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फिलोस्फीयर में माइक्रोबायोम असेंबली का अध्ययन करने और सब्जी किण्वन में अध्ययन करने के लिए एक Gnotobiotic प्रणाली

Published: June 3, 2020 doi: 10.3791/61149
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Tufts University

Summary

रोगाणु मुक्त नापा गोभी उगाने की एक विधि विकसित की गई है जो शोधकर्ताओं को यह मूल्यांकन करने में सक्षम बनाती है कि गोभी के पत्ते की सतहों पर एकल माइक्रोबियल प्रजातियां या बहुप्रजाति माइक्रोबियल समुदाय कैसे बातचीत करते हैं । एक बाँझ सब्जी निकालने भी प्रस्तुत किया जाता है जिसका उपयोग सब्जी किण्वन के दौरान सामुदायिक संरचना में बदलाव को मापने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

फिलोस्फीयर, पौधे के ऊपर के जमीन के हिस्से को रोगाणुओं द्वारा उपनिवेश किया जा सकता है, माइक्रोबियल समुदाय असेंबली की प्रक्रियाओं की पहचान करने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली है। यह प्रोटोकॉल नापा गोभी पौधों के फिलोस्फीयर में माइक्रोबियल समुदाय गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक प्रणाली को रेखांकित करता है। यह एक कैल्शियम युक्त मिट्टी और पोषक शोरबा सब्सट्रेट के साथ टेस्ट ट्यूबों में रोगाणु मुक्त पौधों को कैसे विकसित किया जाए, इसका वर्णन करता है। विशिष्ट माइक्रोबियल संस्कृतियों के साथ रोगाणु मुक्त पौधों का टीका फिलोस्फीयर में माइक्रोबियल विकास और सामुदायिक गतिशीलता को मापने के अवसर प्रदान करता है। किण्वन के दौरान होने वाले माइक्रोबियल समुदायों में गोभी के बदलाव से उत्पादित बाँझ सब्जी निकालने के उपयोग के माध्यम से भी मूल्यांकन किया जा सकता है। यह प्रणाली प्रयोगशाला में स्थापित करने के लिए अपेक्षाकृत सरल और सस्ती है और माइक्रोबियल समुदाय असेंबली में प्रमुख पारिस्थितिक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। यह यह समझने के अवसर भी प्रदान करता है कि फिलोस्फीयर समुदाय संरचना माइक्रोबियल विविधता और सब्जी किण्वन की गुणवत्ता को कैसे प्रभावित कर सकती है। gnotobiotic गोभी फिलोस्फेयर समुदायों के विकास के लिए यह दृष्टिकोण अन्य जंगली और कृषि पौधों की प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

फिलोस्फेरेयर की माइक्रोबियल विविधता पौधों के स्वास्थ्य को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है और पौधों की पर्यावरणीय तनाव को झेलने की क्षमता को भी प्रभावित कर सकती है1,2,3,5.5 बदले में, फसलों का स्वास्थ्य सीधे खाद्य सुरक्षा और गुणवत्ता6,,7को प्रभावित करता है । पौधे पारिस्थितिकी तंत्र के कामकाज में भूमिका निभाते हैं और उनसे जुड़े माइक्रोबायोम दोनों पौधों की इन गतिविधियों को पूरा करने की क्षमता को प्रभावित करतेहैंऔर साथ ही पर्यावरण को सीधे तौर पर प्रभावित करते हैं । जबकि वैज्ञानिकों ने फिलोस्फीयर के कार्य और संरचना को समझना शुरू कर दिया है, फिलोस्फीयर माइक्रोबियल समुदाय असेंबली को प्रभावित करने वाली पारिस्थितिक प्रक्रियाएं पूरी तरह से,9,10समझ में नहीं आती हैं। माइक्रोबायोम11की पारिस्थितिकी का अध्ययन करने के लिए फिलोस्फीयर माइक्रोबायोम एक उत्कृष्ट प्रायोगिक प्रणाली है। ये समुदाय अपेक्षाकृत सरल हैं और समुदाय के कई सदस्यों को मानक प्रयोगशाला मीडिया 10 ,12,,13पर उगाया जा सकता है ।12

किण्वित सब्जियां एक ऐसी प्रणाली है जहां फिलोस्फीयर की सामुदायिक संरचना के महत्वपूर्ण परिणाम होते हैं। सॉरक्राट और किमची दोनों में, वनस्पति पत्तियों (ब्रासिका प्रजातियों के फिलोस्फीयर) पर स्वाभाविक रूप से उत्पन्न होने वाले रोगाणु किण्वन14,,15के लिए इनोकुलम के रूप में कार्य करते हैं। लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया (लैब) को सब्जी माइक्रोबायोम के सर्वव्यापी सदस्य माना जाता है, हालांकि वे फिलोस्फीयर16में कम बहुतायत में हो सकते हैं। किण्वन के दौरान मजबूत अजैविक चयन माइक्रोबियल समुदाय संरचना में बदलाव को चलाता है जिससे लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया बहुतायत में वृद्धि कर सकते हैं। जैसे-जैसे लैब बढ़ती है, वे लैक्टिक एसिड का उत्पादन करते हैं जो किण्वित सब्जी उत्पादों का अम्लीय वातावरण बनाता है17। फिलोस्फीयर और किण्व के बीच की कड़ी यह समझने के लिए एक मॉडल के रूप में सब्जियों का उपयोग करने का अवसर प्रदान करती है कि माइक्रोबायोम कैसे संरचित होते हैं।

हमने रोगाणु मुक्त नापा गोभी विकसित करने और स्प्रे बोतलों का उपयोग करके विशिष्ट माइक्रोबियल समुदायों के साथ उन्हें टीका लगाने के तरीके विकसित किए हैं। यह या तो व्यक्तिगत रोगाणुओं या मिश्रित समुदायों के साथ गोभी को समान रूप से निकालने की एक सस्ती और विश्वसनीय विधि है। एक बाँझ सब्जी निकालने (SVE) भी तीन अलग गोभी प्रकार/किस्मों से विकसित किया गया है: लाल और हरी गोभी(ब्रासिका oleracea)और नापा गोभी(बी rapa)। इन एसवीईएस में नमक का जोड़ किण्वन वातावरण को दोहराता है और किण्वन माइक्रोबायोम असेंबली के छोटे पैमाने पर और अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट प्रयोगात्मक अध्ययनों के लिए अनुमति देता है। इन तरीकों का उपयोग फिलोस्फीयर में माइक्रोबियल समुदाय असेंबली का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और फिलोस्फीयर में माइक्रोबियल समुदाय की गतिशीलता को सब्जी किण्वन की सफलता से कैसे जोड़ा जा सकता है।

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Protocol

1. बढ़ती रोगाणु मुक्त गोभी

  1. रोगाणु मुक्त गोभी उगाने के लिए उपकरण तैयार करना
    1. बारीक धूल कणों को हटाने के लिए कैलसिन्ड मिट्टी की सफाई
      1. कुल्ला कैल्शियम मिट्टी(सामग्री की मेज)नल के पानी के साथ कम से कम 3x; पानी से दूर नाली।
        सावधानी: कैल्सिन्ड मिट्टी बहुत अच्छी धूल पैदा करती है और धोने के दौरान एक सुरक्षात्मक मुखौटा(सामग्री की तालिका)पहनने की सिफारिश की जाती है।
      2. एक पतली परत (~ 4 सेमी) के रूप में एक सूखी चक्र (20 मिनट और 20 मिनट सुखाने के समय के लिए 121 डिग्री सेल्सियस हीटिंग) पर ऑटोक्लेव के रूप में कैल्शियम युक्त मिट्टी फैलाएं।
      3. ट्रे पर फैलने और कम से कम एक सप्ताह के लिए गर्म इनक्यूबेटर (30−37 डिग्री सेल्सियस) में रखकर उपयोग करने से पहले कैलसिन्ड मिट्टी को पूरी तरह से सूखने दें। कैल्शियम युक्त मिट्टी को पूरी तरह से सुखाने के लिए हर 3 दिनों में मिश्रण करने के लिए हिलाओ ताकि यह मुरशिगे और स्कूग (एमएस) पोषक तत्व शोरबा (धारा 1.2) की एक भी मात्रा को अवशोषित कर लेगा।
        नोट: सुखाने से कैलसिन्ड मिट्टी की मात्रा को भी रखने में मदद मिलती है, भले ही इसे ट्यूबों में तौला जाए। अन्य साधनों से सूखना, जैसे कि सुखाने वाला ओवन, भी उपयुक्त होगा।
    2. रोगाणु मुक्त गोभी उगाने के लिए कांच के बर्तन की सफाई
      1. प्रत्येक उपयोग के बीच कांच की नलियों(सामग्री की तालिका) को अच्छी तरहसे साफ और निष्फल करें। 30% ब्लीच समाधान में 30 मिनट के लिए ट्यूब सोख और एक जीवाणु विज्ञान सेटिंग पर एक एसिड धोने में सफाई से पहले नल के पानी के साथ अच्छी तरह से कुल्ला । उपयोगों के बीच एसिड-वॉश दो-तरह की टेस्ट ट्यूब कैप(सामग्री की टेबल)।
    3. गोभी के बीजों को स्टरलाइज करने वाली सतह
      1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 100 नापा गोभी(बी रैपा वार पेकिनेन्सिस)बीज रखें।
        नोट: एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 100 से अधिक बीज जोड़ना या ट्यूब का आकार बदलना बीज कोट हटाने की कमी के कारण बीजों की अंकुरण दरों को प्रभावित कर सकता है।
      2. बीज और भंवर में 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल का 1 एमसीएल जोड़ें। एक पिपेट का उपयोग करके इथेनॉल को त्यागें।
      3. 5 मिनट के लिए 50% ब्लीच और भंवर का 1 एमएल जोड़ें। एक पिपेट का उपयोग करके ब्लीच समाधान को छोड़ दें।
      4. 5 मिनट के लिए ऑटोक्लेव्ड डिओनाइज्ड वॉटर और भंवर का 1 एमएल डालें। एक पिपेट का उपयोग करके डिओनाइज्ड पानी को छोड़ दें।
      5. सभी ब्लीच को कुल्ला करने के लिए 1.1.3.4 3x दोहराएं। बीज कोट को नरम करने के लिए रोपण से पहले 2−8 घंटे के लिए बाँझ डिएकोन्ड पानी में बीज सोख लें।
  2. बढ़ती रोगाणु मुक्त गोभी
    नोट: नापा गोभी(बी रापा वार पेकिनेन्सिस)कांच की ट्यूबों (15 सेमी x 2.5 सेमी) में उगाए जाते हैं जिसमें मुरशिगे और स्कूग (एमएस) पोषक ब्रोथ(चित्रा 1)में भिगोई हुई कैल्शियम युक्त मिट्टी होती है।
    1. एक साफ ग्लास ट्यूब (15 सेमी x 2.5 सेमी) में 10 ग्राम साफ कैल्सिन्ड मिट्टी का वजन करें।
    2. 1 एल डिओनाइज्ड पानी में एमएस मीडियम के 4.4 ग्राम को भंग करके एमएस पोषक शोर तैयार करें। एक पिपेट का उपयोग करके कैल्शियम युक्त मिट्टी को कवर करने के लिए प्रत्येक ग्लास ट्यूब में एमएस पोषक शोरबा (~ 9 एमएल) जोड़ें।
      नोट: ट्यूब में खड़े तरल बीज को अंकुरित होने से रोकेंगे ताकि कुछ ट्यूबों में थोड़ा कम एमएस शोरबा जोड़ा जा सके।
    3. 22 मिमी दो-तरफा टेस्ट ट्यूब कैप और ऑटोक्लेव (60 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस) के साथ ढीले कैप ग्लास ट्यूब। उन्हें ऑटोक्लेव से हटाते समय, उन्हें सील करने के लिए ग्लास ट्यूबों पर टोपियां पुश करें। उपयोग से पहले कमरे के तापमान के लिए ट्यूबों को ठंडा करें।
    4. धीरे-धीरे बाँझ, अतिरिक्त लंबे (25.4 सेमी) संदंश का उपयोग करके प्रत्येक ट्यूब के केंद्र में एक बाँझ गोभी बीज रखें। ट्यूबों को 7-तरह की ट्रे में रखें फिर प्रकाश रैक (पूर्ण स्पेक्ट्रम T5 फ्लोरोसेंट बल्ब या पौधे के विकास के लिए अन्य रोशनी सेटअप) के तहत 24 डिग्री सेल्सियस पर 16 एच प्रकाश चक्र के साथ रखें।
      नोट: बीज रातोंरात अंकुरित होते हैं और 5 दिनों के बाद अपना पहला सच्चा पत्ता विकसित करते हैं। कोटिलेडन बनने के बाद एक सच्चा पत्ता पहला संवहनी पत्ता होता है। इसमें अधिक झुर्रियों वाली धार है और ब्रासिका रैपा में ट्राइहोम में शामिल है।
  3. रोगाणु मुक्त गोभी की बंध्यता के लिए परीक्षण
    नोट: यह परीक्षण करने के लिए कि गोभी रोगाणु मुक्त हैं या नहीं, प्रत्येक बैच से कुछ (5−10) गोभी का चयन करें और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कोई कृषि योग्य उपनिवेश मौजूद हैं।
    1. धीरे-धीरे बंध्य संदंश के साथ पौधे के आधार को मनोरंजक बनाकर और इसे बाहर खींचकर कांच की ट्यूबों से गोभी को हटा दें। गोभी को पूरी तरह से ट्यूब से हटाने से पहले, निष्फल विच्छेदन कैंची का उपयोग करके जड़ों को सावधानी से काट लें। गोभी के पत्तों को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में कॉम्पैक्ट करें।
      नोट: बड़ी गोभी बड़ी पत्तियों में से एक या दो को हटाने की आवश्यकता हो सकती है, जबकि गोभी ट्यूब में अभी भी है ताकि गोभी को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में प्राप्त करना आसान हो सके। इन बड़ी पत्तियों को 1.5 एमएल ट्यूब में जोड़ा जा सकता है बाकी गोभी को ट्यूब में रखा गया है यदि पूरी गोभी की आवश्यकता होती है।
    2. प्रत्येक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 400 माइक्रोल जोड़ें। बाँझ माइक्रोपेस्टल का उपयोग करके, गोभी को 30x से समरूप करें।
    3. गोभी के 100 माइक्रोन एगर प्लेटों पर समरूप यह निर्धारित करने के लिए कि नमूने में कोई संदूषक मौजूद हैं या नहीं। फिलोस्फीयर में पाए जाने वाले ज्यादातर बैक्टीरिया ट्राइप्टिक सोया (टीएस) आगर प्लेट्स पर बढ़ेंगे। गोभी समरूप के रूप में गोभी समरूप चढ़ाना जब व्यापक छिद्र पिपेट युक्तियों का प्रयोग करें मोटी है और नियमित रूप से पिपेट युक्तियों को रोकना कर सकते हैं ।

2. माइक्रोबियल समाधान के साथ फिलोस्फीयर को इनोक्यूलेट करना

  1. टीका उपभेदों के ग्लिसरोल स्टॉक बनाना
    नोट: तालिका 1 माइक्रोबियल आइसोलेट को सूचीबद्ध करता है जिसका उपयोग इस चरण में किया जा सकता है। अन्य फिलोस्फीयर आइसोले का भी यहां इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. घनी एक ताजा लकीर से व्यक्तिगत कालोनियों बाहर लकीर, एक ही मीडिया के दो/तीन नई प्लेटों पर कई कालोनियों पाने के लिए ।
    2. 2−5 दिनों के लिए धारियों को बढ़ने दें, फिर सभी प्लेटों से कालोनियों को 15 एमएल शंकु नली में स्क्रैप करें जिसमें 15% ग्लाइसरोल के 15 एमएल होते हैं, और भंवर को अच्छी तरह से मिलाने के लिए।
    3. अच्छी तरह से मिश्रित ग्लिसरोल स्टॉक के 1 एमएल के एक एलिकोट को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लाइस्रोल स्टॉक स्टोर करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरोल स्टॉक के शेष 14 एमएल को बचाएं क्योंकि गोभी को टीका लगाते समय अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में टीका समाधान की आवश्यकता होती है।
    4. उपयोग से एक सप्ताह पहले, बर्फ पर ग्लाइसेरोल स्टॉक (चरण 2.1.3 से) के 1.5 एमएल ट्यूब को पिघला दें, टीका समाधान के14एमएल की एकाग्रता (कॉलोनी बनाने वाली इकाई [सीएलयू] प्रति μL) निर्धारित करने के लिए कई अलग-अलग कमजोर पड़ने (उदाहरण के लिए, 10-4, 10-5, और 10-5-6)पर पतला, और प्लेट।
  2. नसबंदी टीका स्प्रे बोतलें बंधी
    1. एम्बर दौर बोस्टन पंप की बोतलों (59 एमएल) को अलग करें और कसकर फिटिंग ढक्कन के साथ एक बड़े प्लास्टिक कंटेनर में 30 मिनट के लिए 30% ब्लीच समाधान में सभी घटकों (पंप, ट्यूब, कैप और बोतल) को भिगो दें।
    2. भिगोने के बाद, ध्यान से कंटेनर के ढक्कन के सिर्फ एक कोने को उठाकर कंटेनर से सभी ब्लीच डालें।
    3. प्लास्टिक कंटेनर को ऑटोक्लेव्ड डिओनाइज्ड पानी (कंटेनर आकार के आधार पर ~ 1 एल) के साथ भरकर बोतलों को कुल्लाएं और ध्यान से एक कोने पर ढक्कन उठाकर, फिर से डिओनाइज्ड पानी डालें।
    4. 70% इथेनॉल समाधान के साथ छिड़काव और 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश चालू करके एक जैव सुरक्षा कैबिनेट को स्टरलाइज करें।
      नोट: जैवसेफ्टी कैबिनेट में इस काम को जारी रखें ताकि बोतलों के माइक्रोबियल संदूषण का कोई खतरा न हो क्योंकि वे हवा शुष्क करते हैं।
    5. बड़े प्लास्टिक कंटेनर से बोतलें निकालें और एक पिपेट का उपयोग करके ऑटोक्लेव्ड डिओनाइज्ड पानी से प्रत्येक बोतल को भरें। पंपों को फिर से इकट्ठा करें और प्रत्येक बोतल में एक रखें। बोतल के पंप घटक से ब्लीच को हटाने के लिए प्रत्येक बोतल (प्रति बोतल 10 स्प्रे) के माध्यम से डिओनाइज्ड पानी पंप करें।
    6. यह सुनिश्चित करने के लिए कि कांच की बोतलों से सभी ब्लीच हटा दिए गए हैं, चरण 2.2.5 दोहराएं।
    7. परीक्षण करें कि क्या बोतलें प्रत्येक बोतल पर एक नंबर रखकर बाँझ हैं (बोतल के किनारे पर लैब टेप चिपका जब यह पूरी तरह से सूखा है) तो बोतलों में से प्रत्येक के लिए 1x PBS के 10 एमएल जोड़ें और एक टीएस आगर प्लेट पर 3 स्प्रे पंप । छिड़काव के बाद, कमरे के तापमान पर एक सप्ताह के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें। यदि कोई उपनिवेश प्लेट पर बढ़ते हैं तो यह इंगित करता है कि संबंधित बोतल बाँझ नहीं थी और प्रयोगों के लिए उपयोग नहीं की जानी चाहिए।
    8. बाँझ बोतलों को संग्रहीत करने से पहले, शेष सभी पीबीएस को हटा दें और बोतलों को जैवसेफ्टी कैबिनेट में अच्छी तरह से सूखने दें। उपयोग तक बाँझ प्लास्टिक कंटेनर (आमतौर पर बोतलों को ब्लीच करने के लिए उपयोग किया जाने वाला कंटेनर) में बाँझ बोतलों को स्टोर करें।
  3. माइक्रोबियल इनोकुलम तैयार करना और रोगाणु मुक्त गोभी का छिड़काव करना
    सावधानी: सभी कदम जैव सुरक्षा कैबिनेट में किए जाने चाहिए, क्योंकि छिड़काव माइक्रोबियल समाधानों को दूषित करता है जो काम की सतहों को दूषित कर सकता है या प्रयोगशाला बेंच पर किए जाने पर स्वास्थ्य जोखिम पैदा कर सकता है।
    नोट: गोभी 5 दिनों के बाद सच्ची पत्तियां बनाएगी, इसलिए किसी भी माइक्रोबियल समाधान के साथ अनुमान लगाने से पहले गोभी को लगाने के बाद एक सप्ताह इंतजार करने की सलाह दी जाती है। चूंकि ट्यूब ों को सील कर दिया जाता है, इसलिए गोभी को पानी देने की कोई आवश्यकता नहीं है। प्रयोग रोपण के एक महीने के भीतर सबसे अच्छा प्रदर्शन कर रहे हैं, के रूप में छोटे ट्यूबों गोभी के विकास को प्रतिबंधित ।
    1. बर्फ पर गल ग्लिसरोल स्टॉक्स और 1x पीबीएस में कमजोर वांछित टीका एकाग्रता के लिए (विगलन द्वारा निर्धारित एकाग्रता और कदम 2.1.4 में एक 1 एमएल aliquot चढ़ाना)।
      नोट: विभिन्न प्रकार के टीका स्तरों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन फिलोस्फीयर आइसोलेशन 10 दिनों में गोभी के घोल के10 4 से10 8 सीएफयू/एमएल तक बढ़ सकता है।
    2. बाँझ पंप की बोतल में पतला ग्लिसरोल स्टॉक के 10 एमएल जोड़ें और बोतल पंप घटक से किसी भी अवशिष्ट पीबीएस को हटाने के लिए एक बड़े अपशिष्ट संग्रह बीकर में 5 स्प्रे पंप करें।
    3. गोभी ट्यूब से ढक्कन निकालें, गोभी को स्प्रे बोतल की ओर झुकाएं, और प्रत्येक गोभी को टीका समाधान के 3 पंपों के साथ स्प्रे करें, जो ~ 600 माइक्रोन इनोकुलम प्रदान करता है।
    4. टीका लगाने के बाद, वास्तविक इनपुट टीका एकाग्रता का आकलन करने के लिए गोभी के सबसेट को फसल करें। निष्फल संदंश के साथ एक ट्यूब से गोभी निकालें। बाँझ विच्छेदन कैंची के साथ जड़ों को काट लें और फिर ध्यान से गोभी को एक प्रीवीग्ड बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें। यदि गणना के लिए गोभी के CFUs/g की आवश्यकता है तो भविष्य की गणना के लिए गोभी का वजन रिकॉर्ड करें ।
    5. गोभी युक्त प्रत्येक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 1x पीबीएस के 400 माइक्रोएसएल जोड़ें और गोभी को 30x पीसकर 1x पीबीएस में समरूप बनाने के लिए बाँझ माइक्रोपेस्टल का उपयोग करें।
    6. पतला गोभी समरूप (यदि आवश्यक हो) और पेस्ट गोभी मिश्रण बाहर थाली। गोभी के घोल को पाइपिंग करने के लिए व्यापक छिद्र युक्तियों का उपयोग करें क्योंकि यह मोटी और पौधे के ऊतकों के टुकड़ों से भरा होगा।

3. बाँझ सब्जी निकालने की तैयारी

नोट: यह विधि गोभी बाँझ मीडिया उत्पादन18, 19,19का एक संशोधित संस्करण है ।

  1. एक सुपरमार्केट से गोभी खरीदें। प्रयोगशाला में, गोभी की सबसे बाहरी पत्तियों को हटा दें और त्यागें। शेष सभी गोभी को एक ब्लेंडर में फिट करने के लिए काट लें और गोभी को एक ठीक लुगदी में समरूप करें, यानी, गोभी को आगे मिश्रण के साथ कोई महीन नहीं मिलेगा।
    नोट: कोई भी ब्लेंडर जो गोभी को एक चिकनी सजातीय लुगदी में काट सकता है, इस विधि के लिए उपयुक्त होना चाहिए।
  2. मिश्रित गोभी समरूप वजन और गोभी के प्रति ग्राम आसुत पानी के 2 मिलील जोड़ें। बास्केट कॉफी फिल्टर (बिना ब्लीच पेपर) की 2 परतों के माध्यम से मिश्रित गोभी घोल को फ़िल्टर करें।
  3. गोभी के घोल को सेंट्रलाइज ट्यूब्स में बांटें (आकार सेंट्रलाइज पर निर्भर है)। 20 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर फ़िल्टर किए गए गोभी घोल को 20 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज करें जब तक कि बड़े कण समाधान से बाहर नहीं निकल जाते।
    नोट: गोभी के घोल को लंबे समय तक अपकाइज करना आवश्यक है क्योंकि गोभी के कण तेजी से फिल्टर स्टरलाइजर को रोकते हैं।
  4. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, पैलेट गोभी के मलबे से सुपरनैट को हटा दें, जिसमें ध्यान रखा गया कि पेलेट गोभी परेशान न हो। यदि किण्वन स्थितियों को फिर से बनाने का लक्ष्य है जहां मानक नमक सांद्रता का उपयोग किया जाता है, तो इस चरण में 2% w/v NaCl जोड़ें (यानी, फिल्टर नसबंदी से पहले)।
  5. फिल्टर एक वैक्यूम से जुड़े 0.2 माइक्रोन फिल्टर (500 एमएल या 1 एल) का उपयोग करके सब्जी निकालने को स्टरलाइज करें। बाँझ ट्यूबों (या तो 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब या 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब) में वितरित करें और उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।

4. बाँझ सब्जी निकालने का टीका

  1. गल स्वे और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में 490 माइक्रोएनएल वितरित करें। प्रत्येक टाइमपॉइंट माप विनाशकारी होने के साथ-साथ प्रति उपचार प्रति उपचार कम से कम पांच प्रतिकृति बनाने के लिए पर्याप्त ट्यूबों का उपयोग करें।
  2. माइक्रोबियल के गल ग्लिसरोल स्टॉक बर्फ पर अलग होते हैं और वांछित एकाग्रता के लिए 1x पीबीएस के साथ पतला होते हैं। लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया की एकाग्रता एसवीई के प्रति एमएल 5,000 सीएलयू जितना कम हो सकती है। इस एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए, 250 सीएफयू/माइक्रोन के लिए स्टॉक को पतला करें क्योंकि 10 माइक्रोन का उपयोग 500 माइक्रोन की कुल मात्रा के टीका के लिए किया जाएगा।
  3. पतला माइक्रोबियल आइसोलेट के 10 माइक्रोल के साथ टीका लगाओ SVE। पिपेट को अच्छी तरह से मिलाने के लिए कई बार ऊपर और नीचे। वांछित तापमान पर इनक्यूबेट (किमची उत्पादन तापमान के लिए 14 डिग्री सेल्सियस या सबसे गर्म सॉरक्राट किण्वन के लिए 24 डिग्री सेल्सियस)।
  4. 1 दिन, 2 दिन, 4 दिन, 7 दिन और दिन 14 पर दोहराने ट्यूबों की कटाई करके SVE में माइक्रोबियल आइसोलेट की वृद्धि की दर को मापने ।
    नोट: किण्वन शुरू में तेजी से आय और समय के साथ धीमा कर देता है । इसलिए, अधिक प्रारंभिक टाइमपॉइंट होने से गतिशीलता को अधिक संकल्प मिलता है कि किण्वन कैसे आगे बढ़ता है।
  5. प्रत्येक समय बिंदु पर, कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके टीका लगाए गए एसवीई को अच्छी तरह से मिलाएं। क्रमिक रूप से 1x पीबीएस और प्लेट में टीका एसवीई को आगर प्लेटों पर पतला करें। कॉलोनियों की गिनती से पहले 4−7 दिनों के लिए आगर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: आदमी, रोगोसा, और शार्प (MRS) आगर का उपयोग सभी लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया, खमीर पेप्टोन डेक्सट्रोस (वाईपीडी) की गणना करने के लिए किया जाना चाहिए खमीर के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और अधिकांश अन्य बैक्टीरिया के लिए टीएस एगर फिलोस्फीयर से अलग हो जाता है।
  6. माइक्रो पीएच जांच का उपयोग करके प्रत्येक समय बिंदु पर नमूनों के पीएच रिकॉर्ड करें।
    नोट: यह कदम चढ़ाना के बाद किया जाना चाहिए क्योंकि पीएच जांच ट्यूबों के बीच कोशिकाओं का हस्तांतरण होगा/

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Representative Results

नापा गोभी की वृद्धि दर
बीज नसबंदी विधि का परीक्षण कई अलग-अलग नापा गोभी(बी रैपा वर पेकिनीज) केसाथ किया गया था। पूरक चित्रा 1) विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं की संख्या से और सभी समान विकास दर के साथ लगातार बढ़े। हालांकि, ब्रासिका (बी रैपा: शलजम पर्पल टॉप) की विभिन्न प्रजातियों के साथ तरीकों का परीक्षण; B. oleracea: काहिरा हाइब्रिड, रेखा विशाल संकर; बी कैम्पेस्ट्रिस: पाक चोई खिलौना Choy हाइब्रिड; B. Juncea: सरसों लाल विशाल) सीमित सफलता दी(पूरक चित्रा 2)। नापा गोभी के विपरीत जो कांच की ट्यूबों में फिट होने वाले कॉम्पैक्ट साफ रोसेट बनाता है, ये ब्रासिका स्पीप। या तो स्टरलाइजिंग के बाद कम अंकुरण दर थी या स्टेम तेजी से बढ़ाया एक पतली, अस्वस्थ संयंत्र बनाने के लिए । इसके अलावा, पुराने बीजों (>1 वर्ष पुराने) को स्टरलाइज करने की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि बीज कोट सूख जाते हैं जिससे नसबंदी प्रक्रिया के दौरान उन्हें हटाना कठिन हो जाता है। नियमित रूप से नए बीज खरीदते हैं और यह निर्धारित करने के लिए गोभी के सबसेट का परीक्षण करते हैं कि क्या वे प्रयोग करने से पहले बाँझ हैं।

नापा गोभी फिलोस्फीयर में माइक्रोबियल इनोक्यूलेंट की वृद्धि
माइक्रोबियल आइसोलेटेड(टेबल 1)को या तो एकल तनाव आइसोलेटेड के रूप में या नापा गोभी फिलोस्फीयर में जोड़ीवार बातचीत की तलाश करने के लिए एक और अलग-थलग करने के साथ टीका लगाया गया था। प्रत्येक उपचार के लिए कुल 15 रोगाणु मुक्त गोभी को टीका लगाया गया था और टीका लगाने के तुरंत बाद पांच गोभी काटी गई थीं, पांच को टीका लगाने के चार दिन बाद काटा गया था, और शेष को टीका लगाने के 10 दिन बाद काटा गया था । परिणाम बताते हैं कि फिलोस्फीयर आइसोले नापा गोभी फिलोस्फीयर(चित्रा 2)में तेजी से विकास करने में सक्षम हैं।

बाँझ सब्जी निकालने में माइक्रोबियल इनोक्यूलेंट की वृद्धि
दो खमीर(काजाचस्टानिया बार्नेट और पिभिया मेम्ब्रानिफिएंट्स)और तीन बैक्टीरिया(लैक्टोबेसिलस कोरीनसिस, पेडियोकोकस परवुलस,और ल्यूकोनोस्टोकोक मेसेंटेरोइड्स)को लाल, हरे और नापा गोभी से बने तीन विभिन्न प्रकार के स्वे में टीका लगाया गया था। सभी नमूनों को 24 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था और 14 दिनों में टीका लगाने के विकास को प्रत्येक उपचार के स्पॉट प्लेटिंग 5 माइक्रोन द्वारा या तो श्रीमती या वाईपीडी एगर प्लेटों (एन = 5) पर दर्ज किया गया था। परिणाम चित्रा 3ए में दिखाएगएहैं । प्रत्येक नमूने का पीएच भी किण्वन(चित्रा 3बी)भर में दर्ज किया गया था और पता चलता है कि लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया पीएच 4 से नीचे के स्तर तक SVE एसिड करने में सक्षम थे (एक किण्व है कि खपत के लिए सुरक्षित है का संकेत) ।

Figure 1
चित्रा 1: रोगाणु मुक्त गोभी सेटअप का आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: रोगाणु मुक्त नापा गोभी पर विभिन्न बैक्टीरिया की वृद्धि दर। (क)फिलोस्फीयर में एकल टीकाओं की वृद्धि। (ख)फिलोस्फीयर में दो रोगाणुओं को बिठाने के बाद विकास । रोगाणुओं के विकास को कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों के रूप में मापा गया था जो या तो टीएसए या एमआरएस मीडिया पर चढ़ाया गया गोभी समरूप के प्रति ग्राम गिना जाता है। द = 5. त्रुटि सलाखों = मानक विचलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: लाल, हरे और नापा गोभी के साथ बने बाँझ सब्जी निकालने (SVE) में लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया और खमीर का विकास। (क)स्वे प्लेटेड की प्रति एमएल कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गणना करके माइक्रोबियल इनोक्यूलेंट की वृद्धि मापी गई । खमीर YPD आगर प्लेटों और श्रीमती आगर प्लेटों पर बैक्टीरिया पर चढ़ाया गया । (ख)बाँझ सब्जी निकालने का अम्लीकरण क्योंकि रोगाणु पीएच में गिरावट के रूप में दिखाई देते हैं । द = 5. त्रुटि सलाखों = मानक विचलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

माइक्रोबियल इनोकुलेंट्स का फायला/जेनेरा सूक्ष्म जीव का स्रोत
फर्मीक्यूट्स बेसिलस फिलोस्फीयर
फर्मीक्यूट्स लैक्टोबेसिलस किण्वन
प्रोटेओबैक्टीरिया एक्रोमॉक्टर फिलोस्फीयर
प्रोटेओबैक्टीरिया राइजोबियम फिलोस्फीयर
प्रोटेओबैक्टीरिया स्पिंगोमोनास फिलोस्फीयर

तालिका 1: माइक्रोबियल रोगाणु मुक्त नापा गोभी पर टीका लगाया अलग करता है।

Supplemental Figure 1
पूरक चित्रा 1: पीतलिका रैपा वार पेकिनेन्सिस का विकास: रोगाणु मुक्त स्थितियों में बिल्को। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplemental Figure 2
पूरक चित्रा 2: रोगाणु मुक्त स्थितियों में बढ़ती विभिन्न गोभी किस्में। (A) B. Rapa: शलजम पर्पल टॉप,(बी) बी ओलेरेसिया: काहिरा हाइब्रिड,(C) B. oleracea: रेखा विशालकाय हाइब्रिड,(घ) बी campestris: पाक Choi खिलौना Choy संकर,(ई) बी जूनिया: सरसों लाल विशाल । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

रोगाणु मुक्त नापा गोभी के पौधों का उपयोग नापा गोभी फिलोस्फीयर17में लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया की फैलाव सीमा का अध्ययन करने के लिए किया गया है। रोगाणु मुक्त नापा गोभी का उपयोग फिलोस्फीयर(चित्र 1)में व्यक्तिगत या जोड़ी के लिहाज से वृद्धि का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है। बाँझ सब्जी निकालने बनाने के तरीकों को गोभी की तीन अलग-अलग किस्मों के लिए परीक्षण किया गया है: लाल, हरे और नापा। इनमें से प्रत्येक एसवीईए एक विश्वसनीय विकास मीडिया के रूप में कार्य करता है; टीका रोगाणुओं विभिन्न मीडिया भर में लगातार बढ़ने। एसवीई(चित्रा 2)में एकल तनाव वृद्धि दर से पता चलता है कि प्रयोगशाला तेजी से बढ़ती है और मीडिया को उसी तरह अम्लीय करती है जिसका अनुमान किण्वन17में लगाया जाएगा ।

रोगाणु मुक्त पौधों और बाँझ सब्जी निकालने के संयोजन में इस तरह के प्राथमिकता प्रभाव और फिलोस्फीयर में उत्तराधिकार के रूप में या एक किण्व के भीतर के रूप में विभिन्न पारिस्थितिक सवालों के एक नंबर को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। रोगाणुओं का एक सिंथेटिक समुदाय लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया16प्राप्त करने के लिए फिलोस्फीयर आइसोले आइसोले, या सॉरक्राउट प्राप्त करने के लिए समरूप गोभी को चढ़ाना के माध्यम से निर्माण करना सरल है। समुदाय के सदस्यों के महत्व या कार्य का आकलन करने के लिए फिलोस्फीयर में या एसवीई में अधिक समुदाय के सदस्यों के साथ जोड़ीवार-इंटरैक्शन या लीव-वन-आउट प्रयोग किए जा सकते हैं। एसवीई में पर्यावरण चयन अध्ययन किया जा सकता है जहां सब्जी किण्वित के प्रभाव का आकलन किया जा सकता है। प्रयोगात्मक विकास का उपयोग करके माइक्रोबियल प्रजातियों और समुदायों के विविधीकरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए रोगाणु मुक्त गोभी और एसवीई दोनों का उपयोग करने की भी क्षमता है।

इस रोगाणु मुक्त गोभी प्रणाली की एक सीमा प्रयोगों का छोटा टाइमस्केल है। कांच की छोटी ट्यूबों के इस्तेमाल की वजह से गोभी एक महीने से ज्यादा समय तक नहीं बढ़ पाती क्योंकि उनकी पत्तियां ट्यूबों के किनारे तक ही सीमित हो जाती हैं । बड़े बढ़ते कंटेनर, जैसे पौधे ऊतक संस्कृति बक्से(सामग्री की तालिका) काउपयोग किया जा सकता है, लेकिन ये अभी भी एक पूर्ण आकार के गोभी संयंत्र का उत्पादन नहीं करेंगे। हमने एमएस शोरबा वाले 0.75% एगर में गोभी उगाने की भी कोशिश की है, लेकिन पाया कि इससे गोभी के रोपण की असंगत वृद्धि हुई। पर्याप्त एमएस शोरबा के साथ एक बढ़ती सब्सट्रेट के रूप में कैल्शियम युक्त मिट्टी का उपयोग करने के लिए संतृप्त लेकिन बाढ़ नहीं मिट्टी के अनाज स्वस्थ गोभी उगाने के लिए इष्टतम विधि है ।

रोगाणु मुक्त गोभी के सफल विकास को सुनिश्चित करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। यह सुनिश्चित करना कि कैल्शियम युक्त मिट्टी पूरी तरह से सूखी है जब एमएस शोरबा जोड़ने से मिट्टी ऑटोक्लेव चक्र के दौरान एमएस शोरबा को पूरी तरह से अवशोषित करने की अनुमति देती है। हालांकि, अगर मिट्टी के स्तर पर कोई एमएस शोरबा है, तो बीज जोड़ने से पहले इसे हटा दिया जाना चाहिए; यदि वे एमएस शोरबा में बैठे हैं तो बीज अंकुरित नहीं होंगे। निगरानी के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम बीज नसबंदी है । पुराने बीज (>1 वर्ष पुराने) युवा बीजों के रूप में जल्दी या मज़बूती से अंकुरित नहीं होंगे। नसबंदी या ट्यूबों को ओवरफिल करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली ट्यूब का आकार बदलने से भी नसबंदी पर असर पड़ सकता है। नसबंदी कदम बीज कोट को नरम करने और हटाने में भी मदद करता है ताकि बीज तेजी से अंकुरित हो। यहां ध्यान दें कि माइक्रोबियल संस्कृतियों के साथ उपयोग करने के बाद पंप स्प्रे की बोतलों का पुन: उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि पंप घटक से बायोफिल्म्स को हटाना मुश्किल है। विशेष रूप से ध्यान दें, सावधानी बेसिलस प्रजातियों के साथ लिया जाना चाहिए क्योंकि वे विशेष रूप से ऑटोक्लेविंग के लिए लचीला हैं। किसी भी पंप की बोतलें जो बैसिलस डीपी के संपर्क में आई हैं, उनका पुन: इस् तेम नहीं किया जाता है।

जबकि बाँझ सब्जी निकालने में किण्वन पोत में मौजूद स्थानिक संरचना नहीं होती है, प्रयोगशाला की विकास गतिशीलता बताती है कि यह पीएच में तेजी से गिरावट और किण्वन के 14 दिनों में लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया के विकास में वृद्धि के साथ किण्वन प्रगति की नकल करती है। किण्वन के प्रारंभ में ल्यूकोनोस्टोक मेसेंटेरोइड्स महत्वपूर्ण है और यह लैक्टोबेसिलस और पेडोकोकस स्प्प की तुलना में अधिक तेजी से बहुतायत में वृद्धि हुई, जो अन्य सॉरक्राट उत्तराधिकार सर्वेक्षणों में20 , 21में21देखा गया है। प्रयोगशाला में काम भी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करने के लिए ९६ अच्छी तरह से प्लेटों में तिरस्कृत SVE में प्रयोगशाला के विकास को मापने के लिए ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) रीडिंग प्राप्त करने का पता लगाया है । नापा गोभी निकालने के साथ प्रारंभिक परिणाम आशाजनक लग रहे थे, लेकिन लाल गोभी निकालने के साथ बनाया SVE रंग बदल के रूप में पीएच चकित OD रीडिंग में जिसके परिणामस्वरूप गिरा दिया । इसके अलावा, विकास की गणना करने के लिए ओडी रीडिंग का उपयोग करना इस प्रणाली के उपयोग को एकल तनाव टीकाओं तक सीमित करता है। एक साथ, इन सीमाओं के नेतृत्व में हमें माइक्रोबियल विकास को मापने के लिए OD रीडिंग का उपयोग छोड़ दिया ।

फिलोस्फीयर में पारिस्थितिक बातचीत का परीक्षण सामयिक है क्योंकि इस बात के सबूत हैं कि फिलोस्फीयर फसल संयंत्र के स्वास्थ्य और उत्पादकता को प्रभावित करता है22। हमारी मॉडल प्रणाली केवल नापा गोभी के साथ काम करने के लिए विकसित की गई है, लेकिन कई पौधों की प्रजातियों13,23के फिलोस्फीयर में फिला प्रोटेओबैक्टीरिया, फर्मीक्यूट्स और ऐक्टिनोबैक्टीरिया से बैक्टीरिया आम हैं।, जबकि गोभी की केवल तीन विभिन्न किस्मों का परीक्षण किया गया है, SVE अन्य महत्वपूर्ण कृषि संयंत्रों के साथ बनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, गाजर के रस किण्वन 24 या मक्का रूट25 के माइक्रोबियल उपनिवेशीकरण केदौरान माइक्रोबियल समुदाय विधानसभा की जांच करने वाले अध्ययनों को इस पेपर में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके दोहराया जा सकता है।

किण्व में सामुदायिक असेंबली का अध्ययन करने के लिए एसवीई के साथ रोगाणु मुक्त गोभी को युग्मन करके दिखाया जा सकता है कि फिलोस्फीयर माइक्रोबायोम में परिवर्तन किण्वन की सफलता को कैसे प्रभावित कर सकते हैं। किण्वनों की खराबी या पर्याप्त रूप से कम पीएच तक पहुंचने में विफलता का परिणाम हो सकता है यदि तेजी से प्रारंभिक अम्लीकरण नहीं होता है26. ये खराब किण्वन विनिर्माण प्रक्रियाओं के कारण हो सकते हैं, लेकिन फिलोस्फीयर माइक्रोबायोम में भिन्नता का सब्जी किण्वन17की सफलता पर भी महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है। वर्णित प्रणाली यह निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी मॉडल है कि माइक्रोबायोम असेंबली प्रक्रियाएं सब्जी किण्वन की सफलता को प्रभावित कर सकती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को यूएसडीए-निफा अनुदान: 2017-67013-26520 द्वारा समर्थित किया गया था। ट्रेसी डेबेनपोर्ट और क्लेयर फोगन ने तकनीकी सहायता प्रदान की और रूबी सुनो और केसी कोसेटा इस पांडुलिपि के प्रारंभिक संस्करणों पर उपयोगी टिप्पणियां प्रदान करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 20170-650
15 mL conical tubes Falcon 352096
7-way tray tray Sigma Magenta T8654
Amber Round Boston Glass Bottle GPS 712OZSPPK12BR Ordered on Amazon.com from various suppliers
Basket coffee filters If you care (unbleached paper) Purchased from Wholefoods
Bleach (mercury-free) Austin's 50-010-45
Borosilicate Glass tubes VWR 47729-586
Calcined clay Turface MVP Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm
Cuisinart blender Cuisinart Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup
Dissection scissors 7-389-A American Educational Products Ordered on Amazon.com
Ethanol VWR 89125-172
Forceps Aven 18434 Ordered on Amazon.com
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
KleenGuard M10 Kimberley-Clark 64240
Large plastic container Rubbermaid Ordered on Amazon.com
Light racks Gardner's Supply 39-357 full-spectrum T5 fluorescent bulbs
Magenta tm 2-way caps Millipore Sigma C1934
Man, Rogosa, and Sharpe Fisher Scientific DF0881-17-5 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP
Micropestle Carolina 215828 Also called Pellet Pestle
MS nutrient broth Millipore Sigma M5519 Murashige and Skoog Basal Medium
NaCl Sigma Aldrich S9888
Napa cabbage seeds Johnny's Select Seeds 2814G B. rapa var pekinensis (Bilko)
Petri dish 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 Used to make agar plates
Phosphate buffer saline Fisher Scientific 50-842-941 Teknova
Plant tissue culture box Sigma Magenta GA-7
Serologial pipettes VWR 89130-900
Sterile dowel Puritan 10805-018 Autoclave before use to sterilize
Sterilizing 0.2 µm filter Nalgene 974103
Tryptic soy agar Fisher Scientific DF0370-17-3 This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates
Wide orifice pipette tips Rainin 17007102
Yeast, peptone and dextrose Fisher Scientific DF0428-17-5 This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 160 फिलोस्फीयर गोभी किण्वन रोगाणु मुक्त gnotobiotic बाँझ सब्जी निकालने माइक्रोबायोम माइक्रोबियल समुदाय
फिलोस्फीयर में माइक्रोबायोम असेंबली का अध्ययन करने और सब्जी किण्वन में अध्ययन करने के लिए एक Gnotobiotic प्रणाली
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Miller, E. R., O'Mara Schwartz, J., Cox, G., Wolfe, B. E. A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation. J. Vis. Exp. (160), e61149, doi:10.3791/61149 (2020).

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