Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור של מגלי גל במצב אפס למיקרוסקופיה של מולקולה בודדת בריכוז גבוה

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61154
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

ERRATUM NOTICE

Summary

מתואר כאן שיטת ליטוגרפיה ננוספירה לייצור מקביל של מגלי גל במצב אפס, שהם מערכים של ננו-פטרטורים במיקרוסקופיה זכוכית מצופה מתכת עבור הדמיית מולקולה בודדת בריכוזים ננו-למיקרומולרים של פלואורופורים. השיטה מנצלת את ההרכבה העצמית של הגביש הקולואידי כדי ליצור תבנית מגיד גל.

Abstract

באנזימולוגיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת, פלואורסצנטיות רקע ממצעים מסומנים בתמיסה מגבילה לעתים קרובות את ריכוז הפלורופורים לטווחי פיקו לננומולרים, מספר סדרי גודל פחות מריכוזי ליגנד פיזיולוגיים רבים. ננו-מבנים אופטיים הנקראים מגלי גל במצב אפס (ZMWs), שהם 100−200 ננומטר קוטר צמצמים מפוברקים במתכת מוליכת דקה כגון אלומיניום או זהב, מאפשרים הדמיה של מולקולות בודדות בריכוזים מיקרומולקוליים של פלואורופורים על ידי ההסתה של קטע אור גלוי לנפחים יעילים של זפטוליטר. עם זאת, הצורך בציוד ננו-פיבריות יקר ומתמחה מנע את השימוש הנרחב ב- ZMWs. בדרך כלל, ננו- מבנים כגון ZMWs מתקבלים באמצעות כתיבה ישירה באמצעות ליטוגרפיה של קרן אלקטרונים, שהיא רציפה ואיטית. כאן, קולואידית, או ננוספירה, ליטוגרפיה משמשת כאסטרטגיה חלופית ליצירת מסכות בקנה מידה ננומטר לייצור מדריך גל. דו"ח זה מתאר את הגישה בפירוט, עם שיקולים מעשיים לכל שלב. השיטה מאפשרת אלפי ZMWs אלומיניום או זהב להיעשות במקביל, עם קטרי מדריך גל סופי ומעמקים של 100−200 ננומטר. רק ציוד מעבדה משותף ומאייד תרמי לתצהיר מתכת נדרשים. על ידי הפיכת ZMWs נגיש יותר לקהילה הביוכימית, שיטה זו יכולה להקל על המחקר של תהליכים מולקולריים בריכוזים ובשיעורים הסלולריים.

Introduction

טכניקות של מולקולה אחת כגון העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) או ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של מולקולה אחת (FCS) הן כלים רבי עוצמה לביופיזיקה מולקולרית, המאפשרת לחקור תנועות דינמיות, קונפורמציות ואינטראקציות של ביומולקולות בודדות בתהליכים כגון שעתוק1,2,3, תרגום4,5,6, ורבים אחרים7. עבור smFRET, מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות השתקפות פנימית כוללת (TIRF) היא שיטה נפוצה מכיוון שניתן לעקוב אחר מולקולות קשורות רבות לאורך זמן, והגל האוונסנטי שנוצר על ידי TIR מוגבל לאזור של 100−200 ננומטר הסמוך לכיסוי8. עם זאת, אפילו עם הגבלה זו על נפח עירור, פלואורופורים של עניין עדיין צריך להיות מדולל לטווחי pM או nM על מנת לזהות אותות מולקולה אחת מעל פלואורקנציה ברקע9. מאז קבועי מיכאליס-מאנטן של אנזימים תאיים הם בדרך כלל בטווח μM כדי mM10, תגובות ביוכימיות במחקרים מולקולה אחת הם בדרך כלל הרבה יותר איטי מאשר אלה בתא. לדוגמה, סינתזת חלבונים מתרחשת ב 15−20 חומצות אמינו לשנייה ב E. coli11,12, בעוד רוב ריבוזומים פרוקריוטים בניסויי smFRET לתרגם ב 0.1−1 חומצת אמינו לשנייה13. בסינתזת חלבונים, מבני קריסטל ו- smFRET על ריבוזומים תקועים הראו כי העברת RNAs (tRNAs) משתנה בין מצבים 'היברידיים' ו'קלאסיים ' לפני שלב טרנסלוקיציה tRNA-mRNA14,15. עם זאת, כאשר ריכוזים פיזיולוגיים של גורם GTPase טרנסלוקציה, EF-G, היה נוכח, קונפורמציה שונה, ביניים בין המצבים ההיברידיים והקלאסיים, נצפתה smFRET6. חשוב ללמוד תהליכים מולקולריים דינמיים בקצבים ובריכוזים דומים לאלה שבתא, אך נותר אתגר טכני.

אסטרטגיה להגברת ריכוז המצע הפלואורסצנטי היא שימוש בצמצמי אורך גל תת-גלויים מבוססי מתכת, הנקראים מגלי גל במצב אפס (ZMWs), כדי ליצור שדות עירור מוגבלים שמרגשים באופן סלקטיבי ביומולקולים המותאמים לצמחיםבצמצמים 16 (איור 1). הצמצמים הם בדרך כלל 100−200 ננומטר קוטר ו 100−150 ננומטר בעומק17. מעל אורך גל מנותק הקשור לגודל ולצורה של הבארות (λc ≈ פי 2.3 מהקוטר של מגלי גל עגולים עם מים כמדיוםדיאלקטרי 18), אין מצבי הפצה במנזר הגל, ומכאן המונח מגלי גל במצב אפס. עם זאת, שדה אלקטרומגנטי מתנדנד, המכונה גל אוונסנטי, מתפורר באופן אקספוננציאלי בעוצמה עדיין מנהרות מרחק קצר אל מנגוו הגל18,19. למרות שדומה לגלים האוונסטנטים של TIR, לגלים האוונסטנטים של ZMW יש קבוע ריקבון קצר יותר, וכתוצאה מכך אזור עירור יעיל של 10−30 ננומטר בתוך מרוץ הגל. בריכוזים מיקרומולרים של ליגנדים בעלי תווית פלואורסצנטית, רק מולקולה אחת או כמה נמצאות בו זמנית בתוך אזור העירור. הגבלה זו של נפח העירור וכתוצאה מכך הפחתה של פלואורסצנטיות רקע מאפשרת הדמיית פלואורסצנטיות של מולקולות בודדות בריכוזים רלוונטיים ביולוגית. זה יושם על מערכות רבות20, כולל מדידות FCS של דיפוזיה חלבון יחיד21, מדידות FRET מולקולה אחת של חלבון ליגנדזיקה נמוכה 22 וחלבון-חלבון אינטראקציות23, ומדידות ספקטרו-אלקטרוכימיות של אירועי מחזור מולקולרי יחיד24.

ZMWs יוצרו על ידי דפוס ישיר של שכבת מתכת באמצעות כרסום קרן יון25,26 או ליטוגרפיה קרן אלקטרונים (EBL) ואחריו תחריט פלזמה16,27. שיטות ליטוגרפיה נטולות מסכות אלה יוצרות מגלי גל בסדרה ובדרך כלל דורשות גישה למתקני ננו-פיבריות מיוחדים, ומונעות אימוץ נרחב של טכנולוגיית ZMW. שיטה נוספת, הרמת ליטוגרפיה ננו-הדפסה אולטרה סגולה28, משתמשת בתבנית שקופית קוורץ כדי ללחוץ על תבנית ZMW הפוכה על סרט התנגדות כמו בול. בעוד שיטה זו היא יעילה יותר, זה עדיין דורש EBL לייצור של עובש קוורץ. מאמר זה מציג את הפרוטוקול עבור שיטת ייצור תבנית פשוטה וזולה שאינה דורשת כרסום EBL או קרן יונים ומבוססת על אריזה קרובה של ננוספירות ליצירת מסכה ליטוגרפית.

ננוספירה או ליטוגרפיה "טבעית", שהוצעה לראשונה בשנת 1982 על ידי דקמן ודנסמויר29,30, משתמשת בהרכבה עצמית של חלקיקים קולואידיים חד-דיספרזה, החל מעשרות ננומטרים ועד עשרות מיקרומטרים31, כדי ליצור תבניות לדפוס פני השטח באמצעות תחריט ו / או תצהיר של חומרים. מערכים תקופתיים דו-ממדיים (2D) או תלת-ממדיים (3D) של חלקיקים קולואידיים, המכונים גבישים קולואידיים, מאופיינים בססגוניות בהירה מפיזור ועקיפה32. למרות שנעשה שימוש נרחב פחות מקרן אלקטרונים או פוטוליתוגרפיה, מתודולוגיית מיסוך זו היא פשוטה, בעלות נמוכה, ומצטמצמת בקלות כדי ליצור גדלי תכונות מתחת ל- 100 ננומטר.

