Summary
En metode til dyrkning af kimfri Napa kål er blevet udviklet, som gør det muligt for forskere at vurdere, hvordan enkelte mikrobielle arter eller multispecies mikrobielle samfund interagerer på kål blad overflader. En steril vegetabilsk ekstrakt præsenteres også, som kan bruges til at måle forskydninger i fællesskabets sammensætning under vegetabilsk gæring.
Abstract
Phyllosfæren, den ovennævnte jordede del af planten, der kan koloniseres af mikrober, er et nyttigt modelsystem til at identificere processer af mikrobielle samfund forsamling. Denne protokol skitserer et system til at studere mikrobielle samfund dynamik i phyllosfæren af Napa kål planter. Den beskriver, hvordan man dyrker kimfrie planter i reagensglas med et kalcineret ler og næringsstofbouillonsubstrat. Inokulering af kimfrie planter med specifikke mikrobielle kulturer giver mulighed for at måle mikrobiel vækst og samfundsdynamik i phyllosfæren. Ved brug af sterilt vegetabilsk ekstrakt fremstillet af kål skift i mikrobielle samfund, der opstår under gæringen kan også vurderes. Dette system er relativt enkel og billig at oprette i laboratoriet og kan bruges til at løse centrale økologiske spørgsmål i mikrobielle samfund forsamling. Det giver også mulighed for at forstå, hvordan phyllosfæren samfund sammensætning kan påvirke den mikrobielle mangfoldighed og kvaliteten af vegetabilske fermenteringer. Denne fremgangsmåde til udvikling af gnotobiotiske kål phyllosfære samfund kunne anvendes på andre vilde og landbrugsmæssige plantearter.
Introduction
Mikrobiel mangfoldighed i phyllosfæren spiller en vigtig rolle for opretholdelsen af plantesundhed og kan også påvirke planternes evne til at modstå miljøstress1,2,3,4,5. Til gengæld påvirker afgrøders sundhed direkte fødevaresikkerheden og kvaliteten6,7. Planter spiller en rolle i økosystemets funktion , og deres tilknyttede mikrobiomer påvirker både planternes evne til at udføre disse aktiviteter og påvirker selv miljøet direkte8. Mens forskerne er begyndt at dechifrere phyllosfærens funktion og sammensætning, er de økologiske processer, der påvirker phyllosfærens mikrobielle samfundssamling, ikke fuldtud forstået 9,10. Phyllosfæren mikrobiom er et fremragende eksperimentelt system til at studere økologi mikrobiomer11. Disse samfund er relativt enkle, og mange af de medlemmer af lokalsamfundet kan dyrkes på standard lab medier10,,12,13.
Gærede grøntsager er et system, hvor fællesskabsstrukturen i phyllosfæren har vigtige konsekvenser. I både surkål og kimchi fungerer de mikrober, der naturligt forekommer på vegetabilske blade (phyllosfæren af Brassica-arter) som inokulum til gæring14,15. Mælkesyrebakterier (LAB) betragtes som allestedsnærværende medlemmer af vegetabilske mikrobiomer, men de kan være i lav overflod i phyllosfæren16. Stærk abiotisk udvælgelse under gæring driver et skift i mikrobielle samfund sammensætning gør det muligt mælkesyrebakterier til at stige i overflod. Som LAB vokser, de producerer mælkesyre, som skaber det sure miljø af fermenterede vegetabilske produkter17. Forbindelsen mellem phyllosfæren og gæringen giver mulighed for at bruge grøntsager som model til at forstå, hvordan mikrobiomer er struktureret.
