Summary
Mikropsuz Napa lahanaları yetiştirme yöntemi, araştırmacıların tek mikrobiyal türlerin veya çok türlü mikrobiyal toplulukların lahana yaprağı yüzeylerinde nasıl etkileşimde bulunduklarını değerlendirmelerini sağlar. Steril bir sebze özü de sebze fermantasyon sırasında toplum kompozisyon vardiya ölçmek için kullanılabilir sunulmaktadır.
Abstract
Filosfer, mikroplar tarafından kolonize edilebilir bitkinin zemin üstü kısmı, mikrobiyal topluluk montaj süreçlerini belirlemek için yararlı bir model sistemidir. Bu protokol, Napa lahana bitkilerinin fillosferindeki mikrobiyal topluluk dinamiklerini incelemek için bir sistem özetlemektedir. Bu bir kireçlenmiş kil ve besin suyu substrat ile test tüpleri mikropsuz bitkiler büyümek için nasıl açıklar. Mikrobuzsuz bitkilerin belirli mikrobiyal kültürlerle aşılanması, fillosferdeki mikrobiyal büyümeyi ve toplum dinamiklerini ölçmek için fırsatlar sağlar. Fermantasyon sırasında oluşan mikrobiyal topluluklarda lahanalardan üretilen steril sebze ekstresinin kullanımı da değerlendirilebilir. Bu sistem nispeten basit ve ucuz laboratuvarda kurmak ve mikrobiyal topluluk montaj önemli ekolojik sorulara hitap etmek için kullanılabilir. Ayrıca, fillosfer topluluk bileşiminin mikrobiyal çeşitliliği ve sebze fermantasyonlarının kalitesini nasıl etkileyip etkilebildiğini anlamak için fırsatlar sunar. Gnotobiyotik lahana fillosfer topluluklarının geliştirilmesi için bu yaklaşım diğer yabani ve tarımsal bitki türlerine uygulanabilir.
Introduction
Fillosferin mikrobiyal çeşitliliği bitki sağlığının korunmasında önemli bir rol oynar ve aynı zamanda bitkilerin çevreselstresedayanma yeteneğini etkileyebilir 1,2,3,4,5. Buna karşılık, bitkilerin sağlığı doğrudan gıda güvenliği ve kalite6,7etkiler. Bitkiler ekosistem işleyişinde rol oynar lar ve bunlara bağlı mikrobiyomlar hem bitkilerin bu faaliyetleri yürütme yeteneğini etkiler hem de çevreyi doğrudan etkiler8. Bilim adamları phyllosphere fonksiyonu ve bileşimi deşifre etmeye başlamış olsa da, fillosfer mikrobiyal topluluk montaj etkileyen ekolojik süreçler tam olarak anlaşılamamıştır9,10. Fillosfer mikrobiyomu mikrobiyom11ekolojisini incelemek için mükemmel bir11deneysel sistemdir. Bu topluluklar nispeten basit ve topluluk üyelerinin çoğu standart laboratuvar medya10,12,,13yetiştirilebilir.
Fermente sebzeler, fillosferin toplum yapısının önemli sonuçları olduğu bir sistemdir. Hem lahana turşusu hem de kimchi'de, doğal olarak sebze yapraklarında (Brassica türlerinin fillosferi) oluşan mikroplar fermantasyon için inokül olarak hizmet vermektedir14,15. Laktik asit bakterileri (LAB) bitkisel mikrobiyomların her yerde üyeleri olarak kabul edilir, ancak onlar fillosfer de düşük bolluk olabilir16. Fermantasyon sırasında güçlü abiyotik seçimi, laktik asit bakterilerinin bolluğa artmasına olanak sağlayan mikrobiyal topluluk bileşiminde bir kaymaya yol açtır. LAB büyüdükçe, fermente bitkisel ürünlerin asidik ortamı nı oluşturan laktik asit üretirler17. Fillosfer ve fermantasyon arasındaki bağlantı mikrobiyomların nasıl yapılandırDığını anlamak için sebzeleri bir model olarak kullanma fırsatı sağlar.
Biz mikrop içermeyen Napa lahana büyümek ve sprey şişeleri kullanarak belirli mikrobiyal topluluklar ile aşılamak için yöntemler geliştirdik. Bu eşit ya bireysel mikroplar veya karışık topluluklar ile lahana aşılama ucuz ve güvenilir bir yöntemdir. Bir steril sebze özü (SVE) da üç farklı lahana türleri / çeşitleri geliştirilmiştir: kırmızı ve yeşil lahana(Brassica oleracea) ve Napa lahana(B. rapa). Bu SV'lere tuz ilavesi fermantasyon ortamını kopyalar ve fermantasyon mikrobiyom montajının küçük ölçekli ve nispeten yüksek iş lenmeli deneysel çalışmalarına olanak sağlar. Bu yöntemler, fillosferdeki mikrobiyal topluluk montajını ve fillosferdeki mikrobiyal topluluk dinamiğinin bitkisel fermantasyonun başarısıyla nasıl bağlantılı olabileceğini incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Büyüyen mikropsuz lahanalar
- Mikropsuz lahana yetiştirmek için ekipman hazırlama
- İnce toz partiküllerini gidermek için kireçlenmiş kilin temizlenmesi
- Çalsamalı kil(Malzeme Tablosu)en az 3x musluk suyu ile durulayın; suyu boşaltın.
DİkKAT: Kireçlenmiş kil çok ince toz üretir ve yıkanırken koruyucu bir maske(Malzeme Tablosu)takmaları tavsiye edilir. - Sterilize etmek için ince bir tabaka (~4 cm) halinde ince bir tabaka halinde kalsinlenmiş kil ve kuru bir çevrim (20 dk için 121 °C ısıtma ve 20 dk kurutma süresi) otoklav içine yayın.
- Kalsinlenmiş kilin tepsilere yayılarak ve en az bir hafta sıcak bir kuluçka makinesine (30−37 °C) yerleştirerek kullanımdan önce tamamen kurumasını bekleyin. Bu Murashige ve Skoog (MS) besin suyu (bölüm 1.2) eşit miktarda absorbe edecek şekilde tamamen kireçlenmiş kil kurutmak için her 3 günde bir karıştırın.
NOT: Kurutma aynı zamanda tüpler halinde tartılır bile kireçlenmiş kil hacmi tutmaya yardımcı olur. Kurutma fırını gibi diğer yollarla kurutma da uygun olacaktır.
- Çalsamalı kil(Malzeme Tablosu)en az 3x musluk suyu ile durulayın; suyu boşaltın.
- Mikropsuz lahana yetiştirmek için cam eşya nın temizlenmesi
- Her kullanım arasındaki cam tüpleri(Malzeme Tablosu)iyice temizleyin ve sterilize edin. Tüpleri %30 çamaşır suyu çözeltisinde 30 dakika bekletin ve bakteriyoloji ortamında asit yıkamadan önce musluk suyuyla iyice durulayın. Asit-yıkama iki yönlü test tüpü kapakları(Tablo Malzemeler)arasında kullanır.
- Yüzey sterilize lahana tohumu
- 100 napa lahana(B. rapa var pekinensis)tohumlarını 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
NOT: Bir mikrosantrifüj tüpüne 100'den fazla tohum eklenmesi veya tüpün boyutunun değiştirilmesi, tohum kat kaldırma eksikliği nedeniyle tohumların çimlenme oranlarını etkileyebilir. - Tohumlara %70 etanol ekleyin ve 5 dk. Bir pipet kullanarak etanol atın.
- 5 dk için %50 çamaşır suyu ve girdap 1 mL ekleyin.
- 5 dk. Deiyonize su bir pipet kullanarak atın için otoklavlı deiyonize su ve girdap 1 mL ekleyin.
- Tüm çamaşır suyunu durulamak için adım 1.1.3.4 3x tekrarlayın. Tohumları, tohum katını yumuşatmak için dikimden önce 2−8 saat steril deiyonize suda bekletin.
- 100 napa lahana(B. rapa var pekinensis)tohumlarını 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
- İnce toz partiküllerini gidermek için kireçlenmiş kilin temizlenmesi
- Büyüyen mikropsuz lahanalar
NOT: Napa lahanaları(B. rapa var pekinensis)Murashige ve Skoog (MS) besin suyunda ıslatılmış kireçlenmiş kil içeren cam tüplerde (15 cm x 2,5 cm) yetiştirilir.- Temiz bir cam tüp (15 cm x 2,5 cm) içine temiz kalsinli kil 10 g tartın.
- Deiyonize suyun 1 L'sinde 4,4 g MS ortamını eriterek MS besin suyunu hazırlayın. Bir pipet kullanarak kireçlenmiş kil kapsayacak şekilde her cam tüp ms besin suyu (~ 9 mL) ekleyin.
NOT: Tüpte duran sıvı, tohumun çimlenmesini önleyecektir, bu nedenle bazı tüplere biraz daha az MS suyu eklemek gerekebilir. - 22 mm iki yönlü test tüpü kapakları ve otoklav (60 dk için 121 °C) ile gevşek kapaklı cam tüpler. Otoklavonları çıkarırken, onları mühürlemek için cam tüpler üzerine kapaklar itin. Kullanmadan önce oda sıcaklığına kadar tüpleri soğutun.
- Steril, ekstra uzun (25,4 cm) forceps kullanarak her tüpün ortasına bir steril lahana tohumu yavaşça yerleştirin. Tüpleri 7 yönlü bir tepsiye yerleştirin ve 24 °C'de 16 saatlik ışık döngüsüyle hafif rafların (tam spektrumlu T5 floresan ampuller veya bitki büyümesi için diğer aydınlatma kurulumu) altına yerleştirin.
NOT: Tohumlar bir gecede çimlenir ve 5 gün sonra ilk gerçek yapraklarını geliştirirler. Gerçek bir yaprak, cotyledonlar oluştuktan sonra oluşan ilk vasküler yapraktır. Daha kırışık bir kenarı vardır ve Brassica rapa trichomes kaplıdır.
- Mikropsuz lahanaların sterilitesi için test
NOT: Lahanaların mikropsuz olup olmadığını test etmek için, her bir partiden birkaç (5−10) lahana seçin ve herhangi bir eksteyete koloni olup olmadığını belirleyin.- Lahanayı, sterilize edilmiş ençelerle bitkinin tabanını tutarak ve dışarı çekerek cam tüplerden yavaşça çıkarın. Lahanayı tüpten tamamen çıkarmadan önce, sterilize edilmiş diseksiyon makaslaköklerini dikkatlice kesin. Lahana yapraklarını 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe sıkıştırın.
NOT: Daha büyük lahanalar, lahananın 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne girmesini kolaylaştırmak için hala tüpteyken büyük yapraklardan bir veya ikisini çıkarmayı gerektirebilir. Bu büyük yapraklar, lahananın geri kalanı gerekliyse, lahananın geri kalanı tüpe yerleştirildikten sonra 1,5 mL'lik tüpe eklenebilir. - Her 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 400 μL 1x fosfat tampon salini (PBS) ekleyin. Steril bir mikroteks kullanarak, 30x haşere tarafından lahana homojenize.
- Lahananın 100 μL'lik plakası, numunede herhangi bir kirletici madde olup olmadığını belirlemek için agar plakaları üzerine homojendir. Fillosferde bulunan bakterilerin çoğu triptik soya (TS) agar plakaları üzerinde büyüyecek. Lahana homojenate kalın ve düzenli pipet ipuçları tıkanabilir gibi lahana homojen kaplama geniş orifice pipet uçları kullanın.
- Lahanayı, sterilize edilmiş ençelerle bitkinin tabanını tutarak ve dışarı çekerek cam tüplerden yavaşça çıkarın. Lahanayı tüpten tamamen çıkarmadan önce, sterilize edilmiş diseksiyon makaslaköklerini dikkatlice kesin. Lahana yapraklarını 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe sıkıştırın.
2. Fillosferin mikrobiyal çözeltilerle aşılanması
- Aşılama suşları gliserol stokları yapma
NOT: Tablo 1, bu adımda kullanılabilecek mikrobiyal yalıtmaları listeler. Diğer fillosfer izole burada da kullanılabilir.- Yoğun bir şekilde, yeni bir çizgiden, aynı medyanın iki/üç yeni plakasına, birçok koloniyi elde etmek için tek tek kolonileri dışarı çıkar.
- Çizgiler 2−5 gün boyunca büyümeye izin sonra 15 mL içeren 15 mL konik tüp içine tüm plakalardan koloniler kazımak 15 mL 15% gliserol, ve girdap iyice karıştırmak için.
- İyi karıştırılmış gliserol stokunun 1 mL'lik bir aliquot'ünü 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın ve gliserol stoklarını kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Lahana aşılama sırasında nispeten büyük hacimlerde aşılama çözeltisi gerektiğinden, kalan 14 mL gliserol stoğunu -80 °C'de saklayın.
- Kullanımdan bir hafta önce, 14 mL inoculation çözeltisinin konsantrasyonunu (koloni oluşturma birimi [CFU] belirlemek için buz, seyreltme ve plaka (örneğin, 10-4, 10-5ve 10-6)üzerinde 1 mL gliserol stoku (adım 2.1.3) içeren 1.5 mL tüpü eritin.
- Aşılama sprey şişelerinin sterilizasyonu
- Amber yuvarlak Boston pompa şişeleri (59 mL) sökmek ve tüm bileşenleri (pompa, tüp, kapak ve şişe) 30% çamaşır suyu çözeltisi içinde 30 dakika için büyük bir plastik kapta sıkıca oturan kapak ile ıslatın.
- Sırılsıklam olduktan sonra, kabın kapağının sadece bir köşesini kaldırarak kabın tüm çamaşır suyunu dikkatlice dökün.
- Plastik kabı otoklavlı deiyonize suyla doldurarak şişeleri durulayın (konteyner büyüklüğüne bağlı olarak~1 L) ve bir köşede kapağı kaldırarak deiyonize suyu dikkatlice dökün.
- %70 etanol çözeltisi püskürterek ve UV ışığını 30 dakika açarak bir biyogüvenlik kabinini sterilize edin.
NOT: Bu çalışmaya biyogüvenlik kabininde devam edin, böylece şişelerin kuruyan mikrobiyal kontaminasyon riski yoktur. - Büyük plastik kap şişeleri çıkarın ve bir pipet kullanarak otoklavlı deiyonize su ile her şişe doldurun. Pompaları yeniden birleştirin ve her şişeye bir tane yerleştirin. Şişenin pompa bileşeninden çamaşır suyu çıkarmak için her şişe (şişe başına 10 sprey) yoluyla deiyonize su pompası.
- Tüm çamaşır suyunun cam şişelerden çıkarıldığından emin olmak için adım 2.2.5'i tekrarlayın.
- Şişelerin her şişeye bir numara yerleştirerek steril olup olmadığını test edin (tamamen kuruduğunda şişenin yan tarafına laboratuvar bandı yapıştırma) sonra şişelerin her birine 10 mL 1x PBS ekleyin ve bir TS agar plakaüzerine 3 sprey pompalayın. Püskürtme sonra, oda sıcaklığında bir hafta boyunca plakaları kuluçkaya yatırın. Herhangi bir koloni bir plaka üzerinde büyürse, ilgili şişenin steril olmadığını ve deneyler için kullanılmaması gerektiğini gösterir.
- Steril şişeleri depolamadan önce, kalan tüm PBS'yi çıkarın ve şişelerin biyogüvenlik kabininde iyice kurumasını bekleyin. Steril şişeleri steril plastik bir kapta (genellikle şişelerin beyazlatma için kullanılan kabı) kullanıma kadar saklayın.
- Mikrobiyal inokülhazırlanması ve mikropsuz lahana püskürtme
DİkKAT: Tüm adımlar bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır, çünkü püskürtme, çalışma yüzeylerini kirletebilecek veya laboratuvar tezgahında yapılması halinde sağlık riski oluşturabilecek mikrobik çözeltileri aerosolize eder.
NOT: Lahanalar 5 gün sonra gerçek yapraklar oluşturacak, bu nedenle herhangi bir mikrobiyal çözelti ile aşılama önce lahana dikim sonra bir hafta beklemek tavsiye edilir. Tüpler mühürlü olduğu için lahanaları sulamaya gerek yoktur. Küçük tüpler lahananın büyümesini kısıtlayış gösterdiğinden, deneyler dikimden sonraki bir ay içinde en iyi şekilde gerçekleştirilir.- 1x PBS'de buz ve seyreltik üzerinde, istenilen aşılama konsantrasyonuna göre eritme gliserol stokları (2.1.4 adımda 1 mL aliquot'un çözülmesi ve kaplaması ile belirlenen konsantrasyon).
NOT: Çeşitli aşı seviyeleri kullanılabilir, ancak fillosfer izole 10 gün içinde lahana bulamacı 104 ila 108 CPU/mL büyüyebilir. - Steril pompa şişesine seyreltilmiş gliserol stok 10 mL ekleyin ve şişe pompası bileşeni herhangi bir artık PBS kaldırmak için büyük bir atık toplama kabı içine pompa 5 spreyler.
- Lahana tüpünden kapağı çıkarın, lahanayı sprey şişesine doğru yatırın ve her lahanayı ~600 μL inoculum sağlayan aşı çözeltisinin 3 pompasıyla püskürtün.
- Aşılama dan sonra, gerçek giriş aşılama konsantrasyonu değerlendirmek için lahana bir alt kümesi hasat. Sterilize forceps ile bir tüp lahana çıkarın. Steril diseksiyon makası ile kökleri kesin ve daha sonra lahanayı önceden tartılmış steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe dikkatlice yerleştirin. Hesaplamalar için CFO'lar/g lahana gerekiyorsa, lahananın ağırlığını gelecekteki hesaplamalar için kaydedin.
- Lahana içeren her 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 400 μL 1x PBS ekleyin ve lahanayı 30 x öğüterek 1x PBS'ye homojenize etmek için steril bir mikrokol kullanın.
- Seyreltin lahana homojenate (gerekirse) ve kabare lahana karışımı dışarı plaka. Kalın ve bitki doku parçaları dolu olacak, çünkü lahana bulamaç pipetting için geniş delik ipuçları kullanın.
- 1x PBS'de buz ve seyreltik üzerinde, istenilen aşılama konsantrasyonuna göre eritme gliserol stokları (2.1.4 adımda 1 mL aliquot'un çözülmesi ve kaplaması ile belirlenen konsantrasyon).
3. Steril sebze özü hazırlama
NOT: Bu yöntem lahana steril medya üretimi18,,19değiştirilmiş bir sürümüdür.
- Süpermarketten lahana al. Laboratuvarda, lahananın en dıştaki yapraklarını çıkarın ve atın. Kalan tüm lahanayı blender'a sığdırmak için doğrayın ve lahanayı ince bir hamura homojenize edin, yani lahana daha fazla karıştırma ile daha ince olmayacaktır.
NOT: Lahanayı düzgün homojen bir hamurla doğrayabilen her blender bu yöntem için uygun olmalıdır. - Harmanlanmış lahanahomojen tartın ve lahana gram başına distile su 2 mL ekleyin. Karıştırılmış lahana bulamacını 2 kat sepet kahve filtrelerinden (ağartılmamış kağıt) süzün.
- Santrifüj tüpler (boyutu santrifüj bağlıdır) içine lahana bulamaç dağıtın. Büyük parçacıklar çözeltidışında yerleşene kadar 20.000 x g'de filtrelenmiş lahana bulamacını 20 dk için santrifüj edin.
NOT: Lahana parçacıkları filtre sterilizatörü hızla tıkarken lahana bulamacını uzun süre santrifüj etmek esastır. - Serolojik pipet kullanarak, peletli lahana enkazından süpernatantı çıkarın ve peletli lahanayı rahatsız etmemeye özen tinleyin. Standart tuz konsantrasyonlarının kullanıldığı fermantasyon koşullarını yeniden oluşturmayı hedefliyorsa, bu adımda (örneğin, filtre sterilizasyonundan önce) %2 w/v NaCl ekleyin.
- Filtre, vakuma bağlı 0,2 μm filtre (500 mL veya 1 L) kullanarak sebze ekstresini sterilize edin. Steril tüplere (50 mL santrifüj tüpleri veya 15 mL santrifüj tüpler) dağıtın ve kullanıma kadar -80 °C'de donun.
4. Steril sebze ekstresinin aşılanması
- SVE'yi eritin ve 490 μL'yi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe dağıtın. Her zaman noktası ölçümü yıkıcı olduğundan, zaman noktası başına tedavi başına en az beş kopyaya sahip olmak için yeterli tüpler kullanın.
- Mikrobiyal eritme gliserol stokları buz üzerinde izole ve istenilen konsantrasyona 1x PBS ile seyreltmek. Laktik asit bakterilerinin konsantrasyonu SVE mL başına 5.000 CFU kadar düşük olabilir. Bu konsantrasyonu elde etmek için, toplam 500 μL'lik hacmin aşılanmasında 10°L kullanılacağı için stokları 250 CPU/l'ye seyreltin.
- 10 μL seyreltilmiş mikrobiyal izole ile SVE aşılamak. Pipet yukarı ve aşağı iyice karıştırmak için birkaç kez. İstenilen sıcaklıkta kuluçka (kimchi üretim sıcaklığı için 14 °C veya en sıcak lahana turşusu fermantasyonu için 24 °C).
- 1. gün, 2. gün, 4.
NOT: Fermantasyon başlangıçta hızla ilerler ve zamanla yavaşlar. Bu nedenle, daha fazla başlangıç zaman noktalarına sahip olmak fermantasyonun nasıl devam ettiğine ilişkin dinamiklere daha fazla çözünürlük sağlar. - Her zaman diliminde, aşılanmış SVE'yi birkaç kez yukarı ve aşağı boruhaline vererek iyice karıştırın. 1x PBS'de aşılanmış SVE'yi seri olarak seyreltin ve agar plakaları üzerine plaka. Kolonileri saymadan önce agar plakalarını 4−7 gün kuluçkaya yatırın.
NOT: Man, Rogosa ve Sharpe (MRS) agar tüm laktik asit bakterileri saymak için kullanılmalıdır, maya peptone dekstroz (YPD) maya için kullanılmalıdır, ve ts agar diğer bakteriler için phyllosphere izole. - Bir mikro pH probu kullanarak her zaman noktasında numunelerin pH'ını kaydedin.
NOT: PH probu hücreleri tüpler/tedaviler arasında aktaracağı için bu adım kaplamadan sonra yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Napa lahanabüyüme oranları
Tohum sterilizasyon yöntemi birkaç farklı Napa lahanası ile test edildi (B. rapa var pekinese; Ek Şekil 1) farklı tedarikçilerin bir dizi ve tüm benzer büyüme oranları ile tutarlı büyüdü. Ancak, Brassica farklı türleri ile yöntemleri test (B. rapa: Şalgam Mor Top; B. oleracea: Kahire Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campestris: Pak Choi Oyuncak Choy Hybrid; B. juncea: Hardal Kırmızı Dev) sınırlı başarı verdi(Ek Şekil 2). Cam tüpler sığacak kompakt düzgün rozetler oluşturan Napa lahana aksine, bu Brassica spp. ya sterilizasyon sonra düşük çimlenme oranları vardı ya da kök hızla bir spindly, sağlıksız bitki yapmak için uzadı. Buna ek olarak, eski tohumların sterilizasyonu (>1 yaşında) tohum katlarının kuruması ve sterilizasyon işlemi sırasında çıkarılmasının zorlaşması tavsiye edilmez. Düzenli olarak yeni tohumlar satın alın ve deneyler yapmadan önce steril olup olmadıklarını belirlemek için lahana alt kümesini test edin.
Napa lahana fillosferinde mikrobiyal inokülanların büyümesi
Mikrobiyal izole(Tablo 1)napa lahana fillosferinde çift yönlü etkileşimleri aramak için ya tek bir süzme izole olarak ya da başka bir izole ile birlikte aşılandı. Her tedavi için toplam 15 mikropsuz lahana aşılandı ve aşıdan hemen sonra beş lahana hasat edildi, beşi aşılamadan dört gün sonra hasat edildi ve geri kalanı aşılamadan 10 gün sonra hasat edildi. Sonuçlar, fillosfer izole napa lahana fillosferhızlı büyüme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir(Şekil 2).
Steril sebze ekstresinde mikrobiyal inokülanların büyümesi
İki maya(Kazachstania barnetti ve Pichia membranifaciens)ve üç bakteri(Lactobacillus koreensis, Pediococcus parvulus, ve Leuconostoc mesenteroides) kırmızı, yeşil ve Napa lahanadan yapılmış üç farklı SVE türüne aşılandı. Tüm numuneler 24 °C'de kuluçkaya yatırıldı ve 14 gün içinde inoküllerin büyümesi mrs veya YPD agar plakalarına her tedavinin 5 μL'lik spot kaplaması ile kaydedildi (n = 5). Sonuçlar Şekil 3A'dagösterilmiştir. Her numunenin pH'ı da fermantasyon boyunca kaydedildi(Şekil 3B) ve laktik asit bakterilerinin SVE'yi pH 4'ün altındaki seviyelere asitleyebildiğini göstermektedir (tüketim için güvenli bir fermantasyon gösterir).
Şekil 1: Mikropsuz lahana kurulumu diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikropsuz Napa lahanası üzerinde farklı bakterilerin büyüme oranları. (A) Fillosferdeki tek aşılamaların büyümesi. (B) Filoya iki mikrop aşıladıktan sonra büyüme. Mikropların büyümesi, TSA veya MRS media üzerine kaplanmış lahana homojenate g başına sayılan koloni oluşturan birimler olarak ölçüldü. n = 5 olarak Hata çubukları = standart sapma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kırmızı, yeşil ve Napa lahanası ile yapılan steril sebze özü (SVE) laktik asit bakteri ve mayaların büyümesi. (A) Mikrobiyal inokülanların büyümesi, sve kaplamabaşına koloni oluşturan birimler sayılarak ölçüldü. Mayalar MRS agar plakaları üzerine YPD agar plakaları ve bakteri üzerine kaplandı. (B) Mikroplar pH'da düşüş olarak gösterildiği gibi steril sebze ekstresinin asitlenmesi. n = 5 olarak Hata çubukları = standart sapma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Mikrobiyal inokülantların phyla/Cinsi | Mikrop kaynağı |
| Firmicutes Bacillus | Filosfer |
| Firmicutes Lactobacillus | Fermantasyon |
| Proteobacteria Achromobacter | Filosfer |
| Proteobacteria Rhizobium | Filosfer |
| Proteobacteria Sfingomonas | Filosfer |
Tablo 1: Mikrobiyal mikrobiyal izole mikropsuz Napa lahana aşılanmış.
Ek Şekil 1: Brassica rapa var pekinensis'in büyümesi: Mikropsuz koşullarda Bilko. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Mikropsuz koşullarda yetişen farklı lahana çeşitleri. (A) B. rapa: Şalgam Mor Top, (B) B. oleracea: Kahire Hybrid, (C) B. oleracea: Tropic Giant Hybrid, (D) B. campestris: Pak Choi Oyuncak Choy Hybrid, (E) B. juncea: Hardal Kırmızı Dev. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikropsuz Napa lahana bitkileri Napa lahana phyllosphere17laktik asit bakterilerin dağılım sınırlaması incelemek için kullanılmıştır. Mikropsuz Napa lahanalar da fillosferde bireysel veya çift-bilge büyüme test etmek için kullanılabilir (Şekil 1). Kırmızı, yeşil ve Napa: steril sebze özü yapmak için yöntemler lahana üç farklı çeşitleri için test edilmiştir. Bu SVE'lerin her biri güvenilir bir büyüme ortamı olarak hareket eder; aşılanmış mikroplar sürekli farklı medya genelinde büyür. SVE tek gerinim büyüme oranları (Şekil 2) LAB hızla büyümek ve bir fermantasyon17tahmin edilecek şekilde aynı şekilde medya asitife göstermektedir.
Mikropsuz bitkiler ve steril sebze özü, fillosferde veya bir fermantasyon içinde öncelik etkileri ve ardıllığı gibi bir dizi farklı ekolojik sorunu ele almak için birlikte kullanılabilir. Mikropların sentetik bir topluluk fillosfer izole elde etmek için homojenize lahana kaplama yoluyla inşa etmek kolaydır, veya laktik asit bakterileri elde etmek için lahana turşusu16. Topluluk üyelerinin önemini veya işlevini değerlendirmek için fillosferde veya SVE'de daha fazla topluluk üyesiyle çift yönlü etkileşimler veya bir kerelik deneyler yapılabilir. Çevre seçim çalışmaları, fermente edilen sebzenin etkisinin değerlendirilebileceği SVE'de yapılabilir. Ayrıca mikrobiyal türlerin ve toplulukların deneysel evrimi kullanarak çeşitlendirilmesini ölçmek için hem mikropsuz lahanaları hem de SVE'yi kullanma potansiyeli vardır.
Bu mikrops-free lahana sisteminin bir sınırlama deneylerin kısa zaman ölçeğidir. Kullanılan küçük cam tüpler nedeniyle, lahanalar yaprakları tüplerin kenarı ile sınırlı olduğu gibi bir aydan daha uzun süre büyümek mümkün değildir. Bitki doku kültür kutuları(Malzeme Tablosu)gibi daha büyük büyüyen kaplar kullanılabilir, ancak bunlar yine de tam boyutlu bir lahana bitkisi üretmez. Biz de MS suyu içeren% 0.75 agar lahana büyüyen denedim, ama bu lahana fideleri tutarsız büyüme üretti bulundu. Yeterli MS suyu ile büyüyen bir substrat olarak kireçlenmiş kil kullanarak yeterli MS suyu ile ama kil taneleri sel değil sağlıklı lahana yetiştirmek için en uygun yöntemdir.
Mikropsuz lahanaların başarılı bir şekilde büyümesini sağlamak için birkaç kritik adım vardır. MS suyu eklendiğinde kireçlenmiş kilin tamamen kuru olduğundan emin olmak, kilin otoklav döngüsü sırasında MS et suyuna tam olarak emilmesini sağlar. Ancak, kil düzeyi üzerinde herhangi bir MS suyu varsa, tohumları eklemeden önce kaldırılmalıdır; ms suyu oturuyorsanız tohumlar çimlenmez. İzlemek için bir diğer önemli adım tohum sterilizasyonu olduğunu. Eski tohumlar (>1 yaşında) genç tohumlar kadar hızlı veya güvenilir bir şekilde çimlenmez. Sterilizasyon veya tüplerin aşırı doldurulması için kullanılan tüpün boyutunun değiştirilmesi de sterilizasyonu etkileyebilir. Sterilizasyon adımı da yumuşatmak ve tohum kat kaldırmak böylece tohumlar hızla çimlenmeyardımcı olur. Burada mikrobiyal kültürler ile kullandıktan sonra pompa sprey şişeleri yeniden tavsiye edilmez unutmayın, pompa bileşeni biyofilmleri kaldırmak zordur gibi. Özellikle dikkat, dikkat Bacillus türleri ile özellikle otoklavlama esnek olarak alınmalıdır. Bacillus spp ile temas etmiş herhangi bir pompa şişeleri yeniden kullanılmaz.
Steril sebze ekstresi bir fermantasyon kabında mevcut olan mekansal yapıya sahip olmasa da, LAB'ın büyüme dinamikleri pH'da hızlı bir düşüş ve 14 günlük fermantasyon sırasında laktik asit bakterilerinin büyümesinde artış la fermantasyon ilerlemesini taklit ettiğini göstermektedir. Leuconostoc mesenteroides fermantasyon başında önemlidir ve daha hızlı Lactobacillus ve Pediococcus spp, diğer lahana turşusu veraset anketleri görülen bir eğilim daha hızlı bir şekilde arttı20,21. Laboratuvardaki çalışmalar da 96 kuyu plakaları içine dağıtılan SVE LAB büyümesini ölçmek için optik yoğunluk (OD) okumaları elde etmek için spektrofotometre kullanarak araştırdı. Napa lahana özü ile ilk sonuçlar umut verici görünüyordu, ama pH şaşkın OD okumaları ile sonuçlanan düştü olarak kırmızı lahana özü ile yapılan SVE renk değiştirdi. Ayrıca, büyümeyi sayısallandırmak için OD okumalarının kullanılması, bu sistemin tek gerilim aşıları ile kullanımını sınırlandırır. Birlikte, bu sınırlamalar bizi mikrobiyal büyümeyi ölçmek için OD okumaları kullanarak terk yol açtı.
Fillosferdeki ekolojik etkileşimlerin test edilmesi topikaltır, çünkü fillosferin bitki sağlığını ve üretkenliğini etkilediğine dair kanıtlar vardır22. Bizim model sistemi sadece Napa lahana ile çalışmak için geliştirilmiştir, ancak phyla Proteobacteria bakteriler, Firmicutes, ve Actinobacteria birçok bitki türlerinin phyllosphere yaygındır13,23. Lahana sadece üç farklı çeşitleri test edilmiş olsa da, SVE diğer önemli tarım salkımları ile yapılabilir. Örneğin, havuç suyu fermantasyonu24 veya mısır kökü25 mikrobiyal kolonizasyon sırasında mikrobiyal topluluk montaj araştıran çalışmalar bu yazıda özetlenen protokoller kullanılarak çoğaltılabilir.
Fermantasyonda topluluk meclisini incelemek için mikromsuz lahanayı SVE ile kaplinlemek, fillosfer mikrobiyomundaki değişikliklerin fermantasyonun başarısını nasıl etkileyebileceğini gösterebilir. Fermantasyonların bozulması veya yeterince düşük bir pH'a ulaşılamaması hızlı bir başlangıç asitleşme sayılmaması durumunda ortaya çıkabilir26. Bu şımarık fermantasyon üretim süreçleri nedeniyle olabilir, ama phyllosphere mikrobiyomlarda varyasyon da sebze fermente başarısı üzerinde önemli bir etkisi olabilir17. Açıklanan sistem, hangi mikrobiyom montaj süreçlerinin sebze fermantasyonunun başarısını etkileebileceğini belirlemek için yararlı bir modeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma USDA-NIFA hibesi ile desteklenmiştir: 2017-67013-26520. Tracy Debenport ve Claire Fogan teknik destek sağladı ve Ruby Ye ve Casey Cosetta bu el yazmasının erken sürümleri hakkında yararlı yorumlar sağlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
- Grady, K. L., Sorensen, J. W., Stopnisek, N., Guittar, J., Shade, A. Assembly and seasonality of core phyllosphere microbiota on perennial biofuel crops. Nature Communications. 10 (1), 4135 (2019).
- Pii, Y., et al. Microbial interactions in the rhizosphere: beneficial influences of plant growth-promoting rhizobacteria on nutrient acquisition process. A review. Biology and Fertility of Soils. 51 (4), 403-415 (2015).
- Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
- Bai, Y., et al. Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature. 528 (7582), 364-369 (2015).
- Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
- Dinu, L. D., Bach, S. Induction of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 in the phyllosphere of lettuce: a food safety risk factor. Applied and Environmental Microbiology. 77 (23), 8295-8302 (2011).
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. Journal of Applied Microbiology. 104 (3), 613-626 (2008).
- Bringel, F., Couée, I. Pivotal roles of phyllosphere microorganisms at the interface between plant functioning and atmospheric trace gas dynamics. Frontiers in Microbiology. 6, 486 (2015).
- Maignien, L., DeForce, E. A., Chafee, M. E., Eren, A. M., Simmons, S. L. Ecological succession and stochastic variation in the assembly of Arabidopsis thaliana phyllosphere communities. mBio. 5 (1), e00682 (2014).
- Carlström, C. I., et al. Synthetic microbiota reveal priority effects and keystone strains in the Arabidopsis phyllosphere. Nature Ecology & Evolution. 3 (10), 1445-1454 (2019).
- Meyer, K. M., Leveau, J. H. J. Microbiology of the phyllosphere: a playground for testing ecological concepts. Oecologia. 168 (3), 621-629 (2012).
- Humphrey, P. T., Nguyen, T. T., Villalobos, M. M., Whiteman, N. K. Diversity and abundance of phyllosphere bacteria are linked to insect herbivory. Molecular Ecology. 23 (6), 1497-1515 (2014).
- Williams, T. R., Marco, M. L. Phyllosphere microbiota composition and microbial community transplantation on lettuce plants grown indoors. mBio. 5 (4), e01564 (2014).
- Di Cagno, R., Coda, R., De Angelis, M., Gobbetti, M. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation. Food Microbiology. 33 (1), 1-10 (2013).
- Köberl, M., et al. Deciphering the microbiome shift during fermentation of medicinal plants. Scientific Reports. 9 (1), 13461 (2019).
- Yu, A. O., Leveau, J. H. J., Marco, M. L. Abundance, diversity and plant-specific adaptations of plant-associated lactic acid bacteria. Environmental Microbiology Reports. 12 (1), 16-29 (2020).
- Miller, E. R., et al. Establishment limitation constrains the abundance of lactic acid bacteria in the Napa cabbage phyllosphere. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00269 (2019).
- Stamer, J. R., Stoyla, B. O., Dunckel, B. A. Growth rates and fermentation patterns of lactic acid bacteria associated with sauerkraut fermentation. Journal of Milk and Food Technology. 34 (11), 521-525 (1971).
- Yildiz, F., Westhoff, D. Associative growth of lactic acid bacteria in cabbage juice. Journal of Food Science. 46 (3), 962-963 (1981).
- Zabat, M. A., Sano, W. H., Wurster, J. I., Cabral, D. J., Belenky, P. Microbial community analysis of sauerkraut fermentation reveals a stable and rapidly established community. Foods. 7 (5), Basel, Switzerland. 77 (2018).
- Lee, S. H., Jung, J. Y., Jeon, C. O. Source tracking and succession of kimchi lactic acid bacteria during fermentation. Journal of Food Science. 80 (8), M1871 (2015).
- Trivedi, P., Schenk, P. M., Wallenstein, M. D., Singh, B. K. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions. Microbial Biotechnology. 10 (5), 999-1003 (2017).
- Knief, C., et al. Metaproteogenomic analysis of microbial communities in the phyllosphere and rhizosphere of rice. The ISME Journal. 6 (7), 1378-1390 (2012).
- Wuyts, S., et al. Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134 (2018).
- Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
- Steinkraus, K. H. Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes. Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).