מכוון ההרכבה העצמית של חלקיקים קולואידיים קובע את ההצלחה של שימוש בגבישים קולואידיים כמסכות לדפוס פני השטח. אם הגודל והצורה של חלקיקים הם הומוגניים, חלקיקים קולואידיים יכולים להיות מורכבים בקלות עם אריזה משושה, מונע על ידי דלדול אנטרופי33. אידוי מים לאחר ציפוי טיפה הוא מסלול יעיל למשקע חלקיקי הקולואידים, אם כי שיטות אחרות כוללות ציפוימטבל 34, ציפוי ספין35, תצהיר אלקטרופורטי36, ואיחוד בממשק מי אוויר37. הפרוטוקול המוצג להלן מבוסס על שיטת משקעים אידוי, אשר היה הפשוט ביותר ליישם. האינטרסטיקים המשולשים בין חרוזי פוליסטירן ארוזים היטב יוצרים פתחים שבהם ניתן לטלטל מתכת הקרבה, ויוצרים עמדות(איור 2 ואיור משלים 1). חישול קצר של החרוזים לפני שלב זה מתאים את הצורה ואת הקוטר של פוסטים אלה. החרוזים מוסרים, שכבת מתכת סופית מופקדה סביב העמודים, ואז הפוסטים מוסרים. לאחר שני צעדי התצהיר המתכתיים אל ננו-מסכת הננו-מולקולה הקולואידית, הסרת עמדות הביניים ושינוי הכימיה על פני השטח עבור פסיבציה וקשירה, מערכי ZMW מוכנים לשימוש להדמיית מולקולה אחת. אפיון נרחב יותר של המאפיינים האופטיים ZMW לאחר ייצור ניתן למצוא במאמר נלווה38. מלבד מאייד תרמי לתצהיר אדים של המתכות, אין צורך בכלים מיוחדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: ניתן להשלים את כל השלבים בשטח המעבדה הכללי.

1. ניקוי כיסוי זכוכית

  1. כדי לספק משטח נקי לתצהיר אידוי של חלקיקים קולואידיים, מניחים כיסויי זכוכית בורוסיליקט אופטיים 24 x 30 מ"מ (0.16−0.19 מ"מ) בתוך התוספות המחורצות של צנצנת ויטראז'ים של זכוכית קופלין לניקוי.
    הערה: ודאו שהכיסויים עומדים זקופים ומופרדים היטב כך שכל המשטחים נחשפים בבירור במהלך תהליך הניקוי.
  2. יוצקים מספיק אצטון בצנצנת הכתמים כדי לכסות את כיסויים, מניחים את הכיסוי על, sonicate במשך 10 דקות ב 40 °C (70 °F).
  3. יוצקים את האצטון ושוטפים את הכיסויים על ידי מילוי צנצנת הכתמים ב- H2O מזוקק ושפכים את המים. חזור על הפעולה פעמיים נוספות.
  4. חזור על sonication אצטון (שלבים 1.2 ו 1.3) שוב.
  5. יוצקים מספיק 200 mM KOH בצנצנת כדי לכסות את כיסויים sonicate, מכוסה, במשך 20 דקות ב 40 °C (70 °F).
    הערה: KOH מעט etches הזכוכית.
  6. יש לשטוף את כיסויי המכסים עם Hמזוקק 2O 6 פעמים.
  7. מוסיפים אתנול כדי לכסות את כיסויים, להוסיף את המכסה, sonicate במשך 10 דקות ב 40 °C (50 °F).
  8. יש לשטוף את כיסויי המכסים עם Hמזוקק 2O 3 פעמים.
  9. מרימים כל כיסוי בקצה בעזרת מלקחיים עדינים ומייבשים את הכיסויים בגז N2. גע רק בשולי כיסוי. מניחים כל אחד מהכיסויים המיובשים והמנקים בצלחת פטרי נקייה אישית.

2. תצהיר אידוי של חרוזי פוליסטירן

  1. כדי ליצור את מסכת הגביש הקולואידי עבור מערך ZMW, צנטריפוגה 50 μL של 1 מיקרומטר קוטר, חרוזי פוליסטירן לא פונקציונלי (2.5% w / v במים) ב 15,000 x גרם, 25 °C (5 דקות).
    הערה: לפני צנרת החרוזים, פתרון המלאי צריך להיות מערבולת לזמן קצר במקרה החרוזים התיישבו לתחתית הבקבוק.
  2. להשליך את supernatant, משאיר מעט מים שנותרו ככל האפשר.
    הערה: מים שיורית יכול לשנות את תכונות האידוי של resuspension אתנול39, כך הסרת כמות קטנה של חרוזים על מנת להסיר את כל המים מקובל.
  3. Resuspend החרוזים מן השלב 2.2 ב 50 μL של 1:400 TritonX-100:ממס אתנול. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים לערבב ביסודיות את החרוזים עם הממס.
    הערה: TritonX-100:ממס אתנול צריך להיות חתום עם סרט פרפין לאחר השימוש ומוכן טרי פעם בחודש. החרוזים נוטים לדבוק בצדדים של כלי פלסטיק, כגון צינור microcentrifuge, כך pipette לאורך הצדדים כדי להבטיח כי כל החרוזים הם resuspended.
  4. כדי להקים תא לחות לתצהיר, מניחים 6 מנות פטרי, כל אחת עם כיסוי אחד, על ספסל בשורה עם מכסים שנותרו מעט פתוחים. בכל מנה, מעבירים את הכיסויים לאזור הפתוח כך שהכיסויים חשופים לסביבה כאשר הלחות מוגברת בשלב הבא.
  5. מניחים הייגרומטר ומאוורר חשמלי קטן שבמרכזו מנות הפטרי.
  6. הקלט את הלחות היחסית ההתחלתית (RH) במעבדה. מלא 200 מל עם 150 −200 מל של ~ 75 מעלות צלזיוס מים ומניחים אותו מאחורי המאוורר.
  7. הפעל את המאוורר וכסה את מנות הפטרי, המאוורר, הכיס והיגרומטר במיכל אחסון פלסטיק הפוך ושקוף (66 ס"מ על 46 ס"מ על 38 ס"מ).
  8. תן RH בחדר לעלות ל 70−75%, אשר בדרך כלל לוקח 5−10 דקות.
    הערה: אם RH מעבדת הסביבה נמוכה (מתחת ~ 50%), תן לתא להגיע RH גבוה יותר, אבל לא גבוה מ 80%, כדי לפצות על אובדן לחות במהלך התצהיר (ראה להלן).
  9. כאשר RH מגיע 70−75%, להקליט את RH ולהרים את מיכל אחסון פלסטיק מעט כדי למקם במהירות כיסויים על מנות פטרי, אשר מונע הרטבה יתר של כיסויים.
    הערה: הטמפרטורה בחדר יהיה מעט חם יותר מטמפרטורת החדר, בדרך כלל 25−26 °C (70 °F), כתוצאה של לחות. אם הלחות נראית על כיסויים, אז משטחי הזכוכית רטובים מדי. תא כפפות מסחרי עשוי לפשט חלק זה של הפרוטוקול.
  10. תן RH בחדר להמשיך לעלות ל 85%. בשלב זה, להקליט את RH בתא הלחות ואת pipette 5 μL של השעיית חרוזים למרכז כל כיסוי.
  11. סגור את התא ואת מנות פטרי לאחר כל תצהיר כדי למזער את אובדן הלחות. שואפים לסיים את כל 6 התצהירים תוך 2 דקות.
  12. להקליט את RH בחדר לאחר התצהיר.
    הערה: RH לאחר התצהיר יעזור לאמוד כמה מהר הלחות אבדה במהלך התצהיר, אשר תלוי בתנאי מעבדת הסביבה. עבור ריצה מוצלחת טיפוסית, התא יתחיל ב 85% RH לפני התצהיר ויסתיים ב 70−75% RH לאחר התצהיר.
  13. נותנים לטיפות החרוזים להתפשט ולייבש במשך 5 דקות.
    הערה: אם גבישים קולואידיים יש חורים רבים או אזורים רב שכבתיים, אז התא היה ככל הנראה לח מדי או יבש, בהתאמה. התאם את הלחות היחסית שבה יש לסגור את מנות הפטרי ולהתחיל בתצהירים (עיין בסעיף התוצאות לדיון נוסף באופטימיזציה).

3. חישול חרוזים להפחתת גודל הנקבבובית בתבנית הגביש הקולואידי

  1. כדי לספק משטח טמפרטורה אחיד לחידה של חרוזי פוליסטירן, אשר מצמצם את interstices בין חרוזים ועיגול פינות interstices, מניח צלחת אלומיניום שטוחה, טחון על גבי צלחת חמה קרמית סטנדרטית.
  2. הגדר את הטמפרטורה של הצלחת החמה ל 107 °C (50 °F), טמפרטורת המעבר זכוכית של פוליסטירן40.
    הערה: כדי להשיג טמפרטורה יציבה ומדויקת, בדיקה thermocouple הוחזקה 2−3 מ"מ רוחב ו 4−5 מ"מ עמוק חור בצלחת האלומיניום.
  3. מניחים כיסוי המכיל את תבנית החרוזים על צלחת האלומיניום החמה ואת ה- 20 s (ראו סעיף הדיון להסבר על זמן ההיתוך).
  4. לאחר החימום, להסיר את כיסוי מצלחת האלומיניום ומיד למקם אותו על משטח אלומיניום טמפרטורת חדר אחר כדי לקרר אותו.
    הערה: זה מועיל גם יש כיסויים לתלות מעט מעל קצה הצלחת או ערוצים רדודים טחנה (ראה את הווידאו הנלווה) לתוך הצלחת כדי להקל על איסוף כיסויים.

4. ננו-פייברציה של מגלי גל במצב אפס מאלומיניום באמצעות תבנית הגביש הקולואידי

  1. באמצעות תצהיר אידוי תרמי או קרן אלקטרונים, הפקד 300 ננומטר של נחושת ב 2 Å / s מעל תבנית הגביש הקולואידי כדי ליצור עמדות בין החרוזים.
  2. הסר מתכת עודפת על גבי החרוזים על ידי לחיצה עדינה על פני השטח עם סרט הדבקה. לאט לאט לקלף את הקלטת כדי למשוך את המתכת.
    הערה: כמה כתמים קטנים של מתכת עודפת רפלקטיבית עשויים להישאר לאחר משיכת הסרט, ואלה לעתים קרובות ניתן להסיר על ידי זרם של גז N2. אם כתמים משמעותיים של מתכת עודפת רפלקטיבית נשארים לאחר משיכת הסרט, נסה להשרות את התבניות ב toluene במשך 2 שעות כדי להמיס חלקית את חרוזי פוליסטירן. לשטוף את כיסויים עם מים מזוקקים, יבש עם N2, ולחזור על משיכת הסרט. השריה הנוספת לא אמורה להמיס לחלוטין את החרוזים, שכן החרוזים עוזרים להגן על העמודים מפני נזק במהלך משיכת הקלטת.
  3. כדי להמיס את חרוזי הפוליסטירן, מניחים את תבניות החרוזים בטבלאן ומשרים למשך הלילה.
    זהירות: אדי טולואן עלולים להיות רעילים. עבוד עם טולואן מתחת למכסה המנוע מאוורר היטב ולבש ציוד מגן אישי, כולל כפפות, משקפי בטיחות וחלוק מעבדה. טולואן צריך להיות מאוחסן בארונות מאווררים המיועדים לנוזלים דליקים.
  4. לאחר הדגירה טולואן, לשטוף את התבניות פעם אחת עם כלורופורם ופעמיים עם אתנול. הידית מכסה את ההתמודדויות בזהירות בשלב זה מכיוון שפוסטי המתכת העדינים בגובה 200−300 ננומטר נחשפים כעת. לייבש את התבניות עם N2 ולהסיר פולימר שיורית ומזהמים במנקה פלזמה חמצן במשך 30 דקות.
    זהירות: אדי כלורופורם עלולים להיות רעילים. עבוד עם כלורופורם מתחת למכסה המנוע מאוורר היטב ולבש ציוד מגן אישי, כולל כפפות, משקפי בטיחות וחלוק מעבדה. כלורופורם צריך להיות מאוחסן בארונות מאווררים הרחק ממיסים דליקים אחרים.
  5. באמצעות תצהיר אידוי תרמי או קרן אלקטרונים, הפקדה 3 ננומטר של שכבת הידבקות טיטניום ב 1 Å / s ואחריו 100−150 ננומטר של אלומיניום ב 4 Å / s סביב ועל גבי עמודי הנחושת.
    הערה: ניתן להשתמש בחיפוי עבה יותר כדי להשיג מדריכים עמוקים יותר והנחתה טובה יותר של פלואורסצנטיות רקע, אך זה גם מקטין את התשואה לאחר חשיפת וממיס את הפוסטים בשלב הבא (עיין בסעיף הדיון).
  6. כדי להמיס את עמודי המתכת, להשרות את כיסויי הנחושת תחריט (על בסיס חומצת לימון; רשימת חומרים) במשך 2 שעות.
    זהירות: תחריט מתכת יכול לגרום לכוויות בעור. לעבוד עם תחריטים תחת מכסה המנוע מאוורר היטב ללבוש ציוד מגן. יש לשטוף ידיים ביסודיות לאחר הטיפול. יש לאחסן את תחריט המתכת בארונות מאווררים המיועדים לנוזלים מאכלים.
  7. לשטוף את כיסויים עם מים מזוקקים, יבש עם N2, בעדינות להבריק את פני השטח של חיפוי המתכת עם נייר עדשה לחשוף את כל העמודים שעדיין מכוסים בחיפוי. מניחים את כיסויי הגב לחריט נחושת עוד 2 שעות, ואז לשטוף שוב עם מים מזוקקים ויבש עם N2.
    הערה: שקופיות ZMW צריך להיות מאוחסן במנות פטרי מכוסות ונקיות כדי לשמור אותם ללא מזהמים.

5. ננו-פיבריות של זהב מצב אפס מגלי גל באמצעות תבנית הגביש הקולואידי

הערה: השיטה לייצור ZMWs זהב(איור משלים 1),המשקף את הפרוטוקול לייצור ZMWs אלומיניום, מסופקת בסעיף זה.

  1. באמצעות תצהיר אידוי קרן תרמית או אלקטרונים, הפקדה 3 ננומטר של שכבת הידבקות טיטניום ב 1 Å / s ואחריו 300 ננומטר של אלומיניום ב 4 Å / s.
  2. הסר מתכת עודפת על גבי החרוזים על ידי לחיצה עדינה על פני השטח עם סרט הדבקה. לאט לאט לקלף את הקלטת כדי למשוך את המתכת.
  3. כדי להמיס את חרוזי הפוליסטירן, מניחים את תבניות החרוזים בטבלאן ומשרים למשך הלילה.
  4. לאחר הדגירה טולואן, לשטוף את התבניות פעם אחת עם כלורופורם ופעמיים עם אתנול. לייבש את התבניות עם N2 ולהסיר מזהמי פולימר שיורית במנקה פלזמה חמצן במשך 30 דקות.
  5. באמצעות תצהיר אידוי קרן תרמית או אלקטרונים, הפקד 100−150 ננומטר של זהב ב 5 Å / s סביב ועל גבי עמודי האלומיניום.
  6. כדי להמיס את עמודי המתכת, להשרות את כיסויים תחריט אלומיניום (מבוסס חומצה זרחתית; רשימת חומרים) במשך שעה.
  7. לשטוף את כיסויים עם מים מזוקקים, יבש עם N2, בעדינות להבריק את פני השטח של חיפוי המתכת עם נייר עדשה לחשוף את כל העמודים שעדיין מכוסים בחיפוי. מניחים את כיסויי הגב בתחריט אלומיניום למשך שעה אחת, ואז שוטפים שוב במים מזוקקים ויבשים עם N2.
    הערה: שקופיות ZMW יש לאחסן במנות פטרי מכוסות ונקיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההרכבה העצמית של חלקיקי הקולואידים הפוליסטירן באמצעות משקעים אידויים (שלבים 2.1−2.13) יכולה לייצר מגוון תוצאות שכן היא דורשת שליטה על קצב אידוי הממס. עם זאת, מכיוון שהתצהירים מהירים (10−15 דקות לסיבוב), ניתן אופטימיזציה מהירה של ההליך לתנאי מעבדת סביבה שונים. איור 3A מציג תבנית קולואידית מעוצבת היטב לאחר התצהיר והאידוי. מבחינה מקרוסקופית, אזור החרוזים הוא מעגלי, עם גבולות המוגדרים על ידי טבעת חרוזים אטומה ורב שכבתית. האזורים השקוף, אך לא הלבנים בתמונה הם אזורי המונו-שכבתית הרצויים. איור 3B מציג תבנית קולואידית שנארזה בסביבה לחה מדי (80% RH כשמנות פטרי נסגרו). תבניות אלה נוטות שלא להיות להן גבול מעגלי נקי ויש להן קנוקנות מרובות שכבות המשתרעות כלפי חוץ. התצהיר מקובל וניתן להשתמש בו בשלבים הבאים, אך החורים בסריג מפחיתים את מספר אזורי מערך ZMW השימושיים להדמיית מולקולה אחת. איור 3C מציג תבנית קולואידית שנארזה בסביבה יבשה מדי (65% RH כאשר מנות פטרי נסגרו). תבניות אלה הן בדרך כלל קטנות יותר בקוטר בהשוואה לתבניות האידיאליות, כפולות היטב. ניתן להשתמש בתצהיר, אך האזורים הלבנים הרב שכבתיים, המ פסים פנימה, מפחיתים את האזור הניתן לשימוש להדמיה. לכן, איננו ממליצים לבצע יותר מ-6 תצהירים בכל פעם, שכן תצהירים לקראת סוף התהליך יתרחשו בלחות נמוכה יותר עם פתיחת החדר וסגירת החדר. איור תלת-ממדי מראה את תבנית הקשת שנוצרת על-ידי עקיפה של אור משתקף מגביש הפוליסטירן. דפוס זה יכול לשמש כדי לאשר הצלחה ואיכות של אריזת קריסטל על ידי העין. איור 3E,F מציג תמונות מיקרוסקופיה אטומית (AFM) של תבניות קולואידיות ארוזות היטב. הפגמים בין דגנים נובעים משיבוש במהלך משקעים אידוי41, גרגרים נפרדים ניתן לראות עם מטרה 10x. לכן, בחינת תצהירים קולואידים עם מיקרוסקופ אור בהספק נמוך יכול לשמש גם כדי להעריך את האריזה.

לאחר הפקדת נחושת על תבניות קולואידיות מחושלות (שלב 4.1), תבנית עקיפה קשת עדיין צריך להיות גלוי ומשופר על ידי מתכת רפלקטיבית ציפוי החלק העליון של החרוזים(איור 4A,B). התבניות מאבדות את תבנית עקיפה מחזירת הקשת לאחר משיכת סרט הוויסקי (שלב 4.2) המסירה עודף נחושת(איור 4C). איור 4D,E מציג תמונות AFM של שדה טיפוסי של עמדות נחושת לאחר תצהיר מתכת. הפגמים בין גרגירי הקריסטל הקולואידיים באיור 3E נראים בתמונות של פוסט הנחושת כאזורים גדולים יותר של נחושת. ניתוח של תמונות AFM מראה כי עבור עובי תצהיר נחושת של 300 ננומטר, בסופו של דבר נחושת פוסטים ממוצע 255 ננומטר (איור 4F) בקוטר 121 ננומטר (איור 4G).

תצהיר חיפוי האלומיניום (שלב 4.5) שבו היו החרוזים ועל גבי עמודי הנחושת, ופירוק הפוסטים לאחר מכן (שלבים 4.6 ו-4.7) גורמים לאלומיניום ZMWs המוצג באיור 5A−C. פגמים בין גרגירי הקריסטל הקולואידיים נראים כפתחים גדולים יותר(איור 5B). המרחק הממוצע בין מרכזי ZMW באיור 5C הוא 559 ננומטר, בהתאם למרווח שנקבע על ידי גיאומטריית האריזה המשושה של חרוזי 1 מיקרומטר ( Equation 1 שימוש בתבניות פוליסטירן שנצחו עבור 20 s תוצאות מגלי גל שקוטרם הממוצע הוא 118 ננומטר (איור 5D,E),בקנה אחד עם קטר הדואר וקטנים מספיק כדי לחתוך את התפשטות האור הנראה. פרופיל גובה של מצעד גל מאיור 5D מראה גם כי הוא בעומק של כ-120 ננומטר.

מולקולה בודדת FRET בוצעה ב- ZMWs כדי לבדוק פונקציונליות (איור 6A). שדה טיפוסי של ZMWs להדמיה מוצג באיור 6B, המכיל >3000 מגלי גל בשדה ראייה של 40 x 80 מיקרומטר. ZMWs היו פסיביים לראשונה באמצעות פרוטוקולים שתוארו בעבר42,43. בקצרה, ZMWs אלומיניום היו פסיביים עם poly (חומצה וינילפוספונית) כדי לצפות את חיפוי האלומיניום ואחריו פוליאתילן גליקול (PEG) סיים עם PEG סיים ביוטין כדי לצפות את תחתיות הזכוכית של ZMWs. ZMWs זהב יכול להיות פסיבי עם PEG נגזר תיול כדי לצפות את חיפוי הזהב ואחריו טיפול PEG דומה עבור תחתוני הזכוכית. תאי זרימה, ~ 20 נפח μL, נבנו אז עבור הדמיה מולקולה אחת44. הדמיית FRET מולקולה אחת של דופלקסים DNA בוצעה כמתואר בעבר38. בקצרה, 100 pM−1 nM של ציאנין-3/ציאנין-5 (Cy3/Cy5), דופלקסים DNA ביוטיניל (33 אורך זוג בסיס) היו דגירה במשך 10 דקות בערוצי זרימה פונקציונלי עם סטרפטאבידין (5 דקות דגירה, 0.5 מ"ג / פתרון מ"ל). ניתן לתייג את הריכוז של מקרומולקולות מסומנות כדי להשיג ~ 20% טעינה של מגלי הגל עם מולקולה אחת, המובילה <5% מזחלות גל טעון עם יותר ממולקולה אחת, המבוסס על טעינה מופצת פואסון (רוב מגלי גל, ~ 75%, לא יהיו מולקולות)45. DNA לא מאוגד נשטף עם חיץ דופלקס ללא נוקלאז ואחריו חיץ תאורה (0.3% [w/v] גלוקוז, 300 מיקרוגרם / מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 120 מיקרוגרם / מ"ל קטלאז, ו 1.5 mM טרולוקס [6-הידרוקסי-2,5,7,8-tetramethyl-כרומאן-2-חומצה קרבוקסילית]). דופלקסים DNA שאינם ביוטינילציה Cy5 (אורך 33 זוגות בסיס) היו נוכחים במאגר התאורה ב 0, 50, 100, ו 500 ננומטר כפלואורופורים ברקע בתמיסה. עקבות FRET מולקולה אחת ממולקולות ה- DNA הדופלקס Cy3 / Cy5 משותק נרשמו עם מיקרוסקופ TIRF שנבנה בהתאמה אישית המותאם לתנאי אפי-פלואורסצנטיות. סרטים תועדו עם צמצם מספרי של 1.48 (NA) 100x טבילת שמן עם 532 ננומטר לסירוגין ו 640 ננומטר עירור (חשיפה של 100 ms) ומפצל ספקטרט בעל ראייה כפולה כדי להקליט פליטת Cy3 ו- Cy5 בו זמנית במצלמת התקן מצמיד טעינה (EMCCD) המרבה אלקטרונים. עקבות FRET של מולקולה בודדת עם אקונומיקות שלב בודדות בערוץ Cy5 היו ניתנות לזיהוי בכל הריכוזים של הסביבה Cy5 נבדקו (איור 6C−F). לשם השוואה, מולקולות בודדות יהיו ניתנות לגילוי רק בתאורה TIRF עם pM ל- nM פתרון נמוך ריכוזי פלואורופור46.

Figure 1
איור 1: סכמטי של מגלי גל במצב אפס. דיאגרמה של מערך ZMW עם דיאגרמה מורחבת של ZMW יחיד מימין. אנזימים בודדים מתויגים פלואורסצנטית של עניין (ריבוזום חום עם עיגול אדום כדי לייצג צבע פלואורסצנטי) משותק כימית (באמצעות mRNA בדוגמה זו) לתחתית הזכוכית של ZMWs (פונקציונלי בדרך כלל עם biotinylated-PEG) ניתן לדמיין עם הגדרת מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית טיפוסית המבוססת על לייזר. נורית העירור של 532 ננומטר (חצים ירוקים) משתקפת בגבול המתכת מזכוכית בשל גודלו הקטן של הצמצם (קוטר 100−200 ננומטר), אך גל אוונסצנטי שאינו מתפשט המתפורר באופן אקספוננציאלי בעוצמה קיים בתוך ZMW. התוצאה היא עומק תאורה יעיל של 10−30 ננומטר (הצללה ירוקה בצמצם). ליגנדים פלואורסצנטיים בודדים (tRNAs כחולים עם עיגולים ירוקים כתגי פלורסנט) בריכוזים nM עד μM מתווספים. ליגנד בודד שמתפזר לתוך הצמצם ומתקשר עם האנזים הוא בתמונה ללא פלואורסצנטיות רקע אוסרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סכמטי של שיטת הטמפלטציה הקולואידית שפותחה כדי לייצר מערכי ZMW מאלומיניום. חרוזי פוליסטירן, בקוטר 1 מיקרומטר, מופקדים ומורכבים בעצמם על כיסוי זכוכית נקי, כמתואר בסעיף 2 של הפרוטוקול. לאחר מכן, חרוזים מחומשים כדי להקטין את גודל הנקבבוביות (סעיף 3), ולאחר מכן תצהיר נחושת ופירוק חרוזים בטאלואן. אלומיניום מופקד סביב ועל גבי עמודי הנחושת, אשר לאחר מכן חרוט באופן סלקטיבי משם כדי להשאיר מאחור מערך משושה של nanoapertures (סעיף 4). בשלושת השלבים האחרונים, תצוגות חתך מסופקות מימין לתצוגות התוכנית כדי להציג את הרוחב והגבהים של עמודי הנחושת ו- ZMWs אלומיניום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תוצאות מייצגות מתצהיר אידוי של קולואידים. (א) דוגמה לתצהיר קולואידי אופטימלי. (ב) דוגמה לתצהיר קולואידי מקובל שבו התנאים היו לחים יותר (80% RH) מאשר אידיאלי. חורים בשכבת הקריסטל נראים לעין. (ג) דוגמה לתצהיר קולואידי מקובל שבו התנאים היו יבשים יותר (65% RH) מאשר אופטימלי. אזורי המונו-שכבתית שקופים מעט ואילו אזורים רב שכבתיים הם לבנים ואטומים (היקף ופסים פנימה). (D) גביש קולואידי מואר באור לבן כדי להדגיש את עקיפה קשת מהגבישים. (ה) תמונת AFM (הקשה על בדיקה AFM באוויר) של monolayer של חרוזי פוליסטירן ארוז משושה מתצהיר קולואיד מוצלח (סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר). (ו) תמונת AFM מורחבת של חרוזים ארוזים (סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תמונות מקרוסקופיות ומיקרוסקופיות של תבניות ZMW לאחר תצהיר נחושת. (A) תמונה של שקופיות לאחר אידוי פיזי של נחושת על גבי תבניות החרוזים. (B) תבנית עקיפה קשת מתבניות חרוזים לאחר תצהיר נחושת. (ג) תמונה של תבנית (מימין) לאחר משיכת סרט כדי להסיר נחושת עודפת והקלטת (משמאל). (D) תמונת AFM של עמדות נחושת לאחר משיכת סרט הדבקה ופירוק מלא של חרוזי הפוליסטירן (סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר). (E) תמונת AFM בהגדלה גבוהה יותר של לוח D (סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר). (ו) היסטוגרמה של גובה פוסט הנחושת (מוגדרת כמדידת גובה מקסימלית בתוך כל פוסט), n = 534. (ז) היסטוגרמה של קטרים פוסט נחושת Feret, n = 201. קוטר Feret הוא המרחק המרבי בין שני קווים מקבילים משיק לגבול הפוסט (לכמת ב ImageJ47). כדי לזהות חלקיקים לניתוח, נעשה שימוש בסף באמצע הדרך בין החלק העליון של החיפוי למשטח הזכוכית התחתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תמונות מקרוסקופיות ומיקרוסקופיות של ZMWs מאלומיניום. (A) תמונה של שקופיות לאחר תצהיר אידוי פיזי של 150 ננומטר של אלומיניום סביב ועל גבי עמודי הנחושת. (B) תמונת AFM של ZMWs אלומיניום לאחר פירוק לאחר פירוק (סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר). (C) תמונת הגדלה גבוהה יותר של לוח B (סרגל קנה מידה = 0.2 מיקרומטר). (D) פרופיל עומק אופייני של ZMW בודד מלוח C. פרופיל שנלקח מהקו הירוק שצויר בלוח C. (E) היסטוגרמה של קטר ZMW Feret, n = 240. קטרי Feret נמדדו כמו באיור 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הדמיית FRET של מולקולה בודדת ב-ZMWs. (A) סכמטי (לא בקנה מידה) של הדמיית FRET מולקולה אחת של Cy3, דופלקסים DNA עם תווית Cy5 ב ZMWs עם Cy5 שכותרתו דופלקסים ברקע. (B) שדה לדוגמה של ZMWs תחת תאורת אור לבן (סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר). (C−F) מולקולה בודדת FRET הקלטות של דופלקסים DNA משותק ZMWs בנוכחות 0 (C), 50 (D), 100 (E), ו 500 nM (F) Cy5-labeles בתמיסה. עבור כל ריכוז, הלוח העליון מציג את עוצמת הפלואורסצנטיות Cy3 (ירוק) ו Cy5 (אדום) תחת תאורת לייזר 532 ננומטר (דימות FRET), הפאנל האמצעי מציג את עוצמת הפלואורסצנטיות Cy5 תחת תאורת לייזר 640 ננומטר (עירור קבלה ישיר), והפאנל הנמוך ביותר מראה את יעילות FRET ( Equation 2 ) המחושבת מעוצמות הפלואורסצנטיות הגולמיות של Cy3 (ID) ו- Cy5 (IA). במהלך ההדמיה, אורך גל העירור התחלף בין 532 ל 640 ננומטר כל 100 ms. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: סכמטי של שיטת טמפלטציה קולואידית שפותחה כדי לייצר מערך ZMW מזהב. הפרוטוקול לפברק מערך ZMW זהב מקביל לפרוטוקול לפברק מערך ZMWמאלומיניום (איור 2). במקום להפקיד נחושת על גבי חרוזי פוליסטירן, אלומיניום מופקד. לאחר המסת החרוזים ב toluene, זהב מופקד במקום אלומיניום על גבי העמודים. לאחר מכן, עמודי אלומיניום נחרטים באופן סלקטיבי כדי להשאיר מאחור מערך ZMW מזהב. בשלושת השלבים האחרונים, תצוגות חתך מסופקות מימין לתצוגות התוכנית כדי להציג את הרוחב והגבהים של עמודי האלומיניום ו- ZMWs זהב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: מידול אלמנט סופי של הפצת שדה אלקטרומגנטי ב- ZMWs. (A−D) חתך רוחב של סדר הגודל של וקטור פוינטינג ממוצע הזמן (W/m2)באמצעות מנזר גל עשוי מתבנית לא מתוכננת (A,C) ותבנית מחומשת (B,D). גלי מישור אלקטרומגנטיים מקוטבים ליניארית (1 W המופצים על שטח השקופית) באורכי הגל המפורטים באיור (400 ננומטר או 1,000 ננומטר) הוקרנו על פני השטח התחתונים, והמצב הנמוך ביותר (הבסיסי), בעל מספר הגל הנמוך ביותר, חושב באמצעות תוכנת מידול (Table of Materials) עם שיטת היסוד הסופית לפתרון משוואות מקסוול ותנאי הגבול המתאימים. גבולות מגלי הגל נחשבו למוליכים חשמליים מושלמים, אשר משוערים היטב על ידי קירות אלומיניום או זהב. החתך מתבנית ממתק הגל הלא מתוכנן נקבע על ידי האריזה המשושה של עיגולים בקוטר 1 מיקרומטר, והקצוות התלת-מחודדים מהצורה המשולשת שנוצרה קוצצו לרוחב ~ 60 ננומטר כדי לדגמן צמצם פיזי מציאותי. החתך מהתבניות המהוחות היה כעיגול בקוטר 130 ננומטר. לשני מגלי הגל היה עומק של 130 ננומטר, בדומה לעומק החיפוי לאחר הייצור. (ה,ו) בנוסף לאורכי גל עירור של 400 ננומטר ו-1,000 ננומטר, המודלים נפתרו ב-100 אורכי גל עירור במרווחים שווים בין 400 ננומטר ל-1,000 ננומטר, ומדד המצב האפקטיבי (המוגדר Equation 3 כ- , כאשר kz הוא מספר הגלים במגן הגל, אשר ירד עקב הגבלה במישור הרוחבי, ו- k הוא גל אור העירור בוואקום) שרטט כנגד אורך גל עירור עבור גל המשולש (E) והמעגל (F). עבור אורכי גל קצרים יותר, מצבים גבוהים יותר מתרגשים, ומדד המצב האפקטיבי עולה (מדד מצב אפקטיבי מקסימלי הוא 1, שהוא המקרה המגביל שבו גל המטוס האלקטרומגנטי נע ללא גבולות בממד הרוחב). אורכי הגל הניתוק האפקטיביים של מגלי הגל הוערכו כאורך הגל שבו מדד המצב האפקטיבי יורד ל-0. שים לב כי המדריך המעגלי λניתוק = 221 ננומטר מדוגמנות אלמנט סופי (F) עולה בקנה אחד עם התחזית התיאורטית של אורך הגל הניתוק של מדריך גל מעגלי (λניתוק, אנליטי = 1.7d = 221 ננומטר,כאשר d הוא קוטר מדריך הגל). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: תוצאות מייצגות של ייצור Au ZMW. (א) תמונה מקרוסקופית של מערכי ZMW מזהב. (B−D) תמונות AFM של עמודי אלומיניום מתבנית חרוזים שלא נחצבה (B),תבנית ש-107 °C (C)ותבנית שחוצבה ב- 107 °C (D). (ה) תמונת AFM של ZMWs זהב לאחר פירוק עמודי אלומיניום. (ו) תמונת AFM בהגדלה גבוהה יותר של לוח E. (G) פרופיל עומק אופייני של ZMW מזהב. פרופיל שנלקח מהקו הירוק שצויר בחלונית F (סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר ב- B, C, D ו- F; 5 מיקרומטר ב- E). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבור ההרכבה העצמית הקולואידית (פרוטוקול סעיף 2), השימוש באתנול ולא במים כמו ממס ההשעיה מאיץ את תהליך האידוי כך שהתבניות מוכנות תוך 2−3 דקות לאחר התצהיר ולא 1−2 שעות כמו בשיטות קודמות48,49. פרוטוקול משקעים אידוי המוצג כאן הוא גם פשוט יותר מאשר פרוטוקולי משקעים קודמים הדורשים שליטה על הטיית פני השטח, הטמפרטורה, ונפח האוויר מעל המתלה49,50,51. שבר נפח החלקיקים המשמש בפרוטוקול זה הוא 2.4%, גבוה יותר מאשר 0.2−0.5% בשימוש בשיטות משקעים קודמות48, אשר resuspended קולואידים בתערובות גליסול מים במשך הרבה יותר זמן יישוב סולמות זמן. עם זאת, איכות התצהירים היא חזקה לשינויים בשבר נפח החלקיקים, עם מחקרים קודמים למצוא כי זה יכול להיות מגוון בין 2−10%49,50,51. גדלי התבואה של גבישים קולואידיים המתקבלים בתצהיר מוצלח מפרוטוקול זה הם 20−30 מיקרומטר לרוחב, גדול יותר מאשר דגנים משיטות משקעים קודמות (בדרך כלל כמה מאות ננומטר לרוחב)48,49. מבחינה מקרוסקופית, בערך 2 ס"מ באזורים בקוטר של monolayer קולואידי דומים גם לאזורים 1 ס"מ המיוצרים בשיטות קודמות49. הגודל הגדול של תבניות הגביש הקולואידי המיוצר בשיטה זו מאפשר גם 3−5 תאי זרימה מופרדים44, כל אחד על 3−4 מ"מ רוחב, להיעשות על כל שקופית ZMW. לפיכך, ניתן לבצע מספר ניסויים עצמאיים של מולקולה בודדת בכל שקופית.

חישול תבניות החרוזים הקולואידיות (פרוטוקול סעיף 3) לאחר הרכבה עצמית הוא צעד פשוט אך מכריע להפחתת פלואורסצנטיות רקע מספקת עם ZMWs. כפי שמראה איור 2 משלים, אורך הגל הניתוק האפקטיבי למזחלת גל עם חתך משולש מתבנית לא מתוכננת הוא 894 ננומטר. לשם השוואה, אורך הגל הניתוק האפקטיבי של מדריך גל עגול בקוטר 130 ננומטר מתבנית מחושלת הוא 221 ננומטר, כפי שנקבע הן באופן אנליטי (פי 1.7 מקוטר המדריך18) והן מבחינה מספרית. שימוש חרוזים קטנים יותר לתצהיר יכול גם להקטין את גודל נקבוביות התבנית, אבל מגלי הגל יהיו אז מרווחים קרוב יותר מ 200 ננומטר, שהוא סביב מגבלת עקיפה של אור גלוי. יתר על כן, מגלי הגל יישארו משולשים בחתך רוחב, מה שמוביל להתפשטות כוח לא סימטרית דרך מנגויד הגל(איור משלים 2A−D). חיסרון אחד של שלב חישול הוא כי שונות בזמן ההיתוך יכול להציג תנודות בקוטר מגיד גל, כך תזמון מדויק מסייע למזער את השונות בין אצוות. אינטרסטיקים מתחילים להיסגר בשעות חישול ארוכות מ-25 מעלות צלזיון, וקוטרי הפוסט אינם יורדים מאוד בין 20−25 s (איור משלים 3B−D). מבחן מהיר לסגירת בין-פיס היא לבדוק אם תבניות מחושלות עדיין מייצרות תבנית עקיפה של קשת בענן כאשר הן מוארות באור ונצפות בזווית. אם לא, סביר להניח שרוב הבין-אינטרסטיקים נסגרו. הקשר בין זמן חישול לבין קטר נקבוביות טיפוסי הוצג מוקדם יותר38.

לאחר השגת גודל הנקבבובית הרצוי במהלך שלב החישול, נחושת מופקד (שלב 4.1) על התבניות כדי ליצור צל של המסכה. חשוב להשתמש בתצהיר קו הראייה, כאשר המתכת מתקרבת לתבנית בניצב ככל האפשר. לכן, הגדלת המרחק בין המדגם למקור המתכת, כמו גם להבטיח את הצלחת מחזיק את התבניות אינו מסתובב, כפי שנעשה באופן אוטומטי כמה מכונות תצהיר אדים, יסייע למזער תצהיר לרוחב של מתכת על מצע פוליסטירן. עם זאת, כמה תצהיר לרוחב הוא בלתי נמנע, אשר מקטין את גודל החור ביניים ולכן לאחר חתך ככל מתכת יותר מופקדים52. התוצאה היא עמדות מתכת פירמידליות ולא מבנים דמויי פריזמה52.

מכיוון שכותלי הנחושת הן ככל הנראה פירמידליות ולא פריזמה, תצהיר אלומיניום (שלב 4.5) על גבי העמודים מכסה גם חלק מהצדדים המשופעים, וחוסם את הנגישות של תחריט הנחושת עבור חלק מהפוסטים. לכן, שלב ההטחת נייר העדשה (שלב 4.7 או 5.7) נוסף לאחר השרייה הראשונה בתחריט כדי לשבש באופן מכני את כל עמודי הנחושת שעדיין מכוסים באלומיניום. הפקדת יותר נחושת כדי ליצור פוסטים גבוהים יותר גם הופכת את הפוסטים לרגישים יותר לשיבוש מכני במהלך התחזקות נייר העדשה. עם זאת, יותר מ 500 ננומטר של נחושת לא צריך להיות מופקד מאז המטרה של התצהיר היא להקרין את החור ביניים בקו האמצע 500 ננומטר של חרוזים 1 מיקרומטר.

קושי פוטנציאלי נוסף הוא הסרה לא מכוונת של חיפוי אלומיניום במהלך טיהור נייר העדשה (שלב 4.7 או 5.7). נמצא כי אובדן חיפוי אלומיניום במהלך ההקמה הפך שכיח יותר לאחר הוספת שלב החישול, ככל הנראה בשל שאריות פוליסטירן מוגברות, אשר יכול להפריע דבקות אלומיניום זכוכית (פרוטוקול סעיף 3). עם זאת, טבילת טולואן לילה (שלב 4.3 או 5.3) לאחר משיכת הקלטת פתרה בעיה זו. בתמונת AFM באיור 4Eניתן לראות כמה טבעות שיורית של פוליסטירן בין העמודים, אך חיפוי האלומיניום עדיין התנגד למספר חובבים בשלב 4.7. אם אובדן חיפוי האלומיניום נותר בעיה לאחר השריית טולואן במהלך הלילה, ניתן להוסיף שטיפה RCA-1 (ניקוי סטנדרטי 1), שטיפת פיראנה או ניקוי פלזמה חמצן נוסף לשלב 4.4 או 5.4. ניתן להוסיף את שלבי הכביסה הללו גם לאחר שלב החריטה הסופי (שלב 4.7 או 5.7) ולפני פסיבציה על מנת לנקות עוד יותר את ZMWs.

הביצועים של ZMWs בניסויי FRET מולקולה אחת היה דומה לזה של ZMWs מפוברק עם EBL. במחקר קודם53 ביצוע מולקולה אחת FRET על Cy3 שכותרתו DNA בודד תקוע עם Cy5 שכותרתו חלבון מטעין הליקאז DNA בתמיסה (אותו סידור מקבל תורם כמו זה באיור 6A),אירועי FRET היו ניכרים בבירור ב 100 nM Cy5 רקע, היו פחות ברורים (אות מעקב קבלה נמוכה לרעש) ב 1 μM, ולא ניתן להבחין ב 10 מיקרומטר. נציין כי מחקר קודם עם ZMWs מסחרי דיווח מולקולה אחת FRET מקבל אותות בריכוזים ברקע גבוה ככל 1 mM54, גבוה יותר מאשר אנחנו ומחקרים קודמים אחרים42,53 עם ZMWs מפוברק בתוך הבית השיגו. דיון נוסף בביצועי האות לרקע בקרב ZMWs ניתן ב Jamiolkowski ואח'38. אינטראקציה לא-מדעית של דגימה פלואורסצנטית עם משטחי ZMW53 היא אתגר נפוץ המגביל את הגישה לריכוזים גבוהים יותר, במיוחד אם מינים פלואורסצנטיים מפוזרים בתמיסה הוא מקרומולקולל גדול. מחקרים עם ZMWs על מערכות ביוכימיות מורכבות כגון תרגום הגבילו בדרך כלל ריכוזי מצע פלואורסצנטי חופשיים ל 100−250 nM55,56,57,58. ללא קשר ליישום המיועד של ZMWs, אופטימיזציה של שיטות פסיביציה למערכות שונות יהיה צורך ככל הנראה כדי לשמור על אות מקובל לרעש בריכוזים גבוהים.

בסך הכל, השיטה המוצגת כאן אינה דורשת מיומנויות או ציוד מיוחדים, מאפשרת ייצור מקביל של תבניות רבות בבת אחת, וניתן להתאים אותו לייצור ZMWs במתכות שונות. בעבודה זו הוחלפו נחושת ואלומיניום באלומיניום וזהב, בהתאמה, כדי לייצר ZMWs זהב(איור 3 משלים). זה יתרון עבור מעבדות המשתמשות בשיטות פסיביציה של זהב ולא אלומיניום. בנוסף, הוכח כי ZMWs זהב משפרים את הפליטה של פלואורופורים הסופגים באזור האדום של הספקטרום הנראה לעין, בעוד אלומיניום ZMWs משפר את הפליטה עבור פלואורופורים הסופגים באזור הירוק59. בעתיד, עוצמת האות הפלואורסצנטית של ZMWs מפוברק בשיטה זו עשויה להיות משופרת על ידי חריטה לתוך הזכוכית מתחת לחיפוי מתכת ZMW באמצעות HF16,26,60. זה מביא את biomolecules משותק רחוק יותר מקירות המתכת, אשר יכול להרוות פלואורופורים61. יתר על כן, יש מקסימום בעוצמת תאורת העירור מתחת לכניסה של הצמצם, וזה נוצל בעבר כדי לשפר את פליטת מולקולה אחת26,60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01GM080376, R35GM118139, ומרכז NSF להנדסה MechanoBiology CMMI: 15-48571 ל- Y.E.G., ועל ידי מלגת NIAID טרום דוקטורט NRSA F30AI114187 ל R.M.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Glass Coverslip Cleaning
Acetone Sigma 32201 1 L
Coplin glass staining jar Fisher Scientific 08-817 Staining jar with 8 grooves and molded glass cover
Coverslips VWR 48404-467 24 mm x 30 mm (No.1½, Rectangular)
Ethanol Sigma E7023 1 L
KOH Sigma 30603 Potassium hydroxide
Petri dishes Fisher Scientific R80115TS 100 mm diameter, 15 mm deep
Sonicator Branson Z245143 Tabletop ultrasonic cleaner, 5510
2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads
Clear storage container Fisher Scientific 50-110-8222 26 x 18 x 15 in.
Desk fan O2Cool FD05001A Any small desk (~5 in.) fan will work
Glass beaker Fisher Scientific 02-555-25B 250 mL
Humidity meter Fisher Scientific 11-661-19
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 21-402-903 1.5 mL
Polystyrene microspheres Polysciences 18602-15 1.00 µm diameter, non-functionalized
Triton X-100 deturgent Sigma X100 100 mL
3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template
Aluminum plate Fisher Scientific AA11062RY Customized in-house to 14 cm x 14 cm
Ceramic hotplate Fisher Scientific HP88857100 13 x 8.2 x 3.8 in.
Temperature controller McMaster-Carr 38615K71 Read temperature with thermocouple probe
Thermocouple probe McMaster-Carr 9251T93 Type K, surface probe
4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template
Aluminum etchant Transene Type A
Aluminum pellets Kurt J. Lesker EVMAL40QXHB For electron beam evaporation
Chloroform Sigma 288306 1 L
Copper etchant Transene 49-1
Copper pellets Kurt J. Lesker EVMCU40QXQA For electron beam evaporation
Gold pellets Kurt J. Lesker EVMAUXX40G For electron beam evaporation
Lens paper Thorlabs MC-5
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Scotch tape Staples MMM119
Thin film deposition system Kurt J. Lesker PVD-75 Tabletop thermal evaporation system will also work
Titanium pellets Kurt J. Lesker EVMTI45QXQA For electron beam evaporation
Toluene Sigma 244511 1 L
Representative Results
COMSOL Multiphysics Modeling Software COMSOL, Inc.
Dual View spectral splitter Photometrics, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 715-720 (2010).
  3. Herbert, K. M., Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase: motoring along. Annual Review of Biochemistry. 77, 149-176 (2008).
  4. Chen, C., et al. Dynamics of translation by single ribosomes through mRNA secondary structures. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (5), 582-588 (2013).
  5. Chen, C., et al. Single-molecule fluorescence measurements of ribosomal translocation dynamics. Molecular Cell. 42 (3), 367-377 (2011).
  6. Jamiolkowski, R. M., Chen, C., Cooperman, B. S., Goldman, Y. E. tRNA Fluctuations Observed on Stalled Ribosomes Are Suppressed during Ongoing Protein Synthesis. Biophysical Journal. 113 (11), 2326-2335 (2017).
  7. Myong, S., Stevens, B. C., Ha, T. Bridging Conformational Dynamics and Function Using Single-Molecule Spectroscopy. Structure. 14 (4), 633-643 (2006).
  8. Martin-Fernandez, M. L., Tynan, C. J., Webb, S. E. A 'pocket guide' to total internal reflection fluorescence. Journal of Microscopy. 252 (1), 16-22 (2013).
  9. Holzmeister, P., Acuna, G. P., Grohmann, D., Tinnefeld, P. Breaking the concentration limit of optical single-molecule detection. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1014-1028 (2014).
  10. Scheer, M., et al. BRENDA, the enzyme information system in 2011. Nucleic Acids Research. 39, 670-676 (2011).
  11. Kudva, R., et al. Protein translocation across the inner membrane of Gram-negative bacteria: the Sec and Tat dependent protein transport pathways. Research in Microbiology. 164 (6), 505-534 (2013).
  12. Talkad, V., Schneider, E., Kennell, D. Evidence for variable rates of ribosome movement in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 104 (1), 299-303 (1976).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Dunkle, J. A., et al. Structures of the bacterial ribosome in classical and hybrid states of tRNA binding. Science. 332 (6032), 981-984 (2011).
  15. Kim, H. D., Puglisi, J. D., Chu, S. Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophysical Journal. 93 (10), 3575-3582 (2007).
  16. Levene, M. J., et al. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. Science. 299 (5607), 682-686 (2003).
  17. Zhu, P., Craighead, H. G. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis. Annual Review of Biophysics. 41, 269-293 (2012).
  18. Pollack, G. L., Stump, D. R. Electromagnetism. , Addison-Wesley. Boston, MA. (2002).
  19. Jackson, J. D. Classical electrodynamics. Third edition. , Wiley. New York, NY. (1999).
  20. Crouch, G. M., Han, D., Bohn, P. W. Zero-mode waveguide nanophotonic structures for single molecule characterization. Journal of Physics D: Applied Physics. 51 (19), 193001 (2018).
  21. Wenger, J., et al. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy in a single nanoaperture: towards rapid multicomponent screening at high concentrations. Optics Express. 14 (25), 12206-12216 (2006).
  22. Goldschen-Ohm, M. P., et al. Structure and dynamics underlying elementary ligand binding events in human pacemaking channels. eLife. 5, 20797 (2016).
  23. Miyake, T., et al. Real-Time Imaging of Single-Molecule Fluorescence with a Zero-Mode Waveguide for the Analysis of Protein-Protein Interaction. Analytical Chemistry. 80 (15), 6018-6022 (2008).
  24. Zhao, J., Branagan, S. P., Bohn, P. W. Single-Molecule Enzyme Dynamics of Monomeric Sarcosine Oxidase in a Gold-Based Zero-Mode Waveguide. Applied Spectroscopy. 66 (2), 163-169 (2012).
  25. Fore, S., Yuen, Y., Hesselink, L., Huser, T. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures. Nano Letters. 7 (6), 1749-1756 (2007).
  26. Rigneault, H., et al. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures. Physical Review Letters. 95 (11), 117401 (2005).
  27. Foquet, M., et al. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection. Journal of Applied Physics. 103 (3), 034301 (2008).
  28. Wada, J., et al. Fabrication of Zero-Mode Waveguide by Ultraviolet Nanoimprint Lithography Lift-Off Process. Japanese Journal of Applied Physics. 50 (6), 06 (2011).
  29. Fischer, U. C., Zingsheim, H. P. Submicroscopic pattern replication with visible light. Journal of Vacuum Science and Technology. 19 (4), 881-885 (1981).
  30. Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. Natural lithography. Applied Physics Letters. 41 (4), 377-379 (1982).
  31. Li, B., Zhou, D., Han, Y. Assembly and phase transitions of colloidal crystals. Nature Reviews Materials. 1 (2), 15011 (2016).
  32. Bohn, J. J., Tikhonov, A., Asher, S. A. Colloidal crystal growth monitored by Bragg diffraction interference fringes. Journal of Colloid and Interface Science. 350 (2), 381-386 (2010).
  33. Dimitrov, A. S., Nagayama, K. Continuous Convective Assembling of Fine Particles into Two-Dimensional Arrays on Solid Surfaces. Langmuir. 12 (5), 1303-1311 (1996).
  34. Pisco, M., et al. Nanosphere lithography for optical fiber tip nanoprobes. Light: Science & Applications. 6 (5), 16229 (2017).
  35. Chandramohan, A., et al. Model for large-area monolayer coverage of polystyrene nanospheres by spin coating. Scientific Reports. 7, 40888 (2017).
  36. Besra, L., Liu, M. A review on fundamentals and applications of electrophoretic deposition (EPD). Progress in Materials Science. 52 (1), 1-61 (2007).
  37. Yu, J., et al. Preparation of High-Quality Colloidal Mask for Nanosphere Lithography by a Combination of Air/Water Interface Self-Assembly and Solvent Vapor Annealing. Langmuir. 28 (34), 12681-12689 (2012).
  38. Jamiolkowski, R. M., et al. Nanoaperture fabrication via colloidal lithography for single molecule fluorescence analysis. PLoS ONE. 14 (10), 0222964 (2019).
  39. Innocenzi, P., et al. Evaporation of Ethanol and Ethanol-Water Mixtures Studied by Time-Resolved Infrared Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 112 (29), 6512-6516 (2008).
  40. Rieger, J. The glass transition temperature of polystyrene. Journal of Thermal Analysis. 46 (3), 965-972 (1996).
  41. Donev, A., Torquato, S., Stillinger, F. H., Connelly, R. Jamming in hard sphere and disk packings. Journal of Applied Physics. 95 (3), 989-999 (2004).
  42. Kinz-Thompson, C. D., et al. Robustly Passivated, Gold Nanoaperture Arrays for Single-Molecule Fluorescence Microscopy. ACS Nano. 7 (9), 8158-8166 (2013).
  43. Korlach, J., et al. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (4), 1176-1181 (2008).
  44. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  45. Plénat, T., Yoshizawa, S., Fourmy, D. DNA-Guided Delivery of Single Molecules into Zero-Mode Waveguides. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (36), 30561-30566 (2017).
  46. Kudalkar, E. M., Davis, T. N., Asbury, C. L. Single-Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Cold Spring Harbor protocols. 2016 (5), 077800 (2016).
  47. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  48. Hoogenboom, J. P., Derks, D., Vergeer, P., Blaaderen, A. v Stacking faults in colloidal crystals grown by sedimentation. The Journal of Chemical Physics. 117 (24), 11320-11328 (2002).
  49. Micheletto, R., Fukuda, H., Ohtsu, M. A Simple Method for the Production of a Two-Dimensional, Ordered Array of Small Latex Particles. Langmuir. 11 (9), 3333-3336 (1995).
  50. Denkov, N., et al. Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir. 8 (12), 3183-3190 (1992).
  51. Okubo, T. Convectional, sedimentation and drying dissipative patterns of colloidal crystals of poly(methyl methacrylate) spheres on a watch glass. Colloid and Polymer Science. 286 (11), 1307-1315 (2008).
  52. Ye, S., Routzahn, A. L., Carroll, R. L. Fabrication of 3D Metal Dot Arrays by Geometrically Structured Dynamic Shadowing Lithography. Langmuir. 27 (22), 13806-13812 (2011).
  53. Zhao, Y., et al. Dark-Field Illumination on Zero-Mode Waveguide/Microfluidic Hybrid Chip Reveals T4 Replisomal Protein Interactions. Nano Letters. 14 (4), 1952-1960 (2014).
  54. Goldschen-Ohm, M. P., White, D. S., Klenchin, V. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. Observing Single-Molecule Dynamics at Millimolar Concentrations. Angewandte Chemie International Edition. 56 (9), 2399-2402 (2017).
  55. Noriega, T. R., Chen, J., Walter, P., Puglisi, J. D. Real-time observation of signal recognition particle binding to actively translating ribosomes. eLife. 3, 04418 (2014).
  56. Uemura, S., et al. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution. Nature. 464 (7291), 1012-1017 (2010).
  57. Choi, J., Puglisi, J. D. Three tRNAs on the ribosome slow translation elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 13691-13696 (2017).
  58. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323 (5910), 133-138 (2009).
  59. Martin, W. E., Srijanto, B. R., Collier, C. P., Vosch, T., Richards, C. I. A Comparison of Single-Molecule Emission in Aluminum and Gold Zero-Mode Waveguides. The Journal of Physical Chemistry A. 120 (34), 6719-6727 (2016).
  60. Wenger, J., et al. Single molecule fluorescence in rectangular nano-apertures. Optics Express. 13 (18), 7035-7044 (2005).
  61. Pineda, A. C., Ronis, D. Fluorescence quenching in molecules near rough metal surfaces. The Journal of Chemical Physics. 83 (10), 5330-5337 (1985).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 159 מגלי גל במצב אפס ננו-צמצם פלואורסצנטיות של מולקולה בודדת ליטוגרפיה של ננוספירה קריסטל קולואידי הרכבה עצמית

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 08/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

ייצור של מגלי גל במצב אפס למיקרוסקופיה של מולקולה בודדת בריכוז גבוה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M.,… More

Chen, K. Y., Jamiolkowski, R. M., Tate, A. M., Fiorenza, S. A., Pfeil, S. H., Goldman, Y. E. Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. J. Vis. Exp. (159), e61154, doi:10.3791/61154 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter