Summary
En metode for voksende bakteriefrie Napa kål er utviklet som gjør det mulig for forskere å vurdere hvordan enkelt mikrobielle arter eller multispecies mikrobielle samfunn samhandler på kålbladoverflater. Et sterilt vegetabilsk ekstrakt presenteres også som kan brukes til å måle endringer i fellesskapssammensetning under vegetabilsk gjæring.
Abstract
Phyllosphere, den ovennevnte bakken delen av anlegget som kan koloniseres av mikrober, er et nyttig modellsystem for å identifisere prosesser av mikrobiell fellesskap montering. Denne protokollen skisserer et system for å studere mikrobiell samfunnsdynamikk i phyllosphere av Napa kål planter. Den beskriver hvordan å vokse bakteriefrie planter i reagensrør med en kalsinert leire og næringsbuljong substrat. Inokulasjon av bakteriefrie planter med spesifikke mikrobielle kulturer gir muligheter til å måle mikrobiell vekst og samfunnsdynamikk i phyllosphere. Gjennom bruk av sterilt vegetabilsk ekstrakt produsert fra kålskift i mikrobielle samfunn som oppstår under gjæring kan også vurderes. Dette systemet er relativt enkelt og billig å sette opp i laboratoriet og kan brukes til å løse viktige økologiske spørsmål i mikrobiell fellesskapsforsamling. Det gir også muligheter til å forstå hvordan phyllosphere samfunnet sammensetning kan påvirke mikrobiell mangfold og kvalitet på vegetabilske gjæringer. Denne tilnærmingen for å utvikle gnotobiotiske kål phyllosphere samfunn kan brukes på andre ville og landbruksplantearter.
Introduction
Mikrobiell mangfold av phyllosphere spiller en viktig rolle i å opprettholde plantehelse og kan også påvirke plantens evne til å tåle miljøstress1,2,3,4,5. I sin tur påvirker helsen til avlinger direkte matsikkerhet og kvalitet6,,7. Planter spiller en rolle i økosystemfunksjonen, og deres tilknyttede mikrobiomer påvirker begge plantenes evne til å utføre disse aktivitetene, samt direkte påvirke miljøet selv8. Mens forskere har begynt å tyde funksjonen og sammensetningen av phyllosphere, de økologiske prosesser som påvirker phyllosphere mikrobiell samfunnet montering er ikke fullt ut forstått9,10. Phyllosphere mikrobiome er et utmerket eksperimentelt system for å studere økologi av mikrobiomer11. Disse samfunnene er relativt enkle, og mange av fellesskapsmedlemmene kan dyrkes på standard lab media10,12,13.
Fermenterte grønnsaker er ett system der phyllosphereens samfunnsstruktur har viktige konsekvenser. I både surkål og kimchi fungerer mikrobene som naturlig forekommer på vegetabilske blader (phyllosphere av Brassica arter) som inoculum for gjæring14,15. Melkesyrebakterier (LAB) regnes som allestedsnærværende medlemmer av vegetabilske mikrobiomer, men de kan være i lav overflod i phyllosphere16. Sterk abiotisk utvalg under gjæring driver et skifte i mikrobiell fellesskapssammensetning slik at melkesyrebakterier kan øke i overflod. Etter hvert som LAB vokser, produserer de melkesyre som skaper det sure miljøet til fermenterte vegetabilske produkter17. Koblingen mellom phyllosphere og gjæringen gir en mulighet til å bruke grønnsaker som modell for å forstå hvordan mikrobiomer er strukturert.
Vi har utviklet metoder for å vokse bakteriefrie Napa kål og å inokulere dem med spesifikke mikrobielle samfunn ved hjelp av sprayflasker. Dette er en billig og pålitelig metode for å inokulere kålen jevnt med enten individuelle mikrober eller blandede samfunn. Et sterilt vegetabilsk ekstrakt (SVE) er også utviklet fra tre forskjellige kåltyper/varianter: rød og grønn kål (Brassica oleracea) og Napa kål (B. rapa). Tilsetning av salt til disse SVEene replikerer gjæringsmiljøet og gir mulighet for småskala og relativt høygjennomstrømning eksperimentelle studier av gjæring mikrobiome montering. Disse metodene kan brukes til å studere mikrobiell samfunnsmontering i phyllosphere og hvordan mikrobiell samfunnsdynamikk i phyllosphere kan knyttes til suksessen til vegetabilsk gjæring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voksende bakteriefrie kåler
- Forbereder utstyr for dyrking av bakteriefrie kåler
- Rengjøring av den kalserte leire for å fjerne fine støvpartikler
- Skyll kalsinert leire (Tabell av materialer) minst 3x med vann fra springen; avløp av vann.
FORSIKTIG: Kalsinert leire produserer veldig fint støv, og det anbefales å bruke en beskyttende maske (Tabell over materialer) ved vask. - Spre kalsinert leire ut som et tynt lag (~ 4 cm) i et autoklavbrett og autoklav på en tørr syklus (121 °C oppvarming i 20 min og 20 min tørketid) for å sterilisere.
- La den kalserte leire tørke helt før bruk ved å spre seg ut på brett og plassere i en varm inkubator (30-37 °C) i minst en uke. Rør for å blande hver tredje dag for å tørke den kalserte leire fullt ut slik at den absorberer en jevn mengde Murashige og Skoog (MS) næringsbuljong (pkt. 1.2).
MERK: Tørking bidrar også til å holde volumet av kalsinert leire selv når det veies inn i rør. Tørking på andre måter, for eksempel en tørkeovn, ville også være egnet.
- Skyll kalsinert leire (Tabell av materialer) minst 3x med vann fra springen; avløp av vann.
- Rengjøring av glasset for dyrking av bakteriefrie kåler
- Rengjør og steriliser glassrørene grundig (Materialbordet) mellom hver bruk. Bløtlegg rør i 30 min i 30% blekemiddelløsning og skyll godt med vann fra springen før rengjøring i en syrevask på bakteriologiinnstilling. Syrevask toveis reagensrør caps (Tabell av materialer) mellom bruk.
- Overflate sterilisering kål frø
- Plasser opptil 100 Napa kål (B. rapa var pekinensis) frø i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
MERK: Legge mer enn 100 frø til en mikrocentrifuge rør eller endre størrelsen på røret kan påvirke spiring priser av frøene på grunn av mangel på frø pels fjerning. - Tilsett 1 ml 70% etanol til frøene og vortex i 5 min. Kast etanol ved hjelp av en pipette.
- Tilsett 1 ml 50 % blekemiddel og vortex i 5 min. Kast blekemiddeloppløsningen ved hjelp av en pipette.
- Tilsett 1 ml autoklavert deionisert vann og vortex i 5 min. Kast deionisert vann ved hjelp av en pipette.
- Gjenta trinn 1.1.3.4 3x for å skylle av all blekemiddel. Bløtlegg frøene i sterilt deionisert vann i 2-8 timer før planting for å myke frøfrakken.
- Plasser opptil 100 Napa kål (B. rapa var pekinensis) frø i en 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
- Rengjøring av den kalserte leire for å fjerne fine støvpartikler
- Voksende bakteriefrie kåler
MERK: Napa kål (B. rapa var pekinensis) dyrkes i glassrør (15 cm x 2,5 cm) som inneholder kalsinert leire gjennomvåt i Murashige og Skoog (MS) næringsbuljong (Figur 1).- Veier 10 g ren kalsinert leire i et rent glassrør (15 cm x 2,5 cm).
- Forbered MS næringsbuljong ved å oppløse 4,4 g MS medium i 1 L av deionisert vann. Tilsett MS næringsbuljong (~ 9 ml) til hvert glassrør for å dekke den kalserte leire ved hjelp av en pipette.
MERK: Stående væske i røret vil hindre frøet fra å spire, slik at det kan være necessary å legge litt mindre MS kjøttkraft til noen rør. - Dekselglass i glass løst med 22 mm toveis reagensrørstopper og autoklav (121 °C i 60 min). Når du fjerner dem fra autoklaven, skyver du caps på glassrørene for å forsegle dem. Avkjøl rørene til romtemperatur før bruk.
- Plasser forsiktig ett sterilt kålfrø i midten av hvert rør ved hjelp av sterile, ekstra lange (25,4 cm) tang. Plasser rørene i et 7-veis brett og plasser deretter under lysstativer (fullspektret T5 fluorescerende pærer eller annet belysningsoppsett for plantevekst) med en 16 h lyssyklus ved 24 °C.
MERK: Frø spirer over natten og utvikler sitt første sanne blad etter 5 dager. Et ekte blad er det første vaskulære bladet etter at kotyledonene har dannet seg. Den har en mer rynkete kant og i Brassica rapa er dekket av trichomes.
- Testing for sterilitet av bakteriefrie kåler
MERK: For å teste om kålene er bakteriefrie, velg noen (5−10) kål fra hver batch og plate ut for å avgjøre om noen dyrkbare kolonier er til stede.- Fjern forsiktig kålen fra glassrørene ved å gripe plantens base med steriliserte tang og trekke den ut. Før du fjerner kålen helt fra røret, kutt forsiktig av røttene ved hjelp av sterilisert disseksjonssaks. Komprimer kålbladene i et 1,5 ml mikrosytrifusrør.
MERK: Større kål kan kreve å fjerne ett eller to av de større bladene mens kålen fortsatt er i røret for å gjøre det lettere å få kålen inn i 1,5 ml mikrocentrifugerøret. Disse større bladene kan legges til 1,5 ml røret etter at resten av kålen er plassert i røret hvis hele kålen er nødvendig. - Tilsett 400 μL 1x fosfatbuffer saltvann (PBS) til hvert 1,5 ml mikrosytrifusrør. Ved hjelp av en steril mikropestle, homogeniser kålen ved å plage 30x.
- Plate 100 μL av kål homogenate på agar plater for å avgjøre om det er noen forurensninger tilstede i prøven. De fleste bakterier som finnes i phyllosphere vil vokse på tryptisk soya (TS) agar plater. Bruk brede pipettespisser når du plating kål homogenat som kål homogenate er tykk og kan tette vanlige pipette tips.
- Fjern forsiktig kålen fra glassrørene ved å gripe plantens base med steriliserte tang og trekke den ut. Før du fjerner kålen helt fra røret, kutt forsiktig av røttene ved hjelp av sterilisert disseksjonssaks. Komprimer kålbladene i et 1,5 ml mikrosytrifusrør.
2. Inokulere phyllosphere med mikrobielle løsninger
- Å lage glyserolbestander av inokulasjonsstammer
MERK: Tabell 1 viser mikrobielle isolater som kan brukes i dette trinnet. Andre phyllosphere isolater kan også brukes her.- Tett strek ut individuelle kolonier fra en frisk strek, på to / tre nye plater av samme media for å få mange kolonier.
- La striper vokse i 2-5 dager deretter skrape kolonier fra alle plater til en 15 ml konisk rør som inneholder 15 ml 15% glyserol, og vortex å blande grundig.
- Overfør en aliquot på 1 ml av godt blandet glyserol lager til en 1,5 ml mikrocentrifuge rør og lagre glyserol aksjer ved -80 ° C til bruk. Lagre de resterende 14 ml glyserolbestanden ved -80 °C, da relativt store mengder inokulasjonsoppløsning er nødvendig ved inokulering av kål.
- En uke før bruk tiner du 1,5 ml røret som inneholder 1 ml glyserollager (fra trinn 2.1.3) på is, fortynne og plate ved flere forskjellige fortynninger (f.eks. 10-4,10-5og 10-6)for å bestemme konsentrasjonen (kolonidannende enhet [CFU] per μL) av 14 ml inokulasjonsløsning.
- Sterilisering inokulasjon spray flasker
- Demonter de gule runde Boston-pumpeflaskene (59 ml) og suge alle komponenter (pumpe, rør, hette og flaske) i 30% blekemiddelløsning i 30 min i en stor plastbeholder med et tettsittende lokk.
- Etter bløtlegging, hell forsiktig ut all blekemiddel fra beholderen ved å løfte bare ett hjørne av lokket på beholderen.
- Skyll flaskene ved å fylle plastbeholderen med autoklavert avionisert vann (~ 1 L avhengig av beholderstørrelsen) og hell forsiktig ut avionisert vann, igjen ved å løfte lokket i det ene hjørnet.
- Steriliser et biosikkerhetsskap ved å sprøyte med 70% etanoloppløsning og slå på UV-lyset i 30 min.
MERK: Fortsett dette arbeidet i biosikkerhetsskapet slik at det ikke er fare for mikrobiell kontaminering av flaskene når de lufttørkes. - Fjern flasker fra den store plastbeholderen og fyll hver flaske med autoklavet deionisert vann ved hjelp av en pipette. Sett pumpene igjen og plasser en i hver flaske. Pump deionisert vann gjennom hver flaske (10 spray per flaske) for å fjerne blekemiddel fra pumpekomponenten på flasken.
- Gjenta trinn 2.2.5 for å sikre at all blekemiddel fjernes fra glassflaskene.
- Test om flasker er sterile ved å plassere et tall på hver flaske (stikker lab tape til siden av flasken når den er helt tørr) deretter legge 10 ml 1x PBS til hver av flaskene og pumpe 3 spray på en TS agar plate. Etter sprøyting, inkuber platene i en uke ved romtemperatur. Hvis noen kolonier vokser på en tallerken, indikerer det at den respektive flasken ikke var steril og ikke skal brukes til eksperimenter.
- Før du oppbevarer de sterile flaskene, fjern alle gjenværende PBS og la flaskene tørke grundig i biosikkerhetsskapet. Oppbevar sterile flasker i en steril plastbeholder (vanligvis beholderen som brukes til bleking av flaskene) til bruk.
- Forbereder mikrobiell inoculum og sprøyting bakteriefrie kåler
FORSIKTIG: Alle trinn bør utføres i et biosikkerhetsskap, da sprøyting aerosoliserer mikrobielle løsninger som kan forurense arbeidsflater eller utgjøre en helserisiko hvis det utføres på en laboratoriebenk.
MERK: Kål vil danne sanne blader etter 5 dager, så det anbefales å vente en uke etter planting av kålen før inokulering med noen mikrobielle løsninger. Når rørene er forseglet, er det ikke nødvendig å vanne kålene. Eksperimenter utføres best innen en måned etter planting, da de små rørene begrenser kålens vekst.- Tin glyserolbestandene på is og fortynn i 1x PBS til ønsket inokulasjonskonsentrasjon (konsentrasjon bestemt ved tining og plating en 1 ml aliquot i trinn 2.1.4).
MERK: En rekke forskjellige inokulasjonsnivåer kan brukes, men phyllosphere isolater kan vokse fra 104 til 108 CFUer / ml kålslampe på 10 dager. - Tilsett 10 ml fortynnet glyserollager i den sterile pumpeflasken og pump 5 sprayer i et stort avfallsoppsamlingsbeger for å fjerne eventuelle gjenværende PBS fra flaskepumpekomponenten.
- Fjern lokket fra kålrøret, vipp kålen mot sprayflasken, og spray hver kål med 3 pumper av inokulasjonsløsningen, som gir ~ 600 μL inoculum.
- Etter inokulerende høster du en undergruppe av kålene for å vurdere den faktiske inngangsinnløsningskonsentrasjonen. Fjern kålen fra et rør med steriliserte tang. Klipp av røttene med steril disseksjon saks og deretter forsiktig plassere kål i en forveid steril 1,5 ml mikrocentrifuge rør. Registrer vekten av kålen for fremtidige beregninger hvis CFUer / g kål er nødvendig for beregninger.
- Tilsett 400 μL av 1x PBS til hver 1,5 ml mikrosygående røret som inneholder kål og bruk en steril mikropestle for å homogenisere kålen i 1x PBS ved å slipe den 30x.
- Fortynn kål homogenat (om nødvendig) og plate ut pestled kål blandingen. Bruk brede åpningspisser for pipettering av kålslamen fordi den vil være tykk og full av plantevevsbiter.
- Tin glyserolbestandene på is og fortynn i 1x PBS til ønsket inokulasjonskonsentrasjon (konsentrasjon bestemt ved tining og plating en 1 ml aliquot i trinn 2.1.4).
3. Klargjøre sterilt vegetabilsk ekstrakt
MERK: Denne metoden er en modifisert versjon av kål steril medieproduksjon18,19.
- Kjøp en kål fra et supermarked. I laboratoriet, fjern og kast de ytterste bladene av kålen. Hakk all gjenværende kål for å passe inn i en blender og homogeniser kål til en fin masse, det vil eksempel kålen ikke bli finere med ytterligere blanding.
MERK: Enhver blender som kan hogge kål til en jevn homogen masse bør være egnet for denne metoden. - Vei den blandede kål homogenate og tilsett 2 ml destillert vann per gram kål. Filtrer blandet kålslampe gjennom 2 lag med kurvkaffefiltre (ubleket papir).
- Dispenser kålslampen i sentrifugerør (størrelsen er avhengig av sentrifugen). Sentrifuger den filtrerte kålslampensen ved 20.000 x g i 20 min til store partikler legger seg ut av oppløsningen.
MERK: Det er viktig å sentrifugere kålslamen i lang tid, da kålpartikler raskt tetter filtersterilatoren. - Bruk en serologisk pipette, fjern supernatanten fra pelleted kål rusk tar vare på ikke å forstyrre pelleted kål. Hvis det tar sikte på å gjenskape gjæringsforhold der standard saltkonsentrasjoner brukes, tilsett 2% w / v NaCl på dette trinnet (dvs. før filtersterilisering).
- Filtrer sterilisatoren med et 0,2 μm filter (500 ml eller 1 L) festet til et vakuum. Dispenser i sterile rør (enten 50 ml sentrifugerør eller 15 ml sentrifugerør) og frys ved -80 °C til bruk.
4. Inokulasjon av sterilt vegetabilsk ekstrakt
- Tin SVE og dispenser 490 μL i 1,5 ml mikrosytrifuvrør. Bruk tilstrekkelige rør til å ha minst fem replikere per behandling per timepoint, da hver timepoint-måling er ødeleggende.
- Tin glyserollagre av mikrobielle isolater på is og fortynn med 1x PBS til ønsket konsentrasjon. Konsentrasjonen av melkesyrebakterier kan være så lav som 5000 CFU per ml SVE. For å oppnå denne konsentrasjonen, fortynne bestandene til 250 CFUer/μL fordi 10 μL vil bli brukt til inokulasjon av et totalt volum på 500 μL.
- Inokuler SVE med 10 μL fortynnet mikrobiell isolat. Pipette opp og ned et par ganger for å blande seg grundig. Inkuber ved ønsket temperatur (14 °C for produksjonstemperatur kimchi eller 24 °C for varmeste surkålfermentering).
- Mål veksten av mikrobiell isolat i SVE ved å høste replikere rør på dag 1, dag 2, dag 4, dag 7 og dag 14.
MERK: Gjæringen fortsetter raskt i utgangspunktet og bremser over tid. Derfor gir det å ha flere innledende tidspunkter større oppløsning på dynamikken i hvordan gjæringen fortsetter. - På hvert tidspunkt, bland den inokulerte SVE godt ved å pipe opp og ned et par ganger. Serialt fortynne inokulert SVE i 1x PBS og plate på agarplater. Inkuber agarplatene i 4-7 dager før du teller kolonier.
MERK: Man, Rogosa og Sharpe (MRS) agar bør brukes til å liste opp alle melkesyrebakterier, gjærpegulton dekstrose (YPD) bør brukes til gjær, og TS agar for de fleste andre bakterier isolerer fra phyllosphere. - Ta opp pH-en til prøvene på hvert tidspunkt ved hjelp av en mikropH-sonde.
MERK: Dette trinnet bør utføres etter plating fordi pH-sonden vil overføre celler mellom rør/behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vekstrater for Napa kål
Frø sterilisering metoden ble testet med flere forskjellige Napa kål (B. rapa var pekinese; Supplerende figur 1) fra en rekke ulike leverandører og alle vokste konsekvent med lignende vekstrater. Men testing av metoder med forskjellige arter av Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid; B. juncea: Sennep Red Giant) ga begrenset suksess (Supplerende figur 2). I motsetning til Napa kål som danner kompakte pene rosetter som passer inn i glassrørene, hadde disse Brassica spp. enten hadde lave spiringsrater etter sterilisering eller stammen langstrakt raskt for å lage en spindly, usunn plante. I tillegg steriliserer ikke eldre frø (> 1 år gammel) da frøfrakkene tørker ut, noe som gjør det vanskeligere å fjerne dem under steriliseringsprosessen. Kjøp regelmessig nye frø og test en undergruppe av kål for å avgjøre om de er sterile før de utfører eksperimenter.
Vekst av mikrobielle inoculants i Napa kål phyllosphere
Mikrobielle isolater (Tabell 1) ble vaksinert enten som enkeltstammeisolater eller i kombinasjon med et annet isolat for å se etter parvis interaksjoner i Napa kål phyllosphere. Totalt 15 bakteriefrie kåler ble vaksinert for hver behandling og fem kål ble høstet umiddelbart etter inokulasjon, fem ble høstet fire dager etter inokulasjon, og de resterende ble høstet 10 dager etter inokulasjon. Resultatene viser at phyllosphere isolater er i stand til rask vekst i Napa kål phyllosphere (Figur 2).
Vekst av mikrobielle inoculants i sterilt vegetabilsk ekstrakt
To gjær (Kazachstania barnetti og Pichia membranifaciens) og tre bakterier(Lactobacillus koreensis, Pediococcus parvulusog Leuconostoc mesenteroides) ble inokulert i tre forskjellige typer SVE laget av rød, grønn og Napa kål. Alle prøver ble inkubert ved 24 °C og vekst av inokulatene over 14 dager ble registrert ved punktplating 5 μL av hver behandling på enten MRS- eller YPD agarplater (n = 5). Resultatene vises i figur 3A. PH for hver prøve ble også registrert gjennom gjæringen (figur 3B) og viser at melkesyrebakteriene var i stand til å forsure SVE til nivåer under pH 4 (indikerer en gjæring som er trygg for forbruk).
Figur 1: Diagram av bakteriefri kåloppsett. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Vekstrater av forskjellige bakterier på bakteriefri Napa kål. (A)Vekst av enkelt inokulasjoner i phyllosphere. (B)Vekst etter inokulering av to mikrober i phyllosphere. Vekst av mikrober ble målt som kolonidannende enheter talt per g kål homogenat belagt på enten TSA eller MRS media. n = 5. Feilfelt = standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Vekst av melkesyrebakterier og gjær i sterilt vegetabilsk ekstrakt (SVE) laget med rød, grønn og Napa kål. (A) Veksten av mikrobielle inoculants ble målt ved å telle koloniformingsenheter per ml SVE-belagt. Gjær ble belagt på YPD agar plater og bakterier på MRS agar plater. (B) Forsuring av det sterile vegetabilske ekstraktet som mikrober vokser vist som fall i pH. n = 5. Feilfelt = standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Phyla/Genera av mikrobielle inoculants | Kilde til mikrobe |
| Firmicutes Bacillus | Phyllosphere (andre) |
| Firmicutes Lactobacillus | Gjæring |
| Proteobacteria Achromobacter | Phyllosphere (andre) |
| Proteobacteria Rhizobium (Andre) | Phyllosphere (andre) |
| Proteobacteria Sphingomonas | Phyllosphere (andre) |
Tabell 1: Mikrobielle isolerer vaksinert på bakteriefri Napa kål.
Supplerende figur 1: Vekst av Brassica rapa var pekinensis: Bilko i bakteriefrie forhold. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 2: Ulike kålvarianter vokser i bakteriefrie forhold. (A) B. rapa: Turnip Purple Top, (B) B. oleracea: Cairo Hybrid, (C) B. oleracea: Tropic Giant Hybrid, (D) B. campestris: Choi Toy Choy Hybrid, (E) B. juncea: Sennep Red Giant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriefrie Napa kålplanter har blitt brukt til å studere spredningsbegrensning av melkesyrebakterier i Napa kål phyllosphere17. Bakteriefrie Napa kål kan også brukes til å teste individuell eller parvis vekst i phyllosphere (Figur 1). Metoder for å lage sterilt vegetabilsk ekstrakt har blitt testet for tre forskjellige varianter av kål: rød, grønn og Napa. Hver av disse SVE fungerer som en pålitelig vekst media; inokulerte mikrober vokser konsekvent på tvers av de forskjellige mediene. Enkelt belastning vekstrater i SVE (Figur 2) viser at LAB vokser raskt og forssurer media på samme måte som ville forventes i en gjæring17.
Bakteriefrie planter og sterilt vegetabilsk ekstrakt kan brukes i kombinasjon for å ta opp en rekke ulike økologiske spørsmål som prioriterte effekter og suksesjon i phyllosphere eller innenfor en gjæring. Et syntetisk samfunn av mikrober er enkel å konstruere gjennom plating ut homogenisert kål for å få phyllosphere isolater, eller surkål for å få melkesyre bakterier16. Pairwise-interaksjoner eller leave-one-out eksperimenter med flere samfunnsmedlemmer kan utføres i phyllosphere eller i SVE for å vurdere betydningen eller funksjonen til samfunnsmedlemmer. Miljøvalgstudier kan utføres i SVE hvor virkningen av grønnsaksfermentert kan vurderes. Det er også potensial til å bruke både bakteriefrie kål og SVE til å kvantifisere diversifisering av mikrobielle arter og samfunn ved hjelp av eksperimentell evolusjon.
En begrensning av dette bakteriefrie kålsystemet er den korte tidsskalaen til eksperimentene. På grunn av de små glassrørene som brukes, er kålene ikke i stand til å vokse i perioder lenger enn en måned, da bladene er begrenset av kanten av rørene. Større voksende beholdere, for eksempel plantevevskulturbokser (Table of Materials) kan brukes, men disse vil fortsatt ikke produsere en full størrelse kål plante. Vi har også prøvd å dyrke kål i 0,75% agar som inneholder MS kjøttkraft, men fant at dette produsert inkonsekvent vekst av kål frøplanter. Ved hjelp av kalsinert leire som et voksende substrat med nok MS-kjøttkraft til å mette, men ikke oversvømme leirekornene er den optimale metoden for dyrking av sunne kåler.
Det er noen kritiske trinn for å sikre vellykket vekst av bakteriefrie kåler. Sørg for at den kalserte leire er helt tørr når du legger MS kjøttkraft gjør at leire å fullt absorbere MS kjøttkraft under autoklav syklus. Men hvis det er noen MS kjøttkraft over nivået av leire, må den fjernes før du legger til frøene; frø vil ikke spire hvis de sitter i MS kjøttkraft. Et annet viktig skritt for å overvåke er frø sterilisering. Eldre frø (>1 år gammel) vil ikke spire så raskt eller så pålitelig som unge frø. Endring av størrelsen på røret som brukes til sterilisering eller overfylling av rørene kan også påvirke sterilisering. Steriliseringstrinnet bidrar også til å myke opp og fjerne frøfrakken slik at frøene raskt spirer. Vær oppmerksom på at gjenbruk av pumpesprayflasker etter bruk med mikrobielle kulturer ikke anbefales, da det er vanskelig å fjerne biofilmer fra pumpekomponenten. Spesielt oppmerksom, bør forsiktighet tas med Bacillus arter som de er spesielt motstandsdyktig mot autoklavering. Eventuelle pumpeflasker som har kommet i kontakt med Bacillus spp, brukes ikke på nytt.
Mens sterilt vegetabilsk ekstrakt ikke har romlig strukturering som er tilstede i et gjæringsfartøy, tyder vekstdynamikken i LAB på at det etterligner gjæringsfremgang med et raskt fall i pH og en økning i veksten av melkesyrebakterier i løpet av de 14 dagene med gjæring. Leuconostoc mesenteroides er viktig i begynnelsen av gjæring og det økte i overflod raskere enn Lactobacillus og Pediococcus spp, en trend sett i andre surkål suksesjon undersøkelser20,21. Arbeidet i laboratoriet har også utforsket ved hjelp av spektrofotometer for å oppnå optisk tetthet (OD) avlesninger for å måle veksten av LAB i SVE dispensert i 96 brønnplater. Innledende resultater med Napa kål ekstrakt så lovende, men SVE laget med rødkål ekstrakt endret farge som pH falt resulterer i forvirret OD avlesninger. Videre, ved hjelp av OD målinger for å nummerere vekst begrenser bruken av dette systemet til enkelt belastning inokulasjoner. Sammen førte disse begrensningene oss til å forlate ved hjelp av OD-avlesninger for å måle mikrobiell vekst.
Testing av økologiske interaksjoner i phyllosphere er aktuell som det er bevis for at phyllosphere påvirker avling plante helse og produktivitet22. Vårt modellsystem er bare utviklet for å fungere med Napa kål, men bakterier fra phyla Proteobacteria, Firmicutes og Actinobacteria er vanlige i phyllosphere av mange plantearter13,23. Mens bare tre forskjellige varianter av kål har blitt testet, kan SVE gjøres med andre viktige landbruksplanter. For eksempel kan studier som undersøker mikrobiell samfunnsmontering under gulrotjuicefermentering24 eller mikrobiell kolonisering av maisrot25 replikeres ved hjelp av protokollene som er skissert i dette papiret.
Kobling av bakteriefri kål med SVE for å studere samfunnsmontering i gjæring kan vise hvordan endringer i mikrobiomet phyllosphere kan påvirke gjæringens suksess. Ødeleggelse av fermenter eller manglende evne til å nå en tilstrekkelig lav pH kan resultere hvis det ikke er en rask innledende forsuring26. Disse bortskjemte gjæringsmiddel kan skyldes produksjonsprosesser, men variasjon i phyllosphere mikrobiomer kan også ha en viktig innflytelse på suksessen til vegetabilske fermenter17. Det beskrevne systemet er en nyttig modell for å bestemme hvilke mikrobiomemonteringsprosesser som kan påvirke suksessen til vegetabilsk gjæring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av USDA-NIFA-stipendet: 2017-67013-26520. Tracy Debenport og Claire Fogan ga teknisk støtte og Ruby Ye og Casey Cosetta gi nyttige kommentarer om tidlige versjoner av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
