Summary
Разработан метод выращивания капусты Напа без микробов, который позволяет исследователям оценить, как отдельные микробные виды или многовидовые микробные сообщества взаимодействуют на поверхности листьев капусты. Также представлен стерильный растительный экстракт, который может быть использован для измерения изменений в составе сообщества во время брожения овощей.
Abstract
Филлофера, надземная часть растения, которая может быть колонизирована микробами, является полезной модельной системой для определения процессов сборки микробов. В этом протоколе излагается система изучения динамики микробного сообщества в филосфере капустных растений Напа. Он описывает, как выращивать растения без микробов в пробирках с кальцинированной глиной и питательным бульоном субстрата. Прививка растений, свободных от микробов, с конкретными микробными культурами дает возможность измерить рост микробов и динамику сообщества в филосфере. С помощью стерильного растительного экстракта, произведенного из капусты сдвиги в микробных сообществ, которые происходят во время брожения также могут быть оценены. Эта система является относительно простой и недорогой для установки в лаборатории и может быть использован для решения ключевых экологических вопросов в микробной сборки сообщества. Он также предоставляет возможность понять, как состав сообщества phyllosphere может влиять на микробное разнообразие и качество растительных брожения. Такой подход к развитию gnotobiotic капусты филлосферных сообществ может быть применен к другим диким и сельскохозяйственным видам растений.
Introduction
Микробное разнообразие филосферы играет важную роль в поддержании здоровья растений, а также может влиять на способность растений выдерживать экологический стресс1,,2,,3,,4,,5. В свою очередь, здоровье сельскохозяйственных культур непосредственно влияет на безопасность пищевых продуктов и качество6,7. Растения играют определенную роль в функционировании экосистем и связанных с ними микробиомов как влияют на способность растений осуществлять эти мероприятия, а также непосредственно влияющих на окружающую среду себя8. В то время как ученые начали расшифровывать функцию и состав филосферы, экологические процессы, влияющие на сборку микробного сообщества phyllosphere, не до конца поняты9,,10. Микробиом phyllosphere является отличной экспериментальной системой для изучения экологии микробиомов11. Эти сообщества являются относительно простыми, и многие из членов сообщества могут быть выращены на стандартных лабораторных средств массовой информации10,12,13.
Ферментированные овощи являются одной из систем, где общинная структура иллюровой имеет важные последствия. В квашеной капусте и кимчи микробы, которые естественным образом встречаются на растительных листьях (филосфера видов Brassica) служит инокулумом для брожения14,,15. Бактерии молочной кислоты (LAB) считаются вездесущими членами растительных микробиомов, однако они могут быть в низком изобилии в филосфере16. Сильный абиотический отбор во время брожения приводит к сдвигу в составе микробных сообществ, что позволяет молочнокислым бактериям увеличиваться в изобилии. Как LAB расти, они производят молочную кислоту, которая создает кислой среде ферментированных растительных продуктов17. Связь между филосферой и брожением дает возможность использовать овощи в качестве модели для понимания структуры микробиомов.
Мы разработали методы выращивания капусты Napa без микробов и прививать их конкретными микробными сообществами с помощью спрей-бутылок. Это недорогой и надежный метод равномерной прививки капусты либо отдельными микробами, либо смешанными сообществами. Стерильный растительный экстракт (SVE) также был разработан из трех различных типов капусты / сортов: красная и зеленая капуста (Brassica oleracea) и капуста Напа (B. rapa). Добавление соли в эти СВЕ воспроизводит среду брожения и позволяет проводить мелкомасштабные и относительно высокопроизводительные экспериментальные исследования ферментации микробиомной сборки. Эти методы могут быть использованы для изучения микробной сборки сообщества в филосфере и как микробная динамика сообщества в филосфере может быть связана с успехом растительного брожения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выращивание капусты без микробов
- Подготовка оборудования для выращивания капусты без микробов
- Очистка кальцинированной глины для удаления мелких частиц пыли
- Промыть кальцинированную глину(Таблица материалов)по крайней мере 3x с водопроводной водой; слейте воду.
ВНИМАНИЕ: Кальцинированная глина производит очень мелкую пыль, и рекомендуется носить защитную маску(Таблица материалов)при стирке. - Распространение кальцинированной глины в виде тонкого слоя (4 см) в автоклав лоток и автоклав на сухом цикле (121 кк нагревания в течение 20 мин и 20 минут времени сушки) для стерилизации.
- Разрешить кальцифицированной глины полностью высохнуть перед использованием, распространяя на лотки и размещения в теплом инкубаторе (30-37 градусов по Цельсию) по крайней мере в течение недели. Перемешать, чтобы смешать каждые 3 дня, чтобы полностью высушить кальцитированную глину так, что он будет поглощать равномерное количество Murashige и Skoog (MS) питательный бульон (раздел 1.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сушка также помогает сохранить объем кальцитированной глины, даже если она взвешена в трубках. Сушить с помощью других средств, таких как сушильная печь, также будет подходящим.
- Промыть кальцинированную глину(Таблица материалов)по крайней мере 3x с водопроводной водой; слейте воду.
- Очистка стеклянной посуды для выращивания капусты без микробов
- Тщательно очистить и стерилизовать стеклянные трубки (Таблица материалов) между каждым использованием. Замочите трубки в течение 30 минут в 30% раствор отбеливателя и хорошо промыть с водопроводной водой перед очисткой в кислотной стирки на бактериологии настройки. Кислотно-мыть двухстолотные крышки пробирки (Таблица материалов) между пользами.
- Поверхностная стерилизация семян капусты
- Поместите до 100 напа капуста(B. rapa var pekinensis)семена в 1,5 мл микроцентрифуги трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление более 100 семян в одну микроцентрифуг трубу или изменение размера трубки может повлиять на прорастание семян из-за отсутствия удаления семян пальто. - Добавьте 1 мл 70% этанола к семенам и вихрю в течение 5 мин. Откажитесь от этанола с помощью пипетки.
- Добавьте 1 мл 50% отбеливателя и вихрь в течение 5 мин. Откажитесь от раствора отбеливателя с помощью пипетки.
- Добавьте 1 мл автоклаведированной деионированной воды и вихря в течение 5 мин. Откажитесь от деионированной воды с помощью пипетки.
- Повторите шаг 1.1.3.4 3x, чтобы смыть весь отбеливатель. Замочите семена в стерильной деионизированной воде на 2–8 ч до посадки, чтобы смягчить семенной слой.
- Поместите до 100 напа капуста(B. rapa var pekinensis)семена в 1,5 мл микроцентрифуги трубки.
- Очистка кальцинированной глины для удаления мелких частиц пыли
- Выращивание капусты без микробов
ПРИМЕЧАНИЕ: Капуста Напа(B. rapa var pekinensis)выращивается в стеклянных трубках (15 см х 2,5 см), содержащей кальцинированную глину, пропитанную бульоном Murashige и Skoog (MS)(рисунок 1).- Взвесьте 10 г чистой кальцитированной глины в чистую стеклянную трубку (15 см х 2,5 см).
- Приготовьте бульон MS питательный растворение путем растворения 4.4 g ms среды в 1 L deionized воды. Добавьте бульон MS питательные вещества (9 мл) в каждую стеклянную трубку, чтобы покрыть кальцитированную глину с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стоячая жидкость в пробке предотвратит семя от прорастать поэтому оно могло becessary для того чтобы добавить немножко меньше бульон MS к некоторым пробкам. - Свободно крышка стеклянные трубки с 22 мм двусторонние крышки пробирки и автоклав (121 градусов по Цельсию в течение 60 мин). При удалении их из автоклава, нажмите крышки на стеклянные трубки, чтобы запечатать их. Прохладные трубки до комнатной температуры перед использованием.
- Аккуратно поместите одно стерильное семя капусты в центр каждой трубки с помощью стерильных, экстра-длинных (25,4 см) щипцов. Поместите трубки в 7-й путь лоток затем поместите под световые стойки (полный спектр T5 флуоресцентные лампы или другие установки освещения для роста растений) с 16 ч светового цикла при 24 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Семена прорастают на ночь и развивать свой первый истинный лист после 5 дней. Истинный лист является первым сосудистым листом после образования котиледонов. Он имеет более морщинистую кромку и в Brassica rapa покрыт трихом.
- Тестирование на бесплодие капусты без микробов
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить, не являются ли капуста микробов, выберите несколько (5-10) капусты из каждой партии и пластины, чтобы определить, есть ли какие-либо культивируемые колонии присутствуют.- Аккуратно удалите капусту из стеклянных трубок, схваля основание растения стерилизованными щипцами и вытаскивая ее. Перед тем, как полностью удалить капусту из трубки, осторожно отрежьте корни с помощью стерилизованных ножниц. Компактный листья капусты в 1,5 мл микроцентрифуги трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большая капуста может потребовать удаления одного или двух больших листьев в то время как капуста все еще находится в трубе, чтобы сделать его легче получить капусту в 1,5 мл микроцентрифуги трубки. Эти большие листья могут быть добавлены в трубку 1,5 мл после того, как остальная капуста была помещена в трубку, если вся капуста требуется. - Добавьте 400 мл 1x фосфатного буферного солевого раствора (PBS) на каждую трубку микроцентрифуги 1,5 мл. Используя стерильный микропестле, гомогенизировать капусту, пестоя 30x.
- Плита 100 мл капустного гомогената на пластины агара, чтобы определить, есть ли загрязняющие вещества, присутствующие в образце. Большинство бактерий, найденных в филосфере будет расти на триптической сои (TS) агар пластин. Используйте широкие отверстия пипетки советы, когда покрытие капусты гомогената, как капуста гомогената толстый и может засорить регулярные кончики пипетки.
- Аккуратно удалите капусту из стеклянных трубок, схваля основание растения стерилизованными щипцами и вытаскивая ее. Перед тем, как полностью удалить капусту из трубки, осторожно отрежьте корни с помощью стерилизованных ножниц. Компактный листья капусты в 1,5 мл микроцентрифуги трубки.
2. Прививка филосферы микробными растворами
- Изготовление глицеролов запасов штаммов прививки
ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 перечислены микробные изоляты, которые могут быть использованы на этом этапе. Здесь можно использовать и другие изоляты филосферы.- Плотно полоса из отдельных колоний из свежей полосой, на два / три новых пластины же средства массовой информации, чтобы получить много колоний.
- Пусть полосы растут в течение 2-5 дней, а затем соскребать колонии из всех пластин в 15 мЛ конической трубки, содержащей 15 мл 15% глицерол, и вихрь тщательно перемешать.
- Перенесите aliquot 1 mL хорошо смешанного запаса глицерола в трубку микроцентрифуги 1,5 мл и храните запасы глицерола при -80 градусов по Цельсию до использования. Сохранить оставшиеся 14 мл глицерол бульона при -80 градусов по Цельсию, как относительно большие объемы раствора прививки необходимы при прививке капусты.
- За неделю до использования, оттепель 1,5 мл трубки, содержащей 1 мл глицерола (от шага 2.1.3) на льду, разбавления, и пластины на несколько различных разбавлений (например, 10-4, 10-5, и 10-6) для определения концентрации (колония-формообразование единицы (CFU) на й Л) 14 мл раствора инкуляции.
- Стерилизация прививочных бутылок спрей
- Разобрать янтарь вокруг Бутылки насоса Бостон (59 мл) и замочить все компоненты (насос, трубка, крышка и бутылка) в 30% раствор отбеливателя в течение 30 минут в большом пластиковом контейнере с плотно прилегающей крышкой.
- После замачивания, тщательно вылить весь отбеливатель из контейнера, подняв только один угол крышки контейнера.
- Промыть бутылки, заполнив пластиковый контейнер с автоклаведом деионированной водой (No 1 л в зависимости от размера контейнера) и тщательно вылить деионированной воды, опять же, подняв крышку на одном углу.
- Стерилизовать биобезопасный шкаф путем распыления с 70% этанола раствор и включение УФ-света в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжить эту работу в кабинете биобезопасности, так что нет риска микробного загрязнения бутылок, как они сухие воздуха. - Удалите бутылки из большого пластикового контейнера и заполните каждую бутылку автоклаведомной деионированной водой с помощью пипетки. Собрать насосы и поместить по одному в каждой бутылке. Насос деионированной воды через каждую бутылку (10 спреев на бутылку), чтобы удалить отбеливатель из компонента насоса бутылки.
- Повторите шаг 2.2.5, чтобы убедиться, что все отбеливатель удаляется из стеклянных бутылок.
- Проверьте, являются ли бутылки стерильными, поместив номер на каждой бутылке (прилипание лабораторной лентой в сторону бутылки, когда она полностью сухая), а затем добавить 10 мл 1x PBS к каждой из бутылок и насос 3 спреи на пластину TS агар. После распыления, инкубировать пластины в течение одной недели при комнатной температуре. Если какие-либо колонии растут на тарелке это указывает на то, что соответствующая бутылка не была стерильной и не должна использоваться для экспериментов.
- Перед хранением стерильных бутылок, удалить все оставшиеся PBS и дайте бутылки тщательно высохнуть в шкафу биобезопасности. Храните стерильные бутылки в стерильной пластиковой таре (обычно контейнер, используемый для отбеливания бутылок) до использования.
- Подготовка микробных инокулумов и опрыскивание капусты без микробов
ВНИМАНИЕ: Все шаги должны быть выполнены в кабинете биобезопасности, так как распыление аэрозолизирует микробные растворы, которые могут загрязнять рабочие поверхности или представлять опасность для здоровья, если осуществляется на лабораторной скамейке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Капуста образует истинные листья через 5 дней, поэтому желательно подождать одну неделю после посадки капусты, прежде чем прививать любые микробные растворы. Как трубы запечатаны, нет необходимости поливать капусту. Эксперименты лучше всего проводить в течение месяца после посадки, так как небольшие трубки ограничивают рост капусты.- Запасы глицерола оттепели на льду и разбавляют в 1x PBS до желаемой концентрации прививки (концентрация определяется оттаиванием и покрытием 1 мл аликот в шаге 2.1.4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать различные уровни прививки, но изоляты phyllosphere могут вырасти от 104 до 108 CFUs/mL капусты суспензии в 10 днях. - Добавьте 10 мл разбавленного глицерола в стерильную бутылку насоса и накачать 5 спреев в большой стакан сбора отходов, чтобы удалить любой остаточный PBS из компонента насоса бутылки.
- Снимите крышку с капустной трубки, наклоните капусту к бутылке спреем и опрыските каждую капусту 3 насосами раствора прививки, который обеспечивает 600 фунтов мкм инокулум.
- После прививки, урожай подмножество капусты для оценки фактической концентрации входной прививки. Удалить капусту из трубки с помощью стерилизованных щипцов. Отрежьте корни стерильными ножницами для вскрытия, а затем аккуратно поместите капусту в предварительно прояснеемую стерильную трубку микроцентрифуги 1,5 мл. Запишите вес капусты для будущих расчетов, если для расчетов требуется КФУ/г капусты.
- Добавьте 400 мл 1x PBS к каждой 1,5 мл микроцентрифуги трубки, содержащей капусту и использовать стерильные микропестле для гомогенизации капусты в 1x PBS, измельчая его 30x.
- Разбавить капусту гомогената (при необходимости) и пластины из песчаной смеси капусты. Используйте широкие отверстия советы для pipetting капусты суспензии, потому что он будет толстым и полным кусочков растительной ткани.
- Запасы глицерола оттепели на льду и разбавляют в 1x PBS до желаемой концентрации прививки (концентрация определяется оттаиванием и покрытием 1 мл аликот в шаге 2.1.4).
3. Приготовление стерильного растительного экстракта
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод является модифицированной версией капусты стерильных средств производства средств массовой информации18,19.
- Купить капусту в супермаркете. В лаборатории, удалить и выбросить внешние листья капусты. Нарезать всю оставшуюся капусту, чтобы поместить в блендер и гомогенизировать капусту до мелкой мякоти, т.е. капуста не получит ни одного тонкоста при дальнейшем смешивании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любой блендер, который может нарезать капусту до гладкой однородной мякоти, должен быть подходящим для этого метода. - Взвесьте смешанную капусту гомогената и добавьте 2 мл дистиллированной воды на грамм капусты. Фильтр смешанную капусту суспензии через 2 слоя корзины фильтров кофе (неотбелная бумага).
- Распределите капусту в центрифуги (размер зависит от центрифуги). Центрифуга фильтрованной капусты суспензии на 20000 х г в течение 20 минут, пока крупные частицы оседают из раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы центрифугировать капусту суспензии в течение длительного периода времени, как частицы капусты быстро засорить фильтр стерилизатор. - Используя серологическую пипетки, удалить супернатант из гранулированных мусора капусты, заботясь, чтобы не беспокоить гранулированной капусты. Если целью воссоздать условия брожения, в которых используются стандартные концентрации соли, добавьте 2% w/v NaCl на этом этапе (т.е. перед стерилизацией фильтра).
- Фильтр стерилизовать растительный экстракт с помощью фильтра 0,2 мкм (500 мл или 1 л), прикрепленный к вакууму. Распределите в стерильные трубки (либо 50 мЛ центрифуговых труб или 15 мЛ центрифуговых труб) и заморозить при -80 градусов по Цельсию до использования.
4. Прививка стерильного растительного экстракта
- Оттепель SVE и распределить 490 мл в 1,5 мл микроцентрифуг труб. Используйте достаточное количество труб, чтобы иметь по крайней мере пять репликаций на обработку в точку времени, как каждый временной точки измерения является разрушительным.
- Оттепель глицерол запасы микробных изолятов на льду и разбавить 1x PBS до желаемой концентрации. Концентрация молочнокислых бактерий может быть как низко как 5.000 CFU в mL SVE. Для достижения этой концентрации разбавить запасы до 250 КФУ/л, поскольку для прививки общего объема 500 МЛ будет использовано 10 мл.
- Прививать SVE с 10 мл разбавленного микробного изолята. Pipette вверх и вниз несколько раз тщательно перемешать. Инкубировать при желаемой температуре (14 градусов по Цельсию при температуре производства кимчи или 24 градуса по Цельсию для самого теплого брожения квашеной капусты).
- Измерение темпов роста микробного изолята в SVE путем сбора репликации труб на день 1, день 2, день 4, день 7 и день 14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментация быстро происходит с самого начала и замедляется с течением времени. Таким образом, наличие большего количества исходных временных точек дает большее разрешение динамике того, как происходит брожение. - В каждый момент времени, смешать привитые SVE хорошо, pipetting вверх и вниз несколько раз. Серийно разбавлять привитый SVE в 1x PBS и пластины на агар пластины. Инкубировать агаровые пластины в течение 4-7 дней, прежде чем считать колонии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Человек, Rogosa, и Шарп (MRS) агар должен быть использован для перечисления всех молочнокислых бактерий, дрожжей peptone декстрозы (YPD) должны быть использованы для дрожжей, и TS агар для большинства других бактерий изолирует из phyllosphere. - Запись рН образцов в каждую точку времени с помощью микро рН зонда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен после покрытия, потому что рН зонд будет передавать клетки между трубками / лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Темпы роста капусты Напа
Метод стерилизации семян был протестирован с несколькими различными капустами Napa (B. rapa var pekinese; Дополнительный рисунок 1) от ряда различных поставщиков, и все они росли стабильно с аналогичными темпами роста. Тем не менее, тестирование методов с различными видами Brassica (B. rapa: Turnip Purple Top; B. oleracea: Каирский гибрид, тропический гигантский гибрид; B. campestris: Пак Чой Игрушка Чой Гибрид; B. juncea: Горчица Красный гигант) дал ограниченный успех (Дополнительный рисунок 2). В отличие от капусты Напа, которая образует компактные аккуратные розетки, которые вписываются в стеклянные трубки, эти Brassica spp. либо были низкие показатели прорастания после стерилизации или стебель удлиненный быстро, чтобы сделать веретенообразный, нездоровый завод. Кроме того, стерилизация старых семян (1 год) не рекомендуется, как семенные пальто высыхают, что затрудняет их удаление в процессе стерилизации. Регулярно покупайте новые семена и проверяйте подмножество капусты, чтобы определить, являются ли они стерильными перед проведением экспериментов.
Рост микробных инокулянтов в филлосфере капусты Напа
Микробные изоляты(Таблица 1) были привиты либо как одиночные изоляты штамма или в сочетании с другим изолятом искать парные взаимодействия в phyllosphere капусты Напа. В общей сложности 15 капусты без микробов были привиты для каждого лечения и пять капусты были собраны сразу после прививки, пять были собраны через четыре дня после прививки, а остальные были собраны через 10 дней после прививки. Результаты показывают, что изоляты phyllosphere способны к быстрому росту в филосфере капусты Напа(рисунок 2).
Рост микробных инокулянтов в стерильных растительных экстрактах
Два дрожжа(Kazachstania barnetti и Pichia membranifaciens)и три бактерии(Lactobacillus koreensis, Pediococcus parvulus, и Leuconostoc mesenteroides) были привиты в три различных типа SVE из красного, зеленого и напа капусты. Все образцы были инкубированы при 24 градусах Цельсия, а рост прививок в течение 14 дней был зафиксирован точечным покрытием 5 мл каждого лечения на МРС или YPD агаровые пластины (n No 5). Результаты показаны на рисунке 3A. рН каждого образца был также зарегистрирован в течение брожения(Рисунок 3B) и показывает, что молочнокислые бактерии были способны подкисления SVE до уровней ниже рН 4 (с указанием брожения, что является безопасным для потребления).
Рисунок 1: Диаграмма установки капусты без микробов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Темпы роста различных бактерий на капусте Напа без микробов. ()Рост одиночных прививок в филосфере. (B)Рост после прививки двух микробов в филосферу. Рост микробов измерялся как колонии формирования единиц рассчитывается на г капусты гогената покрывало либо TSA или MRS средств массовой информации. n No 5. Бары ошибок и стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Рост молочнокислых бактерий и дрожжей в стерильном растительном экстракте (SVE), изготовленном из красной, зеленой и капусты Напа. (A) Рост микробных инокулантов был измерен путем подсчета колонии формирования единиц на мЛ SVE покрывало. Дрожжи были покрыты на пластины YPD агар и бактерий на MRS агар пластин. (B) Подкисление стерильного растительного экстракта, как микробы растут показано как падение в рН. n No 5. Бары ошибок и стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
| Фила/Генера микробных инокулантов | Источник микробов |
| Фирмикуты Бациллы | Филосфера |
| Фирмикутес Лактобаклус | Брожения |
| Протеобактерии Ахромобактер | Филосфера |
| Протеобактерии Гизобия | Филосфера |
| Протеобактерии Сфангомоны | Филосфера |
Таблица 1: Микробные изоляты, привитые на капусте Напа без микробов.
Дополнительная фигура 1: Рост Brassica rapa var pekinensis: Bilko в условиях, свободных от микробов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительная фигура 2: Различные сорта капусты, растущие в условиях, свободных от микробов. (A) B. rapa: Turnip Purple Top, (B. oleracea: Cairo Hybrid, (C) B. oleracea: Tropic Giant Hybrid,(D) B. campestris: Pak Choi Toy Cho Hybrid, (E) B. juncea: Mustard Red Giant. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Без зародышей напа капусты растения были использованы для изучения рассеивания ограничение молочнокислых бактерий в напа капуста phyllosphere17. Капуста Napa без микробов также может быть использована для проверки индивидуального или парного роста в филосфере(рисунок 1). Методы изготовления стерильного овощного экстракта были протестированы на трех различных разновидностях капусты: красный, зеленый и напа. Каждый из этих СВЕ выступает в качестве надежного средства роста; привитые микробы постоянно растут в различных средствах массовой информации. Одиночные темпы роста штамма в SVE(Рисунок 2) показывают, что LAB быстро растут и подкисляют средства массовой информации таким же образом, что и ожидалось в брожении17.
Растения без микробов и стерильный растительный экстракт могут быть использованы в сочетании для решения ряда различных экологических вопросов, таких как приоритетные эффекты и преемственность в филосфере или в рамках брожения. Синтетическое сообщество микробов просто построить через покрытие из гомогенизированных капусты для получения изолятов phyllosphere, или квашеной капусты для получения молочнокислых бактерий16. Парные взаимодействия или эксперименты с большим количеством членов сообщества могут проводиться в филосфере или в SVE для оценки важности или функции членов сообщества. Экологические исследования отбора могут быть проведены в SVE, где влияние растительного брожения может быть оценена. Существует также потенциал для использования как капусты без микробов, так и SVE для количественной оценки диверсификации микробных видов и сообществ с использованием экспериментальной эволюции.
Ограничением этой системы капусты без микробов является короткий срок экспериментов. Из-за небольших стеклянных трубок, капусты не в состоянии расти в течение периодов дольше, чем месяц, как их листья ограничены краем труб. Большие контейнеры для выращивания, такие как коробки культуры растительной ткани(Таблица материалов)могут быть использованы, но они по-прежнему не производят полноразмерный капустный завод. Мы также пытались выращивать капусту в 0,75% агар, содержащий бульон MS, но обнаружили, что это привело к непоследовательному росту саженцев капусты. Использование кальцинированной глины в качестве растущего субстрата с достаточным количеством бульона MS, чтобы насытить, но не затопить глиняные зерна является оптимальным методом для выращивания здоровой капусты.
Есть несколько важных шагов для обеспечения успешного роста капусты без микробов. Обеспечение того, чтобы кальцифицированная глина полностью сухая при добавлении бульона MS позволяет глине полностью поглощать бульон MS во время цикла автоклава. Однако, если есть какой-либо MS бульон над уровнем глины, он должен быть удален перед добавлением семян; семена не прорастают, если они сидят в бульоне MS. Другим важным шагом для мониторинга является стерилизация семян. Старые семена (1 год) не прорастают так быстро или надежно, как молодые семена. Изменение размера трубки, используемой для стерилизации или перезаполнения трубок, также может повлиять на стерилизацию. Шаг стерилизации также помогает смягчить и удалить семенной слой так, что семена быстро прорастают. Обратите внимание, что повторное использование бутылки спрей насоса после использования с микробными культурами не рекомендуется, так как трудно удалить биопленки из компонента насоса. Особо следует отметить, что следует проявлять осторожность в отношении видов Bacillus, поскольку они особенно устойчивы к автоклавингу. Любые бутылки насоса, которые вступили в контакт с Bacillus spp не используются повторно.
В то время как стерильный растительный экстракт не имеет пространственного структурирования, которое присутствует в сосуде брожения, динамика роста LAB предполагает, что он имитирует прогресс брожения с быстрым падением рН и увеличение роста молочнокислых бактерий в течение 14 дней брожения. Leuconostoc mesenteroides имеет важное значение в начале брожения и она увеличилась в изобилиибыстрее,чем Lactobacillus и Pediococcus spp, тенденция наблюдается в других обследованиях преемственности квашеной капусты20,21. Работа в лаборатории также исследовал с помощью спектрофотометра для получения оптической плотности (OD) показания для измерения роста LAB в SVE обойтись в 96 пластин скважины. Первоначальные результаты с экстрактом капусты Napa выглядел многообещающим, но SVE сделал с экстрактом красной капусты изменил цвет, как рН упал в результате путаницы ОД чтения. Кроме того, использование показаний ОД для перечисления роста ограничивает использование этой системы для односцевидных прививок. Вместе эти ограничения привели нас к отказу от использования показаний ОД для измерения роста микробов.
Тестирование экологических взаимодействий в филосфере является актуальным, как есть доказательства того, что phyllosphere влияет на здоровье растений и продуктивности22. Наша модельная система была разработана только для работы с капустой Напа, но бактерии из фила Протеобактерии, Firmicutes, и Actinobacteria являются общими в phyllosphere многих видов растений13,23. В то время как только три различных сортов капусты были протестированы, SVE может быть сделано с другими важными сельскохозяйственными растениями. Например, исследования, исследующие сборку микробного сообщества во время брожения морковного сока24 или микробной колонизации корня кукурузы25, могут быть воспроизведены с помощью протоколов, изложенных в настоящем документе.
Соединение капусты без микробов с SVE для изучения сборки сообщества в брожении может показать, как изменения в микробиоме phyllosphere может повлиять на успех брожения. Порча ферментов или неспособность достичь достаточно низкого рН может привести, если нет быстрого первоначального подкисления26. Эти испорченные ферменты могут быть связаны с производственными процессами, но изменение в phyllosphere микробиомы могут также иметь важное влияние на успех овощных ферментов17. Описанная система является полезной моделью для определения того, какие процессы сборки микробиома могут повлиять на успех растительного брожения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом USDA-NIFA: 2017-67013-26520. Трейси Дебенпорт и Клэр Фоган оказали техническую поддержку, а Руби Е и Кейси Косетта дают полезные комментарии по ранним версиям этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
