Summary
Es wurde eine Methode entwickelt, keimfreie Napa-Kohlsorten anzubauen, die es Forschern ermöglicht, zu bewerten, wie einzelne mikrobielle Arten oder mikrobielle Gemeinschaften mit mehreren Arten auf Kohlblattoberflächen interagieren. Es wird auch ein steriler Pflanzenextrakt präsentiert, der zur Messung von Verschiebungen in der Zusammensetzung der Gemeinschaft während der Gemüsegärung verwendet werden kann.
Abstract
Die Phyllosphäre, der oberirdische Teil der Pflanze, der von Mikroben besiedelt werden kann, ist ein nützliches Modellsystem, um Prozesse der mikrobiellen Gemeinschaftsmontage zu identifizieren. Dieses Protokoll skizziert ein System zur Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre von Napa-Kohlpflanzen. Es beschreibt, wie keimfreie Pflanzen in Reagenzgläsern mit einem kalzinierten Ton- und Nährboden anwachsen. Die Impfung von keimfreien Pflanzen mit spezifischen mikrobiellen Kulturen bietet Möglichkeiten, das mikrobielle Wachstum und die Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre zu messen. Durch die Verwendung von sterilem Pflanzenextrakt aus Kohl können auch Verschiebungen in mikrobiellen Gemeinschaften, die während der Fermentation auftreten, bewertet werden. Dieses System ist relativ einfach und kostengünstig im Labor einzurichten und kann verwendet werden, um wichtige ökologische Fragen in der mikrobiellen Gemeinschaftsversammlung zu behandeln. Es bietet auch Möglichkeiten zu verstehen, wie die Zusammensetzung der Phyllosphärengemeinschaft die mikrobielle Vielfalt und Qualität der pflanzlichen Fermentationen beeinflussen kann. Dieser Ansatz zur Entwicklung von gnotobiotischen Kohlphyllosphärengemeinschaften könnte auf andere wilde und landwirtschaftliche Pflanzenarten angewendet werden.
Introduction
Die mikrobielle Vielfalt der Phyllosphäre spielt eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Pflanzengesundheit und kann auch die Fähigkeit von Pflanzen beeinflussen, Umweltbelastungen zu widerstehen1,2,3,4,5. Die Gesundheit der Kulturen wiederum wirkt sich direkt auf die Lebensmittelsicherheit und die Qualität6,7aus. Pflanzen spielen eine Rolle bei der Funktionsweise des Ökosystems und die damit verbundenen Mikrobiome beeinflussen sowohl die Fähigkeit der Pflanzen, diese Aktivitäten durchzuführen, als auch die Umwelt selbst direkt zu beeinflussen8. Während Wissenschaftler begonnen haben, die Funktion und Zusammensetzung der Phyllosphäre zu entschlüsseln, werden die ökologischen Prozesse, die die mikrobielle Gemeinschaft der Phyllosphäre beeinflussen, nicht vollständig verstanden9,10. Das Phyllosphärenmikrobiom ist ein ausgezeichnetes experimentelles System zur Erforschung der Ökologie von Mikrobiomen11. Diese Communities sind relativ einfach und viele der Community-Mitglieder können auf Standard-Labormedien10,12,13angebaut werden.
Fermentiertes Gemüse ist ein System, bei dem die Gemeinschaftsstruktur der Phyllosphäre wichtige Folgen hat. Sowohl im Sauerkraut als auch in der Kimchi dienen die Mikroben, die natürlicherweise auf gemüseblättern (der Phyllosphäre der Brassica-Arten) vorkommen, als Inokulum für die Fermentation14,15. Milchsäurebakterien (LAB) gelten als allgegenwärtige Mitglieder pflanzlicher Mikrobiome, können aber in der Phyllosphäre16in geringem Überfluss vorhanden sein. Starke abiotische Selektion während der Fermentation treibt eine Verschiebung der mikrobiellen Gemeinschaftszusammensetzung, die es Milchsäurebakterien ermöglicht, in Hülle und Fülle zu zunehmen. Während LAB wächst, produzieren sie Milchsäure, die die saure Umgebung von fermentierten pflanzlichen Produkten17 schafft. Die Verbindung zwischen phyllosphere und ferment bietet die Möglichkeit, Gemüse als Modell zu verwenden, um zu verstehen, wie Mikrobiome strukturiert sind.
Wir haben Methoden entwickelt, um keimfreie Napa-Kohlsorten anzubauen und sie mit speziellen mikrobiellen Gemeinschaften mit Sprühflaschen zu impfen. Dies ist eine kostengünstige und zuverlässige Methode, um den Kohl gleichmäßig mit einzelnen Mikroben oder gemischten Gemeinschaften zu impfen. Ein steriler Gemüseextrakt (SVE) wurde auch aus drei verschiedenen Kohlsorten/Sorten entwickelt: Rot- und Grünkohl (Brassica oleracea) und Napa Kohl (B. rapa). Die Zugabe von Salz zu diesen SVEs repliziert die Fermentationsumgebung und ermöglicht kleine und relativ hochdurchsatzige experimentelle Studien der Fermentationsmikrobiom-Montage. Diese Methoden können verwendet werden, um die mikrobielle Gemeinschaftsmontage in der Phyllosphäre zu untersuchen und wie die mikrobielle Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre mit dem Erfolg der pflanzlichen Fermentation in Verbindung gebracht werden kann.
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Protocol
1. Keimfreie Kohlsorten anbauen
- Vorbereitungsgeräte für den Anbau von keimfreiem Kohl
- Reinigung des kalzinierten Tons zur Entfernung von Feinstaubpartikeln
- Kalzinierten Ton(Materialtabelle) mindestens 3x mit Leitungswasser abspülen; Wasser ablassen.
VORSICHT: Kalkton produziert sehr feinen Staub und es wird empfohlen, beim Waschen eine Schutzmaske(Materialtabelle)zu tragen. - Kalzinierten Ton als dünne Schicht (ca. 4 cm) in ein Autoklaventablett und Autoklaven in einem trockenen Zyklus (121 °C Erhitzung für 20 min und 20 min Trocknungszeit) verteilen, um zu sterilisieren.
- Lassen Sie den kalzinierten Ton vor der Verwendung vollständig trocknen, indem Sie ihn auf Schalen ausbreiten und mindestens eine Woche lang in einen warmen Inkubator (30 bis 37 °C) geben. Rühren Sie alle 3 Tage, um den kalzinierten Ton vollständig zu trocknen, so dass er eine gleichmäßige Menge an Murashige und Skoog (MS) Nährstoffbrühe absorbiert (Abschnitt 1.2).
HINWEIS: Das Trocknen hilft auch, das Volumen von kalziniertem Ton zu halten, auch wenn er in Rohre gewogen wird. Auch das Trocknen mit anderen Mitteln, wie z.B. einem Trockenschrank, wäre geeignet.
- Kalzinierten Ton(Materialtabelle) mindestens 3x mit Leitungswasser abspülen; Wasser ablassen.
- Reinigung der Gläser für den Anbau von keimfreiem Kohl
- Gründlich reinigen und sterilisieren die Glasröhren (Tabelle der Materialien) zwischen jedem Einsatz. Rohre für 30 min in 30% Bleichlösung einweichen und gut mit Leitungswasser abspülen, bevor sie in einer Säurewäsche auf einer Bakteriologie-Einstellung gereinigt werden. Säure-Wasch-Zwei-Wege-Reagenzglaskappen (Materialtabelle) zwischen den Verwendungen.
- Oberflächensterilisation kohlsamen
- Bis zu 100 Napa-Kohl (B. rapa var pekinensis) Samen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben.
HINWEIS: Das Hinzufügen von mehr als 100 Samen zu einem Mikrozentrifugenrohr oder die Änderung der Größe des Rohres kann die Keimraten der Samen aufgrund fehlender Entfernung von Samenmänteln beeinflussen. - Fügen Sie 1 ml 70% Ethanol in die Samen und Wirbel für 5 min. Entsorgen Sie das Ethanol mit einer Pipette.
- Fügen Sie 1 ml 50% Bleichmittel und Wirbel für 5 min. Entsorgen Sie die Bleichlösung mit einer Pipette.
- Fügen Sie 1 ml autoklaviertes entionisiertes Wasser und Wirbel für 5 min. Entsorgen Sie das entionisierte Wasser mit einer Pipette.
- Wiederholen Sie Schritt 1.1.3.4 3x, um alle Bleichmittel abzuspülen. Die Samen vor der Pflanzung in sterilem entionisiertem Wasser einweichen, um das Samenfell zu erweichen.
- Bis zu 100 Napa-Kohl (B. rapa var pekinensis) Samen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben.
- Reinigung des kalzinierten Tons zur Entfernung von Feinstaubpartikeln
- Keimfreier Kohl anbauen
HINWEIS: Napa Kohl (B. rapa var pekinensis) werden in Glasröhren (15 cm x 2,5 cm) mit kalziniertem Ton in Murashige und Skoog (MS) Nährbrühe eingeweicht angebaut (Abbildung 1).- 10 g sauberen kalkhaltigen Ton in ein sauberes Glasrohr (15 cm x 2,5 cm) wiegen.
- Bereiten Sie MS-Nährstoffbrühe vor, indem Sie 4,4 g MS-Medium in 1 L entionisiertem Wasser auflösen. Fügen Sie MS-Nährbodenbrühe (ca. 9 ml) zu jedem Glasrohr hinzu, um den kalzinierten Ton mit einer Pipette zu bedecken.
