Summary
Er is een methode ontwikkeld om kiemvrije Napakool te kweken, waarmee onderzoekers kunnen evalueren hoe enkele microbiële soorten of microbiële gemeenschappen op elkaar inwerken op koolbladoppervlakken. Er wordt ook een steriel groenteextract gepresenteerd dat kan worden gebruikt om verschuivingen in de samenstelling van de gemeenschap te meten tijdens de plantaardige gisting.
Abstract
De phyllosfeer, het bovengrondse gedeelte van de plant dat kan worden gekoloniseerd door microben, is een nuttig modelsysteem om processen van microbiële gemeenschapsassemblage te identificeren. Dit protocol schetst een systeem voor het bestuderen van microbiële gemeenschapsdynamiek in de phyllosfeer van Napa koolplanten. Het beschrijft hoe kiemvrije planten groeien in reageerbuizen met een gecalcineerde klei en voedingsbouillon substraat. Inenting van kiemvrije planten met specifieke microbiële culturen biedt mogelijkheden om microbiële groei en gemeenschapsdynamiek in de phyllosfeer te meten. Door het gebruik van steriel plantaardig extract geproduceerd uit koolverschuivingen in microbiële gemeenschappen die optreden tijdens de fermentatie kan ook worden beoordeeld. Dit systeem is relatief eenvoudig en goedkoop op te zetten in het lab en kan worden gebruikt om belangrijke ecologische vragen in microbiële gemeenschap assemblage aan te pakken. Het biedt ook mogelijkheden om te begrijpen hoe phyllosphere gemeenschap samenstelling kan invloed hebben op de microbiële diversiteit en de kwaliteit van plantaardige fermentaties. Deze aanpak voor de ontwikkeling van gnotobiotische kool phyllosphere gemeenschappen zou kunnen worden toegepast op andere wilde en agrarische plantensoorten.
Introduction
Microbiële diversiteit van de phyllosfeer speelt een belangrijke rol bij het behoud van de gezondheid van planten en kan ook invloed hebben op het vermogen van planten om milieustress te weerstaan1,2,3,4,5. De gezondheid van gewassen heeft op zijn beurt een directe invloed op de voedselveiligheid en -kwaliteit6,7. Planten spelen een rol in het functioneren van ecosystemen en de bijbehorende microbiomen hebben beide invloed op het vermogen van planten om deze activiteiten uit te voeren als het milieu zelf rechtstreeks te beïnvloeden8. Terwijl wetenschappers zijn begonnen met het ontcijferen van de functie en samenstelling van de phyllosfeer, de ecologische processen die invloed phyllosphere microbiële gemeenschap assemblage zijn niet volledig begrepen9,10. Het phyllosphere microbioom is een uitstekend experimenteel systeem voor het bestuderen van de ecologie van microbiomen11. Deze gemeenschappen zijn relatief eenvoudig en veel van de leden van de gemeenschap kunnen worden gekweekt op standaard lab media10,,12,13.
Gefermenteerde groenten zijn een systeem waarbij de gemeenschapsstructuur van de phyllosfeer belangrijke gevolgen heeft. In zowel zuurkool als kimchi dienen de microben die van nature voorkomen op groentebladeren (de fylosfeer van Brassica-soorten) als entmateriaal voor fermentatie14,15. Melkzuurbacteriën (LAB) worden beschouwd als alomtegenwoordige leden van plantaardige microbiomen, maar ze kunnen in lage overvloed in de phyllosfeer16. Sterke abiotische selectie tijdens fermentatie drijft een verschuiving in microbiële gemeenschapssamenstelling waardoor melkzuurbacteriën in overvloed kunnen toenemen. Als LAB groeien, produceren ze melkzuur dat de zure omgeving van gefermenteerde plantaardige productencreëert 17. Het verband tussen de phyllosfeer en de fermentatie biedt de mogelijkheid om groenten als model te gebruiken om te begrijpen hoe microbiomen zijn gestructureerd.
We hebben methoden ontwikkeld om kiemvrije Napa kool te kweken en in te enten met specifieke microbiële gemeenschappen met behulp van spuitflessen. Dit is een goedkope en betrouwbare methode om de kool gelijkmatig te inenten met individuele microben of gemengde gemeenschappen. Een steriel groenteextract (SVE) is ook ontwikkeld uit drie verschillende koolsoorten/variëteiten: rode en groene kool(Brassica oleracea) en Napa kool(B. rapa). De toevoeging van zout aan deze SV's repliceert de fermentatieomgeving en maakt kleinschalige en relatief hoge doorvoer experimentele studies van fermentatiemicrobioomassemblage mogelijk. Deze methoden kunnen worden gebruikt om microbiële gemeenschapsassemblage in de phyllosfeer te bestuderen en hoe microbiële gemeenschapsdynamiek in de phyllosfeer kan worden gekoppeld aan het succes van plantaardige fermentatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Groeiende kiemvrije kool
- Bereidingsapparatuur voor de teelt van kiemvrije kool
- Het reinigen van de gecalcineerde klei om fijne stofdeeltjes te verwijderen
- Spoel gecalcineerde klei(Tabel van materialen) ten minste 3x met kraanwater; water af te voeren.
LET OP: Gecalcineerde klei produceert zeer fijn stof en het wordt aanbevolen om een beschermend masker(Tafel van materialen)te dragen bij het wassen. - Verspreid gecalcineerde klei uit als een dunne laag (~ 4 cm) in een autoclave lade en autoclave op een droge cyclus (121 °C verwarming gedurende 20 min en 20 min droogtijd) te steriliseren.
- Laat de gecalcineerde klei voor gebruik volledig drogen door zich uit te spreiden op trays en gedurende ten minste een week in een warme couveuse (30−37 °C) te plaatsen. Roer om de 3 dagen te mengen om de gecalcineerde klei volledig te drogen, zodat het een gelijkmatige hoeveelheid Murashige en Skoog (MS) voedingsbouillon absorbeert (sectie 1.2).
OPMERKING: Drogen helpt ook om het volume van gecalcineerde klei te houden, zelfs wanneer het wordt gewogen in buizen. Drogen op andere manieren, zoals een droogoven, zou ook geschikt zijn.
- Spoel gecalcineerde klei(Tabel van materialen) ten minste 3x met kraanwater; water af te voeren.
- Het glaswerk reinigen voor het kweken van kiemvrije kool
- Grondig reinigen en steriliseren van de glazen buizen(Tabel van materialen) tussen elk gebruik. Week buizen gedurende 30 minuten in 30% bleekmiddeloplossing en spoel goed af met leidingwater voordat u het reinigt in een zure wasbeurt op een bacteriologie-instelling. Acid-wash two-way reageerbuisdoppen(Tabel van materialen) tussen toepassingen.
- Oppervlakte steriliseren koolzaden
- Plaats tot 100 Napa kool (B. rapa var pekinensis) zaden in een 1,5 mL microcentrifuge buis.
OPMERKING: Het toevoegen van meer dan 100 zaden aan een microcentrifugebuis of het veranderen van de grootte van de buis kan invloed hebben op de kiemsnelheid van de zaden als gevolg van gebrek aan zaadlaag verwijderen. - Voeg 1 mL ethanol toe aan de zaden en vortex gedurende 5 min. Gooi de ethanol weg met een pipet.
- Voeg 1 mL bleekwater en vortex toe gedurende 5 minuten. Gooi de bleekmiddeloplossing weg met een pipet.
- Voeg 1 mL autoclaved gedeïnamineerd water en vortex toe gedurende 5 minuten. Gooi het gedeïoniseerde water weg met een pipet.
- Herhaal stap 1.1.3.4 3x om alle bleekwater af te spoelen. Week de zaden in steriel gedeïioniseerd water gedurende 2−8 uur voorafgaand aan het planten om de zaadlaag te verzachten.
- Plaats tot 100 Napa kool (B. rapa var pekinensis) zaden in een 1,5 mL microcentrifuge buis.
- Het reinigen van de gecalcineerde klei om fijne stofdeeltjes te verwijderen
- Groeien van kiemvrije kool
OPMERKING: Napakool (B. rapa var pekinensis) worden geteeld in glazen buizen (15 cm x 2,5 cm) met gecalcineerde klei gedrenkt in Murashige en Skoog (MS) voedingsbouillon (Figuur 1).- Weeg 10 g schone kalk in een schone glazen buis (15 cm x 2,5 cm).
- Bereid MS voedingsbouillon voor door 4,4 g MS-medium op te lossen in 1 L gedeïzuuriseerd water. Voeg MS voedingsbouillon (~ 9 mL) toe aan elke glazen buis om de gecalcineerde klei te bedekken met behulp van een pipet.
OPMERKING: Staande vloeistof in de buis voorkomt dat het zaad ontkiemt, zodat het misschien wel nodig is om iets minder MS-bouillon toe te voegen aan sommige buizen. - Losjes dop glazen buizen met 22 mm tweerichtingstestbuisdoppen en autoclave (121 °C voor 60 min). Bij het verwijderen van hen uit de autoclave, duw caps op de glazen buizen om ze te verzegelen. Koel buizen tot kamertemperatuur voor gebruik.
- Plaats voorzichtig een steriel koolzaad in het midden van elke buis met behulp van steriele, extra lange (25,4 cm) tangen. Plaats de buizen in een 7-weg lade en plaats vervolgens onder lichte rekken (full-spectrum T5 tl-lampen of andere verlichtingsinstallatie voor plantengroei) met een 16 h lichtcyclus bij 24 °C.
OPMERKING: Zaden ontkiemen 's nachts en ontwikkelen hun eerste echte blad na 5 dagen. Een echt blad is het eerste vasculaire blad nadat de cotyledons zich hebben gevormd. Het heeft een meer gerimpelde rand en in Brassica rapa is bedekt met trichomen.
- Testen op steriliteit van kiemvrije kool
OPMERKING: Om te testen of de koolkiemvrij is, selecteert u uit elke partij een paar (5−10) kool en selecteert u om te bepalen of er cultureerbare kolonies aanwezig zijn.- Verwijder voorzichtig de kool uit de glazen buizen door de basis van de plant met gesteriliseerde tangen vast te pakken en eruit te trekken. Voordat u de kool volledig uit de buis verwijdert, moet u de wortels voorzichtig afsnijden met behulp van een gesteriliseerde dissectieschaar. Compact de koolbladeren in een 1,5 mL microcentrifuge buis.
OPMERKING: Grotere kool kan vereisen het verwijderen van een of twee van de grotere bladeren, terwijl de kool is nog steeds in de buis om het gemakkelijker maken om de kool te krijgen in de 1,5 mL microcentrifuge buis. Deze grotere bladeren kunnen worden toegevoegd aan de 1,5 mL buis nadat de rest van de kool is geplaatst in de buis als de hele kool nodig is. - Voeg 400 μL 1x fosfaatbuffer zout (PBS) toe aan elke 1,5 mL microcentrifuge buis. Met behulp van een steriele micropestle, homogeniseren de kool door pesten 30x.
- Plaat 100 μL van het koolhomogenaat op agarplaten om te bepalen of er verontreinigingen in het monster aanwezig zijn. De meeste bacteriën gevonden in de phyllosfeer zal groeien op tryptische soja (TS) agar platen. Gebruik brede opening pipet tips bij het plating kool homogenaat als de kool homogenaat is dik en kan verstoppen regelmatige pipet tips.
- Verwijder voorzichtig de kool uit de glazen buizen door de basis van de plant met gesteriliseerde tangen vast te pakken en eruit te trekken. Voordat u de kool volledig uit de buis verwijdert, moet u de wortels voorzichtig afsnijden met behulp van een gesteriliseerde dissectieschaar. Compact de koolbladeren in een 1,5 mL microcentrifuge buis.
2. Het inenten van de phyllosfeer met microbiële oplossingen
- Het aanmaken van glycerolbestanden van inentingsstammen
OPMERKING: Tabel 1 bevat de microbiële isolaten die in deze stap kunnen worden gebruikt. Andere phyllosfeer isolaten kunnen hier ook worden gebruikt.- Dicht streep uit individuele kolonies uit een verse streep, op twee / drie nieuwe platen van dezelfde media om veel kolonies te krijgen.
- Laat strepen 2−5 dagen groeien en schraap kolonies van alle platen in een 15 mL conische buis met 15 mL van 15% glycerol, en vortex om grondig te mengen.
