Summary
En metod för att odla bakteriefria Napa kål har utvecklats som gör det möjligt för forskare att utvärdera hur enstaka mikrobiella arter eller multispecies mikrobiella samhällen interagerar på kål bladytor. Ett sterilt vegetabiliskt extrakt presenteras också som kan användas för att mäta förändringar i gemenskapens sammansättning under grönsaksjäsning.
Abstract
Fylosfären, den ovan jord delen av växten som kan koloniseras av mikrober, är ett användbart modellsystem för att identifiera processer för mikrobiell gemenskap församling. Detta protokoll beskriver ett system för att studera mikrobiell gemenskap dynamik i fyllosfären av Napa kål växter. Den beskriver hur man odlar bakteriefria växter i provrör med en kalcinerad lera och näringsbuljong substrat. Inokulering av bakteriefria växter med specifika mikrobiella kulturer ger möjligheter att mäta mikrobiell tillväxt och samhällsdynamik i fylosfären. Genom användning av sterila vegetabiliska extrakt som framställs av kål skift i mikrobiella samhällen som uppstår under jäsning kan också bedömas. Detta system är relativt enkelt och billigt att ställa in i labbet och kan användas för att ta itu med viktiga ekologiska frågor i mikrobiell gemenskap församling. Det ger också möjligheter att förstå hur fyktosfären gemenskap sammansättning kan påverka den mikrobiella mångfalden och kvaliteten på vegetabiliska jäsningar. Detta tillvägagångssätt för att utveckla gnotobiotiska kål fyllosfärsamhällen skulle kunna tillämpas på andra vilda och jordbruksväxtarter.
Introduction
Mikrobiell mångfald av phyllosphere spelar en viktig roll för att upprätthålla växtskydd och kan också påverka förmågan hos växter att motstå miljöstr stress1,2,3,4,5. Grödornas hälsa påverkar i sin tur direkt livsmedelssäkerheten och kvaliteten6,,7. Växter spelar en roll i ekosystemets funktion och deras tillhörande mikrobiomer påverkar både växternas förmåga att utföra dessa aktiviteter och påverkar miljön direktsjälva 8. Medan forskare har börjat dechiffrera funktionen och sammansättningen av fysomosfären, är de ekologiska processer som påverkar fylosfären mikrobiell gemenskap församling inte helt klarlagda9,10. Fylosfären mikrobiomet är ett utmärkt experimentellt system för att studera ekologi mikrobiomer11. Dessa samhällen är relativt enkla och många av gemenskapens medlemmar kan odlas på standard lab media10,,12,13.
Jästa grönsaker är ett system där fyllosfärens samhällsstruktur har viktiga konsekvenser. I både surkål och kimchi, mikroberna som naturligt förekommer på vegetabiliska blad (fyllosfären av Brassica arter) fungerar som inokulat för jäsning14,15. Mjölksyrabakterier (LAB) anses allestädes närvarande medlemmar av vegetabiliska mikrobiomer, men de kan vara i lågt överflöd i fylosfären16. Starkt abiotiskt urval under jäsningen driver en förändring i mikrobiell gemenskap sammansättning gör mjölksyra bakterier att öka i överflöd. Som LAB växa, de producerar mjölksyra som skapar den sura miljön av jästa vegetabiliska produkter17. Kopplingen mellan fyllosfären och jäsningen ger en möjlighet att använda grönsaker som modell för att förstå hur mikrobiomer är strukturerade.
Vi har utvecklat metoder för att odla bakteriefria Napa kål och att vaccinera dem med specifika mikrobiella samhällen med sprayflaskor. Detta är en billig och tillförlitlig metod för att jämnt inokukulera kål med antingen enskilda mikrober eller blandade samhällen. Ett sterilt vegetabiliskt extrakt (SVE) har också utvecklats från tre olika kåltyper/sorter: röd och grönkål (Brassica oleracea) och Napa kål (B. rapa). Tillsatsen av salt till dessa SES replikerar jäsningsmiljön och möjliggör småskaliga och relativt höggenomströmning experimentella studier av jäsning mikrobiomet montering. Dessa metoder kan användas för att studera mikrobiell gemenskap församling i fyllosfären och hur mikrobiell gemenskap dynamik i fysloosfären kan kopplas till framgången för vegetabilisk jäsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Växande groddar-fri kål
- Förbereda utrustning för odling av bakteriefri kål
- Rengöring av kalcinerad lera för att avlägsna fina dammpartiklar
- Skölj kalcinerad lera (Tabell av material) minst 3x med kranvatten; rinna av vatten.
VARNING: Kalcinerad lera producerar mycket fint damm och det rekommenderas att bära en skyddsmask (Tabell av material) vid tvättning. - Sprid kalcinerad lera ut som ett tunt lager (~ 4 cm) i en autoklav bricka och autoklav på en torr cykel (121 °C uppvärmning för 20 min och 20 min torktid) för att sterilisera.
- Låt den kalcinerade leran torka helt innan den används genom att sprida ut på brickor och placera i en varm inkubator (30−37 °C) i minst en vecka. Rör om för att blanda var tredje dag för att helt torka den kalcinerade leran så att den absorberar en jämn mängd Murashige och Skoog (MS) näringsbuljong (avsnitt 1.2).
OBS: Torkning hjälper också till att hålla volymen av kalcinerad lera även när den vägs in i rör. Torkning på andra sätt, såsom en torkugn, skulle också vara lämplig.
- Skölj kalcinerad lera (Tabell av material) minst 3x med kranvatten; rinna av vatten.
- Rengöring av glas för odling av bakteriefri kål
- Rengör och sterilisera glasrören (Tabell över materialnoggrant) mellan varje användning. Blötlägg rören i 30 min i 30% blekmedelslösning och skölj väl med kranvatten innan du rengör i en syratvätt på en bakteriologiinställning. Syratvätt tvåvägs provrörslock (Tabell över material) mellan användningarna.
- Ytsterilisering kålfrön
- Placera upp till 100 Napa kål(B. rapa var pekinensis) frön i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Att lägga till mer än 100 frön till ett mikrocentrifugrör eller ändra rörets storlek kan påverka grobarheten för fröna på grund av brist på avlägsnande av utsädesskikt. - Tillsätt 1 ml 70 % etanol till fröna och virveln i 5 min. Kassera etanolen med hjälp av en pipett.
- Tillsätt 1 ml 50 % blekmedel och virvel i 5 min. Kassera blekmedelslösningen med en pipett.
- Tillsätt 1 ml autoklaveriserat avjoniserat vatten och virvel i 5 min. Kassera det avjoniserade vattnet med hjälp av en pipett.
- Upprepa steg 1.1.3.4 3x för att skölja bort allt blekmedel. Blötlägg fröna i sterilt avjoniserat vatten i 2−8 timmar före plantering för att mjuka upp fröskiktet.
- Placera upp till 100 Napa kål(B. rapa var pekinensis) frön i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Rengöring av kalcinerad lera för att avlägsna fina dammpartiklar
- Växande bakteriefria kål
OBS: Napa kål (B. rapa var pekinensis) odlas i glasrör (15 cm x 2,5 cm) som innehåller kalcinerad lera indränkt i Murashige och Skoog (MS) näringsbuljong (figur 1).- Väg 10 g ren kalcinerad lera i ett rent glasrör (15 cm x 2,5 cm).
- Förbered MS näringsbuljong genom att lösa upp 4,4 g MS-medium i 1 L avjoniserat vatten. Tillsätt MS näringsbuljong (~ 9 ml) till varje glasrör för att täcka kalcinerad lera med hjälp av en pipett.
OBS: Stående vätska i röret kommer att förhindra utsädet från att gro så det kan benecessary att lägga något mindre MS buljong till vissa rör. - Löst lock glasrör med 22 mm tvåvägs provrör mössor och autoklav (121 °C för 60 min). När du tar bort dem från autoklaven, tryck lock på glasrören för att täta dem. Kyl rören till rumstemperatur före användning.
- Placera försiktigt ett sterilt kålfrö i mitten av varje rör med sterila, extra långa (25,4 cm) pincett. Placera rören i en 7-vägs bricka och placera sedan under ljusställ (fullspektrum T5 lysrör eller annan belysningsinställning för växttillväxt) med en 16 h ljuscykel vid 24 °C.
OBS: Frön gro över natten och utveckla sin första sanna blad efter 5 dagar. Ett riktigt blad är det första kärlbladet efter att cotyledons har bildats. Den har en mer skrynklig kant och i Brassica rapa är täckt i trichomes.
- Provning av sterilitet hos bakteriefri kål
OBS: För att testa om kålen är bakteriefri, välj några (5−10) kål från varje parti och plattan ut för att avgöra om några odlingsbara kolonier är närvarande.- Ta försiktigt bort kålen från glasrören genom att greppa basen av växten med steriliserade pincett och dra ut den. Innan du tar bort kålen helt från röret, skär försiktigt av rötterna med steriliserad dissekeringssax. Komprimera kålbladen i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Större kål kan kräva att ta bort en eller två av de större bladen medan kål är fortfarande i röret för att göra det lättare att få kål i 1,5 ml mikrocentrifugröret. Dessa större blad kan läggas till 1,5 ml röret efter resten av kålen har placerats i röret om hela kålen krävs. - Tillsätt 400 μL 1x fosfatbuffertsaltlösning (PBS) till varje 1,5 ml mikrocentrifugrör. Med hjälp av en steril mikropestel, homogenisera kål genom att tjafsa 30x.
- Plattan 100 μL av kålhomogenaten på agarplattorna för att avgöra om det finns några föroreningar i provet. De flesta bakterier som finns i fyllosfären kommer att växa på tryptiska soja (TS) agar plattor. Använd breda öppningpiletts när du plätering av kålhomogenat eftersom kålhomogenatet är tjockt och kan täppa till vanliga pipettspetsar.
- Ta försiktigt bort kålen från glasrören genom att greppa basen av växten med steriliserade pincett och dra ut den. Innan du tar bort kålen helt från röret, skär försiktigt av rötterna med steriliserad dissekeringssax. Komprimera kålbladen i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
2. Inokulatera fylosfären med mikrobiella lösningar
- Tillverkning av glycerollager av inokuleringsstammar
Obs: Tabell 1 listar de mikrobiella isolat som kan användas i detta steg. Andra fyllosfärisolat kan också användas här.- Tätt strimma ut enskilda kolonier från en ny strimma, på två / tre nya plattor av samma media för att få många kolonier.
- Låt ränder växa i 2−5 dagar sedan skrapa kolonier från alla plattor till en 15 ml konisk rör som innehåller 15 ml 15% glycerol, och virvel att blanda noggrant.
- Överför en alikvot på 1 ml av det välblandat glycerolbeståndet till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara glycerollager vid -80 °C tills de används. Spara de återstående 14 ml glycerolbuljong vid -80 °C eftersom relativt stora volymer inokuleringslösning krävs vid inokulering av kål.
- En vecka före användning, tina upp det 1,5 ml-rör som innehåller 1 ml glycerollager (från steg 2.1.3) på is, späd och platta vid flera olika utspädningar (t.ex.10-4,10-5och 10-6) för att bestämma koncentrationen (kolonibildande enhet [CFU] per μL) för 14 ml inokuleringslösning.
- Sterilisering av inokuleringssprayflaskor
- Ta isär de gula runda Boston-pumpflaskorna (59 ml) och blötlägg alla komponenter (pump, rör, lock och flaska) i 30% blekmedelslösning i 30 min i en stor plastbehållare med tätt sittande lock.
- Efter blötläggning, häll försiktigt ut allt blekmedel från behållaren genom att lyfta bara ett hörn av locket på behållaren.
- Skölj flaskorna genom att fylla plastbehållaren med autoklaveriserat avjoniserat vatten (~1 L beroende på behållarens storlek) och häll försiktigt ut avjoniserat vatten, igen genom att lyfta locket i ett hörn.
- Sterilisera ett biosäkerhetsskåp genom att spraya med 70% etanollösning och slå på UV-ljuset i 30 min.
OBS: Fortsätt detta arbete i biosäkerhetsskåpet så att det inte finns någon risk för mikrobiell kontaminering av flaskorna när de lufttorkar sig. - Ta bort flaskor från den stora plastbehållaren och fyll varje flaska med autoklaveriserat avjoniserat vatten med hjälp av en pipett. Sätt ihop pumparna igen och placera en i varje flaska. Pumpa det avjoniserade vattnet genom varje flaska (10 sprayer per flaska) för att ta bort blekmedel från pumpkomponenten i flaskan.
- Upprepa steg 2.2.5 för att säkerställa att allt blekmedel avlägsnas från glasflaskorna.
- Testa om flaskorna är sterila genom att placera ett nummer på varje flaska (sticker lab tejp på sidan av flaskan när den är helt torr) tillsätt sedan 10 ml 1x PBS till var och en av flaskorna och pumpa 3 sprayer på en TS agar platta. Efter sprutning, inkubera plattorna i en vecka vid rumstemperatur. Om några kolonier växer på en tallrik indikerar det att respektive flaska inte var steril och bör inte användas för experiment.
- Innan du förvarar de sterila flaskorna, ta bort alla återstående PBS och låt flaskorna torka ordentligt i biosäkerhetsskåpet. Förvara sterila flaskor i en steril plastbehållare (vanligtvis behållaren som används för blekning av flaskorna) tills de används.
- Förbereda mikrobiell inokulat och sprutning av bakteriefria kål
VARNING: Alla steg ska utföras i ett biosäkerhetsskåp, eftersom sprutning av de mikrobiella lösningar som kan förorena arbetsytor eller utgöra en hälsorisk om de utförs på en labbbänk.
OBS: Kål kommer att bilda sanna blad efter 5 dagar, så det är lämpligt att vänta en vecka efter plantering kål innan inokukulera med några mikrobiella lösningar. Eftersom rören är förseglade, finns det ingen anledning att vattna kålen. Experiment utförs bäst inom en månad efter plantering, eftersom de små rören begränsar kålens tillväxt.- Tina glycerollager på is och späd i 1x PBS till önskad inokuleringskoncentration (koncentration som bestäms genom upptining och plätering av ett 1 ml alikvot i steg 2.1.4).
OBS: En mängd olika inokuleringsnivåer kan användas, men fysylosfärisolat kan växa från 104 till 108 CFUs/ml kålslamr i 10 dagar. - Tillsätt 10 ml utspädd glycerolbuljong till den sterila pumpflaskan och pumpa 5 sprayer i en stor avfallsbägare för att avlägsna eventuella kvarvarande PBS från flaskpumpkomponenten.
- Ta bort locket från kålröret, luta kålen mot sprayflaskan och spraya varje kål med 3 pumpar av inokuleringslösningen, vilket ger ~600 μL inokulat.
- Efter inokulering, skörda en delmängd av kål för att bedöma den faktiska inokulering koncentrationen. Ta bort kålen från ett rör med steriliserade pincett. Skär av rötterna med steril dissekering sax och sedan försiktigt placera kål i en preweighed steril 1,5 mL mikrocentrifugrör. Registrera kålens vikt för framtida beräkningar om CFUs/g kål krävs för beräkningar.
- Tillsätt 400 μl 1x PBS till varje 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller kål och använd en steril mikropestle för att homogenisera kålen till 1x PBS genom att mala den 30x.
- Späd kålhomogenat (om det behövs) och plattan ut den pestled kålblandningen. Använd breda öppning tips för pipettering kål slam eftersom det kommer att vara tjock och full av växtvävnad bitar.
- Tina glycerollager på is och späd i 1x PBS till önskad inokuleringskoncentration (koncentration som bestäms genom upptining och plätering av ett 1 ml alikvot i steg 2.1.4).
3. Förbereda sterilt vegetabiliskt extrakt
OBS: Denna metod är en modifierad version av kål steril media produktion18,19.
- Köp en kål från en stormarknad. I labbet, ta bort och kasta de yttersta bladen av kål. Hacka all återstående kål för att passa in i en mixer och homogenisera kål till en fin massa, dvs kålen kommer inte att bli något finare med ytterligare blandning.
OBS: Varje mixer som kan hacka kål till en slät homogen massa bör vara lämplig för denna metod. - Väg den blandade kålhomogenatet och tillsätt 2 ml destillerat vatten per gram kål. Filtrera den blandade kål slam genom 2 lager av korg kaffefilter (oblekt papper).
- Fördela kållamret i centrifugrör (storleken är beroende av centrifugen). Centrifugera den filtrerade kålslamret vid 20 000 x g i 20 minuter tills stora partiklar lägger sig ur lösningen.
OBS: Det är viktigt att centrifugera kål slam under en lång tid som kålpartiklar snabbt täppa till filtret autoklaven. - Ta bort supernatanten från det pelleterade kålskräpet med hjälp av en serologisk pipett och var noga med att inte störa den pelleterade kålen. Om du strävar efter att återskapa jäsningsförhållanden där standardsaltkoncentrationer används, tillsätt 2 % w/v NaCl i detta steg (dvs. före filtersterilisering).
- Filtrera sterilisera grönsaksextraktet med ett 0,2 μm filter (500 ml eller 1 L) fäst vid ett vakuum. Fördela i sterila rör (antingen 50 ml centrifugrör eller 15 ml centrifugrör) och frys vid -80 °C tills de används.
4. Inokulering av sterilt vegetabiliskt extrakt
- Tina SVE och fördela 490 μL i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Använd tillräckligt med rör för att ha minst fem replikat per behandling per timepoint eftersom varje tidpunktsmätning är destruktiv.
- Tina glycerol lager av mikrobiella isolat på is och späd med 1x PBS till önskad koncentration. Koncentrationen av mjölksyrabakterier kan vara så låg som 5000 CFU per ml SVE. För att uppnå denna koncentration späda ut lager till 250 CFUs/μL eftersom 10 μL kommer att användas för inokulering av en total volym på 500 μL.
- Inokulera SVE med 10 μL utspädd mikrobiellt isolat. Pipett upp och ner några gånger för att blanda ordentligt. Inkubera vid önskad temperatur (14 °C för kimchiproduktionstemperatur eller 24 °C för varmaste surkålsjäsning).
- Mät tillväxthastigheten för mikrobiellt isolat i SVE genom att skörda replikatrör dag 1, dag 2, dag 4, dag 7 och dag 14.
OBS: Jäsningen fortsätter snabbt från början och saktar med tiden. Därför har mer inledande tidspunkter ger större upplösning på dynamiken i hur jäsning fortsätter. - Vid varje tidpunkt, blanda den inokulerade SVE-brunnen genom att pipetting upp och ner några gånger. Späd seriellt ut den inokulerade SVE i 1x PBS och plattan på agarplattor. Inkubera agarplattorna i 4−7 dagar innan kolonier räknas.
OBS: Man, Rogosa och Sharpe (MRS) agar bör användas för att räkna upp alla mjölksyrabakterier, jäst pepton dextros (YPD) bör användas för jäst, och TS agar för de flesta andra bakterier isolat från fyloosfären. - Registrera pH-värdet för proverna vid varje tidpunkt med hjälp av en mikropH-sond.
OBS: Detta steg bör utföras efter plätering eftersom pH-sonden kommer att överföra celler mellan rör/behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillväxttakten för Napa kål
Frösteriliseringsmetoden testades med flera olika Napa kål (B. rapa var pekinese; Kompletterande figur 1) från ett antal olika leverantörer och alla växte konsekvent med liknande tillväxttakt. Men testa metoder med olika arter av Brassica (B. rapa: Rova Purple Top; B. oleracea: Cairo hybrid, Tropic jättehybrid; B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid; B. juncea: Senap Röd Jätte) gav begränsad framgång (Kompletterande figur 2). Till skillnad från Napa kål som bildar kompakta snygga rosetter som passar in i glasrören, dessa Brassica spp. antingen hade låg grobarhet efter sterilisering eller stammen avlånga snabbt för att göra en spindly, ohälsosam växt. Dessutom är sterilisering äldre frön (>1 år gammal) rekommenderas inte som utsäde rockar torka ut gör det svårare att ta bort dem under steriliseringsprocessen. Regelbundet köpa nya frön och testa en delmängd av kål för att avgöra om de är sterila innan de utför experiment.
Tillväxt av mikrobiella inokulatärer i Napa kål fyllosfären
Mikrobiella isolat (tabell 1) inokulerades antingen som enstaka stamisolat eller i kombination med ett annat isolat för att leta efter parvisa interaktioner i Napa kålphyllosphere. Totalt 15 groddar-fri kål var inokulerade för varje behandling och fem kål skördades omedelbart efter inokulering, fem skördades fyra dagar efter inokulering, och de återstående skördades 10 dagar efter inokulering. Resultaten visar att fysomosfärisolat kan snabbt växa i Napa kålphyllosphere (Figur 2).
Tillväxt av mikrobiella inokulat medel i sterilt vegetabiliskt extrakt
Två jäst (Kazachstania barnetti och Pichia membranifaciens) och tre bakterier (Lactobacillus koreensis, Pediococcus parvulus, och Leuconostoc mesenteroides) var inokulerade i tre olika typer av SVE gjorda av rött, grönt och Napa kål. Alla prover inkuberades vid 24 °C och tillväxten av inokulaten under 14 dagar registrerades genom punktplätering 5 μL av varje behandling på antingen MRS- eller YPD-agarplattor (n = 5). Resultaten visas i figur 3A. PH-värdet för varje prov registrerades också under hela jäsningen (figur 3B) och visar att mjölksyrabakterierna kunde försura SVE till nivåer under pH 4 (vilket indikerar en jäsning som är säker för konsumtion).
Bild 1: Diagram över könsfri kålinställning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tillväxttakt för olika bakterier på bakteriefri Napa kål. (A)Tillväxt av enstaka vaccinationer i fyloosfären. ( B)Tillväxt efter inokulat två mikrober i fylosfären. Tillväxten av mikrober mättes som koloniformande enheter räknade per g kål homogenat pläterade på antingen TSA eller MRS media. n = 5. Felstaplar = standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tillväxt av mjölksyrabakterier och jäst i sterilt vegetabiliskt extrakt (SVE) gjord med röd, grön och Napa kål. (A)Tillväxten av mikrobiella inokulerande mättes genom att räkna kolonibildande enheter per ml SVE pläterade. Jäst var pläterade på YPD agar plattor och bakterier på MRS agar plattor. ( B)Försurning av det sterila vegetabiliska extraktet när mikrober växer visas som fall i pH. n = 5. Felstaplar = standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Phyla/Genera av mikrobiella inokulativa | Källa till mikrob |
| Firmicutes Bacillus | Fylosfär |
| Firmicutes Lactobacillus | Jäsning |
| Proteobacteria Achromobacter | Fylosfär |
| Proteobacteria Rhizobium | Fylosfär |
| Proteobacteria Sphingomonas | Fylosfär |
Tabell 1: Mikrobiella isolat inokuleras på bakteriefri Napa kål.
Kompletterande figur 1: Tillväxt av Brassica rapa var pekinensis: Bilko i bakteriefria förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: Olika kålsorter som växer i bakteriefria förhållanden. (A) B. rapa: Rova Lila Topp, (B) B. oleracea: Cairo Hybrid, (C) B. oleracea: Tropic Giant Hybrid,d) B. campestris: Pak Choi Toy Choy Hybrid, (E) B. juncea: Senap Röd Jätte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriefria Napa kålplantor har använts för att studera spridningsbegränsning av mjölksyrabakterier i Napa kålphyllosphere17. Bakteriefria Napa-kål kan också användas för att testa individuell eller parvis tillväxt i fyloosfären (figur 1). Metoder för att göra sterila vegetabiliska extrakt har testats för tre olika sorters kål: röd, grön och Napa. Var och en av dessa s.d. SES fungerar som ett tillförlitligt tillväxtmedier. inokulerade mikrober växer konsekvent över de olika medierna. En enda stamtillväxt i SVE (figur 2) visar att LAB växer snabbt och försurar medierna på samma sätt som skulle förväntas i en jäsa17.
Bakteriefria växter och sterilt vegetabiliskt extrakt kan användas i kombination för att ta itu med ett antal olika ekologiska frågor såsom prioriterade effekter och succession i fyllosfären eller inom en jäsning. En syntetisk gemenskap av mikrober är enkel att konstruera genom plätering ut homogeniserade kål för att få fysomosfär isolat, eller surkål för att få mjölksyra bakterier16. Parvis-interaktioner eller leave-one-out experiment med fler gemenskap medlemmar kan utföras i fyllosfären eller i SVE att bedöma vikten eller funktionen av gemenskapens medlemmar. Miljöurvalsstudier kan utföras i SVE där effekterna av den jästa grönsaksen kan bedömas. Det finns också potential att använda både bakteriefria kål och SVE för att kvantifiera diversifiering av mikrobiella arter och samhällen med hjälp av experimentell evolution.
En begränsning av detta bakteriefria kålsystem är den korta tidsskalan för experimenten. På grund av de små glasrör som används kan kålen inte växa under längre perioder än en månad eftersom deras blad är begränsade av rörens kant. Större växande behållare, såsom växtvävnad kultur lådor (Tabell av material) skulle kunna användas, men dessa kommer fortfarande inte att producera en fullstor kål växt. Vi har också provat att odla kål i 0,75% agar som innehåller MS buljong, men fann att detta producerade inkonsekvent tillväxt av kål plantor. Använda kalcinerad lera som ett växande substrat med tillräckligt med MS buljong för att mätta men inte översvämma lerkorn är den optimala metoden för att odla friska kål.
Det finns några kritiska steg för att säkerställa en framgångsrik tillväxt av bakteriefri kål. Se till att den kalcinerade leran är helt torr när du lägger till MS buljong gör att leran att helt absorbera MS buljong under autoklav cykeln. Men om det finns någon MS buljong över nivån på leran, måste det tas bort innan fröna tillsätts; frön kommer inte att gro om de sitter i MS buljong. Ett annat viktigt steg för att övervaka är frösterilisering. Äldre frön (>1 år gamla) kommer inte att gro så snabbt eller tillförlitligt som unga frön. Ändra storleken på röret som används för sterilisering eller överfyllning rören kan också påverka sterilisering. Steriliseringssteget hjälper också till att mjuka upp och ta bort fröskiktet så att fröna snabbt gror. Observera här att återanvändning av pumpsprayflaskorna efter användning med mikrobiella kulturer rekommenderas inte, eftersom det är svårt att ta bort biofilmer från pumpkomponenten. Av särskilt notera, försiktighet bör iakttas med Bacillus arter eftersom de är särskilt motståndskraftiga mot autoklavering. Alla pumpflaskor som har kommit i kontakt med Bacillus spp återanvänds inte.
Medan sterila vegetabiliska extrakt inte har den rumsliga strukturering som finns i ett jäsningskärl, tillväxtdynamik LAB tyder på att det efterliknar jäsning framsteg med en snabb nedgång i pH och en ökning av tillväxten av mjölksyra bakterier under 14 dagar av jäsning. Leuconostoc mesenteroides är viktigt i början av jäsning och det ökade i överflöd snabbare än Lactobacillus och Pediococcus spp, en trend sett i andra surkål successionsundersökningar20,21. Arbetet i labbet har också utforskat med spektrofotometer för att få optisk densitet (OD) avläsningar för att mäta tillväxten av LAB i SVE dispenseras i 96 brunnsplattor. De första resultaten med Napa kål extrakt såg lovande ut, men SVE gjort med rödkål extrakt bytte färg som pH sjönk vilket resulterar i förvirrade OD avläsningar. Dessutom, med hjälp av OD avläsningar för att räkna upp tillväxt begränsar användningen av detta system till enstaka stam inokulering. Tillsammans ledde dessa begränsningar oss att överge med hjälp av OD avläsningar för att mäta mikrobiell tillväxt.
Testa ekologiska interaktioner i fyllosfären är aktuell eftersom det finns bevis för att fysjuksfären påverkar växtskydd och produktivitet22. Vårt modellsystem har endast utvecklats för att arbeta med Napa kål, men bakterier från phyla Proteobacteria, Firmicutes, och Actinobacteria är vanliga i fysloosfären hos många växtarter13,23. Medan endast tre olika sorter av kål har testats, kan SVE göras med andra viktiga jordbruksväxter. Till exempel, studier som undersöker mikrobiell gemenskap församling under morotsjuice jäsning24 eller mikrobiell kolonisering av majs rot25 kan replikeras med hjälp av de protokoll som beskrivs i detta dokument.
Koppling av den bakteriefria kålen med SVE för att studera gemenskap montering i jäsning kan visa hur förändringar i fyloosfären mikrobiomet kan påverka framgången för jäsning. Nedbrytning av jäser eller underlåtenhet att nå ett tillräckligt lågt pH-kol i rättsverkan kan uppstå om det inte finns en snabb initial försurning26. Dessa bortskämda jäsningar kan bero på tillverkningsprocesser, men variation i fyloosfären mikrobiomer kan också ha ett viktigt inflytande på framgången för vegetabiliska jäser17. Det beskrivna systemet är en användbar modell för att avgöra vilka mikrobiomet monteringsprocesser kan påverka framgången för vegetabilisk jäsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av USDA-NIFA-stipendiet: 2017-67013-26520. Tracy Debenport och Claire Fogan som teknisk support och Ruby Ye och Casey Cosetta ge användbara kommentarer om tidiga versioner av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
