Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lineage sporing og klonal analyse i å utvikle Hjernebarken ved hjelp av Mosaikk analyse med doble markører (MADM)

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61147
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Science and Technology Austria

Summary

En protokoll for å utføre avstamning sporing og funksjonell genetisk analyse av kandidat gener på en enkelt celle nivå ved hjelp av mosaikk analyse med doble markører (MADM) presenteres. MADM klonal analyse gir et kvantitativt rammeverk for å måle den proliferative atferd, cellulær utgang, og avstamning forholdet mellom individuelle forfedre og deres datter celler.

Abstract

Fra et begrenset utvalg av forfedre danner den pattedyriske hjernebarken svært organiserte funksjonelle nevrale kretser. Imidlertid er de underliggende cellulære og molekylære mekanismene som regulerer avstamningsoverganger av nevrale stamceller (NSCer) og eventuell produksjon av nevroner og glia i det utviklende nevroepithelium fortsatt uklart. Metoder for å spore NSC divisjonsmønstre og kartlegge avstamningen av klonalt relaterte celler har avansert dramatisk. Imidlertid lider mange moderne avstamning sporingsteknikker av mangel på cellulær oppløsning av avkom celle skjebne, noe som er viktig for å tyde stamfar celle divisjon mønstre. Presentert er en protokoll ved hjelp av mosaikkanalyse med doble markører (MADM) for å utføre in vivo klonalanalyse. MADM manipulerer samtidig individuelle stamceller og visualiserer presise divisjonsmønstre og avstamningsprogresjon ved enestående enkeltcelleoppløsning. MADM-baserte interchromosomale rekombinasjonshendelser under G2-X-fasen av mitose, sammen med tidsmessig udugelig CreERT2,gir nøyaktig informasjon om fødselsdatoene til kloner og deres divisjonsmønstre. Dermed gir MADM-avstamning sporing enestående kvalitative og kvantitative optiske avlesninger av spredningsmodusen til stamcellestamitorer på enkeltcellenivå. MADM åpner også for undersøkelse av mekanismene og funksjonelle kravene til kandidatgener i NSC-avstamningprogresjon. Denne metoden er unik ved at komparativ analyse av kontroll og muterte subkloner kan utføres i samme vevsmiljø in vivo. Her er protokollen beskrevet i detalj, og eksperimentelle paradigmer for å ansette MADM for klonal analyse og avstamning sporing i den utviklende hjernebarken er demonstrert. Viktigere, denne protokollen kan tilpasses til å utføre MADM klonal analyse i noen murine stamcelle nisje, så lenge CreERT2 driveren er til stede.

Introduction

Hjernebarken er en svært organisert struktur bestående av seks forskjellige lag. Cortex inneholder et variert utvalg av celletyper, inkludert nevroner og glia, som samhandler for å danne funksjonelle nevrale kretser. De fleste, om ikke alle, kortikale eksitatoriske projeksjon nevroner og glia er avledet fra et vanlig utvalg av nevrale stamceller (NSCs) kjent som radial glial stamfar (RGPs)1,2,3. RGPs selv er avledet fra nevroepitelstamceller (NESCs) som komponerer det tidlige embryonale nevroepithelium. Ved embryonal dag 9 (E9) hos mus begynner NESCs å gå over til RGPs4. RGP avstamning progresjon krever presis temporal og romlig regulering, og når denne prosessen er hindret, alvorlige nevrologiske lidelser som megalencephaly, microcephaly, lissencephaly, eller funksjonsnedsettelser som schizofreni og autisme kan resultere5,6. På E10 gjennomgår de fleste RGPs symmetriske proliferative divisjoner, noe som resulterer i en utvidelse av nevrale stamcellebasseng4,7. RGPs begynner til slutt å dele asymmetrisk, og produserer kortikale projeksjonsnevroner på en tidsmessig definert måte. Gjennom påfølgende bølger av nevrogenese migrerer nyfødte nevroner inn i den kortikale platen som danner kortikale laminale med tidlige fødte nevroner som opptar dype lag og sene fødte nevroner som bor i de overfladiske lagene8,9,10. Fordi klonalt relaterte pyramidale nevroner migrerer radialt inn i cortex med svært liten tangential dispersjon, datterceller har en tendens til å danne en kolonne eller kjegleformet struktur referert til som en nevronal radial enhet4,11,12,13. Ved E17 er embryonal nevrogen ekspansjon komplett hos mus14. RGPs kan også produsere ependymale celler og noen klasser av glia, inkludert astrocytter og oligodendrocytes1,15,16,17,18,19. Potensialet for RGPs å gi opphav til både nevroner og astrocytter synes å være konsistent på tvers av alle kortikale regioner18,med ca 1/6 av nevrogene RGPs også produsere glia11.

For tiden er de genetiske og epigenetiske faktorene som regulerer temporal progresjon av en stamcelle langs slektslinjen, for det meste ukjent. Temporale mønstre av genuttrykk kan ha betydelig innvirkning på avstamning beslutninger i RGPs20,21,22,23,24. Hvordan dette tett sammensveiset forholdet mellom temporal og romlig mønster fører til molekylært mangfold av voksne nevronale typer på tvers av kortikale områder er ikke kjent. På samme måte er hvordan det enkelte stamcellepotensialet og dens cellulære utgang modulert på celle- og molekylært nivå et viktig ubesvart spørsmål. Fremtidige studier vil forhåpentligvis ta opp noen av disse spørsmålene, og til slutt utvide vår forståelse av funksjonell kortikale kretsdannelse.

Utviklingsnevrobiologi søker å forstå avstamningsforholdet som celler i hjernen deler med hverandre. I utgangspunktet var svært få forskningsverktøy tilgjengelige for dette, og mange tidlige studier var avhengige av visuelle observasjoner av divisjonsmønstre i gjennomsiktige organismer som Caenorhabditis elegans25. De siste tiårene har sett en dramatisk økning i antall og raffinement av teknikker tilgjengelig13,26,27,28,29. Fremveksten av CRISPR-Cas9 genom redigeringssystemet gjør det mulig for syntetisk rekonstruksjon av celle avstamning relasjoner ved å innføre utviklende DNA strekkoder27,,30. To nylige eksempler på barcoding strategier inkluderer bruk av homing guide RNA som leder CRISPR-Cas9 til spesifikke DNA strekkode loci eller en cytidin deaminase smeltet sammen med nickase Cas9 å målrette endogene interspersed gjenta regioner31,32. Disse teknologiene gir svært multipleksede tilnærminger gjennom innføring av strekkoder som gradvis og stabilt akkumulerer unike mutasjoner over tid. Genomredigeringsmetoder er svært verdifulle fordi de tillater tilbakevirkende analyse av forholdet mellom to celler basert på den delte arven til disse strekkodene. Men for å lese strekkodene i individuelle celler, må vevet vanligvis forstyrres, og derfor går informasjon om posisjon, morfologi og absolutte celletall fra en individuell stamfar tapt.

Kombinatoriske merking paradigmer bevare romlig informasjon og i prinsippet også tillate skillet mellom nært lokalisert eller overlappende kloner33,34. For at en linjesporingsmetode skal være informativ, må den merke individuelle forfedre og deres stambånd på en sparsom og uutslettelig måte. Spesielt Brainbow35 og Confetti36,37 tilnærminger bruker stokastisk flerfarget Cre rekombininase-baserte journalister som uttrykker en kombinasjon av fluorescerende proteiner fra en enkelt locus. Det omfattende antallet samtidige fargekombinasjoner som kan oppnås in vivo gjør dette til et kraftig verktøy når du sporer kortikale RGP-kloner og astrocytter34. Transposon-baserte systemer som gir stabil genomisk integrasjon av transgenes koding fluorescerende reportere og tillater avstamning sporing av kortikale forfedre har også blitt utviklet33,,38,39,40,41. Transposonbaserte systemer har en ekstra fordel ved at reporteren konstruerer stabilt integrere seg i genomet, og dermed pålitelig etikett linealt relaterte datterceller. For å spore astrocytt linjer spesielt, en rekke metoder er utviklet som involverer elektroporering av piggyBac transposaser inkludert Star Track, som gjør bruk av en kombinasjon av konstruksjoner koding ulike fluorescerende proteiner40,42. En annen tilnærming, MAGIC markører, introduserer Brainbow vektorer som transposable transgenes. Dette har blitt brukt til å spore embryonale nevrale og astrocytt stamfar34,43. Nylig ble mosaikkanalyse ved dobbel rekombininasemeditert kassettutveksling (MADR) funnet å stikke mutantceller som uttrykker transgene elementer fra nøyaktig definerte kromosomale loci44. Disse kraftige in vivo kombinatoriske merking teknikker har gitt mange innsikt i avstamning dynamikken i stamceller. Disse analysene utføres imidlertid på fast vev, noe som gir et øyeblikksbilde av individuelle kloner på et definert utviklingsstadium. For å observere endringer i avstamningdynamikken til enkeltkloner over tid, må kroniske in vivo-bildemetoder som ligner på de som utføres i den voksne dentate gyrus, brukes45.

Mosaikkanalyse med doble markører (MADM) er en kraftig dual color labeling metode som gjør det mulig for in vivo avstamning sporing av individuelle stamceller i mus46,47. To komponenter er nødvendige for at MADM-merkingshendelser skal forekomme: For det første må MADM-kassetter målrettes mot identiske loci på homologkromosomer. Kassetter består av to kimeriske fluorescerende reporter gener, eGFP (grønn, [G]) og tandem dimer Tomato (rød, tdT [T]). GT-kassetten inneholder N-terminus av eGFP og C-terminus av tdT, atskilt med en intron som inneholder et loxP-område. GT TG-kassetten er konstruert omvendt, med N-terminus av tdT og C-terminus av eGFP. For det andre er uttrykket cre rekombinase i samme celle som inneholder de målrettede MADM-kassettene avgjørende. I fravær av Creuttrykker ikke de kimeriske kassettene funksjonelle eGFP eller tdT fordi deres kodesekvenser er forstyrret. LoxP-nettstedene fungerer som mål for Cre-mediert interchromosomal rekombinasjon, noe som resulterer i rekonstituering av begge uttrykkskassettene samtidig. Hvis rekombinasjon oppstår i G2-fasen av cellesyklusen etterfulgt av X-segregering (G2-X), vil de to dattercellene hver uttrykke ett av de to fluorescerende proteinene. Temporal regulering av CreERT2 aktivitet ved hjelp av tamoxifen (TM) gir nøyaktig informasjon om fødselsdato madm kloner og divisjon mønstre av deres avkom (Figur 1A)29,46,47.

MADM kan potensielt systematisk merke individuelle kloner med høy enkeltcelleoppløsning i musehjernen som ligner på tradisjonelle, men uspesifikke og arbeidskrevende metoder som Golgi farging48 eller fargestofffylling49. Fordi bare arrangøren kjører CreERT2 bestemmer celle type spesifisitet av klonal MADM merking, MADM kan i prinsippet brukes for klonal avstamning sporing i alle murine organ og vev47,,50,51,52. Faktisk har studier allerede brukt MADM til å avsløre avstamning relasjoner i kloner avledet fra ulike vev47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. MADM eksperimentelle paradigmer har blitt brukt til å studere avstamning i kortikale projeksjon nevroner, glia, og postnatal stamceller i den utviklende neocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM har også blitt brukt til å studere celleavledning i den voksne bulke gyrus, thalamus, cerebellar granulaceller, og interneuroner på klonalnivå (se tabell 1 for en komplett liste)47,53,54,56,57,66.

Et unikt trekk ved MADM er evnen til å genetisk knytte mutasjoner distal til en MADM kassett, og dermed skape en genetisk mosaikk (Figur 1B og figur 2). Dette resulterer i vill type datterceller merket med en fluorescerende markør (tdT i figur 1B)og homozygoterte mutant søsken med den andre (eGFP i figur 1B) i et umerket heterozygot miljø. MADM er unik ved at komparativ analyse av kontroll og muterte subkloner kan utføres i samme vevsmiljø in vivo. Opprinnelig ble MADM-kassetter rettet inn i Rosa26-locus 47,men MADM-analyse av genfunksjonen var begrenset til gener som var distale til locus. For å overvinne (i det minste delvis) denne begrensningen og utvide mulighetene for MADM-baserte genanalyser, ble MADM-kassetter banket inn nær centromeres av Chr. 751,Chr. 1146, og Chr. 1251. Målretting av alle 19 mus autosomer med MADM kassetter pågår og vil tillate nesten alle genet å bli studert i fremtiden, og gir en enestående plattform for studiet av utviklingsmessige avstamning relasjoner i kombinasjon med funksjonell genetisk analyse.

Protocol

Museprotokoller ble gjennomgått av institusjonell preklinisk kjerneanlegg (PCF) og intern etisk komité ved IST Austria. All avl og eksperimentering ble utført under en lisens godkjent av det østerrikske føderale vitenskaps- og forskningsdepartementet i samsvar med de østerrikske og EU-dyrelovene.

1. Avl av eksperimentelle mus for MADM klonal analyse

  1. Sette opp tidsbetimede eksperimentelle MADM-parringer (>P56; CD-1) sent på ettermiddagen (17:00) og se etter vaginal plugger den foregående morgenen (08:00). Morgenen pluggen er til stede teller som dag 0,5. Se figur 2 for en oversikt over det eksperimentelle musepareringsoppsettet. Sørg for at tidspunkter for TM-induksjon av CreERT2-aktivitet og analyse er hensiktsmessige for å løse eksperimentelle spørsmål.
    MERK: Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se figur 3 og representative resultater nedenfor.
  2. For postnatal prøvetaking, sett opp avl for å generere fostermødre parallelt.
    MERK: Disse bør startes opptil 1−2 dager før oppstart av eksperimentelle avl.

2. TM induksjon hos MADM mus

  1. Forbered en 20 mg/ml TM arbeidsløsning ved å oppløse den i maisolje i et 15 ml eller 50 ml konisk sentrifugerør og plassere den på en gyngeplattform for ~4 timer ved romtemperatur (RT), noe som sikrer at TM er fullstendig oppløst. Oppbevar arbeidsløsning ved 4 °C dekket med aluminiumsfolie og bruk innen 2 uker.
  2. For å indusere MADM-rekombinasjonshendelser, lever en enkelt injeksjon av TM intraperitonealt (IP) ved hjelp av en 1 ml tuberkulinsprøyte og en 25 G kanyle i en tidsbestemt gravid demning. Avhengig av korokal nevrogenese, injiser TM mellom E10–E15 i en dose på 1–2 mg/gravid demning. For tidlige tidspunkter (dvs. E10) bruker maksimalt 1 mg/gravid demning (25 mg/kg) for å forhindre komplikasjoner under graviditet11. For tidspunkter mellom E11-E15 bruk 2 mg/gravid demning (50 mg/kg)7.
    MERK: Alternativt kan TM administreres med en oral gavage for sen graviditet.
  3. For MADM klonanalyse til postnatale tidspunkter, restituer levende embryoer på E18−E19 gjennom keisersnitt, og deretter oppdra valper med en fostermor.
    MERK: Avhengig av helsestatusen til den gravide kvinnen, kan det ikke være nødvendig å utføre en keisersnitt, men å oppdra valper med fostermor er fortsatt nødvendig fordi den opprinnelige TM-behandlede moren kan ha problemer med å ammende.
  4. For å gjenopprette levende embryoer ved keisersnitt eller for å hente embryonale tidspunkter for analyse, ofre den gravide demningen ved cervical dislokasjon.
  5. Plasser dyret i liggende stilling og desinfiser pels med 70% etanol. Lag et lite snitt i huden i underlivet over livmoren ved hjelp av kirurgiske tang og saks. Lag et andre snitt gjennom musklene og bukmuskelveggen for å avsløre bukhinnen.
  6. Fjern livmoren ved å skille fra det omkringliggende vevet med saks. Overfør intakt livmor på en hanske fylt med varmt vann for å øke embryooverlevelsen til hver er fjernet fra amnionen individuelt.
  7. Bruk finspiss saks og fingre for å nøye åpne livmorveggene for å frigjøre embryoer. Ikke kutt navlestrengene for nær kroppen for å forhindre omfattende blodtap. Hvis embryoer skal brukes til analyse, fortsett til trinn 3.9. Hvis valper skal fostres, fortsett til trinn 2.8.
  8. Hvis det er nødvendig å fostre, rengjør du valpene før du overfører dem til fostermoren. Mens du rengjør valpene, trykker du forsiktig på brystet fra tid til annen for å starte pusten. Plasser tilbake på en annen hanske fylt med varmt vann for å forbedre overlevelsesraten.
    MERK: Det er viktig å forsiktig fjerne eventuell gjenværende amnion og/eller morkake med et papirhåndkle.
  9. Før du overfører valper til fostermoren, fjern fostermoren fra buret, fjern de opprinnelige valpene og erstatt med de eksperimentelle valpene. Returner fostermoren til buret sitt.
    MERK: Se diskusjon for flere forslag for å forbedre godkjenningsfrekvensen for å fremme godkjenning.
  10. Hvis genotyping er nødvendig, samle tå eller hale biopsier mellom P6-P8.
    MERK: Utfør dette trinnet bare hvis dyreforsøkslisenser godkjenner denne praksisen.

3. Vev forberedelse for MADM kloner i hjernen

MERK: For eksperimenter som inkluderer postnatal vev (≥P4), fortsett til trinn 3.1. For embryonale tidspunkter og tidlig postnatal (P0-P3) fortsetter du til trinn 3.9.

  1. Bedøv det eksperimentelle MADM-dyret med en IP-injeksjon av en ketamin/xylazine/acepromazineoppløsning (henholdsvis 65 mg, 13 mg og 2 mg/kg kroppsvekt) og bekreft at musen ikke reagerer ved å klemme bakpoten.
    MERK: Både mannlige og kvinnelige MADM-mus (CD-1-bakgrunn) brukes til analyse. Hvis genotyping er nødvendig, samle ørebiopsier på dette tidspunktet.
  2. Plasser bedøvet dyr i liggende stilling på perfusjon kirurgi skuffen og desinfisere pels med 70% etanol. For å begynne kirurgi, nøye gjøre et snitt med saks og kirurgiske tang gjennom det ytre laget av huden og deretter et andre snitt gjennom muskellaget. Løft spissen av brystbenet og kutt bindevev på sidene, og vær ekstra forsiktig for å unngå å kutte leveren. Thoraxhulen vil være synlig.
  3. Klipp membranen og løft for å avsløre hjertet. Trim forsiktig brystkassen og fest til det kirurgiske brettet for å eksponere hjertet. For valper, fjern brystkassen helt.
  4. Sett en nål med fosfatbufret saltvann (PBS) inn i nedre venstre ventrikkel (blekervev). Ved hjelp av små iris saks gjøre et snitt til den bakre enden av høyre atrium (mørk rød vev) for blodet å drenere.
  5. Utfør perfusjon med PBS etterfulgt umiddelbart av nylagde, iskalde 4% paraformaldehyd (PFA) tilberedt i PBS. For valper (P4-P10) bruk sprøyter for å utføre perfusjon. Fyll en sprøyte med 10 ml PBS og en annen med 10 ml PFA på 10 ml. Sørg for at alle luftbobler i sprøytene er fjernet. For eldre dyr, bruk en peristaltisk pumpe.
  6. Begynn å perfusere med PBS (10 ml ved 2−4 ml/min i valper; 20 ml ved 4–6 ml/min for voksne som bruker en peristaltisk pumpe). Leveren blir klar og blek gul hvis nålen er riktig plassert.
  7. Når du er ferdig, fjern nålen fra valper og sett nålen som inneholder PFA i samme hull. For voksne må du stoppe den peristaltiske pumpen før du bytter PBS-løsningen med iskald PFA, og pass på å unngå bobler i opptaksslangen. Fortsett å perfusere med PFA (10 ml ved 2–4 ml/min i valper; 30 ml ved 4–6 ml/min for voksne som bruker en peristaltisk pumpe).
  8. Når perfusjon er fullført, halshugge musen og fjerne hjernen gjennom forsiktig disseksjon. Overfør hjernen til 4% PFA. Bruk minst 5x hjernevolumene (dvs. ~5−10 ml PFA i et konisk sentrifugerør på 15 ml) og inkuber over natten ved 4 °C for postperfusjonsfiksering for å sikre fullstendig fiksering av vev. Fortsett til trinn 3.10.
  9. For embryonalt vev og tidlig postnatal vev (dvs. P0-P3), etter å ha utført en keisersnitt, halshugge embryoene med saks. Hvis genotyping er nødvendig, samle halen av embryoet på dette punktet. Dissekere umiddelbart ut hjernen og overføre til en 12 brønnplate som inneholder 2−3 ml PFA/brønn. Inkuber over natten ved 4 °C for etterfestning.
  10. Neste morgen bytte PFA med 10 ml (voksen) eller 2-3 ml (embryo) av PBS og gjenta vask 3x i 15 min ved RT. Overfør vev til 30% sukroseløsning i fosfatbuffer (PB) og lagre ved 4 °C på en gyngeplattform til vevet synker i løsningen.
  11. Bygg hjernen i optimal klippetemperatur (OCT) forbindelse i en innebygging mold, ta vare å orientere hjernen for enten koronal eller sagittal snitting. Frys ved å plassere innebyggingsformen på tørris til OCT blir helt ugjennomsiktig (~10−15 min). Oppbevar vevet ved -80 °C inntil videre.

4. Utarbeidelse av MADM-vev for immunohistokjemi

  1. Fest vevsblokken til prøveskiven i kryostat ved å bruke en ring av OCT på disken og plassere blokken direkte inn i OCT når den begynner å fryse. Kontroller at blokken er riktig orientert for ønsket skjæreplan.
    MERK: Her er koronalseksjon for å undersøke kortikale MADM-kloner beskrevet i detalj.
  2. Sett blokktemperaturen i kryostat til -20 °C og bladtemperaturen til -21 °C.
  3. La vevsblokken justeres til kammertemperaturen ved å montere prøveskiven til prøveholderen og la den stå i kryostat i ~5 minutter før du begynner å snitte.
  4. Trim blokk i tykke seksjoner (45-60 μm) til vevsområdet av interesse er nådd.
  5. Når kanten av cortex er godt synlig, stopp snitting og lås bladet. Sørg for at bladet er skjermet før du trimmer blokken.
  6. Trim overflødig OCT rundt vevet med et blad, slik at ~ 1-2 mm oct på alle sider av hjernen.
  7. Deretter orienterer blokken slik at en av de laterale kantene av cortex er orientert nedover og den andre oppover (dvs. den mest rostrale kanten av cortex er spisst til høyre).
  8. Begynn snittingen med en tykkelse på 45 μm for voksne kloner og 30 μm for embryonale kloner. Utfør hver seksjon individuelt og bruk en liten børste for å holde området under kniven ren av rusk igjen mens du trimmer blokken.
    MERK: Hvis dette ikke er gjort og en seksjon faller, kan det være vanskelig å bestemme riktig rekkefølge på skivene.
  9. Hvis seksjonene begynner å krølle, trim kantene på blokken og/eller juster forsiktig glassantirulleplaten.
  10. For embryonal kloneanalyse monterer du seksjoner direkte til en frostet lysbilde. Tørk på en varmeplate ved 37 °C før du går direkte til trinn 5.6.
    MERK: Flere inndelinger kan legges til ett lysbilde, men sørg for at den sekvensielle rekkefølgen opprettholdes.
  11. For å samle voksne kloner, lag 24 brønnplater som inneholder 1 ml PBS/brønn (vanligvis 5-6 plater per hjerne). Fra første brønn, med kalde tang samle individuelle serieseksjoner i PBS i rekkefølge av seksjonering.
    MERK: Den flytende seksjonsmetoden er vedtatt for voksent vev for å sikre at ingen seksjoner går glipp av og at monterte seksjoner ikke inneholder rynker.
  12. Stopp snittingen når slutten av neocortex er nådd.
  13. For voksne kloner, fortsett å montere flytende seksjoner.
    MERK: Seksjoner kan oppbevares i PBS ved 4 °C i opptil 24 timer.

5. Montering av voksent vev for avbildning

MERK: Følgende verktøy er nødvendig: liten pensel, Petriskål, PBS med 0,5% Tween (PBS-T), vedheft lysbilder (Tabell over materialer), monteringsmedium ( Tabell overmaterialer),coverslips, og tang.

  1. Fyll en petriskål med PBS-T.
    MERK: Vaskemiddel brukes til å hjelpe til med monteringsprosessen. Hvis farging for ytterligere antigener som er følsomme for vaskemidler (dvs. glykoproteiner) er nødvendig, er det best å hoppe over tilsetning av Tween.
  2. Plasser et vedheftskli i PBS-T slik at den nesten er dekket opp til etiketten.
  3. Overfør den første delen til PBS-T.
  4. Bruk en liten pensel til å manøvrere delen på lysbildet og ordne den for å bevare rekkefølgen på skjæringen. Fortsett på samme måte med alle videre seksjoner.
  5. Når alle delene er på plass, plasserer du lysbildet (~12−16 seksjoner/lysbilde) i et mørkt lysbildekammer. Løft lokket litt for å la seksjonene tørke helt (ca. 10–20 min), slik at de holder seg til etterfølgende trinn.
  6. Hvis du utfører immunohistokjemi for ytterligere antigener, fortsett direkte til avsnitt 6 eller 7.
    MERK: For embryonale tidspunkter er det nødvendig å utføre immunstådende trinn i minst GFP og tdT (avsnitt 6). For voksne kloner er dette bare nødvendig hvis farging for ekstra antigener parallelt (pkt. 6 og 7).
  7. Rehydrere og vaske seksjoner 1x med 1x PBS i 5 min for å fjerne gjenværende PBS-T. Påfør ~1 ml 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fortynnet i 1x PBS (1 μg/ml) til lysbildet, slik at alle seksjoner er dekket og inkubere i 15 min.
  8. Fjern FORSIKTIG DAPI og vask 1x med 1x PBS i 5 min. Fjern overflødig PBS og tørk i ~ 1−2 min før montering i 110 μL monteringsmedium. Forsegle med en 24 x 60 mm dekkslips og la den tørke i minst 3 timer før bildebehandling.

6. Immunstå bare for GFP og tdT

MERK: Denne delen er nødvendig for embryonale kloner.

  1. Plasser lysbilder horisontalt i et fuktet skyve inkubasjonskammer. Merk lysbildegrenser med en voksmarkør for å minimere mengden buffer som kreves.
  2. Rehydrere seksjoner med 1x PBS. For å forbedre fargingskvaliteten, arbeid med nydelt vev.
  3. Tilsett 250 –400 μL blokkeringsbuffer (0,5 % Triton X-100, 2–3 % normal eselserum i 1x PBS) per lysbilde, noe som sikrer at alle seksjoner er dekket. Inkuber i 1 t.
    MERK: Konsentrasjonen av vaskemiddel (Triton X-100 eller Tween-20) vil variere avhengig av de ekstra primære antistoffene som brukes fordi noen antigener er mer følsomme for vaskemidler enn andre.
  4. Fjern blokkeringsbufferen og legg til primære antistoffer i blokkeringsbufferen i lysbildet (300−400 μL/slide).
    MERK: Et eksempel på en standard primær antistoffreaksjon for anti-GFP/anti-tdT (MADM) kan bruke kyllinganti-GFP (1:500) og kaninanti-RFP (1:500).
  5. Inkuber med primære antistoffer over natten ved 4 °C.
    MERK: Lysbildene må inkuberes perfekt horisontalt med buffer som dekker alle seksjoner. Ellers kan ujevn eller dårlig flekker føre til.
  6. Bekreft neste morgen at blokkeringsbufferen med primære antistoffer fortsatt dekker alle seksjoner på lysbildet. Hvis ikke, gjentar du inkubasjonstrinnet i 3-4 timer ved RT.
  7. Fjern primære antistoffer og vask 4x med 1x PBS i 10 min ved RT.
  8. Legg til sekundære antistoffer fortynnet i blokkeringsbufferen til lysbildet (300-400 μL/slide): Alexa Fluor 488 anti-kylling IgG (1:500) og Cy3 anti-kanin IgG (1:500).
  9. Inkuber ved RT i 2 timer. Hold lysbildene dekket av lys for å forhindre bleking av fluorofeser.
  10. Fjern sekundære antistoffer og vask 2x med 1x PBS i 10 min.
  11. Inkuber med DAPI fortynnet i PBS (1:5,000) i 15 min.
  12. Vask seksjoner 1x med 1x PBS i 10 min.
  13. Fjern overflødig PBS og tørk i ~ 1-2 min før innebygging i 110 μL monteringsmedium.
  14. Forsegle med 24 x 60 mm deksler og la den tørke i minst 3 timer før bildebehandling. Bildet glir innen 1-2 uker etter at du har utført immunohistochemistry for å sikre optimalt signal.

7. Immunstå for GFP, tdT og ekstra antigener

  1. Utfør trinn 6.1−6.3.
  2. Fjern blokkeringsbufferen og legg til primære antistoffer i blokkeringsbufferen i lysbildet (300−400 μL/slide).
    MERK: Når farging for tre eller flere antigener (dvs. GFP, tdT og et protein av interesse) og antistoffet mot proteinet av interesse ble hevet i kanin, anbefales det å bruke anti-tdT (geit) primære antistoff ved en fortynning på 1:500. Et eksempel på en primær antistoffreaksjon for tre antigener med alternativ tdT-farging kan bruke kyllinganti-GFP (1:500), geit anti-tdT (1:500), og antistoff mot protein av interesse (dvs. kanin).
  3. Utfør trinn 6.5−6.7.
  4. Legg til en sekundær antistoffblanding fortynnet i blokkeringsbufferen til lysbildet (300−400 μL/slide): Alexa Fluor 488 anti-kylling IgG (1:500), Cy3 anti-geit IgG (1:500) og Alexa Fluor 647 anti-kanin IgG (1:500).
  5. Utfør trinn 6,9−6,14.

8. Confocal bilde oppkjøp og kvantifisering av MADM kloner

  1. Identifiser og dokumenter hjerneseksjoner som inneholder kloner og deres steder i cortex.
    MERK: Antall seksjoner en klonespenn vil variere avhengig av når klone ble indusert, CreERT2-driveren og analysetidspunktet. Dette trinnet kan utføres på enten et konfusisk mikroskop eller et epifluorescensmikroskop.
  2. Bruk et invertert konfusisk mikroskop, begynn med å velge og konfigurere de riktige laserlinjene og filtrene. For MADM-hjerner velger du henholdsvis DAPI, GFP og tdT (eksitasjon: henholdsvis 358 nm, 488 nm og 554 nm; topputslipp: henholdsvis 461 nm, 507 nm og 581 nm). Sørg for at pinhole er satt til 1 luftig enhet for optimal bildekvalitet.
  3. For konfusale spesifikke innstillinger, bilde kloner med en 20x mål og 1x zoom. For bilder som skal brukes i kvantifiseringer, kan du bruke en skannehastighetspikselverdi på 1,52–2,06 μs (verdier 7–8 i bildeoppkjøpsprogramvaren) uten snitt. Juster laserintensiteten og få innstillinger for hver kanal etter behov.
    MERK: Avhengig av ønsket bildekvalitet kan innstillingene for skannehastighet og snitt variere.
  4. Når klonen er tydelig identifisert, ordne bildefliser for å dekke alle relevante seksjoner i klone. Juster z-stakken slik at alle MADM-merkede celler i klone fanges med et intervall på 1,5 μm/z-stack-skive. Juster flislagt område slik at hele bredden av cortex fanges når du avbilder klone (dvs. fra pial overflate til corpus callosum).
  5. Bilde individuelle kloner som spenner over flere seksjoner fortløpende, slik at eventuelle seksjoner uten celler i en klone fortsatt er avbildet med det formål 3D rekonstruksjon og riktig tolkning av celle romlig informasjon.
  6. Analyser hver seksjon som inneholder celler av en MADM klone sekvensielt fra rostral til den kaudale enden av cortex. Skille individuelle nevroner og glia basert på deres morfologi og / eller markør farging. Registrer posisjonsinformasjon parallelt basert på respektive laggrenser definert av nukleær farging (DAPI).
    MERK: Se figur 4 for representative resultater for embryonal analyse og figur 5 for representative resultater for voksenanalyse.

9. Seriell 3D rekonstruksjon av kloner

MERK: 3D-rekonstruksjonen av individuelle kloner avbildet over seriell hjerneseksjoner er nyttig for visuell visning, samt analyse av 3D klonarkitekturer og kan utføres i henhold til følgende trinn.

  1. Stitch og sikring confocal flislagte bilder basert på oppkjøpparametere ved hjelp av bilde oppkjøp programvare. Åpne .czi-filen, og kjør deretter Sømmetoden under kategorien Behandling i ZEN-programvaren (Zeiss).
  2. Eksporter sydd bildestabler som individuelle z-plan i TIFF-format. Åpne sydd .czi-fil, og kjør deretter metoden Bildeeksport under behandling -fanen. For flerkanalsbilder eksporterer du som røde/grønne/blå bilder for etterfølgende bildebehandling.
  3. Gjenta trinn 9.1 og 9.2 for hver seriell hjernedel av en klone.
    MERK: For nøyaktig 3D-rekonstruksjon må alle hjerneseksjoner i en klone, inkludert de uten merkede celler, også behandles.
  4. Sammenkoble individuelle bilder i en enkelt stabel for å begynne fra den mest rostral til den mest caudal z-flyet ved hjelp av åpen kildekode bildebehandling programvare som ImageJ / Fiji67,68.
    MERK: Eventuelle tomme bilder på kantene av hver hjerneseksjon bør fjernes på dette tidspunktet.
  5. Korriger om nødvendig bildestakken fra trinn 9.4 for feiljustering ved hjelp av en ImageJ-plugin kalt "MultiStackReg" ved å følge trinn 9.5.1−9.5.5. Hvis bildejustering ikke er nødvendig, går du videre til trinn 9.6.
    MERK: Denne plugin utfører bildejustering av kanalen med høyeste kontrast (vanligvis DAPI) og bruker deretter den registrerte transformasjonen til de andre kanalene, og dermed tillater pålitelig bildejustering av flerkanalstabler. En hjelpeplugin kalt"TurboReg"må forhåndsinstalleres.
    1. I ImageJ, installere "MultiStackReg" og "TurboReg" plugins.
    2. Åpne bildestakken med klonebilder hentet fra trinn 9.4 som skal justeres. Del kanaler i DAPI (blå), GFP (grønn) og tdT (rød) i fargealternativet under Bilde-fanen.
    3. Kjør "MultiStackReg" plugin for å justere DAPI kanal av "Rigid Body" transformasjon og lagre transformasjonsfilen.
    4. Bruk den lagrede transformasjonsfilen på de to andre kanalene ved hjelp av "MultiStackReg".
    5. Slå sammen alle tre justerte kanaler og lagre justert stakk.
  6. For å orientere klone i ImageJ rotere stabel av klone bilder hentet fra trinn 9.4 (eller trinn 9.5.5 etter justering) i en vertikal retning med pial overflaten på toppen og corpus callosum nederst. Beskjær i xy flyet om nødvendig.
  7. For både kvalitativ presentasjon og kvantitativ analyse genererer du et maksimalt z-projeksjonsbilde (trinn 9.8) eller utfører 3D-gjengivelse (trinn 9.9) av klone.
  8. Åpne bildestakken fra trinn 9.6 i ImageJ, og velg Z-projeksjonsalternativ med projeksjonstype Maks intensitet. Dette vil generere et bilde av hele klone projiserte på samme plan.
  9. Åpne bildestakken fra trinn 9.6 i ImageJ, og velg 3D Project z-funksjon for å generere en 3D-visualisering av klone som kan roteres.
    MERK: Det er viktig i dette trinnet å legge inn riktig skiveintervall som tilsvarer tykkelsen på individuelle z-stabler under bildeanskaffelse. Interpoleringsverktøyet skal brukes til å fjerne mellomrom mellom skiver.

Representative Results

MADM resulterer i rekonstituering av funksjonelle grønne og røde fluorescerende proteiner med to datterceller som hver uttrykker ett av de to fluorescerende proteinene ved G2-X kromosomsegregeringshendelser (figur 1A). Fordi MADM-hendelser resulterer i permanent og tydelig merking av de to etterkommende ledningene, kan kvantifiserbar vurdering av grønne og røde dattercellesmerninger (subkloner) utføres. Variabler inkludert divisjonsmønster (f.eks. symmetrisk versus asymmetrisk) og potensial (f.eks. antall avkom) av den opprinnelige stamfar kan bestemmes.  Kvantifisering av hver fluorescerende merkede underklone er informativ når det med tilbakevirkende kraft avgjør om den opprinnelige stamcellen gjennomgår symmetriske proliferative divisjoner, eller asymmetriske, nevrogene divisjoner på tidspunktet for TM induksjon. Tidligere studier gruppert Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2 avledet ekscitatory projeksjon kloner i cortex i to brede klasser7,,11,46. Den første, kalt "symmetriske proliferative kloner", består i gjennomsnitt av et betydelig antall nevroner, med både grønne og røde subkloner som inneholder fire eller flere nevroner hver. Den andre gruppen, "asymmetriske kloner" definerer en klasse av kloner der "minoriteten" subklone inneholder færre enn tre nevroner og "flertall" subklone, fire eller flere11. Disse definisjonene er spesifikke for kortikale RGPs og må kanskje besøkes på nytt for andre hjerneregioner og vev. For begge klasser av kortikale kloner, vil avkom bli fordelt gjennom overfladiske og dype lag.

Ved design av MADM klonalstudier er det en rekke aspekter som må tas i betraktning. Tiden da MADM-hendelser induseres ved administrering av TM er et viktig hensyn (figur 3). For kortikale ekscitatory projeksjon neuron MADM kloner (dvs. ved hjelp av Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2) på E10, nesten alle RGPs var fortsatt gjennomgår symmetriske divisjoner11. Induksjon ved E10 med TM fanget derfor flere runder med proliferativ RGP-forsterkning og resulterte i kloner med høye nevrontall. Imidlertid var antall RGPs på E10 generelt lite og dermed TM administrasjon generert svært få MADM hendelser (noen ganger mindre enn en per hjerne). Flertallet av RGPs byttet fra symmetriske til asymmetriske nevrogene divisjoner rundt E12. For å målrette strengt asymmetriske nevrogene kloner, var det best å indusere på E12 eller senere (figur 3). Tiden mellom TM induksjon og observere MADM rekombinering hendelser i cortex tendens til å være mindre enn 24 h. IP injeksjoner var den foretrukne metoden for å administrere TM på embryonale stadier for denne metoden fordi det førte til større reproduserbarhet i klonal induksjon. Det er også viktig å holde TM-dosen til et minimum av to grunner. For det første, hvis MADM-rekombinasjonshastigheten øker, er sannsynligheten for å indusere flere, kanskje overlappende kloner høyere. For det andre, hvis for mye TM leveres, kan en økt forekomst av abort, embryo reabsorpsjon og mindre søppelstørrelser observeres. Abort i omtrent halvparten av alle gravide demninger ble observert da TM-injeksjoner ble levert på E10. Denne frekvensen gikk ned fra E11 og utover og avtok til ca. 1/3 av de gravide demningene ble avbrutt. For et sammendrag av TM-doser, induksjonstider og CreERT2-drivere som brukes i tidligere MADM-studier, se tabell 1. Reporter aktivitet i fravær av TM ble observert med noen TM-induserbare CreERT2 drivere69. Ektopisk uttrykk eller MADM rekombinasjon hendelser i fravær av TM ble ikke observert med Emx1-CreERT2 av Nestin-CreERT2 drivere. Dette kan delvis skyldes det faktum at TM-medierte kromosomale transkombinasjoner forekommer ved ca. 1:1,000 til 1:10,000 lavere frekvens enn cis-rekombinasjoner, noe som reduserer sannsynligheten for ektopisk MADM-merking.

En annen faktor å vurdere når du planlegger et MADM klonanalyseeksperiment er varigheten av studien. Varierer tiden mellom TM induksjon og når eksperimentet ble analysert (A) (tidsvindu) viser stamcelledynamikk over tid64. Korte embryonale tidsvinduer (dvs. TM/E11−A/E13; TM/E11−A/E16) fanget dynamikken i embryonisk nevrogenese (figur 4). Sammenligning av kloner fra to eller flere tidsvinduer gir kvantitativ innsikt i antall celler som produseres og hvordan nevronfordelingen varierer på ulike stadier av avstamningsprogresjon64. For å fange hele potensialet til individuelle kloner, er det nødvendig å utvide tidsvinduet analysert i postnatal eller voksen tidspunkter7,11,12. Eksempler på neokortikale kloner indusert i embryoet og analysert hos den voksne er vist i figur 5. Det er for det meste kortikal nevrogenese og gliogenese øker med E17. Omtrent 1/6 nevrogene RGP fortsetter også å generere astrocytter og/eller oligodendrocytes11.

Symmetriske kloner oppstår når RGPs gjennomgår en eller flere runder med proliferativ divisjon11. RGP kloner indusert mellom E10-E12 var i gjennomsnitt større i størrelse og ga flere romlige funksjoner i den endelige nevronfordelingen (figur 4A-C). Kloner med nevroner relativt likt fordelt gjennom dype og overfladiske lag tok på seg en "sylinder" form mens kloner med nevroner mer spredt i overfladiske lag enn dypere lag utviklet en "kjegle" form11. For å fullt ut fange den romlige og morfologiske informasjonen til en klone, var det nødvendig å beregne hver klone ved hjelp av sekvensielle bilder. For å måle klonal dispersjon ble maksimal lateral dispersjon (målt i alle dimensjoner) i overfladiske lag (LII−VI) av en klone sammenlignet med neuron dispersjon i dype lag (LV/LIV). Dette forholdet (øvre distribusjonsoverdelt:) ga en kvantifiserbar avlesning av den generelle kloneformen.

Asymmetriske kloner, hvor minoritetsunderklonen var tre eller mindre, ga innsikt i den nevronale produksjonen til en enkelt RGP (Figur 4D-F og figur 5A-F)7,11,12. Majoritetspopulasjonen (stor subklone) kan merkes enten i rødt eller grønt, med et gjennomsnitt på omtrent syv eksituatory projeksjon nevroner per klone når indusert ved hjelp av en Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2(Figur 5G)7,11,12. Det totale antallet celler i en MADM klone kan bli ytterligere dissekert ved å analysere fordelingen av nevroner i den store subklone over overfladiske og dype lag. Minoritetspopulasjonen (liten underklone) ble merket av den gjensidige fargen og var i gjennomsnitt 1–2 celler per klone (figur 5H). Den totale "enhetsstørrelse", som i gjennomsnitt var 8–9 nevroner, kunne beregnes ved å legge til de små og store underslutene sammen (figur 5I)7,,11,,12. Det er viktig å merke seg at mens den nevronale produksjonen av RGPs var svært forutsigbar, var det en grad av klonal heterogenitet12,70.

Innføring av en mutasjon distal til MADM kassett muliggjør generering av genetiske mosaikker, noe som gir en unik metode for å dissekere molekylære regulatorer av stamcelle avstamning progresjon. Som sådan gir MADM en enestående eksperimentell plattform for å studere den celle-autonome funksjonen til et gen (f.eks. dens tilknytning til mikrocefali eller makrocephaly). Ved å sammenligne kloner indusert i en MADM genetisk mosaikk til kloner indusert i en kontroll MADM, en svært kvantitativ avlesning av endringer i nevron tall og distribusjon kan genereres. Tidligere MADM-baserte studier kvantifiserte den celle-autonome funksjonen til Otx1 i mikrocefalidannelse på klonalnivå (se figur 6A-E for et representativt eksempel)11. I en annen studie viste MADM klonalanalyse at Ndel1 ikke cell-autonomt regulere projeksjon neuron tall, men i stedet evnen til nyfødte nevroner å gå inn eller migrere innenfor kortikale plate, som senere danner den voksne cortex46. Disse studiene viste den svært kvantitative karakteren av MADM klonal analyse i å studere de celle-autonome funksjonene til gener som regulerer kortikale utvikling. Det finnes for tiden ingen eksempler i litteraturen som bruker MADM til å studere gener innblandet i makrocephaly på klonalnivå. Men i fremtidige studier analyse av gener som er relevante for kontroll av kortikale størrelse generelt kan gi svært ønskelig innsikt på molekylært og cellulært nivå.

Figure 1
Figur 1: MADM-prinsippet for avstamningssporing og klonanalyse på enkelt stamcellenivå. (A) For å utføre avstamning sporing og klonal analyse med MADM, må to komponenter være til stede. Først må MADM-kassetter målrettes mot identiske loci på homologe kromosomer. Kassetter består av to kimeriske fluorescerende reporter gener, eGFP (grønn, [G]) og tandem dimer Tomato (rød, tdT [T]). GT-kassetten inneholder N-terminus av eGFP og C-terminus av tdT, atskilt med en intron som inneholder et loxP-område. GT TG-kassetten er konstruert omvendt, med N-terminus av tdT og C-terminus av eGFP. For det andre må uttrykket for Cre recombinase forekomme i cellen som inneholder de målrettede MADM-kassettene. LoxP-nettstedene fungerer som et mål for Cre-mediert interchromosomal rekombinasjon, noe som resulterer i rekonstituering av begge uttrykkskassettene samtidig. Hvis rekombinasjon oppstår i G2-fasen av cellesyklusen etterfulgt av X-segregering (G2-X), vil de to dattercellene uttrykke ett av de to fluorescerende proteinene. (B)MADM prinsipp for genetisk mosaikkanalyse på ett enkelt klonenivå. Muterte alleler (punktmutasjoner, slettinger, innsettinger, loxP-flankerte betingede alleler som avbildet i figur 1B,etc.) kan innføres distal til TG-MADM-kassetten via meiotisk rekombinasjon (se figur 2 og Hippenmeyer et al.46 for detaljer om hvordan man introduserer muterte alleler i MADM-systemet). Hvis en G2-X Cre recombinase-mediert interchromosomal trans-rekombinasjon oppstår mellom MADM kassetter det resulterer i en GFP + homozygot mutant celle (GeneX-/-) for genet av interesse og en tdT + homozygot vill type celle (GeneX+/+) i en umerket heterozygous miljø46,47,71. Alternative merkingsresultater som ikke brukes i klonalanalysen (dvs. gule celler) har tidligere blitt beskrevet i detalj11,,46,47. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Avlsordninger for generasjon eksperimentelle MADM-mus for avstamning. Avl ordningen for generering av kontroll MADM (A) og Gene X MADM (B) eksperimentelle MADM mus for klonal analyse. For mer informasjon om MADM avl paradigmer se Beattie et al.7 og Hippenmeyer et al.7,46. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Tidskurs paradigmer for MADM-basert klonal avstamning analyse. Skjematisk av eksperimentelle design tid vinduer. For langsgående prøvetaking paradigmer forble tidspunktet for kloneinduksjon konstant og hvor lang tid før analysen varierte. I progressiv intervallprøvetaking forble tidspunktet for analyse konstant, men induksjonstidspunktet varierte. En kombinasjon av en eller begge tilnærminger kan brukes avhengig av spørsmålene som er adressert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: MADM klonalanalyse i utvikling og voksen neocortex. TM-mediert MADM klone induksjon i symmetrisk proliferativ (TM på E10) (A-C) og asymmetrisk nevrogen (TM på E12) (D-F) dele RGPs. Avbildet er individuelle MADM kloner in vivo i utviklingen (TM / E10 -A / E16 og TM / E12−A / E16) (B, E) og voksen (TM / E10 -A / P21 og TM / E12 − A / P21) (C, F) i MADM-11GT / TG; Nestin-CreERT2+/- (B,E) og MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- (C,F). Neuron produksjonen var uavhengig av subklone farge og grønt flertall / minoritet subclones kunne sammenlignes med rødt flertall / minoritets subclones under kontrollforhold7,11. Omtrent 1/6 av voksne kloner inneholdt også astrocytter og/eller oligodendrocytes, indikert av hvite stjerner. Paneler B og F er gjengitt med tillatelse fra Hippenmeyer et al.46 og Rulands og Simons72,henholdsvis. CP = Kortikal plate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: MADM klonal analyse for å kvantifisere RGP-mediert neuron utgang. Analyse av ekscitatorisk nevron (enhet) produksjon av individuelle nevrogene RGPs på klonalnivå ved hjelp av MADM7,11. (A)Eksperimentelt paradigme for å indusere for det meste asymmetriske MADM-kloner i den utviklende cortex. (B) Mulige asymmetriske kloneutfall med flertallet subklone merket i enten grønn eller rød (C) Representative påfølgende seksjoner som spenner over en enkelt nevrogen asymmetrisk klone(D,E)3D rekonstruksjon bilder av representative asymmetrisk G2-X MADM kloner med flertallet populasjon i rødt (D) eller grønn (E) i MADM-11GT / TG; Emx1-CreERT2+/- med TM-induksjon ved E12 og analyse ved P21. Legg merke til at både grønne og røde merkede celler er villtype. (F)Skjematisk indikerer de to mulige eksperimentelle MADM kloneutfallene. (G) Kvantifisering av størrelsen på majoritetsbefolkningen som følge av fornyelse av RGPs i MADM-11 kloner. (H)Kvantifisering av størrelsen på minoritetsbefolkningen som følge av fornyelse av RGPs i MADM-11 kloner. (I)Kvantifisering av den enhetlige størrelsen på asymmetriske nevrogene MADM-11 kloner. Hypotetiske verdier kan representere gjennomsnitt ± SEM. Skala bar = 100 μm (D og E). TM = Tamoxifen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: MADM klonal analyse for å studere gener som fører til mikrocefali og makrocephaly. Hypotetiske MADM klonale analyseresultater når du utfører funksjonell genetisk disseksjon av kandidatgener som fører til mikrocefali eller makrocephaly. For å dissekere de celle-autonome funksjonene til et gen av interesse (Gene X) på neuron utgang, MADM krever mutant alleler som skal innføres distal til MADM kassetter via meiotisk rekombinasjon (for detaljer hvordan å introdusere muterte alleler i MADM-systemet se også Figur 2, Hippenmeyer et al.46, og Laukoter et al.46,73). - Jeghar ikke noe valg. Skjematisk indikerer eksperimentell MADM paradigme for funksjonell analyse av klonale RGP enheter. Den muterte subklonen kan enten danne minoritetspopulasjonen (A) eller flertallet (B) populasjon. - Jeghar ikke noe å gjøre. Hypotetiske MADM klonale analyseresultater når kvantifisere kontroll MADM (hvite barer), Gene-X MADM microcephaly (grå barer) og Gene-X MADM makrocephaly svarte barer) asymmetriske kloner. (C) Kvantifisering av størrelsen på majoritetsbefolkningen. (D) Kvantifisering av minoritetsbefolkningens størrelse. (E) Kvantifisering av den enhetlige størrelsen på asymmetriske nevrogene kloner. Hypotetiske verdier kan representere gjennomsnitt ± SEM. S = Hypotetisk scenario der forskjellen i subklonecellenummer kan nå betydning, i forhold til kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: MADM klonalstudier i litteraturen. Sammendrag av studier i litteraturen som inneholder MADM klonale avstamningseksperimenter, inkludert CreERT2 driver brukt, TM dose, og tidspunkt for injeksjon. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).

Discussion

En metode for å bruke MADM til å spore celleavledning av individuelle RGPs in vivo i den utviklende neocortex er beskrevet. Når madm-hendelser kombineres med TM-inducible CreERT2,kan madm-hendelser bli nøyaktig tidsforstilt, noe som gir en svært kvalitativ og kvantitativ visuell avlesning av stamcelledelingsmønstre på enkeltcellenivå. Ved å titrere dosen av TM levert, i en ideell situasjon kan et gjennomsnitt på mindre enn en klone per kortikale halvkule oppnås, noe som gir tilstrekkelig romlig separasjon for å skille individuelle kloner. Ved å opprettholde vevintegritet fanger denne metoden også viktig informasjon om posisjon, morfologi og absolutte celletall. MADM kassetter på Chr. 117,11,12,46,56,57, på Chr. 751, og den opprinnelige MADM på Rosa2647,53,59 har blitt brukt i MADM klonal analyse studier. Den høye oppløsningen av individuelle celler gir enestående innsikt i både morfologi og klonal forholdet mellom datterceller og tillater levende avbildning av prolifererende stamceller og nye kloner46,52.

Keisersnitt og fostering av valper for analyse av kloner på postnatale tidspunkter er et nødvendig og kritisk skritt i protokollen. Avhengig av helsetilstanden til den TM-behandlede gravide demningen, kan det ikke være nødvendig å utføre en keisersnitt. Det er imidlertid fortsatt nødvendig å oppdra valpene med en fostermor, fordi den TM-behandlede moren kan ha problemer med å ammende. Det er ikke observert forskjeller i behovet for å fostre med forskjellige CreERT2-drivere. Både MADM linjer og fostermødre opprettholdes på en outbred CD-1 bakgrunn. Hvis keisersnitt ikke er nødvendig, kan den TM-behandlede gravide demningen som brukes til å generere eksperimentelle valper gjenbrukes for ytterligere eksperimentelle avl i samsvar med prinsipper i 3R (merk at dette bare kan gjøres hvis dyreeksperielle lisenser godkjenner denne praksisen). Fostermødre kan brukes til å fostre unger innen 2 dager etter at de føder, men høyere suksessrater har blitt observert når fostermødre føder samme dag som de eksperimentelle musene som må fostres. Derfor er det viktig å sette opp tidsdede parringer for fostermødre parallelt med eksperimentelle parring i trinn 1.1. Opprettholde et lignende kull nummer som den opprinnelige fostermors søppel kan forbedre overlevelsesraten av fostrede valper, og derfor fjerning av noen til alle de opprinnelige kull kan være nødvendig. Ytterligere tiltak som kan forbedre fosteringen inkluderer å gni eksperimentererens hansker med søppel og mat (for å fjerne duften av hanskene); gni valpene forsiktig etter keisersnittet med fragmenter av fostermorens skitne søppel og rede; og plassering av valpene i nær kontakt med fostermorens valper før de ble plassert i fostermuseburet.

Som i andre reporterbaserte linjesporingsmetoder, må det tas nøye hensyn når du velger den optimale CreERT2-driveren for MADM kloniske eksperimenter. For det første må arrangøren som brukes uttrykke recombinase både timelig og romlig i stamfarpopulasjonen av interesse. Å finne denne arrangøren kan være utfordrende, fordi noen arrangører kan endre uttrykksmønstre eller bli dempet på ulike utviklingsstadier. For å forbedre celletypespesifisitet flere stedsspesifikke rekombiner, hver drevet av separate arrangører, har blitt brukt. Når en eller begge rekombiner uttrykkes i samme celle, merker dette cellen og avkom med en fluorescerende reporter74,75,76,77. Oppsummert er det viktig å velge en CreERT2-sjåfør som er spesifikk for populasjonen av forfedre som analyseres.

Det mest kritiske trinnet i denne metoden er identifisering av en klone, fordi alle celler må avledes utvetydig fra en enkelt rekombinasjonshendelse (trinn 8.1). Titrering av TM-konsentrasjon sikrer mindre enn én klynge av røde/grønne celler per hjernehalvhalv og maksimerer sannsynligheten for å analysere en enkelt klone (trinn 2.2)7,11. Kloner bør kastes hvis nærliggende klynger av celler forekommer innen 500 μm av klone av interesse. Derfor er det viktig å undersøke flere seksjoner før og etter utseendet på en klone for å sikre at det ikke er noen flere rekombinasjonshendelser i nærheten. På grunn av svakere signal fra fluoroforeene er det nødvendig å utføre immunohistokjemi for eGFP og tdT i embryonale kloner (se avsnitt 6). Dette anbefales kun i voksne kloner hvis flere antigener vil bli colabeled. Når bilde kloner, er det viktig å fange hele bredden av cortex der klone ligger (dvs. fra pial overflate til corpus callosum; se trinn 8.4) for å ikke gå glipp av noen celler. Dette forenkler også bildejustering under bildebehandling (avsnitt 9). Del 8 i protokollen krever et invertert konfusisk mikroskop, men kan tilpasses avhengig av mikroskopoppsettet som er tilgjengelig. Epifluorescensmikroskopi kan brukes, men konfisk mikroskopi anbefales fordi dette fører til en reduksjon i lysforurensning fra utsiden av fokusplanet. Det er også viktig at laserintensiteten og gevinsten justeres slik at grønne, røde og gule celler kan identifiseres utvetydig. Uavhengig av oppsettet anbefales det å bruke et mål om minst 20x for å sikre full romlig separasjon av tett plasserte celler. I tillegg til å registrere den kortikale dybden av alle celler (trinn 8.6), kortikale regioner der klonene er plassert må identifiseres ved hjelp av en hjerneatlas som Allen Brain atlas eller andre stereotaxic koordinat kart. Et navneparadigme bør også vedtas for å sikre at klonebilder er lett identifiserbare. Følgende informasjon kan inkluderes i filnavnet: unik bilde-ID, datobilde ble tatt, genotype av dyr, induksjonsalder, analysealder, bildenummer i forhold til resten av bildene fra samme klone.

Innføring av en mutasjon distal til en MADM kassett gir karakteristisk generering av genetiske mosaikker71 og tillater disseksjon av molekylære regulatorer av avstamning og celletype mangfold på klonal nivå7,11,46,62. For å generere en genetisk mosaikk med MADM, må MADM-kassettene være meioly knyttet til samme kromosom som genet av interesse (se figur 2 for avlsordning). Dette begrenser dagens klonanalyse med MADM til gener som ligger på Chr. 751,Chr. 1146,Chr. 1251og Chr. 6 distal til Rosa26 locus47. Fremtidige studier vil bruke MADM kassetter rettet mot ethvert kromosom, slik at mosaikkanalysen av nesten alle gener av musegenomet på klonalnivå.

Til slutt er MADM ikke begrenset til analysen av stamceller i den utviklende neocortex. Studien av mange stamcellenisjatorer kan dra nytte av evnen til å løse spatiotemporale ordninger av klonalt relaterte celler. Ved å bruke MADM til andre områder av hjernen, sykdomsforhold (f.eks. kreft) eller i andre vev47,,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59, studier viste slektsforhold i kloner avledet fra ulike klasser av stamceller og stamceller (se tabell 1 for gjeldende liste over MADM klonale studier). En annen interessant fremtidig anvendelse av MADM er å kombinere den med flere funksjonelle eller subcellulære reportere, noe som vil øke graden av informasjon som kan ervervet fra kloner.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker alle medlemmer av Hippenmeyer-laboratoriet for diskusjon, Bioimaging Facility, Life Science Facility og Pre-Clinical Facility i IST Austria for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av IST Austria institusjonelle midler; R.B. fikk støtte fra Austrian Science Fund (FWF) Lise-Meitner program (M 2416); N.A fikk støtte fra Austrian Science Fund (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC fikk støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram for Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen nr. A.H. fikk støtte fra en ÖAW DOC (Doktorgradsstipendiat ved det østerrikske vitenskapsakademiet). Denne studien ble også støttet av European Research Council (ERC) under EUs Forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (tilskuddsavtale No 725780 LinPro) til S.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock) Braun 9204512N
1,4-diazabicyclooctane (DABCO) Roth 0718.2
10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock) Braun 8508429N
15 mL conical centrifuge Sarstedt 65.554.502
24 multi-well dishes Roth/Greiner Bio-one CE56.1
27- gauge x 3/4 needle (Sterican) Braun 16010256E
Corn oil Sigma C8267-500ML
Coverslips (24 x 60 mm #1) Thermo Fisher Scientific (Menzel) 15747592
Cryostat Cryostar NX70 Thermo Fisher Scientific 957000H
Dako Pen (Wax marker) Agilent S200230-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
Disposable microtome blade (MX35 Ultra) Thermo Fisher Scientific 705830
Fine Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools (FST) 11254-20
Glass anti-roll plate Histocom M 449980
Glycerol Sigma G5516
LSM 800 Confocal Zeiss
Mounting medium 25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)
Mowiol 4-88 Roth 0713.2
Normal donkey serum Innovative Research IGDNSER100ML
Paraformaldehyde Sigma 441244-1KG
Peristaltic pump 323E/D 400RPM Watson-Marlow 036.3124.00A
Sucrose Sigma S8501-5KG
Superfrost plus glass slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNT
Tamoxifen Sigma T5648
Tissue Embedding mold T-12 (22mm square) Polysciences Inc. 18986-1
Tissue-Tek O.C.T Sakura 4583
Triton X-100 Sigma T8787-250ML
Trizma hydrochloride Sigma 93363
Tween-20 Sigma P9416-100ML
Software and Plugins:
Fiji 1.52p Fiji
MultiStackReg 1.45 Download link
TurboReg EPFL Bioimaging
Zen Blue 2.6 Zeiss
Experimental Models: Organisms/Strains:
Mouse: Emx1-CreER The Jackson Laboratory JAX:027784
Mouse: MADM-11-GT The Jackson Laboratory JAX:013749
Mouse: MADM-11-TG The Jackson Laboratory JAX:013751
Primary antibodies:
Chicken anti-GFP 1:500 Aves Labs GFP-1020
Goat anti-tdTomato 1:500 Sicgen Antibodies AB8181-200
Rabbit anti-RFP 1:500 MBL PM005
Secondary antibodies:
Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500 Jackson Immuno Research 715-475-150
Donkey Anti-Goat Cy3 1:500 Jackson Immuno Research 705-165-147
Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500 Jackson Immuno Research 711-165-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malatesta, P., et al. Neuronal or glial progeny: regional differences in radial glia fate. Neuron. 37 (5), 751-764 (2003).
  2. Miyata, T., Kawaguchi, A., Okano, H., Ogawa, M. Asymmetric inheritance of radial glial fibers by cortical neurons. Neuron. 31 (5), 727-741 (2001).
  3. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  4. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 465-502 (2014).
  5. Desikan, R. S., Barkovich, A. J. Malformations of cortical development. Annals of Neurology. 80 (6), 797-810 (2016).
  6. Gao, R., Penzes, P. Common mechanisms of excitatory and inhibitory imbalance in schizophrenia and autism spectrum disorders. Current Molecular Medicine. 15 (2), 146-167 (2015).
  7. Beattie, R., et al. Mosaic Analysis with Double Markers Reveals Distinct Sequential Functions of Lgl1 in Neural Stem Cells. Neuron. 94 (3), 517-533 (2017).
  8. Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 800, 1-24 (2014).
  9. Lodato, S., Arlotta, P. Generating neuronal diversity in the mammalian cerebral cortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 699-720 (2015).
  10. Hansen, A. H., Duellberg, C., Mieck, C., Loose, M., Hippenmeyer, S. Cell Polarity in Cerebral Cortex Development-Cellular Architecture Shaped by Biochemical Networks. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 176 (2017).
  11. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  12. Llorca, A., et al. A stochastic framework of neurogenesis underlies the assembly of neocortical cytoarchitecture. eLife. 8, e51381 (2019).
  13. Ma, J., Shen, Z., Yu, Y. C., Shi, S. H. Neural lineage tracing in the mammalian brain. Current Opinion in Neurobiology. 50, 7-16 (2018).
  14. Caviness, V., Takahashi, T., Nowakowski, R. Numbers, time and neocortical neuronogenesis: a general developmental and evolutionary model. Trends in Neurosciences. 18 (9), 379-383 (1995).
  15. Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anatomy and Embryology. 156 (2), 115-152 (1979).
  16. Kessaris, N., et al. Competing waves of oligodendrocytes in the forebrain and postnatal elimination of an embryonic lineage. Nature Neuroscience. 9 (2), 173-179 (2006).
  17. Magavi, S., Friedmann, D., Banks, G., Stolfi, A., Lois, C. Coincident generation of pyramidal neurons and protoplasmic astrocytes in neocortical columns. The Journal of Neuroscience. 32 (14), 4762-4772 (2012).
  18. Anthony, T. E., Klein, C., Fishell, G., Heintz, N. Radial glia serve as neuronal progenitors in all regions of the central nervous system. Neuron. 41 (6), 881-890 (2004).
  19. Voigt, T. Development of glial cells in the cerebral wall of ferrets: direct tracing of their transformation from radial glia into astrocytes. The Journal of Comparative Neurology. 289 (1), 74-88 (1989).
  20. Amberg, N., Laukoter, S., Hippenmeyer, S. Epigenetic cues modulating the generation of cell-type diversity in the cerebral cortex. Journal of Neurochemistry. 149 (1), 12-26 (2019).
  21. Beattie, R., Hippenmeyer, S. Mechanisms of Radial Glia Progenitor Cell Lineage Progression. FEBS letters. 591 (24), 3993-4008 (2017).
  22. Telley, L., et al. Temporal patterning of apical progenitors and their daughter neurons in the developing neocortex. Science. 364 (6440), eaav2522 (2019).
  23. Oberst, P., et al. Temporal plasticity of apical progenitors in the developing mouse neocortex. Nature. 573 (7774), 370-374 (2019).
  24. Telley, L., et al. Sequential transcriptional waves direct the differentiation of newborn neurons in the mouse neocortex. Science. 351 (6280), 1443 (2016).
  25. Deppe, U., et al. Cell lineages of the embryo of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (1), 376-380 (1978).
  26. Woodworth, M. B., Girskis, K. M., Walsh, C. A. Building a lineage from single cells: genetic techniques for cell lineage tracking. Nature Reviews Genetics. 18 (4), 230-244 (2017).
  27. Masuyama, N., Mori, H., Yachie, N. DNA barcodes evolve for high-resolution cell lineage tracing. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 63-71 (2019).
  28. Legue, E., Joyner, A. L. Chapter Ten-Genetic Fate Mapping Using Site-Specific Recombinases. Methods in Enzymology. 477, 153-181 (2010).
  29. Postiglione, M. P., Hippenmeyer, S. Monitoring neurogenesis in the cerebral cortex: an update. Future Neurology. 9 (3), 323-340 (2014).
  30. Espinosa-Medina, I., Garcia-Marques, J., Cepko, C., Lee, T. High-throughput dense reconstruction of cell lineages. Open Biology. 9 (12), 190229 (2019).
  31. Hwang, B., et al. Lineage tracing using a Cas9-deaminase barcoding system targeting endogenous L1 elements. Nature Communications. 10 (1), 1234 (2019).
  32. Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
  33. García-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnár, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. 141 (7), 1589-1598 (2014).
  34. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  35. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  36. Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  37. Amitai-Lange, A., et al. A method for lineage tracing of corneal cells using multi-color fluorescent reporter mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
  38. Vasistha, N. A., et al. Cortical and Clonal Contribution of Tbr2 Expressing Progenitors in the Developing Mouse Brain. Cerebral Cortex. 25 (10), 3290-3302 (2015).
  39. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  40. Siddiqi, F., et al. Fate mapping by piggyBac transposase reveals that neocortical GLAST+ progenitors generate more astrocytes than Nestin+ progenitors in rat neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
  41. Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
  42. García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
  43. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  44. Kim, G. B., et al. Rapid Generation of Somatic Mouse Mosaics with Locus-Specific, Stably Integrated Transgenic Elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
  45. Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658 (2018).
  46. Hippenmeyer, S., et al. Genetic Mosaic Dissection of Lis1 and Ndel1 in Neuronal Migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  47. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  48. Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'homme et des vertébrés. , Maloine. Paris, France. (1911).
  49. Cowan, W. M. The emergence of modern neuroanatomy and developmental neurobiology. Neuron. 20 (3), 413-426 (1998).
  50. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  51. Hippenmeyer, S., Johnson, R. L., Luo, L. Mosaic analysis with double markers reveals cell-type-specific paternal growth dominance. Cell Reports. 3 (3), 960-967 (2013).
  52. Riccio, P., Cebrian, C., Zong, H., Hippenmeyer, S., Costantini, F. Ret and Etv4 promote directed movements of progenitor cells during renal branching morphogenesis. PLoS Biology. 14 (2), e1002382 (2016).
  53. Bonaguidi, M. A., et al. In vivo clonal analysis reveals self-renewing and multipotent adult neural stem cell characteristics. Cell. 145 (7), 1142-1155 (2011).
  54. Mayer, C., et al. Clonally Related Forebrain Interneurons Disperse Broadly across Both Functional Areas and Structural Boundaries. Neuron. 87 (5), 989-998 (2015).
  55. Muzumdar, M. D., et al. Clonal dynamics following p53 loss of heterozygosity in Kras-driven cancers. Nature Communications. 7, 12685 (2016).
  56. Shi, W., et al. Ontogenetic establishment of order-specific nuclear organization in the mammalian thalamus. Nature Neuroscience. 20, 516 (2017).
  57. Wong, S. Z. H., et al. In vivo clonal analysis reveals spatiotemporal regulation of thalamic nucleogenesis. PLoS Biology. 16 (4), e2005211 (2018).
  58. Xu, H. T., et al. Distinct Lineage-Dependent Structural and Functional Organization of the Hippocampus. Cell. 157 (7), 1552-1564 (2014).
  59. Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All β Cells Contribute Equally to Islet Growth and Maintenance. PLoS Biology. 5 (7), e163 (2007).
  60. Ortiz-Alvarez, G., et al. Adult neural stem cells and multiciliated ependymal cells share a common lineage regulated by the geminin family members. Neuron. 102 (1), 159-172 (2019).
  61. Kaplan, E. S., Ramos-Laguna, K. A., Mihalas, A. B., Daza, R. A. M., Hevner, R. F. Neocortical Sox9+ radial glia generate glutamatergic neurons for all layers, but lack discernible evidence of early laminar fate restriction. Neural Development. 12 (1), 14 (2017).
  62. Lv, X., et al. TBR2 coordinates neurogenesis expansion and precise microcircuit organization via Protocadherin 19 in the mammalian cortex. Nature Communications. 10 (1), 3946 (2019).
  63. Mihalas, A. B., Hevner, R. F. Clonal analysis reveals laminar fate multipotency and daughter cell apoptosis of mouse cortical intermediate progenitors. Development. 145 (17), dev164335 (2018).
  64. Picco, N., et al. A mathematical insight into cell labelling experiments for clonal analysis. Journal of Anatomy. 235 (3), 687-696 (2019).
  65. Johnson, C. A., Ghashghaei, H. T. Sp2 regulates late neurogenic but not early expansive divisions of neural stem cells underlying population growth in the mouse cortex. Development. , (2020).
  66. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing Neurogenesis and Differentiation: Insights from Quantitative Clonal Analyses of Cerebellar Granule Cells. The Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301 (2008).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  69. Liu, Y., et al. Tamoxifen-independent recombination in the RIP-CreER mouse. PLoS One. 5 (10), e13533 (2010).
  70. Klingler, E., Jabaudon, D. Do progenitors play dice? eLife. 9, e54042 (2020).
  71. Hippenmeyer, S. Dissection of gene function at clonal level using mosaic analysis with double markers. Frontiers in Biology. 8 (6), 557-568 (2013).
  72. Rulands, S., Simons, B. D. Tracing cellular dynamics in tissue development, maintenance and disease. Current Opinion in Cell Biology. 43, 38-45 (2016).
  73. Laukoter, S., et al. Imprinted Cdkn1c genomic locus cell-autonomously promotes cell survival in cerebral cortex development. Nature Communications. 11 (1), 195 (2020).
  74. Daigle, T. L., et al. A Suite of Transgenic Driver and Reporter Mouse Lines with Enhanced Brain-Cell-Type Targeting and Functionality. Cell. 174 (2), 465-480 (2018).
  75. He, M., et al. Strategies and Tools for Combinatorial Targeting of GABAergic Neurons in Mouse Cerebral Cortex. Neuron. 91 (6), 1228-1243 (2016).
  76. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  77. Plummer, N. W., et al. Expanding the power of recombinase-based labeling to uncover cellular diversity. Development. 142 (24), 4385 (2015).
  78. Imayoshi, I., Ohtsuka, T., Metzger, D., Chambon, P., Kageyama, R. Temporal regulation of Cre recombinase activity in neural stem cells. Genesis. 44 (5), 233-238 (2006).
  79. Sasaki, S., et al. Complete loss of Ndel1 results in neuronal migration defects and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7812-7827 (2005).
  80. Acampora, D., et al. Epilepsy and brain abnormalities in mice lacking the Otx1 gene. Nature Genetics. 14 (2), 218-222 (1996).
  81. Soeda, T., et al. Sox9-expressing precursors are the cellular origin of the cruciate ligament of the knee joint and the limb tendons. Genesis. 48 (11), 635-644 (2010).
  82. Klezovitch, O., Fernandez, T. E., Tapscott, S. J., Vasioukhin, V. Loss of cell polarity causes severe brain dysplasia in Lgl1 knockout mice. Genes & Development. 18 (5), 559-571 (2004).
  83. Pimeisl, I. M., et al. Generation and characterization of a tamoxifen-inducible EomesCreER mouse line. Genesis. 51 (10), 725-733 (2013).
  84. Nakagawa, N., et al. Memo1-Mediated Tiling of Radial Glial Cells Facilitates Cerebral Cortical Development. Neuron. 103 (5), 836-852 (2019).
  85. Nowotschin, S., et al. The T-box transcription factor Eomesodermin is essential for AVE induction in the mouse embryo. Genes & Development. 27 (9), 997-1002 (2013).
  86. Balordi, F., Fishell, G. Mosaic removal of hedgehog signaling in the adult SVZ reveals that the residual wild-type stem cells have a limited capacity for self-renewal. Journal of Neuroscience. 27 (52), 14248-14259 (2007).
  87. Liang, H., et al. Neural development is dependent on the function of specificity protein 2 in cell cycle progression. Development. 140 (3), 552-561 (2013).
  88. Guo, C., Yang, W., Lobe, C. G. A Cre recombinase transgene with mosaic, widespread tamoxifen-inducible action. Genesis. 32 (1), 8-18 (2002).
  89. Ahn, S., Joyner, A. L. In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog. Nature. 437 (7060), 894-897 (2005).
  90. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136 (2), 295-305 (2009).
  91. Koundakjian, E. J., Appler, J. L., Goodrich, L. V. Auditory neurons make stereotyped wiring decisions before maturation of their targets. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14078-14088 (2007).
  92. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic β-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  93. Sohal, D. S., et al. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circulation Research. 89 (1), 20-25 (2001).
  94. Ventura, A., et al. Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature. 445 (7128), 661-665 (2007).
  95. Johnson, L., et al. Somatic activation of the K-ras oncogene causes early onset lung cancer in mice. Nature. 410 (6832), 1111-1116 (2001).
  96. Tasic, B., et al. Extensions of MADM (mosaic analysis with double markers) in mice. PLoS One. 7 (3), e33332 (2012).
  97. Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129 (22), 5301-5312 (2002).
  98. Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
  99. Schuchardt, A., D'Agati, V., Larsson-Blomberg, L., Costantini, F., Pachnis, V. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret. Nature. 367 (6461), 380-383 (1994).
  100. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 877-892 (2002).
  101. Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. eLife. 4, e10036 (2015).
  102. Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454 (7200), 104-108 (2008).
  103. Lasrado, R., et al. Lineage-dependent spatial and functional organization of the mammalian enteric nervous system. Science. 356 (6339), 722-726 (2017).
  104. Matsuoka, T., et al. Neural crest origins of the neck and shoulder. Nature. 436 (7049), 347-355 (2005).

Tags

Biologi utgave 159 mosaikkanalyse med doble markører (MADM) klonalanalyse avstamningsanalyse stamcelle hjernebarken radial gliastamor (RGP) nevrogenese nevrovitenskap nevroutvikling
Lineage sporing og klonal analyse i å utvikle Hjernebarken ved hjelp av Mosaikk analyse med doble markører (MADM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beattie, R., Streicher, C., Amberg,… More

Beattie, R., Streicher, C., Amberg, N., Cheung, G., Contreras, X., Hansen, A. H., Hippenmeyer, S. Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM). J. Vis. Exp. (159), e61147, doi:10.3791/61147 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter