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Immunology and Infection

Estudando efeitos da fumaça do cigarro na infecção por pseudomonas em células epiteliais pulmonares

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/61163
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Descrito aqui é um protocolo para estudar como o extrato de fumaça de cigarro afeta a colonização bacteriana em células epiteliais pulmonares.

Abstract

O tabagismo é a principal causa etiológica para enfisema pulmonar e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). O tabagismo também promove a suscetibilidade a infecções bacterianas no sistema respiratório. No entanto, os efeitos do tabagismo em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares humanas ainda não foram estudados minuciosamente. Descrito aqui é um protocolo detalhado para a preparação de extratos de tabagismo de cigarro (ECA), tratamento de células epiteliais pulmonares humanas com ESC, e determinação de infecção bacteriana e infecção. O CSE foi preparado com um método convencional. As células epiteliais pulmonares foram tratadas com 4% de CSE para 3 h. As células tratadas com CSE foram, então, infectadas com Pseudomonas em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. As cargas bacterianas das células foram determinadas por três métodos diferentes. Os resultados mostraram que a CSE aumentou a carga de Pseudomonas em células epiteliais pulmonares. Este protocolo, portanto, fornece uma abordagem simples e reprodutível para estudar o efeito da fumaça de cigarro em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares.

Introduction

O tabagismo afeta a saúde pública de milhões de pessoas em todo o mundo. Muitas doenças deletérios, incluindo câncer de pulmão e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), estão relacionadas ao tabagismo1,,2. O tabagismo aumenta a suscetibilidade a infecções microbianas agudas no sistema respiratório3,,4,5. Além disso, evidências crescentes comprovam que o tabagismo aumenta a patogênese de muitas doenças crônicas6,,7,8. Por exemplo, o tabagismo pode aumentar as infecções virais ou bacterianas que causam a exacerbação da DPOC9. Entre os patógenos bacterianos que contribuem etiologicamente para a exacerbação aguda da DPOC, um patógeno de bacilo gram-negativo oportunista, Pseudomonas aeruginosa,causa infecções que se correlacionam com prognósticos ruins e maiores mortalidades10,11. A exacerbação da DPOC piora a doença acelerando a progressão patológica. Não há terapias eficazes contra a exacerbação da DPOC, exceto para a gestão antissintomática12. A exacerbação da DPOC promove a mortalidade do paciente, diminui a qualidade de vida e aumenta a carga econômica sobre a sociedade13.

As vias respiratórias são um sistema aberto, continuamente submetido a vários patógenos microbianos presentes externamente. Patógenos bacterianos oportunistas são geralmente detectados nas vias aéreas superiores, mas às vezes são observados nas vias aéreas inferiores14,15. Nos modelos animais P. aeruginosa pode ser detectado em sacos alveolares logo 1h após a infecção16. Como um grande mecanismo de defesa, células imunes como macrófagos ou neutrófilos eliminam as bactérias nas vias aéreas. As células epiteliais pulmonares, como a primeira barreira fisiológica, desempenham um papel único na defesa do hospedeiro contra infecções microbianas. As células epiteliais pulmonares podem regular a invasão microbiana, colonização ou replicação independente das células imunes17. Algumas moléculas encontradas em células epiteliais, incluindo PPARg, exercem funções antibacterianas, regulando assim a colonização bacteriana e a replicação nas células epiteliais pulmonares18. O tabagismo pode alterar as moléculas e prejudicar a função normal de defesa nas células epiteliais pulmonares19,20. Estudos recentes relataram exposição direta da fumaça do cigarro às células epiteliais pulmonares usando o aparelho de fumo robô21,22. A exposição à fumaça pode ser realizada de outras formas, incluindo a aplicação de CSE. A preparação do CSE é uma abordagem reprodutível com aplicações potenciais em outros tipos de células, incluindo células endoteliais vasculares que são indiretamente expostas à fumaça de cigarro.

Este relatório descreve um protocolo para gerar extrato de fumaça de cigarro para alterar a carga bacteriana em células epiteliais pulmonares. O CSE aumenta a carga bacteriana de P. aeruginosa,e pode contribuir para a recidiva de infecções bacterianas geralmente vistas na exacerbação da DPOC. Um método convencional é usado para a preparação de CSE. As células epiteliais pulmonares, em seu estágio de crescimento exponencial, são tratadas com 4% de ESC por 3 h. Alternativamente, as células epiteliais pulmonares cultivadas por monocamadas podem ser diretamente expostas à fumaça do cigarro em uma interface ar-líquido. As células tratadas com CSE são então desafiadas com Pseudomonas em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. As bactérias são propagadas a uma velocidade de agitação particular para garantir que a morfologia de sua flagela permaneça intacta para manter sua capacidade invasiva total. A gentamicina é empregada para matar as bactérias deixadas no meio da cultura, reduzindo assim a contaminação potencial durante a subsequente determinação da carga bacteriana. O protocolo também usa Pseudomonascom a etiqueta GFP, que tem sido utilizada como uma poderosa ferramenta para estudar a infecção por Pseudomonas em diferentes modelos. Uma cepa representativa é P. fluorescens Migula23. O grau de infecção ou carga bacteriana após o tratamento de ESE é determinado de três maneiras: o método de placa de gota com contagem de colônias, PCR quantitativo usando primers pseudomonas 16S rRNA ou citometria de fluxo em células infectadas com Pseudomonasfluorescentes . Este protocolo é uma abordagem simples e reprodutível para estudar o efeito da fumaça de cigarro em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares.

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Protocol

1. Preparação 100% CSE

  1. Desenhe 10 mL de mídia de cultura celular livre de soro (DMEM/F12 para células BEAS-2B; meio basal de célula epitelial das vias aéreas para células HSAEC) em uma seringa de 60 mL.
  2. Anexar inversamente uma ponta de pipeta de 1 mL apropriadamente aparada ao bocal da seringa como adaptador para segurar o cigarro (3R4F).
  3. Remova o filtro do cigarro. Coloque um cigarro no adaptador de ponta e que combustão o cigarro.
  4. Desenhe 40 mL de ar contendo fumaça em 10 mL de mídia sem soro. Misture a fumaça com o meio tremendo vigorosamente (30 s por sorteio).
  5. Repita o passo 1.4 cerca de 11x em ~7 min até que o cigarro esteja completamente queimado.
  6. Filtre os 10 mL de mídia defumada com um filtro de 0,22 μm para excluir quaisquer microrganismos e partículas insolúveis. Transfira para um tubo estéril fechado. Prepare o CSE 100% não mais do que 30 minutos antes do ensaio subsequente.

2. Cultura pseudomonas

  1. Inoculado congelado P. aeruginosa (cepa PAO1) ou P. fluorescens Migula (cepa PAO143) em uma placa de ágar de caldo de soja tripptic (TSB) para cultura durante a noite a 37 °C.
    NOTA: Para obter bactérias suficientes para o cultivo, espalhe o máximo de bactérias na placa de ágar TSB possível.
  2. Colete uma mancha bacteriana e incubar em 20 mL de TSB com 5% de glicerol como fonte de carbono.
  3. Agite a suspensão bacteriana em uma incubadora de 37 °C a 200 rpm por 1h até o valor OD600 = 0,6.
    ATENÇÃO: Não deixe que a velocidade de agitação exceda 200 rpm. Velocidades de agitação mais altas podem danificar a morfologia da flagela bacteriana e impactar a invasão bacteriana na epitélia pulmonar. Da mesma forma, limitar o tempo de agitação a 1h para obter bactérias altamente invasivas. Meça o valor de600 OD para estimar o número de bactérias. Um OD600 = 1 corresponde a ~109 unidades formadoras de colônias (CFU)/mL.

3. Cultura de células epiteliais pulmonares humanas e tratamento de ESC

  1. Cultura células BEAS-2B humanas em meio HITES (500 mL de DMEM/F12, 2,5 mg de insulina, 2,5 mg de transferrina, 2,5 mg de selenita de sódio, 2,5 mg de transferrina, 10 μM de hidrocortisona, 10 μM β-estradiol, 10 mM HEPES e 2 mM L-glutamina) suplementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS) como descrito anteriormente24.
  2. Cultura células epiteliais primárias das pequenas vias aéreas humanas (HSAEC) no meio de cultura de células epiteliais das vias aéreas (500 mL de Airway Cell Basal Medium, 500 μg/mL HSA, 0,6 μM ácido linoleico, 0,6 μg/mL lecitina, 6 mM L-glutamina, extrato de 0,4% P, 1,0 μM de epinefrina, 5 μg/mL transferrina, 10 nM T3, 1 μg/mL hidrocortisona, rh EGF 5 ng/mL e 5 μg/mL rh insulina rh). Incubar as células a 37 °C em 5% de CO2.
  3. Dissociar as células com 1 mL de 0,25% de trippsina por 5 minutos até que as células se desprendem completamente do fundo da placa.
  4. Adicione 10 mL de meio HITES completo para neutralizar a trippsina e colete as células em um tubo de 15 mL. Centrifugar a 4 °C a 300 x g por 5 min.
    ATENÇÃO: Monitore cuidadosamente o tempo para digestão de trippsina por microscopia, pois a superdigestão pode causar morte celular.
  5. Descarte o supernascer e resuspenque as células em 2 mL de meio HITES com 10% de FBS.
  6. Pipeta 10 μL da suspensão celular acima na placa e inseri-la em um contador celular automatizado para obter a concentração em células/mL.
  7. Placas BEAS-2B a uma concentração de 3 × 105 células/mL em 6 placas de poço em um volume total de 2 mL em meio HITES suplementado com 10% de FBS para cultura noturna.
  8. Trate as células com aproximadamente 80% de confluência, ou 5 x 105 células/mL, com 4% de CSE por 3 h. Antes do tratamento CSE, altere o meio com meio HITES com 1% de FBS.

4. Infecção bacteriana

  1. Adicione P. aeruginosa ou P. fluorescens Migula (~1 × 107 UFC/mL) a cada poço das células tratadas com CSE e incubar por 1 h a 37 °C em 5% DE CO2.
  2. Aspire os supernantes e substitua por 2 mL de meio HITES fresco para tratar com 4% de CSE e 100 μg/mL de gentamicina.
    NOTA: A gentamicina é usada porque é incapaz de penetrar membranas celulares epiteliais pulmonares humanas. Assim, pode matar todas as bactérias do meio, mas não aquelas que invadiram as células epiteliais pulmonares.
  3. Após 1h de tratamento de CSE/gentamicina a 37 °C em 5% de CO2,aspire os supernacantes e lave as células 3x com PBS para a subsequente determinação de concentração bacteriana.
    NOTA: Para confirmar as bactérias internalizadas, as células infectadas com P. fluorescens Migula, com a rotulagem GFP, foram observadas sob microscopia fluorescente.

5. Determinação da concentração bacteriana utilizando o método da placa de gota

  1. Para determinar a carga bacteriana em células infectadas com o método de placa de gota, lave as células tratadas com gentamicina 2x com 2 mL de PBS frio.
  2. Adicione 1 mL de tampão de lise celular (0,5% tritão X-100 em PBS) a cada poço.
  3. Diluir as células contendo as bactérias internalizadas em um gradiente (1:10, 1:100, 1:1.000 e 1:10.000) para a seguinte inoculação na placa de ágar TSB.
  4. Após 16 h de incubação, obtenha os resultados da UFC contando as colônias bacterianas.

6. Detecção RT-qPCR de rRNA bacteriana 16S

  1. Trate as células epiteliais pulmonares infectadas por Pseudomonas(~1 x 106 células/mL) com gentamicina conforme descrito acima. Aspire o meio e lave as células 2x com 2 mL de PBS frio.
  2. Adicione 0,35 mL do tampão de lise de tiocianato guanidium por poço de uma placa de 6 poços. Colete as células com um raspador de células. Pipete o lise em um tubo de microcentrifutura e misture suavemente com a pipeta.
  3. Adicione o mesmo volume (0,35 mL) de 70% de etanol recém-preparado no lise e misture bem. Transfira todas as amostras para uma coluna de spin colocada em um tubo de coleta de 2 mL. Centrifugar a 10.000 x g para 30 s a 20-25 °C. Em seguida, descarte o tampão no tubo de coleta.
  4. Lave a coluna com 0,7 mL de tampão de lavagem 1. Centrifugar a coluna a 10.000 x g para 30 s. Lave a coluna 2x com 0,5 mL de tampão para lavar o RNA ligado à membrana. Repita a centrifugação a 10.000 x g por 2 min.
  5. Coloque a coluna em um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Adicione 30-50 μL de água sem RNase. Centrifugar a 10.000 x g por 1 min. Colete o fluxo e meça a concentração de RNA.
  6. Realize uma reação de transcrição reversa de acordo com o protocolo do fabricante. Misture 1 μg de RNA total com 10 mL de tampão de reação, 1 μL de transcriptase reversa e água sem RNase para uma reação de 20 μL. Conduza a reação de transcrição reversa a 37 °C por 1h e depois 95 °C por 5 min.
  7. Misture os modelos cDNA (1 μL de cada reação de transcrição reversa acima), 5 μL do Mix Mestre contendo corante SYBR, 1 μL de cada primers específicos de 200 nM e água em uma mistura de 20 μL para a análise de PCR a seguir, de acordo com as recomendações do fabricante.
    NOTA: Os seguintes são os primers direcionados ao rRNA 16S de P. aeruginosa: forward 5'-CAAAACTGAGAGCTAGAGTACG-3′; reverter 5'-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH foi usado como um controle de carregamento com os seguintes primers: para a frente: 5'-GGGGGGACTGGTCATGA-3′; reverso: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.
  8. Use o método de tomografia comparativa para determinar a expressão.

7. Detecção de Pseudomonas fluorescentes com citometria de fluxo

  1. Trate as células epiteliais pulmonares infectadas por Pseudomonas(~1 x 106 células/mL) com gentamicina como descrito anteriormente. Aspire o meio e lave as células 2x com 2 mL de PBS frio.
  2. Analise as amostras com um citômetro de fluxo a um comprimento de onda de 509 nm para detecção de GFP. Termine cada leitura em 100.000 contagens. Analisar os dados adquiridos com softwares relacionados.

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Representative Results

Um diagrama é usado para ilustrar o protocolo na Figura 1. As células BEAS-2B epiteliais pulmonares foram tratadas com ETE e desafiadas com Pseudomonas. Pseudomonas no meio de cultura foram mortas pela gentamicina adicionada e as células foram submetidas ao ensaio da placa de gota, detecção RT-qPCR de Pseudomonas ribossomo 16S RNA, e citometria de fluxo. Em comparação com o controle, o tratamento de ECs aumentou substancialmente a infecção bacteriana nos métodos de placas de gota(Figura 2). Correspondentemente, o CSE afetou a carga bacteriana no HSAEC (Figura 3). A viabilidade celular não mudou consideravelmente após 3h de tratamento de 4% de EC, em 1h de infecção por Pseudomonas, ou em 1 h de tratamento de gentamicina (Figura 4 Figura 5 Figura 6). O método RT-qPCR de 16S alvo rRNA(Figura 7) e a citometria de fluxo(Figura 8) demonstraram resultados semelhantes. Os resultados da microscopia fluorescente mostraram que as bactérias rotuladas por GFP são identificadas com células BEAS-2B em um experimento de infecção por Migula de F.A. (Figura 9). Esses resultados sugerem que o tabagismo aumentou a carga de Pseudomonas nas células BEAS-2B.

Figure 1
Figura 1: Apresentação esquemática do protocolo para estudar os efeitos da fumaça do cigarro na infecção por Pseudomonas em células epiteliais pulmonares. Células epiteliais pulmonares cultivadas em pastilhas de cultura celular ou placas de cultura convencionais ou organoides pulmonares foram expostas à fumaça de cigarro por 16 minutos via robô fumante ou tratadas com CSE preparado por 3h. Essas células foram então infectadas com P. aeruginosa por 1 h (MOI = 10). A gentamicina foi usada para eliminar pseudomonas vivas no meio da cultura. As células acima estavam sujeitas ao método de placa de gota, qRT-PCR ou abordagens de citometria de fluxo para determinar a carga bacteriana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Método de placa de queda para determinar a carga bacteriana nas células BEAS-2B epiteliais pulmonares. As células BEAS-2B foram tratadas com 4% de CSE por 3 h. As células foram então submetidas à infecção por P. aeruginosa (cepa PAO1) por 1h seguida de tratamento de gentamicina para outras 1h. As células foram diluídas e as células foram diluídas para inocular placas TSB por 16 h. Colônias foram contadas; os números da CFU são ilustrados na trama. O gráfico mostra ± média sd, e "*" denota P < 0,05. Os resultados são representativos de n = 3 experimentos. O teste t-testudantil não remunerado de duas vias foi usado para grupos tratados com fumaça e não tratados. P < 0,05 indica significância estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Método de placa de queda para determinar a carga bacteriana nas células HSAEC. As pequenas células epiteliais das pequenas vias aéreas humanas foram tratadas com 4% de ECE por 3 h. As células foram então submetidas à infecção por P. aeruginosa (cepa PAO1) por 1h seguida de tratamento de gentamicina para outras 1h. As células foram diluídas e as células foram diluídas para inoculação em placas TSB por 16 h. Colônias foram contadas; os números da CFU são ilustrados na trama. O gráfico mostra ± média sd, e "*" denota P < 0,05. Os resultados são representativos de n = 3 experimentos. O teste t-testudantil não remunerado de duas vias foi usado para grupos tratados com fumaça e não tratados. P < 0,05 indica significância estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Determinação da viabilidade celular nas células beas-2B tratadas pelo CSE. As células BEAS-2B epiteliais pulmonares foram tratadas com 4% de ECE por 3 h. As células foram manchadas com azul trypan e a viabilidade celular foi medida com contador de células. Gráfico mostra média ± SD. Os resultados são representativos de n = 3 experimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Determinação da viabilidade celular em células epiteliais pulmonares infectadas por Pseudomonas. As células BEAS-2B epiteliais pulmonares foram infectadas com P. aeruginosa (MOI = 10) por 1 h. As células foram manchadas com azul trypan e a viabilidade celular foi medida com um contador de células. Gráfico mostra média ± SD. Os resultados são representativos de n = 3 experimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Determinação da viabilidade celular nas células beas-2B tratadas com gentamicina. As células BEAS-2B epiteliais pulmonares foram tratadas com gentamicina de 100 μg/mL por 1 h. As células foram manchadas com azul trypan e a viabilidade celular foi medida com um contador de células. Gráfico mostra média ± SD. Os resultados são representativos de n = 3 experimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: qRT-PCR para determinar a carga bacteriana em células epiteliais pulmonares. As células tratadas na Figura 2 foram submetidas à extração total do RNA. Uma quantidade equivalente de RNA de cada amostra foi transcrita inversa em cDNA, e a quantidade de RNA 16S de P. aeruginosa foi determinada com PCR quantitativo usando pares de primer específicos. Os resultados do qPCR são plotados no gráfico. O gráfico mostra ± média sd, e "*" denota P < 0,05. Os resultados são representativos de n = 3 experimentos. O teste t-testudantil não remunerado de duas vias foi usado para grupos tratados com fumaça e não tratados. P < 0,05 indica significância estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Citometria de fluxo para determinar a carga bacteriana nas células epiteliais pulmonares. As células BEAS-2B foram tratadas com ECE e infectadas com P. fluorescens Migula (cepa PAO143). As células infectadas foram tratadas com gentamicina e digeridas com trippsina para fazer uma suspensão celular. As suspensões celulares foram passadas através do citómetro de fluxo e as células pseudomonasfluorescentes -positivas foram determinadas em um comprimento de onda de 509 nm. Os resultados da citometria de fluxo são traçados no gráfico. O gráfico mostra ± média sd, e "*" denota P < 0,05. Os resultados são representativos de n = 3 experimentos. O teste t-testudantil não remunerado de duas vias foi usado para grupos tratados com fumaça e não tratados. P < 0,05 indica significância estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Observação de infecção bacteriana com microscopia fluorescente. As células BEAS-2B foram infectadas com P. fluorescens Migula (cepa PAO143) por 1 h. As células foram tratadas com gentamicina por mais 1h e lavadas 2x com PBS frio. As bactérias rotuladas por GFP foram observadas sob um microscópio fluorescente em um comprimento de onda de 480 nm e as células BEAS-2B foram visualizadas com uma imagem de fase. As imagens foram mescladas, e o resultado representativo é mostrado. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A invasão bacteriana em células epiteliais pulmonares é um passo crucial na patogênese das infecções bacterianas. O processo de invasão bacteriana nas células pode ser dividido nas seguintes três etapas: Primeiro, as bactérias entram em contato e aderem à superfície da célula epitelial usando sua flagela. Em segundo lugar, as bactérias são submetidas à internalização ou penetram na membrana celular. Finalmente, as bactérias se replicam e colonizam as células se escapam com sucesso dos mecanismos de defesa celular25,26. Abordagens para a observação de infecções bacterianas em micrófagos pulmonares têm sido desenvolvidas há muito tempo, mas com conhecimento limitado das células epiteliais pulmonares27,28. Este estudo determinou a carga bacteriana nas células epiteliais pulmonares através de três abordagens: um ensaio de placa de gota, RT-qPCR para Pseudomonas ribossomo 16S RNA, e citometria de fluxo. Todas as três abordagens funcionam bem com sensibilidades semelhantes. A escolha das abordagens para determinar a carga bacteriana nas células epiteliais pulmonares depende da disponibilidade de equipamentos e tempo. Nestes experimentos, manter a flagela bacteriana intacta e intacta é crucial para o sucesso da infecção celular epitelialpulmonar 29. Um tempo de agitação mais curto com velocidade limitada pode ajudar a promover ainda mais a capacidade de invasão bacteriana30.

Um grande obstáculo na determinação da concentração bacteriana nas células epiteliais pulmonares é a contaminação bacteriana do meio cultural. Em experimentos de infecção celular, as bactérias são adicionadas ao meio de cultura por um período de tempo específico (ou seja, 1h). Dentro desse tempo, parte dessa carga bacteriana invade com sucesso o compartimento citoplasmósmico, mas os resíduos podem se ligar à membrana externa das células. Um antibiótico, a gentamicina, é usado para matar as bactérias no meio da cultura e os resíduos que se ligavam à membrana externa das células31. A gentamicina é considerada não permeável à membrana celular e, portanto, não afetará as bactérias já dentro das células. O tratamento com gentamicina torna ideal para este sistema excluir a contaminação potencial de fora das células epiteliais pulmonares infectadas.

Para estudar os efeitos da fumaça do cigarro na infecção bacteriana nas células epiteliais pulmonares, as células pulmonares devem ser expostas à fumaça de cigarro antes da infecção bacteriana em modelos celulares. Uma abordagem convencional está preparando CSE fresco para tratar células. A geração de CSE é um método econômico para estudos. CSE é fácil de manusear, o processo de fabricação de CSE é simples, e a injeção intratracheal CSE é eficaz na geração de enfisema em modelos animais em um curto período de tempo32. Abordagens de exposição direta ao cigarro também foram desenvolvidas tanto para modelos celulares in vitro quanto para modelos in vivo de roedores. Seis meses de exposição diária à fumaça de cigarros a camundongos é amplamente utilizado para gerar enfisema33. A exposição direta à fumaça do cigarro requer equipamentos complicados que combinam sistemas de combustão de cigarros e cultura celular. A combustão do cigarro produz fumaça de cigarro, mas também gera uma quantidade de calor que pode afetar a temperatura e a umidade da câmara de cultura. Felizmente, técnicas recentes facilitam a exposição direta ao fumode cigarros 21. Um protocolo da Organização Internacional para a Padronização (ISO) foi implementado para experimentos diretos de exposição ao fumo de cigarros22. A exposição à fumaça do cigarro pode ser realizada uma ou várias vezes. Além disso, juntamente com o progresso das técnicas de cultura celular, as células epiteliais primárias pulmonares também poderiam ser cultivadas em pastilhas transparentes para obter uma monocamada de células epiteliais pulmonares confluentes34. Monocamadas de células epiteliais pulmonares imitam estruturalmente as condições fisiológicas nos tecidos pulmonares. As células podem então ser expostas à fumaça gasosa apical ou ao ar na interface ar-líquido35. Além disso, a cultura dos organoides pulmonares emergiu nos estudos pulmonares atuais36,37. Será interessante saber como a fumaça do cigarro afeta a infecção bacteriana nos organoides pulmonares. A abordagem descrita pode imitar a infecção humana em tecidos em vez de células cultivadas e pode tornar possível mais insights sobre infecção bacteriana respiratória inferior.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte por um Instituto Nacional de Saúde R01 concede HL125435 e HL142997 (para CZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50mL syringe BD Biosciences
airway epithelial cell basal medium ATCC PCS-300-030
Bacteria shaker ThermoFisher Scientific
bronchial epithelial cell growth kit ATCC PCS-300-040
Cell Counter Bio-Rad
CFX96 Real-Time PCR System Bio-Rad
High-Capacity RNA-to-DNA KIT ThermoFisher Scientific 4387406
HITES medium ATCC ATCC 30-2004
human BEAS-2B cells ATCC ATCC CRL-9609
human primary small airway epithelial cells ATCC ATCC PCS-300-030
LSRII flow cytometer BD Biosciences
Nikkon confocal microscope Nikkon
OD reader USA Scientific
PCR primers ITD
Pseudomonas aeruginosa ATCC ATCC 47085 PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens Migula ATCC ATCC 27853 P.aeruginosa GFP
Research-grade cigarettes (3R4F) University of Kentucky TP-7-VA
RNeasy Mini Kit Qiagen 74106
Transprent PET Transwell Insert Corning Costar
Tryptic Soy Broth BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Li, T., Long, C., Fanning, K. V.,… More

Li, T., Long, C., Fanning, K. V., Zou, C. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (159), e61163, doi:10.3791/61163 (2020).

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