- Breng een aliquot van 1 mL van de goed gemengde glycerolvoorraad over in een microcentrifugebuis van 1,5 mL en bewaar glycerolvoorraden bij -80 °C tot gebruik. Bewaar de resterende 14 mL glycerolvoorraad bij -80 °C, omdat relatief grote hoeveelheden inentingsoplossing nodig zijn bij het inenten van kool.
- Een week voor gebruik, dooi de 1,5 mL buis met 1,5 mL glycerolvoorraad (vanaf stap 2.1.3) op ijs, verdunnen en plaat bij verschillende verdunningen (bijvoorbeeld 10-4,10-5en 10-6)om de concentratie (kolonievormende eenheid [CFU] per μL) van de 14 mL inentingsoplossing te bepalen.
- Steriliseren inentingsflessen
- Demonteer de amberronde Boston pompflessen (59 mL) en week alle componenten (pomp, buis, dop en fles) in 30% bleekmiddeloplossing gedurende 30 minuten in een grote plastic container met een nauwsluitend deksel.
- Na het weken, voorzichtig giet alle bleekwater uit de container door het opheffen van slechts een hoek van het deksel van de container.
- Spoel de flessen door het vullen van de plastic container met autoclaved gedeïemiseerd water (~ 1 L, afhankelijk van de grootte van de container) en zorgvuldig giet gedeïoniseerd water, opnieuw door het opheffen van het deksel op een hoek.
- Steriliseer een bioveiligheidskast door te spuiten met 70% ethanoloplossing en het UV-licht gedurende 30 minuten aan te zetten.
OPMERKING: Zet dit werk voort in de bioveiligheidskast, zodat er geen risico is op microbiële besmetting van de flessen als ze drogen. - Verwijder flessen uit de grote plastic container en vul elke fles met autoclaved gedeïniseerd water met behulp van een pipet. De pompen weer in elkaar zetten en er een in elke fles plaatsen. Pomp het gedeïoniseerde water door elke fles (10 sprays per fles) om bleekwater uit de pompcomponent van de fles te verwijderen.
- Herhaal stap 2.2.5 om ervoor te zorgen dat alle bleekwater uit de glazen flessen wordt verwijderd.
- Test of flessen steriel zijn door het plaatsen van een nummer op elke fles (plakken lab tape aan de zijkant van de fles als het volledig droog is) voeg vervolgens 10 mL van 1x PBS aan elk van de flessen en pomp 3 sprays op een TS agar plaat. Na het spuiten, incubeer de platen voor een week bij kamertemperatuur. Als er kolonies groeien op een plaat geeft het aan dat de respectievelijke fles niet steriel was en niet mag worden gebruikt voor experimenten.
- Verwijder voor het opslaan van de steriele flessen alle resterende PBS en laat de flessen goed drogen in de bioveiligheidskast. Bewaar steriele flessen in een steriele plastic container (meestal de container die wordt gebruikt voor het bleken van de flessen) tot gebruik.
- Het bereiden van het microbiële entmateriaal en het spuiten van kiemvrije kool
LET OP: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast, omdat het spuiten van aerosolizes de microbiële oplossingen die het werkoppervlak kunnen vervuilen of een gezondheidsrisico kunnen vormen als deze op een labbank wordt uitgevoerd.
OPMERKING: Kool zal na 5 dagen echte bladeren vormen, dus het is raadzaam om een week na het planten van de kool te wachten voordat ze inenten met microbiële oplossingen. Omdat de buizen zijn afgesloten, is het niet nodig om de kool water te geven. Experimenten worden het best uitgevoerd binnen een maand na het planten, als de kleine buizen beperken de groei van de kool.- Ontdooi glycerolvoorraden op ijs en verdun in 1x PBS tot de gewenste inentingsconcentratie (concentratie bepaald door ontdooiing en beplating van een aliquot van 1 mL in stap 2.1.4).
OPMERKING: Er kunnen verschillende inentingsniveaus worden gebruikt, maar phyllosfeerisolaten kunnen in 10 dagen groeien van 104 tot 108 CFUS/mL kooldrijfmest. - Voeg 10 mL verdunde glycerolvoorraad toe aan de steriele pompfles en pomp 5 sprays in een grote afvalinzamel om eventuele resterende PBS uit de flespompcomponent te verwijderen.
- Haal het deksel uit de koolbuis, kantel de kool naar de spuitfles en spuit elke kool met 3 pompen van de inentingsoplossing, die ~ 600 μL entmateriaal biedt.
- Oogst na het inenten een deelverzameling van de kool om de werkelijke inentingsconcentratie te beoordelen. Haal de kool uit een buis met gesteriliseerde tangen. Snijd de wortels af met steriele dissectieschaar en plaats de kool voorzichtig in een voorgedeileerde steriele 1,5 mL microcentrifugebuis. Noteren van het gewicht van de kool voor toekomstige berekeningen als CFUs / g van kool nodig is voor berekeningen.
- Voeg 400 μL 1x PBS toe aan elke 1,5 mL microcentrifugebuis die kool bevat en gebruik een steriele micropestle om de kool in de 1x PBS te homogeniseren door het 30x te malen.
- Verdun koolhomogenaat (indien nodig) en plaat uit de geplaagde kool mengsel. Gebruik brede opening tips voor pipetting van de kool drijfmest, omdat het zal dik zijn en vol met stukjes plantaardig weefsel.
- Ontdooi glycerolvoorraden op ijs en verdun in 1x PBS tot de gewenste inentingsconcentratie (concentratie bepaald door ontdooiing en beplating van een aliquot van 1 mL in stap 2.1.4).
3. Het bereiden van steriel groenteextract
OPMERKING: Deze methode is een aangepaste versie van kool steriele media productie18,19.
- Koop een kool bij een supermarkt. Verwijder en gooi in het lab de buitenste bladeren van de kool weg. Hak alle resterende kool om in een blender te passen en homogeniseer kool tot een fijne pulp, d.w.z. de kool wordt niet fijner met verder mengen.
OPMERKING: Elke blender die kool kan hakken tot een gladde homogene pulp moet geschikt zijn voor deze methode. - Weeg het gemengde koolhomogenaat af en voeg 2 mL gedestilleerd water per gram kool toe. Filter de gemengde kooldrijfmest door 2 lagen mandkoffiefilters (ongebleekt papier).
- Doe de kooldrijfmest in centrifugebuizen (grootte is afhankelijk van de centrifuge). Centrifugeren de gefilterde kooldrijfmest op 20.000 x g gedurende 20 minuten totdat grote deeltjes uit de oplossing komen.
OPMERKING: Het is essentieel om de kooldrijfmest voor een lange periode te centrifugeren, omdat kooldeeltjes de filtersterilisator snel verstoppen. - Verwijder met behulp van een serologische pipet de supernatant uit het gepelde koolpuin en zorg ervoor dat de pelleted kool niet wordt verstoord. Als u streeft naar het opnieuw creëren van fermentatieomstandigheden waarbij standaardzoutconcentraties worden gebruikt, voegt u bij deze stap 2% w/v NaCl toe (d.w.z. v. filtersterilisatie).
- Filter het groenteextract met behulp van een 0,2 μm-filter (500 mL of 1 L) dat aan een vacuüm is bevestigd. Doe af in steriele buizen (50 mL centrifugebuizen of 15 mL centrifugebuizen) en vries bij -80 °C in tot gebruik.
4. Inenting van steriel groenteextract
- Ontdooi SVE en doseer 490 μL in 1,5 mL microcentrifugebuizen. Gebruik voldoende buizen om ten minste vijf replica's per behandeling per timepoint te hebben, omdat elke timepointmeting destructief is.
- Ontdooi glycerolvoorraden microbiële isolaten op ijs en verdun met 1x PBS tot de gewenste concentratie. De concentratie melkzuurbacteriën kan oplopen tot 5.000 CFU per mL SVE. Om deze concentratie te bereiken, verdunnen voorraden tot 250 CFUs/μL, omdat 10 μL zal worden gebruikt voor inenting van een totaal volume van 500 μL.
- Inenting SVE met 10 μL verdund microbiële isolaat. Pipet op en neer een paar keer grondig mengen. Incubeer bij gewenste temperatuur (14 °C voor kimchiproductietemperatuur of 24 °C voor warmste zuurkoolgisting).
- Meet de groeisnelheid van microbiële isolaat in de SVE door replicerende buizen te oogsten op dag 1, dag 2, dag 4, dag 7 en dag 14.
OPMERKING: De fermentatie verloopt in het begin snel en vertraagt in de loop van de tijd. Daarom geeft het hebben van meer initiële tijdpunten een grotere resolutie aan de dynamiek van hoe fermentatie verloopt. - Op elk momentpunt, meng de ingeënte SVE goed door pipetting op en neer een paar keer. Verdun de ingeënte SVE in 1x PBS en plaat op agarplaten. Broed de agarplaten 4−7 dagen voor het tellen van kolonies.
OPMERKING: Man, Rogosa, en Sharpe (MRS) agar moet worden gebruikt om alle melkzuurbacteriën op te sommen, gist peptone dextrose (YPD) moet worden gebruikt voor gist, en TS agar voor de meeste andere bacteriën isolaten uit de phyllosfeer. - Neem de pH van de monsters op elk timepoint op met behulp van een micro pH-sonde.
LET OP: Deze stap moet worden uitgevoerd na beplating, omdat de pH-sonde cellen tussen buizen/behandelingen zal overbrengen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Groeicijfers napakool
De zaadsterilisatiemethode werd getest met verschillende Napa-kool (B. rapa var pekinese; Aanvullend figuur 1) van een aantal verschillende leveranciers en alle groei consistent met vergelijkbare groeicijfers. Echter, het testen van de methoden met verschillende soorten Brassica (B. rapa: Raap Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid; B. juncea: Mosterd Rode Reus) gaf beperkt succes (Supplemental Figuur 2). In tegenstelling tot Napa kool die compacte nette rozetten die passen in de glazen buizen vormt, deze Brassica spp. ofwel had lage kiemkracht tarieven na sterilisatie of de stengel snel langwerpig om een stekelige, ongezonde plant te maken. Bovendien wordt het steriliseren van oudere zaden (>1 jaar oud) afgeraden omdat de zaadlagen uitdrogen waardoor het moeilijker wordt om ze te verwijderen tijdens het sterilisatieproces. Koop regelmatig nieuwe zaden en test een subset van kool om te bepalen of ze steriel zijn voordat ze experimenten uitvoeren.
Groei van microbiële entolen in de Napa koolphyllosfeer
Microbiële isolaten (Tabel 1) werden ingeënt als single strain isolaten of in combinatie met een ander isolaat om te zoeken naar pairwise interacties in de Napa kool phyllosfeer. In totaal werden 15 kiemvrije kool ingeënt voor elke behandeling en werden vijf koolen onmiddellijk na de inenting geoogst, vijf werden vier dagen na de inenting geoogst en de overige werden 10 dagen na de inenting geoogst. De resultaten tonen aan dat phyllosphere isolaten in staat zijn om snel te groeien in de Napa koolphyllosfeer (figuur 2).
Groei van microbiële entolen in steriel groenteextract
Twee gisten (Kazachstania barnetti en Pichia membranifaciens) en drie bacteriën (Lactobacillus koreensis, Pediococcus parvulus, en Leuconostoc mesenteroïden) werden ingeënt in drie verschillende soorten SVE gemaakt van rood, groen en Napa kool. Alle monsters werden geïncubeerd bij 24 °C en de groei van de inentingen gedurende 14 dagen werd geregistreerd door spot plating 5 μL van elke behandeling op MRS of YPD agar platen (n = 5). De resultaten worden weergegeven in figuur 3A. De pH van elk monster werd ook geregistreerd tijdens de fermentatie(figuur 3B) en toont aan dat de melkzuurbacteriën in staat waren om de SVE te verzuren tot een niveau onder pH 4 (wat wijst op een gisting die veilig is voor consumptie).
Figuur 1: Diagram van kiemvrije koolopstelling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Groeipercentages van verschillende bacteriën op kiemvrije Napa kool. (A) Groei van enkele inentingen in de phyllosfeer. (B) Groei na het inenten van twee microben in de phyllosfeer. De groei van microben werd gemeten als kolonievormende eenheden die per g koolhomogenaat op TSA- of MRS-media werden geteld. n = 5. Foutbalken = standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Groei van melkzuurbacteriën en gisten in steriel groenteextract (SVE) gemaakt met rood, groen en Napa kool. aA) De groei van microbiële entolen werd gemeten door kolonievormende eenheden per mL SVE verguld te tellen. Gisten werden verguld op YPD agar platen en bacteriën op MRS agar platen. (B) Verzuring van het steriele plantaardige extract als microben groeien als daling van de pH. n = 5. Foutbalken = standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Phyla/Geslachten van microbiële entmateriaal | Bron van microbe |
| Firmicutes Bacillus | Phyllosfeer |
| Firmicutes Lactobacillus | Gisting |
| Proteobacteria Achromobacter | Phyllosfeer |
| Proteobacteria Rhizobium | Phyllosfeer |
| Proteobacteria Sphingomonas | Phyllosfeer |
Tabel 1: Microbiële isolaten ingeënt op kiemvrije Napa kool.
Aanvullende figuur 1: Groei van Brassica rapa var pekinensis: Bilko in kiemvrije omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 2: Verschillende koolrassen die groeien in kiemvrije omstandigheden. (A) B. rapa: Raap Purple Top, (B) B. oleracea: Cairo Hybrid, (C) B. oleracea: Tropic Giant Hybrid, (D) B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid, (E) B. juncea: Mosterd Rode Reus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kiemvrije Napa koolplanten zijn gebruikt om verspreidingsbeperking van melkzuurbacteriën in de Napa koolphyllosfeer17te bestuderen. Kiemvrije Napakool kan ook worden gebruikt om individuele of paarsgroei in de phyllosfeer te testen (figuur 1). Methoden voor het maken van steriel groenteextract zijn getest op drie verschillende soorten kool: rood, groen en Napa. Elk van deze SVE's fungeren als een betrouwbare groei media; ingeënte microben groeien consistent over de verschillende media. Single strain growth rates in SVE (figuur 2) tonen aan dat LAB snel groeien en verzuren de media op dezelfde manier die zou worden verwacht in een gisting17.
Kiemvrije planten en steriel groenteextract kunnen in combinatie worden gebruikt om een aantal verschillende ecologische kwesties aan te pakken, zoals prioritaire effecten en opvolging in de phyllosfeer of binnen een fermentatie. Een synthetische gemeenschap van microben is eenvoudig te construeren door het plating uit gehomogeniseerde kool om phyllosphere isolaten te verkrijgen, of zuurkool om melkzuurbacteriën te verkrijgen16. Pairwise-interacties of leave-one-out experimenten met meer leden van de gemeenschap kunnen worden uitgevoerd in de phyllosfeer of in de SVE om het belang of de functie van leden van de gemeenschap te beoordelen. Milieuselectiestudies kunnen worden uitgevoerd in de SVE waar de impact van de gefermenteerde groente kan worden beoordeeld. Er is ook potentieel om zowel de kiemvrije kool als SVE te gebruiken om diversificatie van microbiële soorten en gemeenschappen te kwantificeren met behulp van experimentele evolutie.
Een beperking van dit kiemvrije koolsysteem is de korte tijdschaal van de experimenten. Vanwege de kleine glazen buizen gebruikt, de kool zijn niet in staat om te groeien voor perioden langer dan een maand als hun bladeren worden beperkt door de rand van de buizen. Grotere kweekcontainers, zoals plantenweefselkweekdozen(Table of Materials)zouden kunnen worden gebruikt, maar deze zullen nog steeds geen volle koolplant produceren. We hebben ook geprobeerd om kool te kweken in 0,75% agar met MS-bouillon, maar vonden dat dit een inconsistente groei van de koolzaailingen opdringde. Het gebruik van gecalcineerde klei als groeiend substraat met voldoende MS-bouillon om de kleikorrels te verzadigen, maar niet te overspoelen is de optimale methode voor het kweken van gezonde kool.
Er zijn een paar kritische stappen om een succesvolle groei van kiemvrije kool te garanderen. Ervoor te zorgen dat de gecalcineerde klei volledig droog is bij het toevoegen van MS bouillon kan de klei de MS bouillon volledig absorberen tijdens de autoclave cyclus. Als er echter ms-bouillon over het niveau van de klei zit, moet deze worden verwijderd voordat de zaden worden toegevoegd; zaden niet ontkiemen als ze in MS-bouillon zitten. Een andere belangrijke stap om te controleren is zaad sterilisatie. Oudere zaden (>1 jaar oud) zullen niet zo snel of betrouwbaar ontkiemen als jonge zaden. Het veranderen van de grootte van de buis die wordt gebruikt voor sterilisatie of het overvullen van de buizen kan ook van invloed zijn sterilisatie. De sterilisatie stap helpt ook verzachten en verwijderen van de zaadlaag, zodat de zaden snel ontkiemen. Houd er hier rekening mee dat het hergebruik van de pompspuitflessen na gebruik met microbiële culturen niet wordt aanbevolen, omdat het moeilijk is om biofilms uit de pompcomponent te verwijderen. Van bijzonder belang, moet voorzichtigheid worden genomen met Bacillus soorten als ze zijn bijzonder veerkrachtig voor autoclaving. Pompflessen die in contact zijn gekomen met Bacillus spp worden niet hergebruikt.
Hoewel steriele groenteextract niet de ruimtelijke structurering heeft die aanwezig is in een fermentatievat, suggereert de groeidynamiek van LAB dat het fermentatievoortgang nabootst met een snelle daling van de pH en een toename van de groei van melkzuurbacteriën gedurende de 14 dagen van fermentatie. Leuconostoc mesenteroïden is belangrijk aan het begin van de gisting en het steeg in overvloed sneller dan de Lactobacillus en Pediococcus spp, een trend gezien in andere zuurkool successie enquêtes20,21. Werk in het lab heeft ook onderzocht met behulp van spectrofotometer om optische dichtheid (OD) lezingen te verkrijgen voor het meten van de groei van LAB in SVE afgegeven in 96 put platen. Eerste resultaten met Napa kool extract zag er veelbelovend uit, maar SVE gemaakt met rode kool extract veranderde van kleur als de pH gedaald wat resulteert in verwarde OD lezingen. Bovendien beperkt het gebruik van OD-metingen om de groei op te sommen het gebruik van dit systeem tot inentingen met één soort. Samen, deze beperkingen leidde ons te verlaten met behulp van OD lezingen om microbiële groei te meten.
Het testen van ecologische interacties in de phyllosfeer is actueel omdat er aanwijzingen zijn dat de phyllosfeer de gezondheid en productiviteit van gewassen beïnvloedt22. Ons model systeem is alleen ontwikkeld om te werken met Napa kool, maar bacteriën uit de phyla Proteobacteria, Firmicutes, en Actinobacteria komen vaak voor in de phyllosfeer van vele plantensoorten13,23. Terwijl slechts drie verschillende soorten kool zijn getest, kan SVE worden gemaakt met andere belangrijke landbouwbedrijven. Bijvoorbeeld, studies onderzoeken microbiële gemeenschap assemblage tijdens degisting van wortelsap 24 of microbiële kolonisatie van maïswortel25 kan worden gerepliceerd met behulp van de protocollen beschreven in dit document.
Het koppelen van de kiemvrije kool met de SVE om gemeenschapsassemblage in fermentatie te bestuderen, kan laten zien hoe veranderingen in het phyllosphere microbioom het succes van fermentatie kunnen beïnvloeden. Bederf van fermenten of het niet bereiken van een voldoende lage pH kan het gevolg zijn als er geen snelle initiële verzuring is26. Deze bedorven fermenten kunnen te wijten zijn aan productieprocessen, maar variatie in phyllosphere microbiomen kan ook een belangrijke invloed hebben op het succes van plantaardige fermenten17. Het beschreven systeem is een nuttig model om te bepalen welke microbioom assemblageprocessen het succes van plantaardige fermentatie kunnen beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de USDA-NIFA subsidie: 2017-67013-26520. Tracy Debenport en Claire Fogan boden technische ondersteuning en Ruby Ye en Casey Cosetta geven nuttige opmerkingen over de vroege versies van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
