Descrevemos um método confiável para a preparação de extratos celulares inteiros de leveduras ou outras células usando uma fábrica de congelador criogênico que minimiza a degradação e a desnaturação de proteínas. Os extratos celulares são adequados para purificação de complexos proteicos funcionais, análises proteômicas, estudos de co-imunoprecipitação e detecção de modificações de proteína labile.
A facilidade da manipulação genética e a forte conservação evolutiva das máquinas celulares eucarióticas na levedura saccharomyces cerevisiae tornou-a um organismo modelo genético preeminente. No entanto, uma vez que o isolamento eficiente da proteína depende da interrupção ideal das células, o uso de levedura para análise bioquímica de proteínas celulares é dificultado por sua parede celular que é cara para digerir enzimaticamente (usando lyticase ou zymolyase), e difícil de interromper mecanicamente (usando um batedor de contas tradicional, uma prensa francesa ou um moedor de café) sem causar aquecimento de amostras, o que por sua vez causa denaturação e degradação de proteínas. Embora a moagem manual de células de levedura sob nitrogênio líquido (LN2) usando uma argamassa e pilão evite o superaquecimento das amostras, é trabalhosa intensiva e sujeita à variabilidade na lise celular entre os operadores. Por muitos anos, temos preparado com sucesso extratos de levedura de alta qualidade usando criogrinding de células em uma fábrica de congelador automatizada. A temperatura de -196 °C alcançada com o uso da LN2 protege o material biológico da degradação por proteases e núcleos, permitindo a recuperação de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas. Aqui descrevemos esta técnica em detalhes para células de levedura brotante que envolve primeiro o congelamento de uma suspensão de células em um tampão de lise através de sua adição dropwise em LN2 para gerar gotículas congeladas de células conhecidas como “pipoca”. Esta pipoca é então pulverizada sob LN2 em um moinho de congelador para gerar um extrato congelado “em pó” que é descongelado lentamente e esclarecido por centrifugação para remover detritos insolúveis. Os extratos resultantes estão prontos para aplicações a jusante, como purificação de proteínas ou ácidos nucleicos, análises proteômicas ou estudos de co-imunoprecipitação. Esta técnica é amplamente aplicável para a preparação de extratos celulares de uma variedade de microrganismos, tecidos vegetais e animais, espécimes marinhos, incluindo corais, bem como isolar DNA/RNA de espécimes fósseis forenses e permafrost.
A levedura é um organismo modelo popular para estudos de proteínas, pois é um simples organismo eucariótico com abundância de ferramentas genéticas e bioquímicas disponíveis para pesquisadores1. Por causa de sua parede celular resistente, um desafio que os pesquisadores enfrentam é desaformar as células sem danificar o conteúdo celular. Diferentes métodos estão disponíveis para a obtenção de extratos proteicos através da interrupção de células de levedura que incluem lise enzimática (zymolyase)2,3, lise química4, lise física por congelamento5,à base de pressão (imprensa francesa)6,7, mecânica (contas de vidro, moedor de café)8,9, baseado em sônicação10 e criogênico2,11. A eficiência da lise celular e o rendimento da proteína podem variar consideravelmente dependendo da técnica empregada, afetando assim o resultado final ou a adequação para a aplicação a jusante desejada para o lise. Ao estudar proteínas instáveis, ter modificações pós-transacionais fugazes ou sensíveis à temperatura, é particularmente importante usar um método que minimize a perda ou a degradação da amostra durante a preparação.
Técnica de preparação de extrato | Detalhes | Vantagens | Desvantagens | Análise a jusante | Referência |
Imprensa francesa: Homogeneizador de alta pressão (também conhecido como Microfluidizer) com pré-tratamento enzimático usando Zymolyase | Zymolyase-20T, um homogeneizador de alta pressão microfluidizador. O disruptor consiste em uma bomba de alta pressão acionada a ar (razão 1:250; pressão de ar necessária 0,6-l MPa) e uma câmara de interrupção especial com uma unidade de pressão traseira adicional. É necessário um tamanho amostral mínimo de 20 mL para o processamento. | A interrupção total final obtida usando o protocolo combinado aproximou-se de 100 % com 4 passes a uma pressão de 95 MPa, em comparação com apenas 32 % de interrupção com 4 passes a 95 MPa usando apenas homogeneização sem o Zymolyase. | Não é apropriado para aplicações em pequena escala. As enzimas podem ficar caras para preparações em grande escala. | Purificação de proteínas | 6 |
Batedor de contas: células tratadas com zymolyase com contas de vidro em um instrumento fastprep | Aproximadamente um volume igual de contas de vidro frias, secas e lavadas com ácido é adicionado a um determinado volume de pelotas de célula no tampão de lise e as células são interrompidas por uma agitação manual vigorosa. | É particularmente útil ao fazer extratos de muitas culturas de leveduras pequenas diferentes para fins de ensaio, em vez de para purificação de proteínas. | Durante o procedimento das contas de vidro, as proteínas são tratadas severamente causando espuma extensiva levando à desnaturação proteica. A quantidade de quebra celular varia, enquanto a proteólise, bem como a modificação das proteínas podem resultar do aquecimento do extrato acima de 4°C durante a quebra mecânica. | Principalmente análises de DNA e RNA, mas também análises de proteínas por eletrofiorese de gel desnaturing, com ou sem manchas ocidentais. | 8 |
Tratamento zymolyase seguido de lise usando uma combinação de choque osmótico e homogeneização do Dounce | Após a digestão enzimática das paredes celulares, os esferoplastos são líssedos com 15 a 20 traçados de um pilão apertado (folga de 1 a 3 μm) em um homogeneizador do Dounce. | Vantajoso para o uso de cepas deficientes protease, como BJ926 ou EJ101. Esta é a maneira mais suave de quebrar células de levedura e, portanto, é mais adequada para o preparo de extratos que podem realizar funções enzimáticas complexas (por exemplo, tradução, transcrição, replicação de DNA) e em que a integridade das estruturas macromoleculares (por exemplo, ribossomos, emendas) deve ser mantida. Também é útil para isolar núcleos intactos que podem ser usados para estudos de cromatina (Bloom and Carbon, 1982) ou para extratos de proteína nuclear (Lue e Kornberg, 1987). | As principais desvantagens do procedimento de lise esferoplastia são que ele é relativamente tedioso e caro, especialmente para preparações em larga escala (>10 litros), e os longos períodos de incubação podem levar à proteólise ou modificação de proteínas. Para as preparações de cromatina, elas parecem ser de qualidade variada ou inferior às produzidas pela centrifugação diferencial (baseada na integridade da escada nucleossomo). | Isolando núcleos intactos para estudos de cromatina, extratos que podem realizar funções enzimáticas complexas, extratos que requerem a integridade de estruturas macromoleculares, extratos de proteínanuclear. |
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Interrupção celular de células congeladas flash moendo em nitrogênio líquido usando uma argamassa/pilão ou um liquidificador | As células são congeladas imediatamente em nitrogênio líquido e depois líricas moendo manualmente em uma argamassa usando um pilão, ou usando um liquidificador Waring na presença de nitrogênio líquido. | O protocolo é rápido e fácil. Pode acomodar quantidades variadas de células de levedura, incluindo culturas muito grandes. Sua principal vantagem é que as células são imediatamente retiradas do estado de crescimento ativo em nitrogênio líquido (−196°C), diminuindo as atividades de enzimas degradativas, como proteases e nucleases, bem como atividades que modificam proteínas (por exemplo, fosfates e quinases). É particularmente adequado para fazer extratos de células inteiras a partir de uma única cultura de levedura para purificação de proteínas em larga escala. | Um pouco confuso e potencialmente perigoso para o investigador descuidado. Pequenas amostras (ou seja, culturas de levedura de 10 a 100 ml) não são facilmente processadas porque não há massa suficiente de aglomerados de células congeladas para fraturar efetivamente no liquidificador. É demorado processar amostras individuais e limpar o equipamento entre os usos. | Extratos de células inteiras de uma única cultura de levedura para purificação de proteínas em larga escala. | 2 |
Autolise, fábrica de contas | pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm / Ø 0,5 mm, 5 × 3 min/3 min | Lise rápida e eficiente, especialmente para preparação de extratos em pequena escala | A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas. Equipamento de espancamento de contas necessário. | Análises em pequena escala. | 10 |
Autolise, Sonicação | pH 5.0, 50 °C, 24 h, 200 rpm, 4 × 5 min/2 min, pulser 80%, potência 80% | Os equipamentos de sonicação geralmente estão disponíveis na maioria das instituições. | A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas. Equipamento de sonicação necessário. A lise lenta pode levar mais de 24 horas. | Preparações da parede celular de levedura. | |
Processo de ebulição e congelamento | Nenhum equipamento especializado é necessário além de um freezer padrão e um bloco de aquecimento ou banho de água quente. | Eficiente, reprodutível, simples e barato. | A geração de calor leva à desnaturação e degradação das macromoléculas. | Análises de DNA por PCR. | 5 |
Tabela 1: Comparação dos métodos disponíveis para a preparação de extratos de levedura.
A criogrinding (também conhecida como moagem criogênica/moagem criogênica) é comumente empregada para recuperar ácidos nucleicos, proteínas ou produtos químicos de amostras sensíveis à temperatura de forma confiável para análises quantitativas ou qualitativas. Tem sido usado com sucesso para múltiplas aplicações em diversas áreas, incluindo biotecnologia, toxicologia, ciência forense12,13, ciência ambiental, biologia vegetal14 e ciência de alimentos. O isolamento de macromoléculas biológicas intactas é geralmente criticamente dependente da temperatura. Temperaturas extremamente baixas garantem que as proteases e núcleos permaneçam inativos, resultando em um isolamento confiável de proteínas intactas, ácidos nucleicos e outras macromoléculas para análises subsequentes. De fato, um moinho de congelador normalmente mantém uma temperatura amostral de -196 °C (o ponto de ebulição da LN2), minimizando assim o DNA/RNA ou desnaturação e degradação de proteínas.
A fábrica de congeladores emprega uma câmara de moagem eletromagnética que move rapidamente uma barra de metal sólido ou cilindro para frente e para trás dentro de um frasco contendo a amostra a ser pulverizada entre plugues finais de aço inoxidável. O instrumento cria e rapidamente inverte um campo magnético dentro da câmara de moagem. À medida que o campo magnético muda para frente e para trás, o ímã esmaga a amostra contra os plugues, alcançando assim o “criogrinding” e a pulverização da pipoca. A fábrica de congeladores substitui a argamassa e o pilão e permite o processamento sequencial de várias amostras (ou até 4 amostras menores simultaneamente) com alta reprodutibilidade e evita a variabilidade usuário-usuário associada à moagem manual. Uma vez que as amostras são processadas, os extratos celulares podem ser usados para uma variedade de aplicações a jusante.
Uma limitação de estudar proteínas nativas a partir de levedura é a lise ineficiente das células de levedura devido à sua parede celular resistente. Embora vários métodos tenham sido desenvolvidos, o método mais consistente e eficiente em nossas mãos é o criogrinding de células de leveduras flash congelado como pipoca. Este método permite a preparação confiável de extratos celulares inteiros de alta qualidade de levedura brotante em comparação com outros métodos de lise. Os resultados representativos d…
The authors have nothing to disclose.
A pesquisa no laboratório Gunjan é apoiada por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde, Fundação Nacional de Ciência e do Departamento de Saúde da Flórida. Agradecemos ao estudante de graduação John Parker pela assistência técnica.
50 mL polycarbonate tubes with screw caps | Beckman | 357002 | Centrifuge tubes |
BD Bacto Peptone | BD Biosiences | 211677 | Yeast YPD media component |
BD Bacto Yeast Extract | BD Biosiences | 212750 | Yeast YPD media component |
Beckman Avanti centrifuge | Beckman | B38624 | High speed centrifuge |
Beckman JLA-9.1000 | Beckman | 366754 | Rotor |
D-(+)-Dextrose Anhydrous | MP Biomedicals | 901521 | Yeast YPD media component |
Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | Swinging bucket rotor |
Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Refrigerated centrifuge |
Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | Volume excluder and cryoprotectant |
HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Buffer |
HIS6 antibody | Novagen | 70796 | Antibody for HIS tag |
KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | Salt for maintaining ionic strength |
MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | Proteasome Inhibitor |
Phosphatase inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32957 | Phosphatase inhibitor cocktail |
Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | Protein Stain |
Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32963 | Protease inhibitor cocktail |
Rotor JLA 25.500 | Beckman | JLA 25.500 | Rotor |
Sodium Butyrate | EM Science | BX2165-1 | Histone Deacetylase Inhibitor |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S6521 | Phosphatase Inhibitor |
Sodium Vanadate | MP Biomedicals | 159664 | Phosphatase Inhibitor |
Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | 13408-09-8 | Phosphatase Inhibitor |
Spex Certiprep 6850 freezer mill | SPEX Sample Prep | 6850 | Freezer Mill |
TALON Metal Affinity Resin | BD Biosiences | 635502 | For pulling down HIS tagged proteins |
Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | Non-ionic detergent |
β-Mercaptoethanol | AMRESCO | M131-250ML | Reducing agent |