बाद में कई वर्गों की जांच करना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आसपास कोई अतिरिक्त पुनर्संयोजन घटनाएं नहीं हैं। फ्लोरोफोरस के कमजोर संकेत के कारण, भ्रूण क्लोन में ईजीएफपी और टीडीटी के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करना आवश्यक है (धारा 6 देखें)। यह केवल वयस्क क्लोन में अनुशंसित है यदि अतिरिक्त एंटीजन को कोलेबल किया जाएगा। जब इमेजिंग क्लोन, यह प्रांतस्था की पूरी चौड़ाई पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है, जहां क्लोन स्थित है (यानी, पायल सतह से कॉर्पस callosum के लिए; कदम ८.४ देखें) किसी भी कोशिकाओं को याद नहीं करने के लिए । यह इमेज प्रोसेसिंग (सेक्शन 9) के दौरान इमेज अलाइनमेंट की सुविधा भी देता है। प्रोटोकॉल की धारा 8 में एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है लेकिन उपलब्ध माइक्रोस्कोप सेटअप के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है। एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की सिफारिश की जाती है क्योंकि इससे फोकस प्लेन के बाहर से प्रकाश संदूषण में कमी आती है। यह भी महत्वपूर्ण है कि लेजर तीव्रता और लाभ को समायोजित किया जाए ताकि हरे, लाल और पीले रंग की कोशिकाओं की स्पष्ट रूप से पहचान की जा सके। सेटअप के बावजूद, बारीकी से तैनात कोशिकाओं का पूर्ण स्थानिक पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 20x के उद्देश्य का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। सभी कोशिकाओं (चरण 8.6) की कॉर्टिकल गहराई को रिकॉर्ड करने के अलावा, कॉर्टिकल क्षेत्र जहां क्लोन स्थित हैं, उन्हें मस्तिष्क एटलस जैसे एलन ब्रेन एटलस या अन्य टकसाली समन्वय मानचित्रों का उपयोग करके पहचाना जाना चाहिए। क्लोन छवियों को आसानी से पहचानने योग्य हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए एक फ़ाइल नामकरण प्रतिमान भी अपनाया जाना चाहिए। निम्नलिखित जानकारी फ़ाइल नामकरण में शामिल किया जा सकता है: अद्वितीय छवि आईडी, तिथि छवि लिया गया था, पशु का जीनोटाइप, प्रेरण की आयु, विश्लेषण की आयु, एक ही क्लोन से छवियों के बाकी के संबंध में छवि संख्या ।

एक एमएडीएम कैसेट में उत्परिवर्तन डिटल का परिचय विशिष्ट रूप से आनुवंशिक मोज़ेक71 के उत्पादन की अनुमति देता है और क्लोनल स्तर 7 ,11,46,,62,पर वंश और कोशिका प्रकार की विविधता के आणविक नियामकों के विच्छेदन की अनुमतिदेताहै। MADM के साथ एक आनुवंशिक पच्चीकारी उत्पन्न करने के लिए, MADM कैसेट को रुचि के जीन के रूप में एक ही गुणसूत्र से जुड़ा होना चाहिए (प्रजनन योजना के लिए चित्रा 2 देखें)। यह एमएडीएम के साथ वर्तमान क्लोनल विश्लेषण को सीएचआर 751,सीएचआर 1146,सीएचआर 1251और सीएचआर 6 डिस्टल से रोजा26 लोकस47पर स्थित जीन तक सीमित करता है। भविष्य के अध्ययनों से किसी भी गुणसूत्र के लिए लक्षित MADM कैसेट का उपयोग करेंगे, क्लोनल स्तर पर माउस जीनोम के लगभग सभी जीन के पच्चीकारी विश्लेषण की अनुमति ।

अंत में, एमएडीएम विकासशील नियोकॉर्टेक्स में जनक कोशिकाओं के विश्लेषण तक सीमित नहीं है। कई स्टेम सेल निकस के अध्ययन से क्लोनली संबंधित कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्थाओं को हल करने की क्षमता से लाभ हो सकता है। मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों में एमएडीएम लागू करके, रोग की स्थिति (जैसे, कैंसर), या अन्य ऊतकों में47,50,,51,,52,,,53,,54,,55,56,,57,58,,59,अध्ययनों से पता चला कि जनक और स्टेम कोशिकाओं के विविध वर्गों से प्राप्त क्लोन में वंश संबंध (एमएडीएम क्लोनल अध्ययन की वर्तमान सूची के लिए तालिका 1 देखें)।,, एमएडीएम का एक और दिलचस्प भविष्य का अनुप्रयोग इसे अतिरिक्त कार्यात्मक या उपकोशिकीय संवाददाताओं के साथ जोड़ना है, जो क्लोन से प्राप्त की जा सकने वाली जानकारी की डिग्री को बढ़ाएगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम चर्चा के लिए Hippenmeyer प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद, जैवएजिंग सुविधा, जीवन विज्ञान सुविधा, और पूर्व नैदानिक सुविधा IST ऑस्ट्रिया में तकनीकी सहायता के लिए । इस काम को आईएसटी ऑस्ट्रिया संस्थागत कोष द्वारा समर्थित किया गया था; आरबी को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ) लिसे-मीननर कार्यक्रम (एम 2416) से समर्थन मिला; एन. ए को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ) फिरनबर्ग-प्रोग्राम (टी 1031) से समर्थन मिला; जीसी को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्क्लोडोवस्का-क्यूरी ग्रांट एग्रीमेंट नंबर 754411 के तहत आईएसटीप्लस पोस्टडॉक्टोरल फेलो के रूप में समर्थन मिला; A.H. एक ÖAW डॉक्टर (ऑस्ट्रिया के विज्ञान अकादमी के डॉक्टरेट फैलोशिप) से समर्थन प्राप्त किया । इस अध्ययन को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता संख्या ७२५७८० LinPro) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) द्वारा एसएच को भी समर्थन दिया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock) Braun 9204512N
1,4-diazabicyclooctane (DABCO) Roth 0718.2
10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock) Braun 8508429N
15 mL conical centrifuge Sarstedt 65.554.502
24 multi-well dishes Roth/Greiner Bio-one CE56.1
27- gauge x 3/4 needle (Sterican) Braun 16010256E
Corn oil Sigma C8267-500ML
Coverslips (24 x 60 mm #1) Thermo Fisher Scientific (Menzel) 15747592
Cryostat Cryostar NX70 Thermo Fisher Scientific 957000H
Dako Pen (Wax marker) Agilent S200230-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
Disposable microtome blade (MX35 Ultra) Thermo Fisher Scientific 705830
Fine Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools (FST) 11254-20
Glass anti-roll plate Histocom M 449980
Glycerol Sigma G5516
LSM 800 Confocal Zeiss
Mounting medium 25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)
Mowiol 4-88 Roth 0713.2
Normal donkey serum Innovative Research IGDNSER100ML
Paraformaldehyde Sigma 441244-1KG
Peristaltic pump 323E/D 400RPM Watson-Marlow 036.3124.00A
Sucrose Sigma S8501-5KG
Superfrost plus glass slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNT
Tamoxifen Sigma T5648
Tissue Embedding mold T-12 (22mm square) Polysciences Inc. 18986-1
Tissue-Tek O.C.T Sakura 4583
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Trizma hydrochloride Sigma 93363
Tween-20 Sigma P9416-100ML
Software and Plugins:
Fiji 1.52p Fiji
MultiStackReg 1.45 Download link
TurboReg EPFL Bioimaging
Zen Blue 2.6 Zeiss
Experimental Models: Organisms/Strains:
Mouse: Emx1-CreER The Jackson Laboratory JAX:027784
Mouse: MADM-11-GT The Jackson Laboratory JAX:013749
Mouse: MADM-11-TG The Jackson Laboratory JAX:013751
Primary antibodies:
Chicken anti-GFP 1:500 Aves Labs GFP-1020
Goat anti-tdTomato 1:500 Sicgen Antibodies AB8181-200
Rabbit anti-RFP 1:500 MBL PM005
Secondary antibodies:
Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500 Jackson Immuno Research 715-475-150
Donkey Anti-Goat Cy3 1:500 Jackson Immuno Research 705-165-147
Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500 Jackson Immuno Research 711-165-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malatesta, P., et al. Neuronal or glial progeny: regional differences in radial glia fate. Neuron. 37 (5), 751-764 (2003).
  2. Miyata, T., Kawaguchi, A., Okano, H., Ogawa, M. Asymmetric inheritance of radial glial fibers by cortical neurons. Neuron. 31 (5), 727-741 (2001).
  3. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  4. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 465-502 (2014).
  5. Desikan, R. S., Barkovich, A. J. Malformations of cortical development. Annals of Neurology. 80 (6), 797-810 (2016).
  6. Gao, R., Penzes, P. Common mechanisms of excitatory and inhibitory imbalance in schizophrenia and autism spectrum disorders. Current Molecular Medicine. 15 (2), 146-167 (2015).
  7. Beattie, R., et al. Mosaic Analysis with Double Markers Reveals Distinct Sequential Functions of Lgl1 in Neural Stem Cells. Neuron. 94 (3), 517-533 (2017).
  8. Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 800, 1-24 (2014).
  9. Lodato, S., Arlotta, P. Generating neuronal diversity in the mammalian cerebral cortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 699-720 (2015).
  10. Hansen, A. H., Duellberg, C., Mieck, C., Loose, M., Hippenmeyer, S. Cell Polarity in Cerebral Cortex Development-Cellular Architecture Shaped by Biochemical Networks. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 176 (2017).
  11. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  12. Llorca, A., et al. A stochastic framework of neurogenesis underlies the assembly of neocortical cytoarchitecture. eLife. 8, e51381 (2019).
  13. Ma, J., Shen, Z., Yu, Y. C., Shi, S. H. Neural lineage tracing in the mammalian brain. Current Opinion in Neurobiology. 50, 7-16 (2018).
  14. Caviness, V., Takahashi, T., Nowakowski, R. Numbers, time and neocortical neuronogenesis: a general developmental and evolutionary model. Trends in Neurosciences. 18 (9), 379-383 (1995).
  15. Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anatomy and Embryology. 156 (2), 115-152 (1979).
  16. Kessaris, N., et al. Competing waves of oligodendrocytes in the forebrain and postnatal elimination of an embryonic lineage. Nature Neuroscience. 9 (2), 173-179 (2006).
  17. Magavi, S., Friedmann, D., Banks, G., Stolfi, A., Lois, C. Coincident generation of pyramidal neurons and protoplasmic astrocytes in neocortical columns. The Journal of Neuroscience. 32 (14), 4762-4772 (2012).
  18. Anthony, T. E., Klein, C., Fishell, G., Heintz, N. Radial glia serve as neuronal progenitors in all regions of the central nervous system. Neuron. 41 (6), 881-890 (2004).
  19. Voigt, T. Development of glial cells in the cerebral wall of ferrets: direct tracing of their transformation from radial glia into astrocytes. The Journal of Comparative Neurology. 289 (1), 74-88 (1989).
  20. Amberg, N., Laukoter, S., Hippenmeyer, S. Epigenetic cues modulating the generation of cell-type diversity in the cerebral cortex. Journal of Neurochemistry. 149 (1), 12-26 (2019).
  21. Beattie, R., Hippenmeyer, S. Mechanisms of Radial Glia Progenitor Cell Lineage Progression. FEBS letters. 591 (24), 3993-4008 (2017).
  22. Telley, L., et al. Temporal patterning of apical progenitors and their daughter neurons in the developing neocortex. Science. 364 (6440), eaav2522 (2019).