Vi har udviklet metoder til at dyrke kønsceller-fri Napa kål og til at vaccinere dem med specifikke mikrobielle samfund ved hjælp af sprayflasker. Dette er en billig og pålidelig metode til jævnt podning kål med enten individuelle mikrober eller blandede samfund. En steril grøntsag ekstrakt (SVE) er også blevet udviklet fra tre forskellige kål typer / sorter: rød og grøn kål (Brassica oleracea) og Napa kål (B. rapa). Tilsætning af salt til disse SVEs replikerer fermenteringsmiljøet og giver mulighed for små og relativt højt gennemløb eksperimentelle undersøgelser af fermentering mikrobiom samling. Disse metoder kan bruges til at studere mikrobiel samfund samling i phyllosfæren og hvordan mikrobielle samfund dynamik i phyllosfæren kan være knyttet til succes vegetabilsk gæring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrkning af kønscellerfri kål
- Forberedelse af udstyr til dyrkning af kønsfri kål
- Rengøring af kalcineret ler for at fjerne fine støvpartikler
- Skyl kalcineret ler (Materialetabel) mindst 3x med postevand; dræne vand.
FORSIGTIG: Kalcineret ler producerer meget fint støv, og det anbefales at bære en beskyttende maske (Tabel over Materialer) ved vask. - Spred kalcineret ler ud som et tyndt lag (~ 4 cm) i en autoklave bakke og autoklave på en tør cyklus (121 °C opvarmning i 20 min og 20 min tørretid) til at sterilisere.
- Det kalcinerede ler tørres helt, inden det anvendes, ved at sprede sig på bakkerne og anbringe det i en varm inkubator (30−37 °C) i mindst en uge. Rør til at blande hver 3 dage til fuldt tørre kalcineret ler, så det vil absorbere en jævn mængde Murashige og Skoog (MS) næringsstof bouillon (afsnit 1.2).
BEMÆRK: Tørring hjælper også med at holde mængden af kalcineret ler, selv når det vejes i rør. Tørring på anden måde, såsom en tørreovn, ville også være egnet.
- Skyl kalcineret ler (Materialetabel) mindst 3x med postevand; dræne vand.
- Rengøring af glas til dyrkning af kønscellerfri kål
- Rengør og steriliser glasrørene(materialetabellen)grundigt mellem hver brug. Soak rør i 30 min i 30% blegemiddel opløsning og skyl godt med postevand før rengøring i en syre vask på en bakteriologi indstilling. Syrevask tovejs reagensglashætter (Materialetabel) mellem anvendelserne.
- Overflade sterilisering kål frø
- Placer op til 100 Napa kål(B. rapa var pekinensis)frø i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
BEMÆRK: Tilføjelse af mere end 100 frø til et mikrocentrifugerør eller ændring af rørets størrelse kan påvirke spireevnen af frøene på grund af manglende fjernelse af frøfrakke. - Tilsæt 1 ml 70% ethanol til frøene og vortex i 5 min. Kassér ethanolen ved hjælp af en pipette.
- Tilsæt 1 ml 50% blegemiddel og vortex i 5 min. Kassér blegemiddelopløsningen med en pipette.
- Tilsæt 1 ml autoklaveret deioniseret vand og vortex i 5 min. Kassér det deioniserede vand ved hjælp af en pipette.
- Trin 1.1.3.4 3x for at skylle alt blegemiddel af. Læg frøene i blød i sterilt deioniseret vand i 2−8 timer før plantning for at blødgøre frøfrakken.
- Placer op til 100 Napa kål(B. rapa var pekinensis)frø i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
- Rengøring af kalcineret ler for at fjerne fine støvpartikler
- Dyrkning af kønsfri kål
BEMÆRK: Napa kål (B. rapa var pekinensis) dyrkes i glasrør (15 cm x 2,5 cm) indeholdende kalcineret ler dyppet i Murashige og Skoog (MS) næringsstof bouillon (Figur 1).- Der vejes 10 g rent kalcineret ler i et rent glasrør (15 cm x 2,5 cm).
- Forbered MS næringsstof bouillon ved at opløse 4,4 g MS medium i 1 L deioniseret vand. Der tilsættes MS næringsstof bouillon (~ 9 ml) til hvert glasrør til at dække kalcineret ler ved hjælp af en pipette.
BEMÆRK: Stående væske i røret vil forhindre frøene i at spire, så det kan være trængende at tilføje lidt mindre MS bouillon til nogle rør. - Hætteglasrør løst med 22 mm tovejs reagensglashætter og autoklave (121 °C i 60 min). Når du fjerner dem fra autoklaven, skubbe hætter på glasrørene for at forsegle dem. Afkøles rør til stuetemperatur før brug.
- Placer forsigtigt et sterilt kålfrø i midten af hvert rør ved hjælp af sterile, ekstra lange (25,4 cm) hingst. Derefter anbringes rørene i en 7-vejs bakke under lysriste (fuldspektret T5 lysstofrør eller anden belysningsopsætning til plantevækst) med en lyscyklus på 16 timer ved 24 °C.
BEMÆRK: Frø spire natten over og udvikle deres første sande blad efter 5 dage. Et sandt blad er det første vaskulære blad efter cotyledons har dannet. Det har en mere rynket kant og i Brassica rapa er dækket af trichomes.
- Test for sterilitet af kimfrie kål
BEMÆRK: For at teste, om kålene er kimfri, skal du vælge nogle få (5−10) kål fra hvert parti og hver plade ud for at afgøre, om der er dyrkeer.- Fjern forsigtigt kålen fra glasrørene ved at gribe plantens bund med steriliserede knypper og trække den ud. Før du fjerner kålen helt fra røret, forsigtigt afbrød rødderne ved hjælp af steriliseret dissektion saks. Komprimer kålen blade i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
BEMÆRK: Større kål kan kræve fjernelse af en eller to af de større blade, mens kålen stadig er i røret for at gøre det lettere at få kålen ind i 1,5 ml mikrocentrifuge rør. Disse større blade kan tilsættes til 1,5 ml rør efter resten af kålen er blevet placeret i røret, hvis hele kål er påkrævet. - Der tilsættes 400 μL 1x fosfatbuffersalline (PBS) til hvert mikrocentrifugerør på 1,5 ml. Ved hjælp af en steril mikropest, homogenisere kål ved at plage 30x.
- Plade 100 μL af kålhomogenatet på agarplader for at fastslå, om der er forurenende stoffer til stede i prøven. De fleste bakterier findes i phyllosfæren vil vokse på tryptiske soy (TS) agar plader. Brug brede blænde pipette tips, når plating kål homogenat som kål homogenat er tyk og kan tilstoppe regelmæssige pipette tips.
- Fjern forsigtigt kålen fra glasrørene ved at gribe plantens bund med steriliserede knypper og trække den ud. Før du fjerner kålen helt fra røret, forsigtigt afbrød rødderne ved hjælp af steriliseret dissektion saks. Komprimer kålen blade i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
2. Podning af phyllosfæren med mikrobielle opløsninger
- Fremstilling af glycerollagre af inokuleringsstammer
BEMÆRK: Tabel 1 viser de mikrobielle isolater, der kan bruges i dette trin. Andre phyllosfære isolater kunne også bruges her.- Tæt streak ud enkelte kolonier fra en frisk stribe, på to / tre nye plader af samme medie for at få mange kolonier.
- Lad striberne vokse i 2-5 dage og derefter skrabe kolonier fra alle plader i et 15 ml konisk rør indeholdende 15 ml 15% glycerol, og vortex blandes grundigt.
- En 1 ml af det velblandet glycerollager overføres til et mikrocentrifugeglas på 1,5 ml og lagrene af glycerol opbevares ved -80 °C, indtil det anvendes. Gem de resterende 14 ml glycerolbestand ved -80 °C, da der kræves relativt store mængder inokuleringsopløsning ved podning af kål.
- En uge før brug, 1,5 ml rør, der indeholder 1 ml glycerolbestand (fra trin 2.1.3) på is, fortyndes og pladen ved flere forskellige fortyndinger (f.eks. 10-4, 10-5og 10-6) for at bestemme koncentrationen (kolonidannende enhed [CFU] pr. μL) af den 14 ml inokuleringsopløsning.
- Sterilisering af sprøjteflasker til indokering
- Demonter de gule runde Boston pumpeflasker (59 ml) og læg alle komponenter (pumpe, rør, hætte og flaske) i 30% blegemiddel opløsning i 30 min i en stor plastbeholder med et tætsiddende låg.
- Efter iblødsætning, forsigtigt hælde alle blegemiddel fra beholderen ved at løfte blot et hjørne af låget af beholderen.
- Skyl flaskerne ved at fylde plastbeholderen med autoklaveret deioniseret vand (~ 1 L afhængigt af beholderens størrelse) og hæld forsigtigt deioniseret vand ud, igen ved at løfte låget i det ene hjørne.
- Steriliser et biosikkerhedsskab ved at sprøjte med 70% ethanolopløsning og tænde UV-lyset i 30 min.
BEMÆRK: Fortsæt dette arbejde i biosikkerhedsskabet, så der ikke er risiko for mikrobiel kontaminering af flaskerne, da de lufttørrer. - Fjern flasker fra den store plastbeholder og fyld hver flaske med autoklaveret deioniseret vand ved hjælp af en pipette. Saml pumperne igen, og placer en i hver flaske. Pump det deioniserede vand gennem hver flaske (10 sprays pr. flaske) for at fjerne blegemiddel fra flaskens pumpekomponent.
- Trin 2.2.5 gentages for at sikre, at alt blegemiddel fjernes fra glasflaskerne.
- Test, om flaskerne er sterile ved at placere et nummer på hver flaske (stikning lab tape på siden af flasken, når den er helt tør) derefter tilføje 10 ml 1x PBS til hver af flaskerne og pumpe 3 sprays på en TS agar plade. Efter sprøjtning skal pladerne inkuberes i en uge ved stuetemperatur. Hvis der vokser kolonier på en plade, indikerer det, at den pågældende flaske ikke var steril og ikke bør anvendes til forsøg.
- Før de sterile flasker opbevares, skal du fjerne alle resterende PBS og lade flaskerne tørre grundigt i biosikkerhedsskabet. Opbevares sterile flasker i en steril plastbeholder (typisk beholderen, der anvendes til blegning af flaskerne) indtil brug.
- Forberedelse af det mikrobielle inokulum og sprøjtning af kønsceller
FORSIGTIG: Alle trin skal udføres i et biosikkerhedsskab, da sprøjtning aerosoliserer de mikrobielle opløsninger, der kan forurene arbejdsflader eller udgøre en sundhedsrisiko, hvis de udføres på en laboratoriebænk.
BEMÆRK: Kål vil danne sande blade efter 5 dage, så det er tilrådeligt at vente en uge efter plantning af kål før podning med nogen mikrobielle løsninger. Da rørene er forseglet, er der ingen grund til at vande kål. Eksperimenter udføres bedst inden for en måned efter plantning, da de små rør begrænser kålens vækst.- Optø glycerollagre på is og fortyndes i 1x PBS til den ønskede inokuleringskoncentration (koncentration bestemt ved optøning og plettering af en 1 ml aliquot i trin 2.1.4).
BEMÆRK: En række forskellige inokuleringsniveauer kan anvendes, men phyllosfæreisolater kan vokse fra 104 til 108 CFUs/ml kålgylle på 10 dage. - Der tilsættes 10 ml fortyndet glycerollager til den sterile pumpeflaske, og pump 5 sprays i et stort affaldsopsamlingsbæger for at fjerne eventuelle resterende PBS fra flaskepumpekomponenten.
- Fjern låget fra kålrøret, vip kålen mod sprayflasken, og spray hver kål med 3 pumper af inokuleringsopløsningen, som giver ~ 600 μL inokulum.
- Efter podning høstes en delmængde af kålene for at vurdere den faktiske tilførselskoncentration. Fjern kålen fra et rør med steriliserede knypper. Skær rødderne af med steril dissektionssaks, og anse forsigtigt kålen i et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Optag vægten af kål til fremtidige beregninger, hvis CFUs/g kål er påkrævet til beregninger.
- Der tilsættes 400 μL 1x PBS til hver 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende kål, og der anvendes en steril mikropest for at homogenisere kålen i 1x PBS ved at slibe den 30x.
- Fortynd kål homogenat (hvis det kræves) og plade ud den plagede kål blandingen. Brug brede blænde tips til pipettering kål gylle, fordi det vil være tyk og fuld af plantevæv stykker.
- Optø glycerollagre på is og fortyndes i 1x PBS til den ønskede inokuleringskoncentration (koncentration bestemt ved optøning og plettering af en 1 ml aliquot i trin 2.1.4).
3. Forberedelse af sterilt vegetabilsk ekstrakt
BEMÆRK: Denne metode er en modificeret version af kål sterile medierproduktion 18,19.
- Køb en kål fra et supermarked. I laboratoriet, fjerne og kassér de yderste blade af kålen. Hak alle resterende kål til at passe ind i en blender og homogenisere kål til en fin pulp, dvs kål vil ikke få nogen finere med yderligere blanding.
BEMÆRK: Enhver blender, der kan hakke kål til en glat homogen pulp bør være egnet til denne metode. - Der vejes det blandede kålhomogenat, og der tilsættes 2 ml destilleret vand pr. gram kål. Filtrere den blandede kålslæmning gennem 2 lag kurvkaffefiltre (ublelet papir).
- Kålslæden tilsættes i centrifugerør (størrelsen afhænger af centrifugen). Centrifuge den filtrerede kålgylle ved 20.000 x g i 20 min. indtil store partikler sætter sig ud af opløsningen.
BEMÆRK: Det er vigtigt at centrifugere kålslællen i en længere periode, da kålpartikler hurtigt tilstoppe filtersterilisatoren. - Ved hjælp af en serologisk pipette, fjerne supernatant fra pelleted kål vragrester passe på ikke at forstyrre pelleteret kål. Hvis der sigtes mod at genskabe gæringsforhold, hvor der anvendes standardaltkoncentrationer, tilsættes 2 % w/v NaCl på dette trin (dvs. før filtersterilisering).
- Filteret steriliseres vegetabilsk ekstraktet ved hjælp af et 0,2 μm filter (500 ml eller 1 L), der er fastgjort til et vakuum. Der udleveres i sterile rør (enten 50 ml centrifugerør eller 15 ml centrifugerør) og fryses ved -80 °C, indtil det anvendes.
4. Inokulering af sterilt vegetabilsk ekstrakt
- SVE optøs, og 490 μL til 1,5 ml mikrocentrifugerør. Brug tilstrækkeligt med rør til at have mindst fem replikater pr. behandling pr. timepoint, da hver måling af tidspunkter er destruktiv.
- Optø glycerollagre af mikrobielle isolater på is og fortyndes med 1x PBS til den ønskede koncentration. Koncentrationen af mælkesyrebakterier kan være så lav som 5.000 CFU pr. ml SVE. For at opnå denne koncentration fortyndes lagrene til 250 CFUs/μL, fordi der vil blive anvendt 10 μL til inokulering af et samlet volumen på 500 μL.
- Podes SVE med 10 μL fortyndet mikrobiel isolat. Pipette op og ned et par gange for grundigt at blande. Inkuber ved den ønskede temperatur (14 °C for kimchi-produktionstemperatur eller 24 °C for varmeste surkålgæring).
- Mål væksthastigheden for mikrobiel isolate i SVE ved at høste replikatrør på dag 1, dag 2, dag 4, dag 7 og dag 14.
BEMÆRK: Gæringen forløber hurtigt i starten og bremser med tiden. Derfor giver flere indledende tidspunkter større opløsning på dynamikken i, hvordan gæringen skrider frem. - På hvert tidspunkt blandes den podede SVE godt ved at pipettere op og ned et par gange. Den podede SVE i serielt fortynding i 1x PBS og plade på agarplader. Agarpladerne inkuberes i 4-7 dage, før kolonierne tælles.
BEMÆRK: Man, Rogosa, og Sharpe (MRS) agar bør anvendes til at opregne alle mælkesyrebakterier, gær peptone dextrose (YPD) bør anvendes til gær, og TS agar for de fleste andre bakterier isolater fra phyllosfæren. - Prøvernes pH-h registreres på hvert tidspunkt ved hjælp af en mikro-pH-sonde.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres efter plating, fordi pH-sonden vil overføre celler mellem rør/behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vækstrater for Napa kål
Frøsterilisationsmetoden blev testet med flere forskellige Napa kål (B. rapa var pekinese; Supplerende figur 1) fra en række forskellige leverandører og alle voksede konsekvent med lignende vækstrater. Men afprøvning af metoder med forskellige arter af Brassica (B. rapa: Majroe Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid; B. juncea: Sennep Red Giant) gav begrænset succes(Supplerende Figur 2). I modsætning til Napa kål, der danner kompakte pæne rosetter, der passer ind i glasrør, disse Brassica spp. enten havde lav spiring satser efter sterilisering eller stilken aflange hurtigt at gøre en spindelagtig, usund plante. Desuden anbefales sterilisering af ældre frø (>1 år gammel), da frøfrakkerne tørrer ud, hvilket gør det sværere at fjerne dem under steriliseringsprocessen. Regelmæssigt købe nye frø og teste en delmængde af kål for at afgøre, om de er sterile, før de udfører eksperimenter.
Vækst af mikrobielle inokulanter i Napa kål phyllosfæren
Mikrobielle isolater (tabel 1) blev podet enten som enkelt stamme isolater eller i kombination med en anden isolere at lede efter pairwise interaktioner i Napa kål phyllosfæren. I alt 15 kønsfrie kål blev podet til hver behandling, og fem kål blev høstet umiddelbart efter podning, fem blev høstet fire dage efter podning, og de resterende blev høstet 10 dage efter podning. Resultaterne viser, at phyllosfæreisolater er i stand til hurtig vækst i Napa kål phyllosfæren (Figur 2).
Vækst af mikrobielle inokulanter i sterilt vegetabilsk ekstrakt
To gær(Kazachstania barnetti og Pichia membranifaciens) og tre bakterier (Lactobacillus koreensis, Pediococcus parvulus, og Leuconostoc mesenteroides) blev podet i tre forskellige typer af SVE lavet af rød, grøn, og Napa kål. Alle prøver blev inkuberet ved 24 °C, og væksten af inoculaterne over 14 dage blev registreret ved spotbesætning 5 μL af hver behandling på enten MRS- eller YPD-agarplader (n = 5). Resultaterne er vist i figur 3A. PH-værdien for hver prøve blev også registreret under hele gæringen (figur 3B) og viser, at mælkesyrebakterierne var i stand til at forsure SVE til niveauer under pH 4 (hvilket indikerer en gæring, der er sikker til konsum).
Figur 1: Diagram over kimfri kålopsætning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vækstrater for forskellige bakterier på bakteriefri Napa kål. (A) Vækst af enkelte vaccinationer i phyllosfæren. (B) Vækst efter podning to mikrober i phyllosfæren. Væksten af mikrober blev målt som kolonidannende enheder, der blev talt pr. g kålhomogenat belagt på enten TSA- eller MRS-medier. n = 5. Fejllinjer = standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Vækst af mælkesyrebakterier og gær i sterilt grøntsagsekstrakt (SVE) lavet med rød, grøn og Napa kål. (A) Væksten af mikrobielle inokulanter blev målt ved at tælle kolonidannende enheder pr. ml SVE-belagt. Gær blev belagt på YPD agar plader og bakterier på MRS agar plader. (B) Forsuring af det sterile vegetabilske ekstrakt som mikrober vokser vist som fald i pH. n = 5. Fejllinjer = standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Phyla/Slægter af mikrobielle inokulanter | Kilde til mikrobe |
| Firmicutes Bacillus | Phyllosfæren |
| Firmicutes Lactobacillus | Gæring |
| Proteobacteria Achromobacter | Phyllosfæren |
| Proteobbakterier Rhizobium | Phyllosfæren |
| Proteobakterier Sphingomonas | Phyllosfæren |
Tabel 1: Mikrobielle isolater podet på bakteriefri Napa kål.
Supplerende figur 1: Vækst af Brassica rapa var pekinensis: Bilko i kimfrie forhold. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 2: Forskellige kålsorter, der vokser under kimfrie forhold. (A) B. rapa: Turnip Purple Top, (B) B. oleracea: Cairo Hybrid, (C) B. oleracea: Tropic Giant Hybrid, (D) B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid, (E) B. juncea: Sennep Red Giant. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kimfri Napa kål planter er blevet brugt til at studere spredning begrænsning af mælkesyrebakterier i Napa kål phyllosphere17. Kimfri Napa kål kan også bruges til at teste individuelle eller par-wise vækst i phyllosfæren (Figur 1). Metoder til fremstilling af sterilt vegetabilsk ekstrakt er blevet testet for tre forskellige sorter af kål: rød, grøn og Napa. Hver af disse SV'er fungerer som et pålideligt vækstmedie. podede mikrober vokser konsekvent på tværs af de forskellige medier. Vækstrater for en enkelt stamme i SVE (figur 2) viser , at LAB vokser hurtigt og forsurer mediet på samme måde , som man kunne forvente i en gæring17.
Kimfrie planter og sterilt vegetabilsk ekstrakt kan anvendes i kombination til at behandle en række forskellige økologiske spørgsmål såsom prioriterede virkninger og arv i phyllosfæren eller inden for en gæring. Et syntetisk samfund af mikrober er let at konstruere gennem plating ud homogeniserede kål for at opnå phyllosfæren isolater, eller surkål til at opnå mælkesyrebakterier16. Pairwise-interaktioner eller leave-one-out eksperimenter med flere medlemmer af fællesskabet kan udføres i phyllosfæren eller i SVE at vurdere betydningen eller funktionen af community-medlemmer. Miljøudvælgelsesundersøgelser kan udføres i SVE, hvor virkningen af den vegetabilske fermenteret kan vurderes. Der er også mulighed for at bruge både kimfrie kål og SVE til at kvantificere diversificeringen af mikrobielle arter og samfund ved hjælp af eksperimentel udvikling.
En begrænsning af dette kimfrie kålsystem er den korte tidshorisont for forsøgene. På grund af de små glasrør, der anvendes, kål er ikke i stand til at vokse i perioder længere end en måned som deres blade er begrænset af kanten af rørene. Større voksende beholdere, såsom plantevæv kultur kasser (Tabel overmaterialer)kunne anvendes, men disse vil stadig ikke producere en fuld størrelse kål plante. Vi har også prøvet at dyrke kål i 0,75% agar indeholdende MS bouillon, men fandt, at dette producerede inkonsekvent vækst af kål planter. Brug kalcineret ler som et voksende substrat med nok MS bouillon til at mætte, men ikke oversvømme lerkorn er den optimale metode til dyrkning af sunde kål.
Der er et par kritiske skridt til at sikre en vellykket vækst af kim-fri kål. Sikring af, at det kalcinerede ler er helt tørt, når der tilføjes MS-bouillon, gør det muligt for leret fuldt ud at absorbere MS-bouillon under autoklavens cyklus. Men hvis der er nogen MS bouillon over niveauet af leret, skal det fjernes, før du tilføjer frøene; frø vil ikke spire, hvis de sidder i MS bouillon. Et andet vigtigt skridt til at overvåge er frø sterilisation. Ældre frø (>1 år gamle) vil ikke spire så hurtigt eller så pålideligt som unge frø. Ændring af størrelsen af røret, der anvendes til sterilisation eller overfyldning rørene kan også påvirke sterilisation. Sterilisationstrinnet hjælper også med at blødgøre og fjerne frølakken, så frøene hurtigt spirer. Bemærk her, at genbrug af pumpesprayflasker efter brug med mikrobielle kulturer ikke anbefales, da det er vanskeligt at fjerne biofilm fra pumpekomponenten. Det skal især bemærkes, at der udvises forsigtighed med Bacillus-arter, da de er særligt modstandsdygtige over for autoklavering. Pumpeflasker, der er kommet i kontakt med Bacillus spp, genbruges ikke.
Mens sterile vegetabilske ekstrakt ikke har den rumlige strukturering, der er til stede i en gæring fartøj, vækstdynamik LAB tyder på, at det efterligner gæring fremskridt med et hurtigt fald i pH og en stigning i væksten af mælkesyrebakterier i løbet af de 14 dage gæring. Leuconostoc mesenteroides er vigtig i begyndelsen af gæringen, og den steg i overflod hurtigere end Lactobacillus og Pediococcus spp , en tendens, der ses i andre sauerkraut succession undersøgelser20,21. Arbejdet i laboratoriet har også undersøgt ved hjælp af spektrofotometer til at opnå optisk tæthed (OD) aflæsninger til måling af væksten af LAB i SVE dispenseret i 96 brøndplader. Indledende resultater med Napa kål ekstrakt så lovende, men SVE lavet med rødkål ekstrakt ændret farve som pH faldt resulterer i forvirrede OD aflæsninger. Desuden begrænser brugen af OD-aflæsninger til at opregne vækst brugen af dette system til enkelte stammeooomuleringer. Sammen førte disse begrænsninger os til at opgive at bruge OD-aflæsninger til at måle mikrobiel vækst.
Test af økologiske interaktioner i phyllosfæren er aktuel, da der er tegn på, at phyllosfæren påvirker planteplantens sundhedog produktivitet 22. Vores model system er kun blevet udviklet til at arbejde med Napa kål, men bakterier fra phyla Proteobacteria, Firmicutes, og Actinobacteria er almindelige i phyllosfæren af mange plantearter13,23. Mens kun tre forskellige sorter af kål er blevet testet, kan SVE fremstilles sammen med andre vigtige landbrugsplanter. For eksempel kan undersøgelser, der undersøger mikrobielle samfund forsamling under gulerod saft gæring24 eller mikrobiel kolonisering af majs rod25 replikeres ved hjælp af de protokoller, der er skitseret i dette papir.
Kobling af kimfri kål med SVE for at studere samfundssamling i gæring kan vise, hvordan ændringer i phyllosfærens mikrobiom kan påvirke gæringens succes. Fordærbning af gæring eller manglende evne til at nå et tilstrækkeligt lavt pH-niveau kan resultere, hvis der ikke sker en hurtig indledende forsuring26. Disse forkælet gærer kan skyldes fremstillingsprocesser, men variation i phyllosfæren mikrobiomer kan også have en vigtig indflydelse på succesen af vegetabilske gærer17. Det beskrevne system er en nyttig model til bestemmelse af, hvad mikrobiom samlingsprocesser kan påvirke succes vegetabilsk gæring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af USDA-NIFA-tilskuddet: 2017-67013-26520. Tracy Debenport og Claire Fogan ydede teknisk support, og Ruby Ye og Casey Cosetta giver nyttige kommentarer til tidlige versioner af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
