Summary
Primære cilier er ekstracellulære strukturer forbundet med centriole. Primær cilia detektion ved immunfluorescerende farvning er en forholdsvis enkel procedure, der resulterer i ekstremt høj kvalitet billeder. I denne protokol, fibroblaster udtrykke primære cilier blev fastsat, immunstained, og afbildet i en fluorescerende eller konfokal mikroskop.
Abstract
Primære cilier reguleres dynamisk under cellecyklusprogression, specielt i G0/G1-faserne af cellecyklussen, og som resorberes før mitose. Primær cilier kan visualiseres med meget avancerede metoder, herunder transmission elektron mikroskopi, 3D-billeddannelse, eller ved hjælp af software til automatisk påvisning af primære cilier. Men, immunfluorescerende farvning af primære cilier er nødvendig for at udføre disse metoder. Denne publikation beskriver en protokol til nem påvisning af primær cilier in vitro ved farvning acetylerede alpha tubulin (axoneme) og gamma tubulin (basal krop). Denne immunfluorescerende farvning protokol er relativt enkel og resulterer i billeder i høj kvalitet. Denne protokol beskriver, hvordan fire cellelinjer (C2C12, MEF, NHLF og hudfibroblaster), der udtrykker primær cilier, blev fikseret, immunstained og afbildet med et fluorescerende eller konfokal mikroskop.
Introduction
Primære cilier er sensoriske, ensomme, membran-bundet, ikke-tåtil strukturer forbundet med cellens mor centriole. Primære cilier findes på de fleste hvirveldyr celler med undtagelse af røde blodlegemer, adipocytter1, og hepatocytes2. Primær cilier dannes som en aflang axonme sammensat af mikrotubuli, hvis hovedkomponent er α-tubulin. Axonemet vokser fra den basale krop, som er struktureret fra γ-tubulin. Længden af den primære cilier varierer mellem 2-10 μm; dimensionerne kan dog ændre sig under glycylation, sult, hypoxi, cytotoksisk stress eller efter udsættelse for iioniserendestråling 3,4,,5,6,7. Normalt har celler kun ét primært cilium, som er involveret i morfogenese og cellesignalveje, der er vigtige for celleproliferedning og differentiering8,9.
Primære cilier reguleres dynamisk under cellecyklusprogression, specielt i G0/G1-faserne, og resorberes, før de indtastes i mitose i en proces forbundet med tubulindeacetylation medieret af HDAC6 (histone deacetylase 6)10. Det nøjagtige øjeblik for primær cilia resorption afhænger af celletype og udtryk for gener direkte involveret i denne proces, såsom Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,13. Afhængigt af celletypen udtrykker den primære cilier forskellige typer receptorer, ionkanaler og aktive signalveje. Disse omfatter de vigtigste signalreceptorer, der påvirker spredning og overlevelse, EGFR, PDGFR og FGFR. Også inkluderet er nogle af de signalveje, der kan påvirke funktionen af et eller flere organer, herunder pindsvin, Notch, og Wnt. Takket være disse receptorer og signalveje, den primære cilier også udføre en kemosensorisk funktion. Denne funktion gør det muligt for primære cilier at opdage specifikke ligander for Notch, hormoner, og biologisk aktive stoffer såsom serotonin eller somatostatin. Andre specifikke funktioner udstillet af primære cilier af forskellige længder omfatter reaktion på ændringer i temperatur, tyngdekraft, og osmolalitet14.
Primær cilier kan visualiseres ved hjælp af forskellige metoder, såsom levende visualisering, transmission elektron mikroskopi, 3D-billedbehandling, eller ved software til automatisk påvisning af primære cilier5,15,16,17. Men disse metoder er højt specialiserede og igangværende forskning behov grundlæggende, hurtig og nem metoder til farvning primære cilier i alle faser af forskningen. Beskrevet er en nem og nyttig metode til påvisning af primære cilier i dyrkede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af kultur medier, løsninger og retter
- Autoklave dækslerne (22 x 22 mm). Forbered 6 brøndplader. Optø fosterets serum (FBS) og antibiotisk penicillin/streptomycin, og varm dyringsmediet til stuetemperatur (RT). Brug trypsin-EDTA (0.25%) og 1x PBS (fosfat buffered saltvand med calcium og magnesium) til passage af cellerne.
- Der tilberedes frisk 4% paraformaldehyd (PFA) i dH2O (800 mg PFA i 20 ml dH2O). PFA skal være frisklavet til hvert forsøg. Opløsningen omrøres og opvarmes ved 55 °C i 30 minutter i emhætten. Afkøl ved RT. Tilsæt 1 M natriumhydroxid, indtil opløsningen bliver klar (pH = 7,2–7,4). Opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
Bemærk: PFA er giftig; bær altid passende personlige værnemidler og klargør i den kemiske hætte. - Forbered 500 ml kulturmedier, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium), der indeholder 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 2% glutamin.
- Der tilberedes 13 ml 1% gelatineopløsning i steril dH2O (130 mg gelatine i 13 ml dH2O). Brug 2 ml 1% gelatine til hver brønd i en 6 brøndplade. Hold dig steril.
- Rengør laminar flow hætten med 70% ethanol. Placer det nødvendige materiale inde i laminar flowhætten, før du starter forsøget.
2. Cellekultur for immunokætætætning farvning
- Tø cellerne (i denne undersøgelse C2C12, MEF, NHLF, og hud fibroblaster) ved hjælp af standard teknikker og plade dem i en T75 kolbe suppleret med ~ 10-12 ml af de forberedte medier. Inkuberes ved 37 °C/5% CO2/90% relativ luftfugtighed (RH), indtil cellerne når 70% sammenløb.
- Fjern cellerne fra kuvøsen og læg dem i laminar flow hætten. Fjern kulturmediet, og skyl cellerne kortvarigt 2x med 1x PBS. Der tilsættes ~2 ml 0,25 % trypsin-EDTA i T75-kolben og inkuberes ved 37 °C i ~5 min. Kontroller jævnligt det omvendte mikroskop for at overvåge celleopdelingen.
BEMÆRK: Inkubationstiden afhænger af cellelinjen og skal derfor bestemmes empirisk. - Forsigtigt resuspenderede cellerne i 10 ml kultur medier, pipettering omhyggeligt for at skabe en enkelt celle suspension. Skyl kolben igen, hvis det er nødvendigt.
- Celleaffjedringen anbringes i et konisk rør på 50 ml og centrifuge i 5 min. ved ~200 x g. Dekantere supernatant, tilsæt 10 ml kultur medier, og forsigtigt resuspend pellet. Tag 20 μL af cellesuspensionen og blandes i et 1:1-forhold med trypanblåt og tælles i et cytometer efter standardmetoden.
- Placer en coverslip inde i hver brønd af en 6 godt plade ved hjælp af pincet. Coat dækslerne med gelatine ved at hælde ~ 2 ml i brøndene. Dette vil hjælpe cellerne vedhæfte til coverslips. Fjern gelatineopløsningen og lad den lufttørre i et par minutter. Dækslerne er nu klar til dyrkning af cellerne. Start dyrkningen med det samme.
- Seed 100.000 fibroblaster i hver brønd og tilføje 2 ml kultur medier. Cellerne inkuberes i 24 timer ved 37 °C/5% CO2/90% RH. På dette tidspunkt kan cellerne behandles i henhold til brugerens behov. Behandlinger til at fremkalde ciliaation er tidligere blevet beskrevet4,,5.
BEMÆRK: Det oprindelige såningsnummer afhænger af cellernes fordoblingstid og bør bestemmes i overensstemmelse hermed.
3. Immunfluorescerende farvning af primær cilier in vitro
- Varm 4% paraformaldehyd til RT. Forbered Pasteur pipetter, 1x PBS (RT), affaldsbeholder, 15 ml koniske rør, mikropipetter (0,5-10 μL, 20-200 μL og 100-1.000 μL) og spidser. Tag cellerne fra kuvøsen og læg dem på bænken.
BEMÆRK: Farvningsproceduren behøver ikke at blive udført under sterile forhold. Alle løsninger skal være på RT. - Fjern medier fra hver brønd. Lad dækslæbet inde i brønden. Meget forsigtigt vaske cellerne 3x med 2 ml 1x PBS. Ved hjælp af en Pasteur pipette tilsættes 2 ml 4% PFA i hver brønd for at fikse cellerne. Inkuber i 10 min på RT. Fjern PFA og vask 3x med 1x PBS.
BEMÆRK: Brug altid et tilstrækkeligt volumen til at dække hele dækslet i inkubationsperioderne. Lad aldrig cellerne tørre. Hæld aldrig nogen af opløsningerne direkte på dækslæbet. - Forbered 0,5% Triton X-100 i 13 ml 1x PBS 10 min før brug. Tilføj 2 ml i hver brønd. Inkuber i 15 min. Vask forsigtigt 4x med 1x PBS.
BEMÆRK: Triton X-100 er uopløselig i PBS ved RT. Varm 0,5% Triton X-100 opløsningen til 37 °C i et vandbad for at opløse den. - Optø gedeserum 5 min før brug. Gedeserum fortyndes i 1x PBS i et 1:20-forhold som blokerende opløsning. Der tilsættes 150 μL til hver dæksl, og der inkuberes i 20 min.
BEMÆRK: Forlænd blokeringsperioden op til 60 min, hvis det er nødvendigt. Cellerne må ikke vaskes efter blokering med gedeserum. - Optø de primære antistoffer (dvs. anti-acetyleret alfa tubulin og anti-gamma tubulin) 5 min før brug. Antistofferne fortyndes separat i 1x PBS på følgende måde: mus anti-acetyleret alfasjepiol i forholdet 1:800 og kaninanti gamma tubulin i et 1:300-forhold. Fjern blokeringsløsningen. Må ikke vaskes. Der tilsættes 150 μL af begge antistoffortyndinger til dækslerne og inkuberes i 60 min. ved RT.
BEMÆRK: Hvis der inkuberes 500-1.000 μL af de primære antistofopløsninger natten over, forsegles 6 brøndpladen med paraffinfilm, og den opbevares ved 4 °C. Alternativt kan du bruge 150 μL antistof og inkuberes i et fugtighedskammer. - Fjern de primære antistoffer. Dækslingerne vaskes meget forsigtigt 3x med 2 ml 1x PBS. Forbered de sekundære antistoffer i 1x PBS ved separat fortynding Cy3 får anti-mus og Alexa Fluor488 ged anti-kanin i en 1:300 forholdet. Der tilsættes 150 μL af begge sekundære antistoffortyndinger til dækslerne. Inkuber i 45 min på RT i mørke.
BEMÆRK: Inkuber i mørke for at undgå fotobleaching. Andre kombinationer af sekundære antistoffer kan anvendes efter behov. - Forbered en DAPI -opløsning (4', 6-diamidino-2-phenylindole) i henhold til producentens anvisninger. De overskydende aliquots opbevares ved -20 °C. 10 μL fortyndes fra en bestands aliquot (1:5.000) i 50 ml 1x PBS. Der tilsættes 2 ml af denne fortynding til dækslerne. Inkuber i 5 min på RT i mørke.
BEMÆRK: Det er vigtigt at inkubere cellerne i mørke for at undgå fotobleaching. DAPI-fortyndingen kan opbevares ved 4 °C i op til 1 måned. - Forbered 2 nåle, dias, pincet og monteringsmedier. Mærl diasene.
- Fjern DAPI-løsningen fra brøndene. Vask 3x med 1x PBS. Sæt en dråbe monteringsmedie på hvert dias. Brug nålen til forsigtigt at løfte dækslæbet fra brøndens bund. Vend dækslæden med en pincet, og placer den forsigtigt over dråben af monteringsmedierne. Fjern forsigtigt eventuelle bobler.
- Beskyt objektglasset mod lys og opbevar dem natten over ved 4 °C.
- Brug et fluorescerende eller konfokal mikroskop med høj forstørrelse til at visualisere den primære cilier.
BEMÆRK: Objektglassene kan opbevares i mørke ved 4 °C i op til 2 måneder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den immunfluorescerende farvning af primære cilier er en forholdsvis enkel procedure, der resulterer i billeder af høj kvalitet. I disse forsøg blev fibroblaster, der udtrykte primær cilier, fikseret, immunstained og afbildet i et fluorescerende eller konfokal mikroskop efter den protokol, der er beskrevet ovenfor. Det primære cilium blev påvist ved hjælp af acetyleret α-tubulin og γ-tubulin. Evalueringen af primær cilier kan udføres på forskellige niveauer, og enhver ændring i denne henseende kan kædes sammen med eksponering for iioniserende stråling, cellemetabolisme (f.eks. sult) eller kemisk behandling (f.eks. cytostatika)5,18.
Virkningen af iioniserende stråling på primær cilier er blevet undersøgt i forskellige cellelinjer (f.eks. myoblastcellelinjen C2C12), som blev bestrålet (2, 6, 10 og 20 Gy) og ændringerne i den primære cilier-incidens analyseret. Ifølge Filipova ved al.4ændrer lave bestrålingsdoser ikke forekomsten af en enkelt primær cilier i C2C12-celler. Men højere doser af iioniserende stråling (dvs. 20 Gy) induceret udseendet af flere primære cilier (Figur 1A, B,C). Tilsvarende, når NHLF celler blev bestrålet ved 2 Gy den primære cilier blev påvist ved immunfluorescens (Figur 2).
Metabolisk stress er også kendt for at øge hyppigheden af primære cilier19. I dette tilfælde blev MEF fibroblaster sultet og analyseret for ændringer i den primære cilierforekomst (figur 3).
Immunfluorescens farvning viste, at fibroblast celler foretaget primære cilier efter behandling med doxorubin og taxol. De fibroblaster, der blev behandlet med 120 nM doxorubicin, udtrykte et enkelt primærcilium (figur 4); højere doser inducerede forekomsten af flere primære cilier (Figur 5). Behandling med 1,25 nM taxol resulterede også i tilstedeværelsen af et enkelt primærcilium (Figur 6). I modsætning til behandlingen med doxorubicin blev der ikke påvist flere cilier efter behandling med højere doser taxol5.
Figur 1: Forekomst af primær cilier i bestrålede C2C12-celler. Repræsentative fotografier af primær cilier i C2C12-celler. Primær ciliadetektion blev udført ved immunfluorescens. Axonme (pil) af den primære cilier blev vurderet med acetyleret α-tubulin antistof (rød) og basal kroppen ved γ-tubulin antistof (pil, grøn). Kerner blev plettet med DAPI (blå). aA) ogb) flere cilier blev observeret 72 timer efter bestråling med 20 Gy. cC) Enkelt primær cilier efter 72 h bestråling med 20 Gy4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Påvisning af primær cilier i bestrålede NHLF-celler. Repræsentative fotografier af primære cilier i NHLF-celler. Primær cilier (pil) detektion blev udført ved immunfluorescens. Axonemes af den primære cilier blev plettet med acetyleret α-tubulin antistof (rød) og de basale organer med γ-tubulin antistof (grøn). Kerner blev plettet med DAPI (blå). Enkelt primær cilier 24 timer efter bestråling ved 2 Gy. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forekomsten af primær cilier i MEF-cellerne efter metabolisk stress forårsaget af serumsult. Repræsentative fotografier af primær cilier 24 timer efter serumsult (0,1% FBS) i MEF-celler. Primær cilier (pil) detektion blev udført ved immunfluorescens. Axonemes var mærket med acetyleret α-tubulin antistof (rød). Basale kroppe blev plettet med γ-tubulin antistof (grøn). Kerner blev plettet med DAPI (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative fotografier af primære cilier i hudfibroblaster. Primær cilier (pil) detektion blev udført ved immunfluorescens. Primær cilier blev plettet med acetyleret α-tubulin antistof (rød), mens de basale organer blev plettet med γ-tubulin antistof (grøn). Kerner blev plettet med DAPI (blå). Primær cilier blev påvist 72 timer efter behandling med 120 nM doxorubicin5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative fotografier af flere cilier i hudfibroblaster. Primær cilier (pil) detektion blev udført ved immunfluorescens. Axonmes blev mærket af acetyleret α-tubulin antistof (rød) og de basale organer blev plettet med γ-tubulin antistof (grøn). Kerner blev plettet med DAPI (blå). Der blev påvist flere cilier 72 timer efter behandling med 120 nM doxorubicin5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Repræsentative fotografier af hudfibroblaster behandlet med taxol. Primær cilier (pil) blev påvist ved immunfluorescens. Primær cilier blev plettet med acetyleret α-tubulin antistof (rød) og med γ-tubulin antistof (grøn). Axoneme kerner blev plettet med DAPI (blå). Primær cilier blev påvist 72 h efter behandling med 1,25 nM taxol5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere forfattere har beskrevet forskellige metoder til påvisning af primære cilier, undertiden også beskriver forskellige fiksering metoder, der kan påvirke derespåvisning6,20,,21,22. Uanset hvad, er det svært at finde en komplet og ligetil protokol til registrering. Den disponibile metode vil uden tvivl være til stor hjælp for undersøgelsen af den primære cilierundersøgelse, især i de tidlige forskningsfaser eller til en hurtig og nem metode til at teste tilstedeværelsen af primære cilier i en valgt cellelinje. Derfor er denne protokol beskrevet så detaljeret som muligt til påvisning af primær cilier in vitro efter forskellige former for behandling.
Denne protokol blev ændret til daglig brug20,23,24. For eksempel blev 10% formalin erstattet af 4% PFA, hvis friske forberedelse anbefales på grund af sin korte holdbarhed. PFA er et godt valg til bevarelse af cellemorfologi og er specielt velegnet til visualisering af membranbundne proteiner. Organiske opløsningsmidler, såsom methanol, har en dehydrerende effekt på cellen og fjerner små, opløselige molekyler og lipider under fikseringsprocessen, hvilket gør den uegnet til brug i visse scenarier25. Permeabilization opnås med 0,5% Triton X-100 i 1x PBS i 15 min. Gedeserum i en 1:20 fortynding i 1x PBS i 20 min. anvendes som blokerende middel. Både primære antistoffer, mus anti-acetylerede tubulin og kanin anti-γ-tubulin, kan inkuberes samtidigt i 60 min. ved hjælp af en 1:800 og 1:300 fortynding i 1x PBS,henholdsvis 20,21,23,24. Desuden blev de sekundære antistoffer, antimuse-IgG (hele molekylet) F(ab′)2 fragment-Cy3-antistof fremstillet hos får og Alexa Fluor488 AffiniPure F(ab')₂ fragment ged anti-kanin IgG, fortyndet 1:300 i 1x PBS. De blev inkuberet samtidigt i 45 min.
Det kan være nødvendigt at tage ekstra standardiseringstrin, hvis de primære antistoffer inkuberes natten over. Under udviklingen af protokollen blev det konstateret, at en overnight inkubation behov et volumen på mindst 500-1.000 μL af primære antistoffer opløsning, 6 godt plade skal forsegles med parafilm, og opbevaring skal være ved 4 °C for at forhindre fordampning.
De mest kritiske skridt for en vellykket farvning af primære cilier er: 1) valg af cellelinje og optimal cellekultur praksis; 2) anvendelse af gelatine belagte dækslip; 3) konsekvent brug af frisk 4% paraformaldehyd; 4) inkubation af det sekundære antistof og DAPI i mørke; 5) udfører en blid flip og placering af dækslæbet på toppen af monteringsmediet i diaset.
Der er ingen forudseelige potentielle begrænsninger i protokollens fremtidige anvendelse. Desuden er primær cilia forskning bliver mere relevant på en række områder, og nem, hurtig og pålidelig cilia detektion metoder er afgørende. Endvidere vil denne protokol lette den fremtidige undersøgelse af primær cilier i celletyper, hvor primære cilier hidtil ikke er blevet opdaget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Forsvarsministeriet i Tjekkiet - Langsigtet organisation udviklingsplan Medicinske aspekter af masseødelæggelsesvåben af Fakultetet for MilitærSundhedsvidenskab, University of Defence; Ministeriet for Uddannelse, Ungdom og Sport, Tjekkiet (Specifikt forskningsprojekt Nr.: SV/ FVZ201703) og PROGRES Q40/06. Også tak til Daniel Diaz for hans venlige hjælp i engelsk revision.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
