Summary
È stato sviluppato un metodo per coltivare cavoli Napa privi di germi che consente ai ricercatori di valutare come singole specie microbiche o comunità microbiche multispecie interagiscono sulle superfici delle foglie di cavolo. Viene inoltre presentato un estratto vegetale sterile che può essere utilizzato per misurare i cambiamenti nella composizione della comunità durante la fermentazione vegetale.
Abstract
La fillosfera, la parte sotterranea della pianta che può essere colonizzata dai microbi, è un utile sistema modello per identificare i processi di assemblaggio della comunità microbica. Questo protocollo delinea un sistema per studiare le dinamiche della comunità microbica nella filosfera delle piante di cavolo Napa. Descrive come coltivare piante prive di germi in provette con un substrato di brodo di argilla e nutrienti. L'inoculazione di piante prive di germi con colture microbiche specifiche offre l'opportunità di misurare la crescita microbica e le dinamiche della comunità nella fillosfera. Attraverso l'uso di estratto vegetale sterile prodotto da cavoli si sposta nelle comunità microbiche che si verificano durante la fermentazione può anche essere valutato. Questo sistema è relativamente semplice ed economico da configurare in laboratorio e può essere utilizzato per affrontare le principali questioni ecologiche nell'assemblaggio della comunità microbica. Fornisce inoltre l'opportunità di capire in che modo la composizione della comunità della fillosfera può influire sulla diversità microbica e sulla qualità delle fermentazioni vegetali. Questo approccio per lo sviluppo di comunità di filosfera gnotobiotica potrebbe essere applicato ad altre specie vegetali selvatiche e agricole.
Introduction
La diversità microbica della fillosfera svolge un ruolo importante nel mantenimento della salute delle piante e può anche influenzare la capacità delle piante di resistere allo stress ambientale1,2,3,4,5. A sua volta, la salute delle colture influisce direttamente sulla sicurezza alimentare e sulla qualità6,7. Le piante svolgono un ruolo nel funzionamento dell'ecosistema e i microbiomi associati influenzano entrambi la capacità delle piante di svolgere queste attività, sia influenzando direttamente l'ambiente stesso8. Mentre gli scienziati hanno iniziato a decifrare la funzione e la composizione della fillosfera, i processi ecologici che influenzano l'assemblaggio della comunità microbica della fillosfera non sono pienamente compresi9,10. Il microbioma della fillosfera è un ottimo sistema sperimentale per studiare l'ecologia dei microbiomi11. Queste comunità sono relativamente semplici e molti dei membri della comunità possono essere coltivati susupportidi laboratorio standard 10,12,13.
Le verdure fermentate sono un sistema in cui la struttura comunitaria della fillosfera ha conseguenze importanti. Sia nei crauti che nei kimchi, i microbi che si verificano naturalmente sulle foglie vegetali (la filosfera delle specie di Ottone) servono come inoculum per la fermentazione14,15. I batteri dell'acido lattico (LAB) sono considerati membri onnipresenti di microbiomi vegetali, tuttavia possono essere in bassa abbondanza nella fillosfera16. Una forte selezione abiotica durante la fermentazione favorisce uno spostamento nella composizione della comunità microbica che consente ai batteri dell'acido lattico di aumentare in abbondanza. Man mano che LAB cresce, producono acido lattico che crea l'ambiente acido dei prodotti vegetali fermentati17. Il legame tra la fillosfera e il fermento offre l'opportunità di utilizzare le verdure come modello per capire come sono strutturati i microbiomi.
Abbiamo sviluppato metodi per coltivare cavoli Napa privi di germi e per inocularli con specifiche comunità microbiche utilizzando bottiglie spray. Questo è un metodo economico e affidabile per inoculare uniformemente il cavolo con microbi individuali o comunità miste. Un estratto vegetale sterile (SVE) è stato sviluppato anche da tre diversi tipi di cavolo/varietà: cavolo rosso e verde (Brassica oleracea) e cavolo Napa (B. rapa). L'aggiunta di sale a queste SVI replica l'ambiente di fermentazione e consente studi sperimentali su piccola scala e relativamente ad alto velocità possibile di assemblaggio del microbioma di fermentazione. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare l'assemblaggio della comunità microbica nella fillosfera e come le dinamiche della comunità microbica nella fillosfera possono essere collegate al successo della fermentazione vegetale.
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Protocol
1. Cavoli senza germi in crescita
- Preparazione di attrezzature per la crescita di cavoli senza germi
- Pulizia dell'argilla calcificata per rimuovere le particelle di polvere fine
- Risciacquare l'argilla calcinata (Tabella dei materiali) almeno 3x con acqua del rubinetto; drenare l'acqua.
AVVISO: L'argilla calciata produce polveri molto sottili e si consiglia di indossare una maschera protettiva (Tabella dei materiali) durante il lavaggio. - Stendere l'argilla calciata come uno strato sottile (4 cm) in un vassoio autoclave e autoclave su un ciclo asciutto (121 gradi centigradi per 20 min e 20 min tempo di essiccazione sterile) per
- Lasciare asciugare completamente l'argilla calcina prima dell'uso stendendosi su vassoi e mettendoin un'incubatrice calda (30-37 gradi centigradi) per almeno una settimana. Mescolare per mescolare ogni 3 giorni per asciugare completamente l'argilla calcinata in modo che assorba una quantità uniforme di brodo nutriente Divietto e Skoog (MS) (sezione 1.2).
NOTA: L'essiccazione aiuta anche a mantenere il volume di argilla calciata anche quando viene pesata in tubi. Anche l'essiccazione con altri mezzi, come un forno di essiccazione, sarebbe adatta.
- Risciacquare l'argilla calcinata (Tabella dei materiali) almeno 3x con acqua del rubinetto; drenare l'acqua.
- Pulizia della vetreria per la coltivazione di cavoli senza germi
- Pulire e sterilizzare accuratamente i tubi di vetro (Tabella dei materiali) tra ogni utilizzo. Immergere i tubi per 30 min nella soluzione di candeggina 30% e risciacquare bene con acqua del rubinetto prima di pulire in un lavaggio acido su un ambiente batteriologia. Tappi di provetta a doppio lavaggio acidi (Tabella dei materiali) tra gli usi.
- Semi di cavolo sterilizzanti per la superficie
- Mettere fino a 100 semi di cavolo Napa (B. rapa var pekinensis) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.
NOTA: L'aggiunta di più di 100 semi a un tubo di microcentrifuga o la modifica delle dimensioni del tubo può influenzare i tassi di germinazione dei semi a causa della mancanza di rimozione del mantello di semi. - Aggiungere 1 mL di 70% di etanolo ai semi e vortice per 5 min. Scartare l'etanolo con una pipetta.
- Aggiungere 1 mL di 50% candeggina e vortice per 5 min. Scartare la soluzione di candeggina utilizzando una pipetta.
- Aggiungere 1 mL di acqua e vortice autoclaved deionizzato e vortice per 5 min. Scartare l'acqua deionizzata utilizzando una pipetta.
- Ripetere il passaggio 1.1.3.4 3x per risciacquare tutta la candeggina. Immergere i semi in acqua sterile deionizzata per 2/8 h prima di piantare per ammorbidire il mantello del seme.
- Mettere fino a 100 semi di cavolo Napa (B. rapa var pekinensis) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.
- Pulizia dell'argilla calcificata per rimuovere le particelle di polvere fine
- Cavoli senza germi in crescita
NOTA: i cavoli napa (B. rapa var pekinensis) sono coltivati in tubi di vetro (15 cm x 2,5 cm) contenenti argilla calcificata imbevuta di Murashige e Skoog (MS) brodo nutritivo (Figura 1).- Pesare 10 g di argilla calcina pulita in un tubo di vetro pulito (15 cm x 2,5 cm).
- Preparare il brodo nutritivo MS sciogliendo 4,4 g di mezzo MS in 1 L di acqua deionizzata. Aggiungete il brodo nutriente MS (9 mL) ad ogni tubo di vetro per coprire l'argilla calcinata utilizzando una pipetta.
NOTA: Il liquido permanente nel tubo impedirà al seme di germinare, quindi potrebbe esserenecessario aggiungere un po 'meno brodo MS ad alcuni tubi. - Tubi di vetro a cappuccio libero con tappi di provetta bidirezionali da 22 mm e autoclave (121 gradi centigradi per 60 min). Quando li rimuove dall'autoclave, spingere i tappi sui tubi di vetro per sigillarli. Raffreddare i tubi a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Posizionare delicatamente un seme di cavolo sterile al centro di ogni tubo utilizzando pinze sterili e extra-lunghe (25,4 cm). Posizionare i tubi in un vassoio a 7 vie quindi posizionarli sotto i rack luminosi (lampadine fluorescenti T5 a spettro pieno o altre impostazioni di illuminazione per la crescita delle piante) con un ciclo di luce di 16 h a 24 .
NOTA: I semi germinano durante la notte e sviluppano la loro prima vera foglia dopo 5 giorni. Una vera foglia è la prima foglia vascolare dopo che i cotiledoni si sono formati. Ha un bordo più rugoso e in Brassica rapa è coperto di tricomi.
- Test per la sterilità dei cavoli privi di germi
NOTA: per verificare se i cavoli sono privi di germi, selezionare alcuni (5-10) cavoli da ogni lotto e scegliere se sono presenti colonie di cultura.- Rimuovere delicatamente il cavolo dai tubi di vetro afferrando la base della pianta con pinze sterilizzate ed estraendola. Prima di rimuovere completamente il cavolo dal tubo, tagliare con attenzione le radici utilizzando forbici sterilizzate. Compattare le foglie di cavolo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
NOTA: i cavoli più grandi potrebbero richiedere la rimozione di una o due delle foglie più grandi mentre il cavolo è ancora nel tubo per rendere più facile ottenere il cavolo nel tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Queste foglie più grandi possono essere aggiunte al tubo da 1,5 mL dopo che il resto del cavolo è stato inserito nel tubo se è necessario l'intero cavolo. - Aggiungere 400 lofani di 1x 1x di salina da cuscinetto fosfato (PBS) ad ogni tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Utilizzando un micropestle sterile, omogeneizzare il cavolo da pestlare 30x.
- Piastra 100 L del cavolo omogeneo su piastre di agar per determinare se ci sono contaminanti presenti nel campione. La maggior parte dei batteri trovati nella fillosfera crescerà su piastre di soia a tritarie (TS). Utilizzare punte di pipetta orifice largo durante la placcatura cavolo omogeneo come l'omogeneizzato cavolo è spesso e può ostiare le punte pipette regolari.
- Rimuovere delicatamente il cavolo dai tubi di vetro afferrando la base della pianta con pinze sterilizzate ed estraendola. Prima di rimuovere completamente il cavolo dal tubo, tagliare con attenzione le radici utilizzando forbici sterilizzate. Compattare le foglie di cavolo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
2. Inoculare la fillosfera con soluzioni microbiche
- Fare scorte di glicerolo di ceppi di inoculazione
NOTA: la Tabella 1 elenca gli isolati microbici che possono essere utilizzati in questo passaggio. Altri isolati di phyllosphere potrebbero essere utilizzati anche qui.- Densamente sfrecciare fuori singole colonie da una striscia fresca, su due/tre nuove piastre dello stesso supporto per ottenere molte colonie.
- Lascia che le striature crescano per 2-5 giorni, poi raschia colonie da tutte le piastre in un tubo conico di 15 mL contenente 15 mL del 15% di glicerolo, e vortice per mescolare accuratamente.
- Trasferire un'aliquota di 1 mL dello stock di glicerolo ben miscelato in un tubo di microcentrifuga di 1,5 ml e conservare le scorte di glicerolo a -80 gradi centigradi fino all'uso. Conservare i restanti 14 mL di brodo di glicerolo a -80 gradi centigradi, poiché sono necessari volumi relativamente grandi di soluzione di inoculazione durante l'inoculazione dei cavoli.
- Una settimana prima dell'uso, scongelare il tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di brodo di glicerolo (dal punto 2.1.3) su ghiaccio, diluire e piastra a diverse diluizioni (ad esempio, 10-4, 10-5e 10-6)per determinare la concentrazione (unità di formazione della colonia [CFU] per soluzione di inocL.
- Sterilizzare le bottiglie spray per l'inoculazione
- Smontare le bottiglie di pompaggio ambrate di Boston (59 mL) e immergere tutti i componenti (pompa, tubo, tappo e bottiglia) in soluzione di candeggina 30% per 30 min in un grande contenitore di plastica con un coperchio strettamente adatto.
- Dopo l'ammollo, versare con attenzione tutta la candeggina dal contenitore sollevando un solo angolo del coperchio del contenitore.
- Sciacquare le bottiglie riempiendo il contenitore di plastica con acqua autoclaved dionizzata (1 L a seconda delle dimensioni del contenitore) e versare con attenzione l'acqua deionizzata, ancora una volta sollevando il coperchio ad un angolo.
- Sterilizzare un armadio di biosicurezza spruzzando con soluzione di etanolo al 70% e accendendo la luce UV per 30 min.
NOTA: Continuare questo lavoro nell'armadio di biosicurezza in modo che non vi sia alcun rischio di contaminazione microbica delle bottiglie mentre si asciugano l'aria. - Rimuovere le bottiglie dal grande contenitore di plastica e riempire ogni bottiglia con acqua autoclaved deionizzata utilizzando una pipetta. Rimontare le pompe e posizionarne una in ogni bottiglia. Pompare l'acqua deionizzata attraverso ogni bottiglia (10 spray per bottiglia) per rimuovere la candeggina dal componente pompa della bottiglia.
- Ripetere il passaggio 2.2.5 per assicurarsi che tutta la candeggina venga rimossa dalle bottiglie di vetro.
- Verificare se le bottiglie sono sterili posizionando un numero su ogni bottiglia (attaccando il nastro da laboratorio sul lato della bottiglia quando è completamente asciutto) quindi aggiungere 10 mL di 1x PBS a ciascuna delle bottiglie e pompare 3 spray su una piastra di agar TS. Dopo l'irrorazione, incubare le piastre per una settimana a temperatura ambiente. Se le colonie crescono su un piatto indica che la rispettiva bottiglia non era sterile e non deve essere utilizzata per esperimenti.
- Prima di conservare le bottiglie sterili, rimuovere tutti i PBS rimanenti e lasciare asciugare accuratamente le bottiglie nell'armadio di biosicurezza. Conservare le bottiglie sterili in un contenitore di plastica sterile (in genere il contenitore utilizzato per sbiancare le bottiglie) fino all'uso.
- Preparazione dell'inoculo microbico e spruzzo di cavoli privi di germi
AVVISO: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in un armadio di biosicurezza, come irrorazione aerosolizza le soluzioni microbiche che potrebbero contaminare le superfici di lavoro o rappresentare un rischio per la salute se effettuate su un banco di laboratorio.
NOTA: I cavoli formeranno foglie vere dopo 5 giorni, quindi è consigliabile attendere una settimana dopo aver piantato il cavolo prima di inoculare con qualsiasi soluzione microbica. Poiché i tubi sono sigillati, non c'è bisogno di innaffiare i cavoli. Gli esperimenti sono meglio eseguiti entro un mese dalla semina, in quanto i piccoli tubi limitano la crescita del cavolo.- Scongelare glicerolo sul ghiaccio e diluire in 1x PBS alla concentrazione di inoculazione desiderata (concentrazione determinata dallo scongelamento e dalla placcatura di un 1 mL nel passaggio 2.1.4).
NOTA: È possibile utilizzare una varietà di diversi livelli di inoculazione, ma gli isolati di fillosfera possono crescere da 104 a 108 CFU/mL di liquami di cavolo in 10 giorni. - Aggiungere 10 mL di brodo di glicerolo diluito alla bottiglia sterile della pompa e pompare 5 spruzzi in un grande becher di raccolta dei rifiuti per rimuovere qualsiasi PBS residuo dal componente della pompa della bottiglia.
- Togliere il coperchio dal tubo del cavolo, inclinare il cavolo verso la bottiglia spray e spruzzare ogni cavolo con 3 pompe della soluzione di inoculazione, che fornisce 600 dollari lof inoculum.
- Dopo l'inoculazione, raccogliere un sottoinsieme dei cavoli per valutare la concentrazione di inoculazione effettiva dell'input. Rimuovere il cavolo da un tubo con pinze sterilizzate. Tagliare le radici con feccia sterile di scarico e quindi posizionare con cura il cavolo in un tubo di microcentrifuga sterile prepesato da 1,5 mL. Registrare il peso del cavolo per i calcoli futuri se Per i calcoli sono necessari CSU/g di cavolo.
- Aggiungere 400 luna di 1x PBS ad ogni tubo di microcentrifuga da 1,5 ml contenente cavolo e utilizzare un micropestle sterile per omogeneizzare il cavolo nel 1x PBS macinandolo 30x.
- Diluire cavolo omogeneo (se necessario) e piastrare la miscela di cavolo pested. Utilizzare punte di orifice larghe per pipettare i liquami di cavolo perché sarà spesso e pieno di pezzi di tessuto vegetale.
- Scongelare glicerolo sul ghiaccio e diluire in 1x PBS alla concentrazione di inoculazione desiderata (concentrazione determinata dallo scongelamento e dalla placcatura di un 1 mL nel passaggio 2.1.4).
3. Preparazione dell'estratto di verdura sterile
NOTA: Questo metodo è una versione modificata della produzione di supporti sterili di cavolo18,19.
- Acquistare un cavolo da un supermercato. In laboratorio, rimuovere e scartare le foglie più esterne del cavolo. Tritare tutto il cavolo rimanente per adattarsi a un frullatore e omogeneizzare il cavolo ad una polpa fine, cioè, il cavolo non otterrà alcuna fine con ulteriore miscelazione.
NOTA: Qualsiasi frullatore in grado di tritare il cavolo a una polpa omogenea liscia dovrebbe essere adatto a questo metodo. - Pesare l'omogenea del cavolo miscelato e aggiungere 2 mL di acqua distillata per grammo di cavolo. Filtrare i liquami di cavolo miscelato attraverso 2 strati di filtri per caffè a cesto (carta non sbiancata).
- Distribuisci il liquame del cavolo in tubi centrifuga (la dimensione dipende dalla centrifuga). Centrifugare il liquame di cavolo filtrato a 20.000 x g per 20 min fino a quando grandi particelle si stabiliscono fuori soluzione.
NOTA: È essenziale centrifugare il liquame del cavolo per un lungo periodo di tempo, poiché le particelle di cavolo intasano rapidamente lo sterilizzatore del filtro. - Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere il supernatante dai detriti di cavolo pelleta avendo cura di non disturbare il cavolo pelletto. Se si mira a ricreare condizioni di fermentazione in cui vengono utilizzate concentrazioni standard di sale, aggiungere il 2% w/v NaCl in questa fase (cioè prima della sterilizzazione del filtro).
- Filtro sterilizzare l'estratto vegetale utilizzando un filtro di 0,2 m (500 mL o 1 L) attaccato a un vuoto. Distribuisci in tubi sterili (o tubi di centrifuga 50 mL o tubi di centrifuga di 15 mL) e congelati a -80 gradi fino all'uso.
4. Inoculazione dell'estratto vegetale sterile
- Scongelare sartiame svelto e erogare 490 gradi l in tubi di microcentrifuga da 1,5 ml. Utilizzare tubi sufficienti per avere almeno cinque repliche per trattamento per punto temporale poiché ogni misurazione del punto temporale è distruttiva.
- Scongelare glicerolo di isolati microbici sul ghiaccio e diluire con 1x PBS alla concentrazione desiderata. La concentrazione di batteri dell'acido lattico può essere a partire da 5.000 CFU per mL di SVE. Per raggiungere questa concentrazione, diluire gli stock a 250 CCU/L perché per l'inoculazione di un volume totale di 500 gradi centigradi.
- SVE inoculata con 10 gradi di isolare microbico diluito. Pipette su e giù un paio di volte per mescolare a fondo. Incubare alla temperatura desiderata (14 gradi per la temperatura di produzione del kimchi o 24 gradi centigradi per la fermentazione dei crauti più caldi).
- Misurare il tasso di crescita dell'isolamento microbico nella SVE raccogliendo i tubi replicati il giorno 1, giorno 2, giorno 4, giorno 7 e giorno 14.
NOTA: La fermentazione procede rapidamente all'inizio e rallenta nel tempo. Pertanto, avere più tempi iniziali dà una maggiore risoluzione alla dinamica di come procede la fermentazione. - Ad ogni punto temporale, mescolare bene la SVE inoculata pipettando su e giù un paio di volte. Diluire serialmente l'SVE inoculato in 1x PBS e la piastra sulle piastre di agar. Incubale le piastre di agar per 4-7 giorni prima di contare le colonie.
NOTA: L'agar Man, Rogosa e Sharpe (MRS) deve essere usato per enumerare tutti i batteri dell'acido lattico, il peptone di lievito dextrose (YPD) deve essere usato per il lievito e l'agar TS per la maggior parte degli altri batteri si isola dalla fillosfera. - Registrare il pH dei campioni ad ogni momento utilizzando una sonda micro pH.
NOTA: Questo passaggio deve essere effettuato dopo la placcatura perché la sonda del pH trasferirà le cellule tra tubi / trattamenti.
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Representative Results
Tassi di crescita dei cavoli di Napa
Il metodo di sterilizzazione dei semi è stato testato con diversi cavoli Napa (B. rapa var pekinese; Figura supplementare 1) da un certo numero di fornitori diversi e tutti sono cresciuti costantemente con tassi di crescita simili. Tuttavia, testare i metodi con diverse specie di Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid; B. juncea: Senape Red Giant) ha dato un successo limitato (Figura supplementare 2). A differenza del cavolo Napa che forma rosette ordinate compatte che si inseriscono nei tubi di vetro, queste spp. Di Brassica avevano bassi tassi di germinazione dopo la sterilizzazione o il gambo allungato rapidamente per creare una pianta spinosa e malsana. Inoltre, sterilizzare i semi più vecchi (>1 anni) non è raccomandato in quanto i cappotti di semi si asciugano rendendo più difficile rimuoverli durante il processo di sterilizzazione. Acquistare regolarmente nuovi semi e testare un sottoinsieme di cavoli per determinare se sono sterili prima di effettuare esperimenti.
Crescita degli inoculanti microbici nella filosfera del cavolo Napa
Gli isolati microbici (Tabella 1) sono stati inoculati come isolati di singolo ceppo o in combinazione con un altro isolato per cercare interazioni pairwise nella fillosfera del cavolo DiNapa. Un totale di 15 cavoli senza germi sono stati inoculati per ogni trattamento e cinque cavoli sono stati raccolti immediatamente dopo l'inoculazione, cinque sono stati raccolti quattro giorni dopo l'inoculazione, e il resto sono stati raccolti 10 giorni dopo l'inoculazione. I risultati mostrano che gli isolati della fillosfera sono in grado di una rapida crescita nella fillosfera del cavolo Napa (Figura 2).
Crescita di inoculanti microbici in estratto vegetale sterile
Due lieviti (Kazachstania barnetti e Pichia membranifaciens) e tre batteri (Lactobacillus koreensis, Pediococcus parvulus, e Leuconostoc mesenteroides) sono stati inoculati in tre diversi tipi di SVE in rosso, verde e cavolo Napabage. Tutti i campioni sono stati incubati a 24 gradi centigradi e la crescita degli inoculati nell'arco di 14 giorni è stata registrata con la placcatura a campione di 5 -L di ogni trattamento su piastre di agar MRS o YPD (n . 5). I risultati sono illustrati nella Figura 3A. Il pH di ogni campione è stato anche registrato durante tutta la fermentazione (Figura 3B) e mostra che i batteri dell'acido lattico erano in grado di acidificare l'SVE a livelli inferiori al pH 4 (indicando un fermento sicuro per il consumo).
Figura 1: Diagramma della configurazione del cavolo privo di germi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Tassi di crescita di diversi batteri sul cavolo Napa privo di germi. (A) Crescita di singole vaccinazioni nella fillosfera. (B) Crescita dopo aver inoculato due microbi nella fillosfera. La crescita dei microbi è stata misurata come unità formanti colonia conteggiate per g di cavolo omogenato placcato su TSA o MRS media. n n - 5. Barre di errore: deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Crescita di batteri e lieviti di acido lattico in estratto vegetale sterile (SVE) realizzato con cavolo rosso, verde e Napa. (A) La crescita degli inoculanti microbici è stata misurata contando le unità formanti colonia per mL di SVE placcate. I lieviti erano placcati su piastre di agar YPD e batteri su piastre di agar MRS. (B) L'acidificazione dell'estratto vegetale sterile man mano che crescono microbi mostrate come caduta nel pH. n n - 5. Barre di errore: deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Phyla/Genera di inoculanti microbici | Fonte di microbo |
| Firmicutes Bacillus | Phyllosfera |
| Firmicutes Lactobacillus | Fermentazione |
| Proteobatteri Achromobacter | Phyllosfera |
| Proteobatteri Rhizobium | Phyllosfera |
| Proteobatteri Sphingomonas | Phyllosfera |
Tabella 1: Isolazioni microbiche inoculate sul cavolo Napa privo di germi.
Figura supplementare 1: Crescita di Brassica rapa var pekinensis: Bilko in condizioni di assenza di germi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 2: Diverse varietà di cavolo che crescono in condizioni prive di germi. (A) B. rapa: Turnip Purple Top, (B) B. oleracea: Cairo Hybrid, (C) B. oleracea: Tropic Giant Hybrid, (D) B. campestris: Pak Choy Choy Hybrid, (E) B. juncea: Mustard Red Giant. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le piante di cavolo Napa prive di germi sono state utilizzate per studiare la limitazione della dispersione dei batteri dell'acido lattico nella fillosfera del cavolo di Napa17. I cavoli Napa privi di germi possono anche essere utilizzati per testare la crescita individuale o a coppie nella fillosfera (Figura 1). I metodi per la produzione di estratto vegetale sterile sono stati testati per tre diverse varietà di cavolo: rosso, verde e Napa. Ognuna di queste SVI agisce come un mezzo di crescita affidabile; microbi inoculati crescono costantemente attraverso i diversi media. I tassi di crescita a ceppo singolo in SVE (Figura 2) mostrano che LAB crescono rapidamente e acidificano i media nello stesso modo che sarebbe previsto in un fermento17.
Piante prive di germi ed estratto vegetale sterile possono essere utilizzati in combinazione per affrontare una serie di diverse questioni ecologiche come gli effetti prioritari e la successione nella fillosfera o all'interno di un fermento. Una comunità sintetica di microbi è semplice da costruire attraverso placcatura cavoli omogeneizzati per ottenere isolati di filosfera, o crauti per ottenere batteri dell'acido lattico16. Le interazioni a coppie o gli esperimenti leave-one-out con più membri della comunità possono essere effettuati nella phylosphere o nella SVE per valutare l'importanza o la funzione dei membri della comunità. Studi di selezione ambientale possono essere effettuati nella SVE dove è possibile valutare l'impatto della verdura fermentata. C'è anche il potenziale per utilizzare sia i cavoli privi di germi che la SVE per quantificare la diversificazione delle specie e delle comunità microbiche utilizzando l'evoluzione sperimentale.
Una limitazione di questo sistema di cavolo privo di germi è la breve tempistica degli esperimenti. A causa dei piccoli tubi di vetro utilizzati, i cavoli non sono in grado di crescere per periodi più lunghi di un mese in quanto le loro foglie sono confinate dal bordo dei tubi. Si potrebbero utilizzare contenitori più grandi in crescita, come scatole di coltura dei tessuti vegetali (Tabella dei materiali),ma questi non produrranno comunque un impianto di cavolo di dimensioni complete. Abbiamo anche provato a coltivare cavoli nello 0,75% di agar contenente brodo MS, ma abbiamo scoperto che questo ha prodotto una crescita incoerente delle piantine di cavolo. L'utilizzo dell'argilla calcigata come substrato in crescita con brodo di SM sufficiente a saturare ma non a inondazione i grani di argilla è il metodo ottimale per coltivare cavoli sani.
Ci sono alcuni passaggi critici per garantire la crescita di successo dei cavoli privi di germi. Garantire che l'argilla calcificata sia completamente asciutta quando si aggiunge il brodo MS permette all'argilla di assorbire completamente il brodo MS durante il ciclo dell'autoclave. Tuttavia, se c'è del brodo MS sul livello dell'argilla, deve essere rimosso prima di aggiungere i semi; semi non germinano se sono seduti nel brodo MS. Un altro passo importante da monitorare è la sterilizzazione del seme. I semi più vecchi (>1 anni) non germoglieranno con la stessa rapidità o sicurezza dei semi giovani. Anche la modifica delle dimensioni del tubo utilizzato per la sterilizzazione o il riempimento eccessivo dei tubi può influire sulla sterilizzazione. La fase di sterilizzazione aiuta anche ad ammorbidire e rimuovere il mantello del seme in modo che i semi germinano rapidamente. Si noti qui che il riutilizzo delle bottiglie spray pompa dopo l'uso con colture microbiche non è raccomandato, in quanto è difficile rimuovere i biofilm dal componente della pompa. In particolare, occorre prestare particolare attenzione alle specie di Bacillus in quanto sono particolarmente resistenti all'autoclaving. Eventuali bottiglie di pompa che sono venute a contatto con Bacillus spp non vengono riutilizzate.
Mentre l'estratto vegetale sterile non ha la struttura spaziale presente in un recipiente di fermentazione, la dinamica di crescita di LAB suggerisce che imita il progresso della fermentazione con un rapido calo del pH e un aumento della crescita dei batteri dell'acido lattico nei 14 giorni di fermentazione. Leuconostoc mesenteroides è importante all'inizio della fermentazione ed è aumentato in abbondanza più rapidamente rispetto al Lactobacillus e Pediococcus spp, una tendenza visto in altri rilevamenti di successione di crauti20,21. Il lavoro in laboratorio ha anche esplorato l'utilizzo dello spettrofotometro per ottenere letture di densità ottica (OD) per misurare la crescita del LAB in SVE erogato in 96 lastre di pozzo. I risultati iniziali con l'estratto di cavolo Napa sembravano promettenti, ma SVE fatto con estratto di cavolo rosso cambiato colore come il pH caduto con conseguente letture OD confuse. Inoltre, l'utilizzo di letture OD per enumerare la crescita limita l'uso di questo sistema a inoculazioni a singolo ceppo. Insieme, queste limitazioni ci hanno portato ad abbandonare l'uso delle letture OD per misurare la crescita microbica.
Testare le interazioni ecologiche nella fillosfera è attuale in quanto vi sono prove che la fillosfera influisce sulla salute e la produttività delle piante delle colture22. Il nostro sistema modello è stato sviluppato solo per lavorare con il cavolo Napa, ma i batteri dei proteobatteri phyla, Firmicutes e Actinobacteria sono comuni nella filolosfera di molte specie vegetali13,23. Mentre solo tre diverse varietà di cavolo sono state testate, SVE può essere fatta con altre importanti piante agricole. Ad esempio, gli studi che studiano l'assemblaggio della comunità microbica durante la fermentazione del succo di carota24 o la colonizzazione microbica della radice di mais25 possono essere replicati utilizzando i protocolli descritti in questo documento.
L'accoppiamento del cavolo privo di germi con la SVE per studiare l'assemblaggio della comunità in fermentazione può mostrare come i cambiamenti nel microbioma della fillosfera possano influenzare il successo della fermentazione. Lo sfasolimento dei fermenti o la mancata raggiungimento di un pH sufficientemente basso possono verificarsi se non c'è una rapida acidificazione iniziale26. Questi fermenti viziati potrebbero essere dovuti a processi di produzione, ma la variazione nei microbiomi della fillosfera può anche avere un'importante influenza sul successo dei fermenti vegetali17. Il sistema descritto è un modello utile per determinare quali processi di assemblaggio del microbioma possono influire sul successo della fermentazione vegetale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Tracy Debenport e Claire Fogan hanno fornito supporto tecnico e Ruby Ye e Casey Cosetta hanno fornito utili commenti sulle prime versioni di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