HINWEIS: Stehende Flüssigkeit im Rohr verhindert, dass das Saatgut keimt, so dass es notwendig sein könnte, einigen Röhren etwas weniger MS-Brühe hinzuzufügen. - Lose Kappenglasrohre mit 22 mm Zwei-Wege-Reagenzglaskappen und Autoklaven (121 °C für 60 min). Wenn Sie sie aus dem Autoklaven entfernen, schieben Sie Kappen auf die Glasrohre, um sie zu versiegeln. Vor Gebrauch Rohre auf Raumtemperatur kühlen.
- Legen Sie vorsichtig einen sterilen Kohlsamen in die Mitte jedes Rohres mit sterilen, extralangen (25,4 cm) Zangen. Legen Sie die Rohre in eine 7-Wege-Schale und dann unter Lichtgestellen (Vollspektrum-T5-Leuchtstofflampen oder andere Beleuchtungseinstellungen für das Pflanzenwachstum) mit einem 16-Stunden-Lichtzyklus bei 24 °C.
HINWEIS: Samen keimen über Nacht und entwickeln ihr erstes wahres Blatt nach 5 Tagen. Ein wahres Blatt ist das erste Gefäßblatt, nachdem sich die Kotyledonen gebildet haben. Es hat eine eher faltige Kante und in Brassica rapa ist in Trichome bedeckt.
- Prüfung auf Sterilität von keimfreiem Kohl
HINWEIS: Um zu testen, ob die Kohlsorten keimfrei sind, wählen Sie aus jeder Charge und Platte ein paar Kohlsorten aus, um festzustellen, ob kultische Kolonien vorhanden sind.- Entfernen Sie den Kohl vorsichtig aus den Glasröhren, indem Sie die Basis der Pflanze mit sterilisierten Zangen greifen und herausziehen. Bevor Sie den Kohl vollständig aus dem Rohr entfernen, schneiden Sie die Wurzeln vorsichtig mit einer sterilisierten Sezierschere ab. Die Kohlblätter in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr verdichten.
HINWEIS: Größere Kohlsorten erfordern möglicherweise das Entfernen eines oder zwei der größeren Blätter, während sich der Kohl noch in der Röhre befindet, um es einfacher zu machen, den Kohl in das 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr zu bekommen. Diese größeren Blätter können dem 1,5 ml Rohr hinzugefügt werden, nachdem der Rest des Kohls in das Rohr gelegt wurde, wenn der gesamte Kohl benötigt wird. - Fügen Sie jedem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr 400 l 1x Phosphatpuffer-Saline (PBS) hinzu. Mit einem sterilen Mikroschädling den Kohl durch 30-faches Schädling sanieren.
- Platte 100 l des Kohls homogenisiert auf Agarplatten, um festzustellen, ob in der Probe Verunreinigungen vorhanden sind. Die meisten Bakterien, die in der Phyllosphäre gefunden werden, wachsen auf tryptischen Sojaplatten (TS). Verwenden Sie breite Öffnungspipettenspitzen beim Plattieren kohlhomogenat, da das Kohlhomogenat dick ist und regelmäßige Pipettenspitzen verstopfen kann.
- Entfernen Sie den Kohl vorsichtig aus den Glasröhren, indem Sie die Basis der Pflanze mit sterilisierten Zangen greifen und herausziehen. Bevor Sie den Kohl vollständig aus dem Rohr entfernen, schneiden Sie die Wurzeln vorsichtig mit einer sterilisierten Sezierschere ab. Die Kohlblätter in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr verdichten.
2. Inokulation der Phyllosphäre mit mikrobiellen Lösungen
- Herstellung von Glycerinvorräten von Impfstämmen
HINWEIS: In Tabelle 1 sind die mikrobiellen Isolate aufgeführt, die in diesem Schritt verwendet werden können. Auch andere Phyllosphärenisolate könnten hier verwendet werden.- Dicht streifen einzelne Kolonien von einem frischen Streifen, auf zwei /drei neue Platten der gleichen Medien, um viele Kolonien zu bekommen.
- Lassen Sie Streifen für 2 bis 5 Tage wachsen, dann kratzen Kolonien von allen Platten in ein 15 ml konisches Rohr mit 15 ml 15% Glycerin, und Wirbel gründlich zu mischen.
- Übertragen Sie ein Aliquot von 1 ml des gut gemischten Glycerinbestands in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und lagern Sie Die Glycerinbestände bei -80 °C bis zur Verwendung. Sparen Sie die restlichen 14 ml Glycerinbestand bei -80 °C, da bei der Impfung von Kohl relativ große Mengen an Impflösung erforderlich sind.
- Eine Woche vor Gebrauch das 1,5 ml-Rohr mit 1 ml Glycerinstock (ab Schritt 2.1.3) auf Eis, verdünnt und platte bei mehreren verschiedenen Verdünnungen (z. B. 10-4, 10-5und 10-6) auftauen, um die Konzentration (koloniebildende Einheit [KBE] pro L) der 14 ml Impflösung zu bestimmen.
- Sterilisierende Impfsprayflaschen
- Zerlegen Sie die bernsteinfarbenen runden Boston Pumpenflaschen (59 ml) und tränken Sie alle Komponenten (Pumpe, Rohr, Kappe und Flasche) in 30% Bleichlösung für 30 min in einem großen Kunststoffbehälter mit einem eng anliegenden Deckel.
- Nach dem Einweichen alle Bleichmittel vorsichtig aus dem Behälter gießen, indem Sie nur eine Ecke des Deckels des Behälters heben.
- Spülen Sie die Flaschen, indem Sie den Kunststoffbehälter mit autoklaviertem entionisiertem Wasser (je nach Behältergröße 1 L) befüllen und vorsichtig entionisiertes Wasser ausgießen, indem Sie den Deckel an einer Ecke anheben.
- Sterilisieren Sie einen Biosicherheitsschrank, indem Sie mit 70% Ethanollösung besprühen und das UV-Licht 30 min einschalten.
HINWEIS: Setzen Sie diese Arbeit im Biosicherheitsschrank fort, damit keine Gefahr einer mikrobiellen Kontamination der Flaschen besteht, wenn sie lufttrocken sind. - Entfernen Sie Flaschen aus dem großen Kunststoffbehälter und füllen Sie jede Flasche mit autoklaviertem entionisiertem Wasser mit einer Pipette. Montieren Sie die Pumpen wieder zusammen und legen Sie eine in jede Flasche. Pumpen Sie das entionisierte Wasser durch jede Flasche (10 Sprays pro Flasche), um Bleichmittel aus der Pumpenkomponente der Flasche zu entfernen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.2.5, um sicherzustellen, dass alle Bleichmittel aus den Glasflaschen entfernt werden.
- Testen Sie, ob Flaschen steril sind, indem Sie eine Nummer auf jede Flasche legen (Laborband an der Seite der Flasche kleben, wenn es vollständig trocken ist), und fügen Sie dann 10 ml 1x PBS zu jeder der Flaschen hinzu und pumpen Sie 3 Sprays auf eine TS-Agarplatte. Nach dem Sprühen die Platten eine Woche bei Raumtemperatur bebrüten. Wenn Kolonien auf einem Teller wachsen, bedeutet dies, dass die jeweilige Flasche nicht steril war und nicht für Experimente verwendet werden sollte.
- Vor der Lagerung der sterilen Flaschen alle verbleibenden PBS entfernen und die Flaschen gründlich im Biosicherheitsschrank trocknen lassen. Bewahren Sie sterile Flaschen in einem sterilen Kunststoffbehälter (in der Regel den Behälter zum Bleichen der Flaschen) bis zur Verwendung auf.
- Vorbereitung des mikrobiellen Inokulums und Sprühen von keimfreiem Kohl
VORSICHT: Alle Schritte sollten in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden, da das Sprühen die mikrobiellen Lösungen aerosolisiert, die Arbeitsflächen kontaminieren oder ein Gesundheitsrisiko darstellen könnten, wenn sie auf einer Laborbank durchgeführt werden.
HINWEIS: Kohl bildet nach 5 Tagen echte Blätter, daher ist es ratsam, eine Woche nach der Pflanzung des Kohls zu warten, bevor er mit mikrobiellen Lösungen impfen kann. Da die Rohre versiegelt sind, besteht keine Notwendigkeit, den Kohl zu wässern. Experimente werden am besten innerhalb eines Monats nach der Pflanzung durchgeführt, da die kleinen Röhren das Wachstum des Kohls einschränken.- Glycerinvorräte auf Eis auftauen und in 1x PBS auf die gewünschte Impfkonzentration verdünnen (Konzentration durch Auftauen und Plattieren eines 1 ml Aliquot in Schritt 2.1.4 bestimmt).
HINWEIS: Es können verschiedene Impfstufen verwendet werden, aber Phyllosphärenisolate können innerhalb von 10 Tagen von 104 bis 108 KBE/ml Kohlschlämme wachsen. - Fügen Sie 10 ml verdünnten Glyzerinbestand in die sterile Pumpenflasche und pumpen Sie 5 Sprays in ein großes Abfallsammelbecher, um restliche PBS aus der Flaschenpumpenkomponente zu entfernen.
- Entfernen Sie den Deckel aus dem Kohlrohr, neigen Sie den Kohl in Richtung der Sprühflasche und sprühen Sie jeden Kohl mit 3 Pumpen der Impflösung, die für inokulum 600 l liefert.
- Nach der Impfung eine Teilmenge der Kohlsorten ernten, um die tatsächliche Inokulationskonzentration zu bewerten. Entfernen Sie den Kohl aus einem Rohr mit sterilisierten Zangen. Schneiden Sie die Wurzeln mit einer sterilen Sezierschere ab und legen Sie den Kohl vorsichtig in ein vorgewogenes steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Zeichnen Sie das Gewicht des Kohls für zukünftige Berechnungen auf, wenn KBE/g Kohl für Berechnungen erforderlich ist.
- Fügen Sie 400 l 1x PBS zu jedem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Kohl hinzu und verwenden Sie ein steriles Mikropestle, um den Kohl in die 1x PBS zu homogenisieren, indem er ihn 30x mahlt.
- Kohl homogenisieren (falls erforderlich) und die geponte Kohlmischung verdünnen. Verwenden Sie breite Öffnungsspitzen zum Pipetieren der Kohlschlämme, da sie dick und voller pflanzlicher Gewebestücke sein wird.
- Glycerinvorräte auf Eis auftauen und in 1x PBS auf die gewünschte Impfkonzentration verdünnen (Konzentration durch Auftauen und Plattieren eines 1 ml Aliquot in Schritt 2.1.4 bestimmt).
3. Zubereitung steriler Pflanzenextrakt
HINWEIS: Diese Methode ist eine modifizierte Version der Kohl sterilen Medienproduktion18,19.
- Kaufen Sie einen Kohl im Supermarkt. Entfernen und entsorgen Sie im Labor die äußersten Blätter des Kohls. Schneiden Sie den restlichen Kohl, um in einen Mixer zu passen und homogenisieren Kohl zu einem feinen Fruchtfleisch, d.h. der Kohl wird nicht feiner mit weiterer Mischung.
HINWEIS: Jeder Mixer, der Kohl zu einem glatten homogenen Fruchtfleisch hacken kann, sollte für diese Methode geeignet sein. - Den gemischten Kohl homogenieren und 2 ml destilliertes Wasser pro Gramm Kohl hinzufügen. Filtern Sie die gemischte Kohlschlämme durch 2 Schichten Korbkaffeefilter (ungebleichtes Papier).
- Die Kohlschlämme in Zentrifugenröhrchen geben (die Größe ist abhängig von der Zentrifuge). Zentrifugieren Sie die gefilterte Kohlschlämme bei 20.000 x g für 20 min, bis sich große Partikel aus der Lösung absetzen.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Kohlschlämme für einen langen Zeitraum zu zentrieren, da Kohlpartikel den Filtersterilisator schnell verstopfen. - Mit einer serologischen Pipette, entfernen Sie den Überstand aus den pelleted Kohl Schutt, um darauf zu achten, den Pellet Kohl nicht zu stören. Wenn Ziel der Wiederherstellung von Fermentationsbedingungen, unter denen Standardsalzkonzentrationen verwendet werden, 2% w/v NaCl bei diesem Schritt hinzufügen (d. h. vor der Filtersterilisation).
- Filter sterilisieren Sie den Pflanzenextrakt mit einem 0,2 m-Filter (500 ml oder 1 L), der an einem Vakuum befestigt ist. In sterile Schläuche (entweder 50 ml Zentrifugenrohre oder 15 ml Zentrifugenrohre) geben und bei -80 °C einfrieren, bis sie verwendet werden.
4. Impfung von sterilem Pflanzenextrakt
- SVE auftauen und 490 l in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre geben. Verwenden Sie genügend Rohre, um mindestens fünf Replikationen pro Behandlung pro Zeitpunkt zu haben, da jede Zeitpunktmessung destruktiv ist.
- Glycerinbestände an mikrobiellen Isolaten auf Eis auftauen und mit 1x PBS auf die gewünschte Konzentration verdünnen. Die Konzentration von Milchsäurebakterien kann bis zu 5.000 KBE pro ml SVE betragen. Um diese Konzentration zu erreichen, werden die Lagerbestände auf 250 KBE/L verdünnt, da 10 l für die Impfung mit einem Gesamtvolumen von 500 l verwendet werden.
- Impfen Sie SVE mit 10 l verdünntem mikrobiellem Isolat. Pipette ein paar Mal rauf und runter, um gründlich zu mischen. Bei gewünschter Temperatur inkubieren (14 °C für Kimchi-Produktionstemperatur oder 24 °C für wärmste Sauerkrautfermentation).
- Messen Sie die Wachstumsrate des mikrobiellen Isolats im SVE, indem Sie replizierte Rohre am Tag 1, Tag 2, Tag 4, Tag 7 und Tag 14 ernten.
HINWEIS: Die Gärung verläuft von Anfang an schnell und verlangsamt sich mit der Zeit. Daher gibt mehr Anfangszeitpunkte eine größere Lösung für die Dynamik des Fermentationsverlaufs. - Mischen Sie den geimpften SVE zu jedem Zeitpunkt gut, indem Sie ein paar Mal auf und ab pfeifen. Den geimpften SVE in 1x PBS und Platte auf Agarplatten seriell verdünnen. Inkubieren Sie die Agarplatten für 4 bis 7 Tage, bevor Sie Kolonien zählen.
HINWEIS: Mann, Rogosa und Sharpe (MRS) Agar sollte verwendet werden, um alle Milchsäurebakterien aufzuzählen, Hefe Pepton-Dextrose (YPD) sollte für Hefe verwendet werden, und TS-Agar für die meisten anderen Bakterienisolate aus der Phyllosphäre. - Zeichnen Sie den pH-Wert der Proben zu jedem Zeitpunkt mit einer Mikro-pH-Sonde auf.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte nach der Beschichtung durchgeführt werden, da die pH-Sonde Zellen zwischen Röhren/Behandlungen überträgt.
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Representative Results
Wachstumsraten von Napa-Kohl
Die Samensterilisationsmethode wurde mit mehreren verschiedenen Napa Kohlsorten getestet (B. rapa var pekinese; Ergänzende Abbildung 1) von einer Reihe von verschiedenen Lieferanten und alle wuchsen konsequent mit ähnlichen Wachstumsraten. Jedoch, Testen der Methoden mit verschiedenen Arten von Brassica (B. rapa: Rüben lila Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid; B. juncea: Senf Roter Riese) gab begrenzten Erfolg (Ergänzungsfigur 2). Im Gegensatz zu Napa Kohl, der kompakte, gepflegte Rosetten bildet, die in die Glasröhren passen, hatten diese Brassica spp. entweder niedrige Keimraten nach der Sterilisation oder der Stamm längte sich schnell zu einer spindeligen, ungesunden Pflanze. Darüber hinaus wird die Sterilisation älterer Samen (>1 Jahr alt) nicht empfohlen, da die Samenmäntel austrocknen, was es schwieriger macht, sie während des Sterilisationsprozesses zu entfernen. Kaufen Sie regelmäßig neue Samen und testen Sie eine Teilmenge Kohl, um festzustellen, ob sie steril sind, bevor Sie Experimente durchführen.
Wachstum von mikrobiellen Inokulanten in der Napa Kohlphyllosphäre
Mikrobielle Isolate (Tabelle 1) wurden entweder als Einzelstammisolate oder in Kombination mit einem anderen Isolat geimpft, um in der Napa-Kohlphyllosphäre nach paarweise Wechselwirkungen zu suchen. Für jede Behandlung wurden 15 keimfreie Kohlsorten geimpft und fünf Kohlsorten unmittelbar nach der Impfung geerntet, fünf vier Tage nach der Impfung geerntet und die restlichen 10 Tage nach der Impfung geerntet. Die Ergebnisse zeigen, dass Phyllosphärenisolate in der Napa-Kohlphyllosphäre schnell wachsen können (Abbildung 2).
Wachstum von mikrobiellen Inokulanten in sterilem Pflanzenextrakt
Zwei Hefen (Kazachstania barnetti und Pichia membranifaciens) und drei Bakterien (Lactobacillus koreensis, Pediococcus parvulusund Leuconostoc mesenteroides) wurden in drei verschiedene Arten von SVE aus Rot, Grün und Napa Kohl geimpft. Alle Proben wurden bei 24 °C inkubiert und das Wachstum der Inokulaten über 14 Tage wurde durch Spot-Beschichtung von 5 l jeder Behandlung auf MRS- oder YPD-Agarplatten (n = 5) aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3Adargestellt. Der pH-Wert jeder Probe wurde auch während der Gärung aufgezeichnet (Abbildung 3B) und zeigt, dass die Milchsäurebakterien in der Lage waren, den SVE auf Werte unter pH4 zu säuern (was auf eine für den Verzehr unbedenkliche Gärung hindeutet).
Abbildung 1: Diagramm der keimfreien Kohleinrichtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Wachstumsraten verschiedener Bakterien auf keimfreiem Napa-Kohl. (A) Wachstum einzelner Impfungen in der Phyllosphäre. (B) Wachstum nach der Impfung von zwei Mikroben in die Phyllosphäre. Das Wachstum von Mikroben wurde als koloniebildende Einheiten gemessen, die pro g Kohlhomogenat gezählt wurden, das entweder auf TSA- oder MRS-Medien plattiert wurde. n = 5. Fehlerbalken = Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Wachstum von Milchsäurebakterien und Hefen in sterilem Pflanzenextrakt (SVE) mit Rot-, Grün- und Napakohl. (A) Das Wachstum von mikrobiellen Inokulanzien wurde gemessen, indem Koloniebildeinheiten pro ml SVE plattiert gezählt wurden. Hefen wurden auf YPD-Agarplatten und Bakterien auf MRS-Agarplatten plattiert. (B) Versauerung des sterilen Pflanzenextrakts, wenn Mikroben wachsen, die als rückgang des pH-Werts dargestellt werden. n = 5. Fehlerbalken = Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Phyla/Genera von mikrobiellen Inokulanten | Quelle der Mikrobe |
| Firmicutes Bacillus | Phyllosphäre |
| Firmicutes Lactobacillus | Gärung |
| Proteobacteria Achromobacter | Phyllosphäre |
| Proteobacteria Rhizobium | Phyllosphäre |
| Proteobacteria Sphingomonas | Phyllosphäre |
Tabelle 1: Mikrobielle Isolate, die auf keimfreiem Napa-Kohl geimpft werden.
Ergänzende Figur 1: Wachstum von Brassica rapa var pekinensis: Bilko unter keimfreien Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 2: Verschiedene Kohlsorten, die unter keimfreien Bedingungen wachsen. (A) B. rapa: Rüben lila Top, (B) B . oleracea: Cairo Hybrid, (C) B. oleracea: Tropic Giant Hybrid, (D) B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid, (E) B. juncea: Senf Roter Riese. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Keimfreie Napa-Kohlpflanzen wurden verwendet, um die Dispersionsbeschränkung von Milchsäurebakterien in der Napa Kohlphyllosphäre17zu untersuchen. Keimfreie Napa-Kohlsorten können auch verwendet werden, um individuelles oder paarweises Wachstum in der Phyllosphäre zu testen (Abbildung 1). Methoden zur Herstellung von sterilem Pflanzenextrakt wurden für drei verschiedene Kohlsorten getestet: Rot, Grün und Napa. Jede dieser SVE fungiert als zuverlässiges Wachstumsmedium; geimpfte Mikroben wachsen durchgängig über die verschiedenen Medien. Die Wachstumsraten der einzelnen Stämme in SVE (Abbildung 2) zeigen, dass LAB schnell wächst und die Medien auf die gleiche Weise säuert, wie es bei einer Fermentation erwartet würde17.
Keimfreie Pflanzen und steriler Pflanzenextrakt können in Kombination verwendet werden, um eine Reihe von verschiedenen ökologischen Fragen wie Prioritätseffekte und Abfolge in der Phyllosphäre oder innerhalb einer Gärung zu behandeln. Eine synthetische Gemeinschaft von Mikroben ist einfach zu konstruieren, indem homogenisierte Kohlsorten ausgeplatttit werden, um Phyllosphärenisolate zu erhalten, oder Sauerkraut, um Milchsäurebakterien zu erhalten16. Paar-Interaktionen oder Leave-One-out-Experimente mit mehr Community-Mitgliedern können in der Phyllosphäre oder im SVE durchgeführt werden, um die Bedeutung oder Funktion von Community-Mitgliedern zu bewerten. Umweltauswahlstudien können im SVE durchgeführt werden, wo die Auswirkungen des fermentierten Gemüses bewertet werden können. Es besteht auch das Potenzial, sowohl den keimfreien Kohl als auch SVE zu nutzen, um die Diversifizierung von mikrobiellen Arten und Gemeinschaften mithilfe experimenteller Evolution zu quantifizieren.
Eine Einschränkung dieses keimfreien Kohlsystems ist der kurze Zeitrahmen der Experimente. Aufgrund der verwendeten kleinen Glasröhren können die Kohlsorten nicht länger als einen Monat wachsen, da ihre Blätter durch den Rand der Rohre begrenzt sind. Größere Anbaubehälter, wie z.B. Pflanzengewebekultur-Boxen (Materialtabelle) könnten verwendet werden, aber diese werden immer noch keine Kohlpflanze in voller Größe produzieren. Wir haben auch versucht, Kohl in 0,75% Agar mit MS-Brühe anzubauen, aber festgestellt, dass dies zu einem inkonsistenten Wachstum der Kohlsämlinge führte. Die Verwendung von kalziniertem Ton als wachsendes Substrat mit genügend MS-Brühe, um die Tonkörner zu sättigen, aber nicht zu überfluten, ist die optimale Methode für den Anbau von gesundem Kohl.
Es gibt einige wichtige Schritte, um ein erfolgreiches Wachstum von keimfreiem Kohl zu gewährleisten. Die Sicherstellung, dass der kalzinierte Ton vollständig trocken ist, wenn MS-Brühe hinzugefügt wird, ermöglicht es dem Ton, die MS-Brühe während des Autoklavenzyklus vollständig zu absorbieren. Wenn es jedoch eine MS-Brühe über dem Niveau des Tons gibt, muss sie entfernt werden, bevor die Samen hinzugefügt werden; Samen keimen nicht, wenn sie in MS-Brühe sitzen. Ein weiterer wichtiger Schritt zur Überwachung ist die Samensterilisation. Ältere Samen (>1 Jahre alt) keimen nicht so schnell oder zuverlässig wie junge Samen. Die Änderung der Größe des Rohres, das für die Sterilisation oder Überfüllung der Rohre verwendet wird, kann sich auch auf die Sterilisation auswirken. Der Sterilisationsschritt hilft auch, das Samenfell zu erweichen und zu entfernen, so dass die Samen schnell keimen. Beachten Sie hier, dass die Wiederverwendung der Pumpensprühflaschen nach der Verwendung mit mikrobiellen Kulturen nicht empfohlen wird, da es schwierig ist, Biofilme aus der Pumpenkomponente zu entfernen. Besonders hervorzuheben ist, dass bei Bacillus-Arten Vorsicht geboten ist, da sie besonders widerstandsfähig gegen Autoklavieren sind. Alle Pumpenflaschen, die mit Bacillus spp in Kontakt gekommen sind, werden nicht wiederverwendet.
Während steriler Pflanzenextrakt nicht die räumliche Strukturierung hat, die in einem Fermentationsgefäß vorhanden ist, deutet die Wachstumsdynamik von LAB darauf hin, dass es den Fermentationsfortschritt mit einem schnellen Rückgang des pH-Werts und einem Wachstum von Milchsäurebakterien während der 14 Tage der Fermentation imitiert. Leuconostoc mesenteroides ist wichtig zu Beginn der Fermentation und es stieg in Hülle und Fülle schneller als die Lactobacillus und Pediococcus spp, ein Trend in anderen Sauerkraut-Nachfolge-Erhebungengesehen 20,21. Die Arbeit im Labor hat auch mit Spektralphotometer untersucht, um optische Dichte (OD) Messwerte für die Messung des Wachstums von LAB in SVE in 96 Brunnenplatten abgegeben zu erhalten. Erste Ergebnisse mit Napa Kohl-Extrakt sah vielversprechend, aber SVE mit Rotkohl-Extrakt änderte Farbe, wie der pH-Wert fiel, was zu verwirrten OD-Messungen. Darüber hinaus beschränkt die Verwendung von OD-Messungen zur Aufzählung des Wachstums die Verwendung dieses Systems auf einzelne Stammimpfungen. Zusammen führten diese Einschränkungen dazu, dass wir die Verwendung von OD-Messungen zur Messung des mikrobiellen Wachstums aufgeben mussten.
Das Testen ökologischer Wechselwirkungen in der Phyllosphäre ist aktuell, da es Hinweise darauf gibt, dass die Phyllosphäre die Pflanzengesundheit und Produktivität beeinflusst22. Unser Modellsystem wurde nur entwickelt, um mit Napa Kohl zu arbeiten, aber Bakterien aus den Phyla Proteobacteria, Firmicutes und Actinobacteria sind in der Phyllosphäre vieler Pflanzenartenhäufig 13,23. Während nur drei verschiedene Kohlsorten getestet wurden, kann SVE mit anderen wichtigen landwirtschaftlichen Pflanzen hergestellt werden. Beispielsweise können Studien zur Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaftsmontage während der Karottensaftfermentation24 oder der mikrobiellen Besiedlung von Maiswurzel25 mit den in diesem Papier beschriebenen Protokollen repliziert werden.
Die Kopplung des keimfreien Kohls mit dem SVE zur Untersuchung der Gemeinschaftsmontage in der Fermentation kann zeigen, wie Veränderungen im Phyllosphärenmikrobiom den Erfolg der Fermentation beeinflussen können. Verderbder von Fermenten oder ein Nichterreichen eines ausreichend niedrigen pH-Wertes kann die Folge sein, wenn es keine schnelle anfängliche Versauerung26gibt. Diese verdorbenen Fermente können auf Herstellungsverfahren zurückzuführen sein, aber Variationen in Phyllosphäremikrobiomen können auch einen wichtigen Einfluss auf den Erfolg von pflanzlichen Fermenten17haben. Das beschriebene System ist ein nützliches Modell, um zu bestimmen, welche Mikrobiom-Montageprozesse den Erfolg der pflanzlichen Fermentation beeinflussen können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den USDA-NIFA-Zuschuss unterstützt: 2017-67013-26520. Tracy Debenport und Claire Fogan leisteten technische Unterstützung und Ruby Ye und Casey Cosetta gaben hilfreiche Kommentare zu frühen Versionen dieses Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
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