  23. Oberst, P., et al. Temporal plasticity of apical progenitors in the developing mouse neocortex. Nature. 573 (7774), 370-374 (2019).
  24. Telley, L., et al. Sequential transcriptional waves direct the differentiation of newborn neurons in the mouse neocortex. Science. 351 (6280), 1443 (2016).
  25. Deppe, U., et al. Cell lineages of the embryo of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (1), 376-380 (1978).
  26. Woodworth, M. B., Girskis, K. M., Walsh, C. A. Building a lineage from single cells: genetic techniques for cell lineage tracking. Nature Reviews Genetics. 18 (4), 230-244 (2017).
  27. Masuyama, N., Mori, H., Yachie, N. DNA barcodes evolve for high-resolution cell lineage tracing. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 63-71 (2019).
  28. Legue, E., Joyner, A. L. Chapter Ten-Genetic Fate Mapping Using Site-Specific Recombinases. Methods in Enzymology. 477, 153-181 (2010).
  29. Postiglione, M. P., Hippenmeyer, S. Monitoring neurogenesis in the cerebral cortex: an update. Future Neurology. 9 (3), 323-340 (2014).
  30. Espinosa-Medina, I., Garcia-Marques, J., Cepko, C., Lee, T. High-throughput dense reconstruction of cell lineages. Open Biology. 9 (12), 190229 (2019).
  31. Hwang, B., et al. Lineage tracing using a Cas9-deaminase barcoding system targeting endogenous L1 elements. Nature Communications. 10 (1), 1234 (2019).
  32. Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
  33. García-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnár, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. 141 (7), 1589-1598 (2014).
  34. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  35. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  36. Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  37. Amitai-Lange, A., et al. A method for lineage tracing of corneal cells using multi-color fluorescent reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
  38. Vasistha, N. A., et al. Cortical and Clonal Contribution of Tbr2 Expressing Progenitors in the Developing Mouse Brain. Cerebral Cortex. 25 (10), 3290-3302 (2015).
  39. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  40. Siddiqi, F., et al. Fate mapping by piggyBac transposase reveals that neocortical GLAST+ progenitors generate more astrocytes than Nestin+ progenitors in rat neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
  41. Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  42. García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
  43. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  44. Kim, G. B., et al. Rapid Generation of Somatic Mouse Mosaics with Locus-Specific, Stably Integrated Transgenic Elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
  45. Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658 (2018).
  46. Hippenmeyer, S., et al. Genetic Mosaic Dissection of Lis1 and Ndel1 in Neuronal Migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  47. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  48. Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'homme et des vertébrés. , Maloine. Paris, France. (1911).
  49. Cowan, W. M. The emergence of modern neuroanatomy and developmental neurobiology. Neuron. 20 (3), 413-426 (1998).
  50. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  51. Hippenmeyer, S., Johnson, R. L., Luo, L. Mosaic analysis with double markers reveals cell-type-specific paternal growth dominance. Cell Reports. 3 (3), 960-967 (2013).
  52. Riccio, P., Cebrian, C., Zong, H., Hippenmeyer, S., Costantini, F. Ret and Etv4 promote directed movements of progenitor cells during renal branching morphogenesis. PLoS Biology. 14 (2), e1002382 (2016).
  53. Bonaguidi, M. A., et al. In vivo clonal analysis reveals self-renewing and multipotent adult neural stem cell characteristics. Cell. 145 (7), 1142-1155 (2011).
  54. Mayer, C., et al. Clonally Related Forebrain Interneurons Disperse Broadly across Both Functional Areas and Structural Boundaries. Neuron. 87 (5), 989-998 (2015).
  55. Muzumdar, M. D., et al. Clonal dynamics following p53 loss of heterozygosity in Kras-driven cancers. Nature Communications. 7, 12685 (2016).
  56. Shi, W., et al. Ontogenetic establishment of order-specific nuclear organization in the mammalian thalamus. Nature Neuroscience. 20, 516 (2017).
  57. Wong, S. Z. H., et al. In vivo clonal analysis reveals spatiotemporal regulation of thalamic nucleogenesis. PLoS Biology. 16 (4), e2005211 (2018).
  58. Xu, H. T., et al. Distinct Lineage-Dependent Structural and Functional Organization of the Hippocampus. Cell. 157 (7), 1552-1564 (2014).
  59. Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All β Cells Contribute Equally to Islet Growth and Maintenance. PLoS Biology. 5 (7), e163 (2007).
  60. Ortiz-Alvarez, G., et al. Adult neural stem cells and multiciliated ependymal cells share a common lineage regulated by the geminin family members. Neuron. 102 (1), 159-172 (2019).
  61. Kaplan, E. S., Ramos-Laguna, K. A., Mihalas, A. B., Daza, R. A. M., Hevner, R. F. Neocortical Sox9+ radial glia generate glutamatergic neurons for all layers, but lack discernible evidence of early laminar fate restriction. Neural Development. 12 (1), 14 (2017).
  62. Lv, X., et al. TBR2 coordinates neurogenesis expansion and precise microcircuit organization via Protocadherin 19 in the mammalian cortex. Nature Communications. 10 (1), 3946 (2019).
  63. Mihalas, A. B., Hevner, R. F. Clonal analysis reveals laminar fate multipotency and daughter cell apoptosis of mouse cortical intermediate progenitors. Development. 145 (17), dev164335 (2018).
  64. Picco, N., et al. A mathematical insight into cell labelling experiments for clonal analysis. Journal of Anatomy. 235 (3), 687-696 (2019).
  65. Johnson, C. A., Ghashghaei, H. T. Sp2 regulates late neurogenic but not early expansive divisions of neural stem cells underlying population growth in the mouse cortex. Development. , (2020).
  66. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing Neurogenesis and Differentiation: Insights from Quantitative Clonal Analyses of Cerebellar Granule Cells. The Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301 (2008).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  69. Liu, Y., et al. Tamoxifen-independent recombination in the RIP-CreER mouse. PLoS One. 5 (10), e13533 (2010).
  70. Klingler, E., Jabaudon, D. Do progenitors play dice? eLife. 9, e54042 (2020).
  71. Hippenmeyer, S. Dissection of gene function at clonal level using mosaic analysis with double markers. Frontiers in Biology. 8 (6), 557-568 (2013).
  72. Rulands, S., Simons, B. D. Tracing cellular dynamics in tissue development, maintenance and disease. Current Opinion in Cell Biology. 43, 38-45 (2016).
  73. Laukoter, S., et al. Imprinted Cdkn1c genomic locus cell-autonomously promotes cell survival in cerebral cortex development. Nature Communications. 11 (1), 195 (2020).
  74. Daigle, T. L., et al. A Suite of Transgenic Driver and Reporter Mouse Lines with Enhanced Brain-Cell-Type Targeting and Functionality. Cell. 174 (2), 465-480 (2018).
  75. He, M., et al. Strategies and Tools for Combinatorial Targeting of GABAergic Neurons in Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 91 (6), 1228-1243 (2016).
  76. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  77. Plummer, N. W., et al. Expanding the power of recombinase-based labeling to uncover cellular diversity. Development. 142 (24), 4385 (2015).
  78. Imayoshi, I., Ohtsuka, T., Metzger, D., Chambon, P., Kageyama, R. Temporal regulation of Cre recombinase activity in neural stem cells. Genesis. 44 (5), 233-238 (2006).
  79. Sasaki, S., et al. Complete loss of Ndel1 results in neuronal migration defects and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7812-7827 (2005).
  80. Acampora, D., et al. Epilepsy and brain abnormalities in mice lacking the Otx1 gene. Nature Genetics. 14 (2), 218-222 (1996).
  81. Soeda, T., et al. Sox9-expressing precursors are the cellular origin of the cruciate ligament of the knee joint and the limb tendons. Genesis. 48 (11), 635-644 (2010).
  82. Klezovitch, O., Fernandez, T. E., Tapscott, S. J., Vasioukhin, V. Loss of cell polarity causes severe brain dysplasia in Lgl1 knockout mice. Genes & Development. 18 (5), 559-571 (2004).
  83. Pimeisl, I. M., et al. Generation and characterization of a tamoxifen-inducible EomesCreER mouse line. Genesis. 51 (10), 725-733 (2013).
  84. Nakagawa, N., et al. Memo1-Mediated Tiling of Radial Glial Cells Facilitates Cerebral Cortical Development. Neuron. 103 (5), 836-852 (2019).
  85. Nowotschin, S., et al. The T-box transcription factor Eomesodermin is essential for AVE induction in the mouse embryo. Genes & Development. 27 (9), 997-1002 (2013).
  86. Balordi, F., Fishell, G. Mosaic removal of hedgehog signaling in the adult SVZ reveals that the residual wild-type stem cells have a limited capacity for self-renewal. Journal of Neuroscience. 27 (52), 14248-14259 (2007).
  87. Liang, H., et al. Neural development is dependent on the function of specificity protein 2 in cell cycle progression. Development. 140 (3), 552-561 (2013).
  88. Guo, C., Yang, W., Lobe, C. G. A Cre recombinase transgene with mosaic, widespread tamoxifen-inducible action. Genesis. 32 (1), 8-18 (2002).
  89. Ahn, S., Joyner, A. L. In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog. Nature. 437 (7060), 894-897 (2005).
  90. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136 (2), 295-305 (2009).
  91. Koundakjian, E. J., Appler, J. L., Goodrich, L. V. Auditory neurons make stereotyped wiring decisions before maturation of their targets. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14078-14088 (2007).
  92. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic β-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  93. Sohal, D. S., et al. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circulation Research. 89 (1), 20-25 (2001).
  94. Ventura, A., et al. Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature. 445 (7128), 661-665 (2007).
  95. Johnson, L., et al. Somatic activation of the K-ras oncogene causes early onset lung cancer in mice. Nature. 410 (6832), 1111-1116 (2001).
  96. Tasic, B., et al. Extensions of MADM (mosaic analysis with double markers) in mice. PLoS One. 7 (3), e33332 (2012).
  97. Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129 (22), 5301-5312 (2002).
  98. Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
  99. Schuchardt, A., D'Agati, V., Larsson-Blomberg, L., Costantini, F., Pachnis, V. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret. Nature. 367 (6461), 380-383 (1994).
  100. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 877-892 (2002).
  101. Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. eLife. 4, e10036 (2015).
  102. Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454 (7200), 104-108 (2008).
  103. Lasrado, R., et al. Lineage-dependent spatial and functional organization of the mammalian enteric nervous system. Science. 356 (6339), 722-726 (2017).
  104. Matsuoka, T., et al. Neural crest origins of the neck and shoulder. Nature. 436 (7049), 347-355 (2005).

Tags

जीव विज्ञान अंक 159 डबल मार्कर (एमएडीएम) क्लोनल विश्लेषण वंश विश्लेषण स्टेम सेल सेरेब्रल कॉर्टेक्स रेडियल ग्लिया प्रोजेनिटर (आरजीपी) न्यूरोजेनेसिस न्यूरोसाइंस न्यूरोडेवलपमेंट के साथ मोज़ेक विश्लेषण
डबल मार्कर (एमएडीएम) के साथ मोज़ेक विश्लेषण का उपयोग करके सेरेब्रल कॉर्टेक्स विकसित करने में वंश ट्रेसिंग और क्लोनल विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beattie, R., Streicher, C., Amberg,… More

Beattie, R., Streicher, C., Amberg, N., Cheung, G., Contreras, X., Hansen, A. H., Hippenmeyer, S. Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM). J. Vis. Exp. (159), e61147, doi:10.3791/61147 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter