Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fremstilling af Zero Mode Waveguides for høj koncentration enkelt molekyle mikroskopi

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

ERRATUM NOTICE

Summary

Beskrevet her er en nanosfære litografi metode til parallel fremstilling af nul mode waveguides, som er arrays af nanoapertures i en metal-klædt glas mikroskopi coverslip for enkelt molekyle billeddannelse på nano-til mikromolar koncentrationer af fluorophores. Metoden udnytter kolloid krystal selvmontering til at oprette en waveguide skabelon.

Abstract

I enkeltmolekyle fluorescens enzymologi, baggrund fluorescens fra mærkede substrater i opløsning ofte begrænser fluorophore koncentration til pico- til nanomolar intervaller, flere størrelsesordener mindre end mange fysiologiske ligand koncentrationer. Optiske nanostrukturer kaldet zero mode waveguides (ZMWs), som er 100−200 nm i diameteråbninger fremstillet i et tyndt ledende metal som aluminium eller guld, tillader billeddannelse af individuelle molekyler ved mikromolarkoncentrationer af fluorophorer ved at begrænse synlig lysudledning til zeptoliter effektive mængder. Behovet for dyrt og specialiseret nanofabrikationsudstyr har imidlertid udelukket udbredt brug af Z BMW'er. Typisk opnås nanostrukturer som Z BMW'er ved direkte skrivning ved hjælp af elektronstråle litografi, som er sekventiel og langsom. Her, kolloid, eller nanosfære, litografi bruges som en alternativ strategi for at skabe nanometer-skala masker til waveguide fabrikation. Denne rapport beskriver tilgangen i detaljer med praktiske overvejelser for hver fase. Metoden gør det muligt at lave tusindvis af aluminiums- eller guld-Z BMW'er parallelt med endelige waveguide-diametre og dybder på 100−200 nm. Der kræves kun almindeligt laboratorieudstyr og en termisk fordamper til metalaflejring. Ved at gøre Z BMW'er mere tilgængelige for det biokemiske samfund kan denne metode lette studiet af molekylære processer ved cellulære koncentrationer og hastigheder.

Introduction

Enkeltmolekyleteknikker såsom enkeltmolekyle fluorescensresonansenergioverførsel (smFRET) eller enkeltmolekyle fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) er kraftfulde værktøjer til molekylær biofysik, der gør det muligt at studere dynamiske bevægelser, konformationer og interaktioner mellem individuelle biomolekyler i processer som transskription1,2,3, oversættelse4,5,6og mange andre7. For smFRET er total intern refleksions-fluorescens (TIRF) mikroskopi en almindelig metode, fordi mange tøjrede molekyler kan følges over tid, og den evanescentbølge, der genereres af TIR, er begrænset til en 100−200 nm region, der støder op til coverslip8. Men selv med denne begrænsning af excitationsvolumen skal fluorophorer af interesse stadig fortyndes til pM- eller nM-intervaller for at detektere enkeltmolekylesignaler over baggrundsfluorecens9. Da Michaelis-Menten konstanter af cellulære enzymer er typisk i μM til mM rækkevidde10, biokemiske reaktioner i enkelt molekyle undersøgelser er normalt meget langsommere end dem i cellen. For eksempel forekommer proteinsyntese ved 15−20 aminosyrer pr. Sekund i E. coli11,12, mens de fleste prokaryote ribosomer i smFRET-eksperimenter oversætter ved 0,1−1 aminosyre pr. Sekund13. I proteinsyntese viste krystalstrukturer og smFRET på fastlåste ribosomer, at overførsels-RNA'er (tRNA'er) svinger mellem 'hybride' og 'klassiske' tilstande før tRNA-mRNA-translokation trin14,15. Men når fysiologiske koncentrationer af translokation GTPase faktor, EF-G, var til stede, en anden kropsbygning, mellemliggende mellem hybrid og klassiske stater, blev observeret i smFRET6. Det er vigtigt at studere dynamiske molekylære processer med hastigheder og koncentrationer svarende til dem i cellen, men er fortsat en teknisk udfordring.

En strategi til at øge koncentrationen af fluorescerende substrater er brugen af metalbaserede, sub-synlige bølgelængdeåbninger, kaldet nultilstandsbølgeguider (ZMWs), til at generere begrænsede excitationsfelter, der selektivt ophidser biomolekyler lokaliseret i åbningerne16 (Figur 1). Åbningerne er typisk 100−200 nm i diameter og 100−150 nm i dybden17. Over en cutoff bølgelængde relateret til størrelsen og formen af brøndene (λc ≈ 2,3 gange diameteren for cirkulære waveguides med vand som dielektrisk medium18), ingen formering tilstande er tilladt i waveguide, og dermed udtrykket nul mode waveguides. Men en oscillerende elektromagnetisk felt, nævnte en evanescent bølge, eksponentielt henfalder i intensitet stadig tunneler en kort afstand ind i waveguide18,19. Selv ligner TIR evanescent bølger, ZMW evanescent bølger har en kortere henfald konstant, hvilket resulterer i 10−30 nm effektiv excitation region inden for waveguide. Ved mikromolarkoncentrationer af fluorescerende mærkede ligands er kun et eller nogle få molekyler samtidig til stede inden for excitationsregionen. Denne begrænsning af excitationsvolumen og deraf følgende reduktion af baggrundsfluorescens muliggør fluorescensbilleddannelse af enkelte molekyler i biologisk relevante koncentrationer. Dette er blevet anvendt på mange systemer20, herunder FCS-målinger af enkeltproteindiffusion21, enkeltmolekyle FRET-målinger af lav-affinitets ligand-protein22 og proteinproteininteraktioner23og spektroelektriske målinger af enkeltmolekyleomsætningshændelser24.

Z BMW'er er fremstillet ved direkte at mønstre et metallag ved hjælp af ionstrålefræsning25,26 eller elektronstråle litografi (EBL) efterfulgt af plasma-ætsning16,27. Disse maskeløse litografimetoder skaber bølgeledere i serier og kræver typisk adgang til specialiserede nanofabrikker, hvilket forhindrer udbredt anvendelse af ZMW-teknologi. En anden metode, ultraviolet nanoimprint litografi lift-off28, bruger en kvarts dias skimmel til at trykke en omvendt ZMW skabelon på en modstå film som et stempel. Mens denne metode er mere strømlinet, kræver den stadig EBL til fremstilling af kvartsformen. Denne artikel præsenterer protokollen for en enkel og billig skabelon fabrikation metode, der ikke kræver EBL eller ion-stråle fræsning og er baseret på tæt pakning af nanosfærer til at danne en litografisk maske.

Nanosfære eller "naturlig" litografi, som først blev foreslået i 1982 af Deckman og Dunsmuir29,30, bruger selvsamling af monodisperse kolloid partikler, der spænder fra snesevis af nanometer til snesevis af mikrometer31, til at skabe skabeloner til overflademønstre via ætsning og / eller deposition af materialer. De todimensionale (2D) eller tredimensionelle (3D) udvidede periodiske arrays af kolloide partikler, kaldet kolloide krystaller, er kendetegnet ved en lys iriscence fra spredning og diffraktion32. Selvom denne maskeringsmetode er mindre udbredt end elektronstråle eller fotolitografi, er den enkel, billig og let skaleret ned for at skabe funktionsstørrelser under 100 nm.

At lede selvsamlingen af kolloide partikler bestemmer succesen med at bruge kolloide krystaller som masker til overflademønstre. Hvis partiklernes størrelse og form er homogene, kan kolloide partikler let samles selv med sekskantet pakning, drevet af entropisk udtømning33. Vandfordampning efter dråbebelægning er en effektiv vej til sediment af kolloide partiklerne, selv om andre metoder omfatter dip-coating34, spin coating35, elektrophoretic deposition36og konsolidering ved en luft-vand interface37. Nedenstående protokol er baseret på fordampningssedimenteringsmetoden, som var den enkleste at implementere. De trekantede interstices mellem tætpakkede polystyrenperler danner åbninger, hvor man kan plade et offermetal, danne stillinger(figur 2 og supplerende figur 1). Kort udglødning af perlerne, før dette trin justerer formen og diameteren af disse stillinger. Perlerne fjernes, et sidste metallag deponeres omkring stolperne, og derefter fjernes stolperne. Efter de to metalaflejringstrin på kolloid nanomaske, fjernelse af de mellemliggende stillinger og overfladekemimodifikation til passivering og tøjring er ZMW-arrays klar til brug til enkeltmolekylebilleddannelse. Mere omfattende karakterisering af ZMW optiske egenskaber efter fabrikation kan findes i en ledsagende artikel38. Udover en termisk fordamper til dampaflejring af metallerne kræves der ingen specialiserede værktøjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle trin kan udføres i generelt laboratorierum.

1. Rengøring af glasskår

  1. For at give en ren overflade til fordampningsaflejring af kolloidpartikler skal du placere 24 x 30 mm optiske borosilikatglasovertræk (0,16−0,19 mm tykkelse) i de rillede skær på en coplinglaspletter til rengøring.
    BEMÆRK: Sørg for, at overtræksskålerne står oprejst og er godt adskilte, så alle overflader er tydeligt eksponeret under rengøringsprocessen.
  2. Hæld nok acetone i farvningskrukken til at dække coverlips, placer dækslet på og sonicate i 10 minutter ved 40 °C.
  3. Hæld acetonen ud og skyl coverlips ved at fylde farvningskrukken med destilleret H2O og hælde vandet ud. Gentag 2 gange mere.
  4. Gentag acetone-sonikeringen (trin 1.2 og 1.3) igen.
  5. Hæld nok 200 mM KOH i krukken til at dække coverlips og sonikat, dækket, i 20 min ved 40 °C.
    BEMÆRK: KOH'en ætser glasset lidt.
  6. Dækslet skylles med destilleret H2O 6 gange.
  7. Der tilsættes ethanol til at dække overtræksklip, tilsæt låget og sonicate i 10 minutter ved 40 °C.
  8. Dækslet skylles med destilleret H2O 3 gange.
  9. Pick up hver coverslip på kanten ved hjælp af blide pincet og tør coverslips med N2 gas. Rør kun ved kanterne af coverlip. Placer hver af de tørrede, rensede coverslips i en individuel ren Petri parabol.

2. Fordampningsaflejring af polystyrenperler

  1. For at skabe den kolloide krystalmaske til ZMW-systemet skal der centrifuge 50 μL med en diameter på 1 μm, ikke-funktionaliserede polystyrenperler (2,5% w/v i vand) ved 15.000 x g, 25 °C i 5 min.
    BEMÆRK: Før perlerne pipetteres, skal stamopløsningen kortvarigt hvirvles, hvis perlerne er faldet til bunds i flasken.
  2. Kassér supernatanten, så der er så lidt vand tilbage som muligt.
    BEMÆRK: Restvand kan ændre fordampningsegenskaberne for ethanolrepensionen39, så fjernelse af en lille mængde perler for at fjerne alt vandet er acceptabelt.
  3. Resuspend perlerne fra trin 2.2 i 50 μL af 1:400 TritonX-100:ethanol solvent. Pipette op og ned flere gange for grundigt at blande perlerne med opløsningsmidlet.
    BEMÆRK: TritonX-100:Ethanolopløsningsmiddel skal forsegles med paraffinfilm efter brug og tilberedes frisk en gang om måneden. Perlerne har tendens til at klæbe til siderne af en plastbeholder, såsom et mikrocentrifugerør, så pipetter langs siderne for at sikre, at alle perler genbruges.
  4. For at oprette et fugtighedskammer til aflejring skal du placere 6 Petri-retter, hver med en coverlip, på en bænk i en linje med låg, der er lidt på klem. I hver skål skal du flytte coverlipet til det åbne område, så coverlips udsættes for miljøet, når fugtigheden øges i næste trin.
  5. Placer et hygrometer og en lille elektrisk ventilator centreret bag Petri retter.
  6. Registrer den begyndende relative luftfugtighed (RH) i laboratoriet. Fyld et 200 mL bægerglas med 150−200 mL ~75 °C vand og læg det bag ventilatoren.
  7. Tænd for ventilatoren og dæk petriskålene, ventilatoren, bægeret og hygrometeret med en væltet, gennemsigtig plastbeholder (66 cm x 46 cm x 38 cm).
  8. Lad RH i kammeret stige til 70−75%, hvilket typisk tager 5−10 min.
    BEMÆRK: Hvis det omgivende laboratorium RH er lavt (under ~ 50%), lad kammeret nå en højere RH, men ikke højere end 80%, for at kompensere for tab af fugtighed under deposition (se nedenfor).
  9. Når RH når 70-75%, skal du registrere RH og løfte plastbeholderen lidt for hurtigt at placere dæksler på petriskålene, hvilket forhindrer overbegæskning af dækslerne.
    BEMÆRK: Temperaturen i kammeret vil være lidt varmere end stuetemperatur, typisk 25−26 °C, som følge af befugtning. Hvis fugt er synlig på dækslet, så er glasoverfladerne for våde. En kommerciel handskeæske kan forenkle denne del af protokollen.
  10. Lad RH i kammeret fortsætte med at stige til 85%. På det tidspunkt registreres RH i fugtighedskammeret og pipetten 5 μL af perleaffjedringen på midten af hver coverlip.
  11. Luk kammeret og petriskålene efter hver aflejring for at minimere tab af fugtighed. Tilstræbe at afslutte alle 6 depositioner inden for 2 min.
  12. Registrer RH i kammeret efter depositionen.
    BEMÆRK: RH efter aflejring vil hjælpe med at måle, hvor hurtigt luftfugtigheden gik tabt under aflejring, hvilket afhænger af omgivende laboratorieforhold. For en typisk vellykket køre, vil kammeret starte ved 85% RH før deposition og ende på 70−75% RH efter deposition.
  13. Lad perledråberne spredes og tørre i 5 minutter.
    BEMÆRK: Hvis kolloidkrystallerne har mange huller eller flerlagsområder, var kammeret sandsynligvis for fugtigt eller tørt. Juster den relative luftfugtighed, hvor petriskålene skal lukkes, og begynd depositionerne (se resultatafsnittet for yderligere diskussion af optimering).

3. Perleglødning for at reducere porestørrelsen i den kolloide krystalskabelon

  1. For at give en ensartet temperaturoverflade til udglødning af polystyrenperlerne, som indsnævrer interperlen interstices og runder interstices hjørner, placere en flad, fræset aluminium plade oven på en standard keramisk kogeplade.
  2. Varmpladens temperatur indstilles til 107 °C, glasovergangstemperaturen for polystyren40.
    BEMÆRK: For at opnå stabil og præcis temperatur blev der holdt en termoelementsonde i et 2-3 mm bredt og 4-5 mm dybt hul i aluminiumspladen.
  3. Placer en coverlip indeholder perle skabelon på den varme aluminium plade og anneal i 20 s (se diskussionsafsnittet for forklaring af smeltetid).
  4. Efter opvarmning skal du fjerne coverlipet fra aluminiumspladen og straks placere det på en anden rumtemperatur aluminiumsoverflade for at afkøle den.
    BEMÆRK: Det er nyttigt enten at få coverlips hænge lidt over kanten af pladen eller mølle lavvandede kanaler (se den ledsagende video) i pladen for at lette afhentning af coverlips.

4. Nanofabrication af aluminium nul mode waveguides ved hjælp af kolloid krystal skabelon

  1. Ved hjælp af termisk eller elektronstråle fordampningsaflejring deponeres 300 nm kobber ved 2 Å/s over den kolloide krystalskabelon for at generere stolper i interstices mellem perlerne.
  2. Fjern overskydende metal oven på perlerne ved forsigtigt at trykke på overfladen med tape. Skræl langsomt båndet for at trække metallet af.
    BEMÆRK: Nogle små pletter af reflekterende overskydende metal kan forblive efter båndtræk, og disse kan ofte fjernes ved en strøm af N2 gas. Hvis der er væsentlige pletter af reflekterende overskydende metal tilbage efter båndtræk, kan du prøve at gennembløde skabelonerne i toluen i 2 timer for delvist at opløse polystyrenperlerne. Vask coverlips med destilleret vand, tør med N2, og gentag tape trække. Den ekstra blød bør ikke helt opløse perlerne, da perlerne hjælper med at beskytte stolperne mod skader under båndtræk.
  3. For at opløse polystyrenperlerne skal du placere perleskabelonerne i toluen og suge natten over.
    ADVARSEL: Toluendampe kan være giftige. Arbejd med toluen under en godt ventileret hætte og brug personlige værnemidler, herunder handsker, sikkerhedsbriller og en laboratoriekittel. Toluen skal opbevares i ventilerede skabe, der er beregnet til brændbare væsker.
  4. Efter toluen inkubationen skylles skabelonerne en gang med kloroform og to gange med ethanol. Håndtag coverslips omhyggeligt på dette punkt, fordi den sarte 200−300 nm høje metal stillinger er nu udsat. Tør skabelonerne med N2 og fjern restpolymer og forurenende stoffer i en iltplasmarens i 30 minutter.
    ADVARSEL: Kloroformdampe kan være giftige. Arbejd med kloroform under en godt ventileret hætte og brug personlige værnemidler, herunder handsker, sikkerhedsbriller og en laboratoriekittel. Kloroform skal opbevares i ventilerede skabe væk fra andre brændbare opløsningsmidler.
  5. Ved hjælp af termisk eller elektronstråle fordampningsaflejring deponeres 3 nm af et titanium vedhæftningslag ved 1 Å/s efterfulgt af 100−150 nm aluminium ved 4 Å/s rundt og oven på kobberpælene.
    BEMÆRK: Man kan bruge tykkere beklædning til at opnå dybere vejledninger og bedre dæmpning af baggrundslyst, men dette reducerer også udbyttet efter at have udsat og opløst indlæggene i næste trin (se diskussionsafsnittet).
  6. For at opløse metalstolperne lægges dækslerne i kobberetikschant (citronsyrebaseret; Tabel over materialer) til 2 timer.
    ADVARSEL: Metaletikt kan forårsage hudforbrændinger. Arbejd med etchants under en godt ventileret hætte og brug beskyttelsesudstyr. Vask hænderne grundigt efter håndtering. Metalechant skal opbevares i ventilerede skabe, der er beregnet til ætsende væsker.
  7. Skyl coverlips med destilleret vand, tør med N2, og forsigtigt buff overfladen af metalbeklædning med linse papir til at afsløre eventuelle stillinger, der stadig er dækket af beklædning. Placer coverslips tilbage i kobber etchant i yderligere 2 timer, derefter skylles igen med destilleret vand og tør med N2.
    BEMÆRK: ZMW-lysbilleder skal opbevares i overdækkede, rene petriskåle for at holde dem fri for forurenende stoffer.

5. Nanofabrication af guld nul mode waveguides ved hjælp af kolloid krystal skabelon

BEMÆRK: Metoden til fremstilling af guld-Z BMW'er (Supplerende figur 1), som afspejler protokollen til fremstilling af aluminiumS-Z BMW'er, findes i dette afsnit.

  1. Ved hjælp af termisk eller elektronstråle fordampningsaflejring deponeres 3 nm af et titanium vedhæftningslag ved 1 Å/s efterfulgt af 300 nm aluminium ved 4 Å/s.
  2. Fjern overskydende metal oven på perlerne ved forsigtigt at trykke på overfladen med tape. Skræl langsomt båndet for at trække metallet af.
  3. For at opløse polystyrenperlerne skal du placere perleskabelonerne i toluen og suge natten over.
  4. Efter toluen inkubationen skylles skabelonerne en gang med kloroform og to gange med ethanol. Tør skabelonerne med N2 og fjern resterende polymerforurenende stoffer i en iltplasmarens i 30 minutter.
  5. Brug termisk eller elektronstråle fordampningsaflejring, depositum 100−150 nm guld ved 5 Å/s rundt og oven på aluminiumspælene.
  6. For at opløse metalstolperne skal du suge dækslet i aluminiumsetchant (fosforsyrebaseret; Tabel over materialer) i 1 time.
  7. Skyl coverlips med destilleret vand, tør med N2, og forsigtigt buff overfladen af metalbeklædning med linse papir til at afsløre eventuelle stillinger, der stadig er dækket af beklædning. Placer coverslips tilbage i aluminium etchant i 1 time, derefter skylles igen med destilleret vand og tør med N2.
    BEMÆRK: ZMW-lysbilleder skal opbevares i overdækkede, rene petriskåle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Polystyrenkolloidpartiklernes selvmontering via fordampningssedimentering (trin 2.1−2.13) kan give en række resultater, da det kræver kontrol af fordampningshastigheden for opløsningsmidler. Men da depositionerne er hurtige (10-15 min pr. runde), kan proceduren hurtigt optimeres til forskellige omgivende laboratorieforhold. Figur 3A viser en velformet kolloid skabelon efter aflejring og fordampning. Makroskopisk er området af perler cirkulært med kanter, der er defineret af en uigennemsigtig, flerlagsring af perler. De gennemskinnelige, men ikke hvide områder i billedet er de ønskede monolayerområder. Figur 3B viser en kolloid skabelon, der var pakket i et alt for fugtigt miljø (80% RH, når petriskåle blev lukket). Disse skabeloner har en tendens til ikke at have en ren cirkulær grænse og har flerlags tendrils, der strækker sig udad. Aflejringen er acceptabel og kan bruges i efterfølgende faser, men hullerne i gitteret reducerer antallet af brugbare ZMW-arrayområder til enkeltmolekylebilleddannelse. Figur 3C viser en kolloid skabelon, der blev pakket i et alt for tørt miljø (65% RH, når petriskåle blev lukket). Disse skabeloner er normalt mindre i diameter sammenlignet med de ideelle, godt spredte skabeloner. Depositionen kan bruges, men de flerlags, hvide områder, som stribe indad, reducere området brugbare til billeddannelse. Således anbefaler vi ikke at udføre mere end 6 depositioner ad gangen, da depositioner mod slutningen af processen vil forekomme ved en lavere luftfugtighed, når kammeret åbnes og lukkes. Figur 3D viser regnbuemønsteret produceret ved diffraktion af reflekteret lys fra polystyrenkrystallen. Dette mønster kan bruges til at bekræfte succes og kvalitet af krystal pakning med øjet. Figur 3E,F viser atomare kraftmikroskopibilleder (AFM) af velpakkede kolloide skabeloner. Defekterne mellem korn opstår ved fastklemning under fordampningssedimentet41, og forskellige korn kan ses med et 10x mål. Således kan undersøgelse af kolloidaflejringerne med et laveffektlysmikroskop også bruges til at vurdere pakning.

Efter aflejring af kobber på de udglødede kolloide skabeloner (trin 4.1) skal regnbuediffraktionsmønsteret stadig være synligt og forstærket af den reflekterende metalbelægning toppen af perlerne (Figur 4A, B). Skabelonerne mister det reflekterende regnbue diffraktionsmønster efter scotch tape pull (trin 4.2), der fjerner overskydende kobber (Figur 4C). Figur 4D,E viser AFM billeder af et typisk felt af kobber stillinger efter metal deposition. Fejlene i mellem de kolloide krystalkorn i figur 3E er synlige i kobberpostbillederne som større områder af kobber. Analyse af AFM-billeder viser, at for en kobberaflejringstykkelse på 300 nm er de endelige kobberpæle i gennemsnit 255 nm (Figur 4F) i højden og 121 nm i diameter (Figur 4G).

Aflejring af aluminium beklædning (trin 4,5), hvor perlerne var, og på toppen af kobber stillinger, og efterfølgende opløsning af stillinger (trin 4,6 og 4,7) resultere i aluminium ZMWs vist i figur 5A−C. Defekter mellem de kolloide krystalkorn er synlige som større åbninger(Figur 5B). Den gennemsnitlige afstand mellem ZMW-centrene i figur 5C er 559 nm, i overensstemmelse med den afstand, der er fastsat af den sekskantede tætpakkegeometri for de 1 μm perler ( Equation 1 Brug af polystyrenskabeloner, der blev udglødet i 20 s, resulterer i bølgeledere, der i gennemsnit er 118 nm i diameter (Figur 5D, E), i overensstemmelse med indlægmete og tilstrækkeligt lille til at afskære formering af synligt lys. En højdeprofil af en waveguide fra Figur 5D viser også, at den er ~120 nm dyb.

Enkelt molekyle FRET blev udført i ZMWs at teste for funktionalitet (Figur 6A). Et typisk felt af Z BMW'er til billeddannelse er vist i figur 6B, som indeholder >3000 bølgeledere i et synsfelt på 40 x 80 μm. ZMWs blev først passiveret ved hjælp af protokoller beskrevet tidligere42,43. Kort, aluminium ZMWs blev passiveret med poly (vinylphosphonic syre) til pels aluminium beklædning efterfulgt af methoxy-afsluttet polyethylen glycol (PEG) oversået med biotin-afsluttet PEG til pels glasbundene af ZMWs. Guld ZMWs kan passivated med thiol-derivatized PEG at belægge guld beklædning efterfulgt af en lignende PEG behandling for glasbunden. Flowkamre, ~20 μL volumen, blev derefter konstrueret til enkeltmolekylebilleddannelse44. Enkelt molekyle FRET billeddannelse af DNA duplexes blev udført som beskrevet tidligere38. Kort, 100 pM−1 nM cyanin-3/cyanine-5 (Cy3/Cy5), biotinylerede DNA duplexes (33 base pair længde) blev inkuberet i 10 minutter i flow kanaler funktionaliseret med streptavidin (5 min inkubation, 0,5 mg / ml opløsning). Koncentrationen af mærkede makromolekyler kan titreres for at opnå ~ 20% belastning af waveguides med et molekyle, hvilket fører til <5% waveguides fyldt med mere end et molekyle, baseret på Poisson distribueret belastning (de fleste waveguides, ~ 75%, vil ikke have nogen molekyler)45. Ubundet DNA blev vasket væk med nukleasefri duplexbuffer efterfulgt af belysningsbuffer (0,3% [w/v] glukose, 300 μg/mL glucoseoxidase, 120 μg/mL katalase og 1,5 mM Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-chromane-2-carboxylicsyre]). Ikke-biotinylerede Cy5-mærkede DNA-duplexer (33 baseparlængde) var til stede i belysningsbufferen ved 0, 50, 100 og 500 nM som baggrundsfluorofer i opløsning. Enkelt molekyle FRET spor fra immobiliserede Cy3/Cy5 duplex DNA molekyler blev registreret med en specialbygget TIRF mikroskop justeret til epi-fluorescens betingelser. Film blev optaget med en 1,48 numerisk blænde (NA) 100x olie nedsænkning mål med vekslende 532 nm og 640 nm excitation (100 ms eksponering) og en dual view spektral splitter til at registrere Cy3 og Cy5 emission samtidig på en elektron-multiplikation opladning-koblet enhed (EMCCD) kamera. Enkeltmolekyle FRET-spor med enkelttrinsblegemidler i Cy5-kanalen kunne påvises ved alle koncentrationer af omgivende Cy5-testet(figur 6C−F). Til sammenligning ville enkelte molekyler kun kunne påvises i TIRF-belysning med pM til lav nM-opløsning fluorophorekoncentrationer46.

Figure 1
Figur 1: Skematisk over bølgeledere i nultilstand. Diagram over ZMW-matrix med udvidet tværsnitsdiagram over en enkelt ZMW til højre. Enkelt fluorescerende mærkede enzymer af interesse (brun ribosom med rød cirkel til at repræsentere fluorescerende farvestof) kemisk immobiliseret (via mRNA i dette eksempel) til glasbunden af ZMWs (typisk funktionaliseret med biotinyleret-PEG) kan afbildes med en typisk laserbaseret epifluorescensmikroskopiopsætning. 532 nm excitationslyset (grønne pile) reflekteres ved glasmetalgrænsen på grund af blændens lille størrelse (100-200 nm diameter), men en ikke-formerende evanescentbølge, der henfalder eksponentielt i intensitet, er til stede inden for ZMW. Dette resulterer i en 10-30 nm effektiv belysningsdybde (grøn skygge i blænde). Der tilsættes individuelle fluorescerende ligands (blå tRNA'er med grønne cirkler som fluorescerende tags) ved nM til μM-koncentrationer. En individuel ligand, der diffunderer ind i blænden og interagerer med enzymet, afbildes uden uoverkommelig baggrundsfluorescens. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk af kolloid templating metode udviklet til at fremstille aluminium ZMW arrays. Polystyrenperler med en diameter på 1 μm deponeres og samles selv på en renset glasovertræksdåse som beskrevet i protokollens punkt 2. Perler er derefter udglødet for at reducere pore størrelser (afsnit 3), efterfulgt af kobber deposition og perle opløsning i toluen. Aluminium deponeres rundt og oven på kobberstolperne, som derefter selektivt ætses væk for at efterlade et sekskantet udvalg af nanoapertures (afsnit 4). For de sidste tre trin, er tværsnit synspunkter til højre for planen synspunkter for at vise bredder og højder af kobber stillinger og aluminium ZMWs. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative resultater af fordampningsdeposition af kolloider. (A) Eksempel på optimal colloid deposition. (B) Eksempel på en acceptabel kolloid deposition, hvor forholdene var mere fugtige (80% RH) end ideelle. Huller i krystalmonomeren er synlige. (C) Eksempel på en acceptabel kolloid deposition, hvor forholdene var tørrere (65% RH) end optimale. Monolayerregionerne er lidt gennemskinnelige, mens flerlagsområder er hvide og uigennemsigtige (omkreds og striber indad). (D) En kolloid krystal belyst med hvidt lys for at fremhæve regnbuen diffraktion fra krystaller. (E) AFM-billede (tappe sonde AFM i luften) af et monolag af sekskantet emballerede polystyrenperler fra en vellykket kolloidaflejring (skalastang = 10 μm). (F) Udvidet AFM-billede af pakkede perler (skalastang = 2 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Makroskopiske og mikroskopiske billeder af ZMW-skabeloner efter kobberaflejring. (A) Billede af lysbilleder efter fysisk fordampning af kobber oven på perleskabelonerne. (B) Rainbow diffraktion mønster fra perle skabeloner efter kobber deposition. (C) Billede af en skabelon (til højre) efter et bånd trække for at fjerne overskydende kobber og båndet (venstre). D) AFM-billede af kobberpæle efter båndtræk og fuldstændig opløsning af polystyrenperlerne (skalastang = 5 μm). (E) Højere forstørrelse AFM billede af panel D (skala bar = 2 μm). (F) Histogram af kobber post højder (defineret som maksimal højdemåling inden for hver post), n = 534. (G) Histogram af kobber post Feret diametre, n = 201. Feretdiameteren er den maksimale afstand mellem to parallelle linjer tangent til stolpens grænse (kvantificeret i ImageJ47). For at identificere partikler til analyse blev der anvendt en tærskel halvvejs mellem toppen af beklædningen og den nederste glasoverflade. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Makroskopiske og mikroskopiske billeder af aluminiums-ZMWs. (A) Billede af lysbilleder efter fysisk fordampningsaflejring af 150 nm aluminium rundt og oven på kobberstolperne. (B) AFM billede af aluminium ZMWs efter post opløsning (skala bar = 5 μm). (C) Højere forstørrelsesbillede af panel B (skalalinje = 0,2 μm). (D) Typisk dybdeprofil for en individuel ZMW fra panel C. Profil taget fra den grønne linje trukket i panel C. (E) Histogram af ZMW Feret diametre, n = 240. Feretdiametre blev målt som i figur 4. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Enkelt molekyle FRET billeddannelse i ZMWs. (A) Skematisk (ikke at skalere) af enkelt molekyle FRET billeddannelse af Cy3, Cy5-mærket DNA duplexes i ZMWs med Cy5 mærket duplexes i baggrunden. (B) Eksempelfelt for Z BMW'er under hvidt lys (skalastang = 10 μm). (C−F) Enkelt molekyle FRET optagelser af DNA duplexer immobiliseret i ZMWs i overværelse af 0 (C), 50 (D), 100 (E), og 500 nM (F) Cy5-mærket duplexes i opløsning. For hver koncentration viser toppanelet Cy3 (grøn) og Cy5 (rød) fluorescensintensitet under 532 nm laserbelysning (FRET-billeddannelse), midterpanelet viser Cy5-fluorescensintensiteten under 640 nm laserbelysning (direkte acceptorudsendelse), og det laveste panel viser FRET-effektiviteten ( Equation 2 ) beregnet ud fra de rå Cy3 ( ID) og Cy5 (IA) fluorescensintensiteter. Under billeddannelse skiftede excitationsbølgelængden mellem 532 og 640 nm hver 100 ms. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Skematisk af kolloid templating metode udviklet til at fremstille guld ZMW array. Protokol til fremstilling af guld ZMW array svarer til protokol til at fremstille aluminium ZMW array (Figur 2). I stedet for at deponere kobber oven på polystyrenperlerne, deponeres aluminium. Efter opløsning af perlerne i toluen deponeres guld i stedet for aluminium oven på stolperne. Aluminium stillinger er derefter selektivt ætset til at efterlade guld ZMW array. For de sidste tre trin, er tværsnit synspunkter til højre for planen synspunkter for at vise bredder og højder af aluminium stillinger og guld ZMWs. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Finite element modellering af elektromagnetisk felt formering i ZMWs. (A−D) Tværsnit af størrelsen af den tidsgennemsniterede Poynting-vektor (W/m2)gennem en waveguide lavet af en ikke-annealed skabelon (A,C) og en udglødet skabelon (B,D). Lineært polariserede elektromagnetiske planbølger (1 W fordelt over diasområdet) ved de bølgelængder, der er anført i figuren (400 nm eller 1.000 nm), blev projiceret op på bundoverfladen, og den laveste (grundlæggende) tilstand, som har det laveste bølgenummer, blev beregnet ved hjælp af modelleringssoftware (Tabel over materialer) med den begrænsede elementmetode til løsning af Maxwells ligninger og passende grænseforhold. Grænserne for bølgeguiderne blev antaget at være perfekte elektriske ledere, som er godt tilnærmet af aluminium eller guldvægge. Tværsnit fra den ikke-annede waveguide-skabelon blev bestemt af den sekskantede pakning af cirkler med en diameter på 1 μ m, og de tretakkede spidser fra den resulterende trekantede form blev klippet til ~ 60 nm bredde for at modellere en realistisk fysisk blænde. Tværsnit fra de udglødede skabeloner blev tilnærmet som en cirkel 130 nm i diameter. Begge waveguides havde en 130 nm dybde, svarende til beklædning dybde efter fabrikation. (E,F) Ud over excitationsbølgelængder på 400 nm og 1.000 nm blev modellerne løst ved 100 excitationsbølgelængder jævnt fordelt mellem 400 nm og 1.000 nm, og det effektive tilstandsindeks (defineret som Equation 3 , hvor kz er bølgetallet i bølgeguiden, som reduceres på grund af begrænsning i det tværgående plan, og k er excitationslysbølgetallet i vakuum) blev afbildet mod excitationsbølgelængde for trekantede (E) og cirkulære (F) bølgeledere. For kortere bølgelængder er højere tilstande ophidsede, og det effektive tilstandsindeks øges (max effektivt tilstandsindeks er 1, hvilket er det begrænsende tilfælde, hvor den elektromagnetiske planbølge bevæger sig ubegrænset i den tværgående dimension). De effektive bølgelængder af bølgeguiderne blev anslået som bølgelængden, hvor det effektive tilstandsindeks falder til 0. Bemærk, at den cirkulære vejledning λcutoff = 221 nm fra finite element modellering (F) er i overensstemmelse med den teoretiske forudsigelse af en cirkulær bølgeguide's cutoff bølgelængde (λcutoff,analytical = 1,7d = 221 nm, hvor d er waveguide diameter). Klik her for at hente denne fil.

Supplerende figur 3: Repræsentative resultater fra Au ZMW-fabrikation. (A) Makroskopisk billede af guld ZMW arrays. (B−D) AFM billeder af aluminium stillinger fra en perle skabelon, der ikke var udglødet (B), en skabelon, der blev udglødet ved 107 °C for 20 s (C), og en skabelon, der blev udglødet ved 107 ° C for 25 s (D). (E) AFM billede af guld ZMWs efter opløsning af aluminium stillinger. (F) Højere forstørrelse AFM billede af panel E. (G) Typisk dybdeprofil af en guld ZMW. Profil taget fra den grønne linje, der trækkes i panel F (skalastang = 1 μm i B, C, Dog F; 5 μm i E). Klik her for at hente denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til kolloid selvmontering (protokol afsnit 2) fremskynder brugen af ethanol i stedet for vand, da ophængningsopløsningsmidlet fremskynder fordampningsprocessen, så skabeloner er klar i 2−3 minutter efter aflejring i stedet for 1−2 timer som i tidligere metoder48,49. Den fordampningssedisationsprotokol, der præsenteresher,er også enklere end tidligere sedimenteringsprotokoller, der kræver kontrol af overfladehældning, temperatur og luftvolumen over suspensionen49,50,51. Partikelvolumenfraktionen, der anvendes i denne protokol, er 2,4%, højere end de 0,2−0,5%, der blev anvendt i tidligere sedimenteringsmetoder48, som genophældte kolloider i vandglycerolblandinger i meget længere afregningstidsskalaer. Kvaliteten af depositionerne er imidlertid robust over for ændringer i partikelvolumenfraktionen, hvor tidligere undersøgelser viser, at den kan varieres mellem 2−10%49,50,51. Kornstørrelserne af kolloidkrystaller opnået i en vellykket deposition fra denne protokol er 20−30 μm på tværs, større end korn fra tidligere sedimenteringsmetoder (typisk flere hundrede nanometer på tværs)48,49. Makroskopisk kan de ca. 2 cm i diameterområder af kolloid monolayer også sammenlignes med de 1 cm områder, der er produceret ved tidligere metoder49. Den store størrelse af de kolloide krystalskabeloner, der produceres i denne metode, gør det også muligt at lave 3-5 adskilte flowkamre44, hver ca. 3-4 mm brede, på hvert ZMW-dias. Således kan flere uafhængige enkeltmolekyle eksperimenter udføres på hvert dias.

Annealing af de kolloidale perleskabeloner (protokolafsnit 3) efter selvmontering er et simpelt, men afgørende skridt for tilstrækkelig reduktion af baggrundsfluorescens med ZMWs. Som supplerende figur 2 viser, er den effektive cutoff bølgelængde for en waveguide med det trekantede tværsnit fra en uannealed skabelon 894 nm. Til sammenligning er den effektive bølgelængde med en cirkulær bølgeguide med en diameter på 130 nm fra en udglødet skabelon 221 nm, som bestemmes både analytisk (1,7 gange diameteren af føringen18) og numerisk. Brug af mindre perler til deposition kunne også reducere størrelsen af skabelon porerne, men waveguides ville derefter være fordelt tættere end 200 nm, hvilket er omkring diffraktion grænse for synligt lys. Desuden vil bølgeguiderne forblive trekantede i tværsnit, hvilket fører til ikke-asymmetrisk kraftudbredelse gennem bølgeguiden (Supplerende figur 2A−D). En ulempe ved udglødningstrinnet er, at variation i smeltetiden kan introducere udsving i waveguide diameter, så nøjagtig timing hjælper med at minimere variation mellem partier. Interstices begynder at lukke ved udglødning gange længere end 25 s, og postdiametre ikke falder meget mellem 20−25 s (Supplerende figur 3B−D). En hurtig test for interstice lukning er at kontrollere, om udglødet skabeloner stadig producere en regnbue diffraktion mønster, når belyst med lys og set i en vinkel. Hvis ikke, de fleste interstices sandsynligvis har lukket. Forholdet mellem udglødningstid og typiske porediametre er blevet præsenteret tidligere38.

Efter at have opnået den ønskede porestørrelse under udglødningstrinnet deponeres kobber (trin 4.1) på skabelonerne for at skabe en skygge af masken. Det er vigtigt at bruge synslinje deposition, med metal nærmer skabelonen så vinkelret som muligt. Således vil en forøgelse af afstanden mellem prøven og metalkilden samt sikring af, at pladen med skabelonerne ikke roterer, som det automatisk sker i nogle dampaflejringsmaskiner, hjælpe med at minimere sideværts deposition af metal på polystyrenundersubstratet. Men nogle laterale deposition er uundgåelig, hvilket reducerer størrelsen af det interstitielle hul og dermed post tværsnit som mere metal deponeres52. Dette resulterer i pyramideformede metalstolper snarere end prismelignende strukturer52.

Fordi kobber stillinger er sandsynligvis pyramideformede snarere end prisme formet, aluminium deposition (trin 4,5) på toppen af stolperne dækker også nogle af de skrå sider, blokerer tilgængeligheden af kobber etchant for nogle af de stillinger. Således linsen papir polering skridt (trin 4,7 eller 5,7) blev tilføjet efter den første blød i etchant til mekanisk forstyrre enhver kobber stillinger stadig er dækket af aluminium. Deponering af mere kobber for at skabe højere stillinger gør også stillinger mere modtagelige for mekaniske forstyrrelser under linsen papir polering. Der bør dog ikke deponeres mere end 500 nm kobber, da målet med deposition er at projicere det interstitielle hul ved 500 nm midterlinjen af 1 μm perlerne.

En anden potentiel vanskelighed er utilsigtet fjernelse af aluminium beklædning under linsen papir polering (trin 4,7 eller 5,7). Det blev konstateret, at tab af aluminium beklædning under polering blev hyppigere efter udglødning skridt blev tilføjet, sandsynligvis på grund af øget polystyren rester, som kan forstyrre aluminium overholdelse af glas (protokol afsnit 3). Natten over toluen blød (trin 4.3 eller 5.3) efter tape pull løst dette problem. I AFM billedet i Figur 4E, nogle resterende ringe af polystyren kan ses mellem stolperne, men aluminium beklædning stadig modstået flere buffs i trin 4.7. Hvis tab af aluminiumsbeklædningen forbliver et problem efter natten over toluen blød, kan der tilsættes en RCA-1 (standard clean-1) vask, piranha vask eller yderligere iltplasmarensning til trin 4.4 eller 5.4. Disse vasketrin kan også tilføjes efter det sidste ætsetrin (trin 4.7 eller 5.7) og før passivering for yderligere at rengøre ZMWs.

ZMWs' ydeevne i enkeltmolekyle FRET-eksperimenter svarede til ZMWs fremstillet med EBL. I en tidligere undersøgelsevar 53, der udførte enkeltmolekyle FRET på Cy3 mærket enkeltstrenget DNA med Cy5-mærket DNA-helicase loaderprotein i opløsning (det samme donoracacacatorarrangement som i figur 6A), FRET-hændelser tydeligt synlige ved 100 nM Cy5-baggrund, mindre klare (lavere acceptorspor til støj) ved 1 μM og ikke mærkbare ved 10 μM. Vi bemærker, at en tidligere undersøgelse med kommercielle Z BMW'er rapporterede enkeltmolekyle FRET acceptor signaler ved baggrundskoncentrationer så højt som 1 mM54, højere end vi og andre tidligere undersøgelser42,53 med in-house fabrikerede ZMWs har opnået. Yderligere diskussion af signal-til-baggrund ydeevne blandt ZMWs er givet i Jamiolkowski et al.38. Ikke-specifik interaktion mellem fluorescerende prøve og ZMW-overfladerne53 er en almindelig udfordring, der begrænser adgangen til højere koncentrationer, især hvis de spredende fluorescerende arter i opløsning er et stort makromolekyle. Undersøgelser med Z BMW'er på komplekse biokemiske systemer såsom oversættelse har typisk begrænset koncentrationer af frie fluorescerende substrater til 100−250 nM55,56,57,58. Uanset den påtænkte anvendelse af Z BMW'erne vil optimering af passiveringsmetoder for forskellige systemer sandsynligvis være nødvendig for at opretholde et acceptabelt signal til støj ved høje koncentrationer.

Samlet set kræver den metode, der præsenteres her, ingen specialiserede færdigheder eller udstyr, tillader parallel fremstilling af mange skabeloner på én gang og kan tilpasses til at fremstille Z BMW'er i forskellige metaller. I dette arbejde blev kobber og aluminium erstattet med henholdsvis aluminium og guld for at fremstille guld-Z BMW'er (Supplerende figur 3). Dette er fordelagtigt for laboratorier, der bruger passivering metoder af guld i stedet for aluminium. Derudover har guld Z BMW'er vist sig at øge emissionen for fluorophorer, der absorberer i den røde region af det synlige spektrum, mens aluminium ZMWs øge emissionen for fluorophores, der absorberer i den grønne region59. I fremtiden kan lysstofrørsintensiteten fra ZMWs fremstillet med denne metode forbedres ved ætsning i glasset under ZMW-metalbeklædningen ved hjælp af HF16,26,60. Dette bringer de immobiliserede biomolekyler længere væk fra metalvæggene, som kan slukke fluorophores61. Desuden er der et maksimum i excitation belysning intensitet under indgangen til blænden, og dette er blevet udnyttet tidligere til at øge enkelt molekyle emission26,60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R01GM080376, R35GM118139, og NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 til Y.E.G., og af en NIAID præ-ph.d.-stipendiat NRSA stipendium F30AI114187 til R.M.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. Electromagnetism. , Addison-Wesley. Boston, MA. (2002).
  19. Jackson, J. D. Classical electrodynamics. Third edition. , Wiley. New York, NY. (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Tags

Bioengineering Problem 159 nul-tilstand waveguides nano-blænde enkelt molekyle fluorescens nanosfære litografi kolloid krystal selvmontering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

Fremstilling af Zero Mode Waveguides for høj koncentration enkelt molekyle mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M.,… More

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter