Summary
提示は、ビブラートメカット心筋切れスライスからヒトおよび動物心室心筋細胞を単離するためのプロトコルである。カルシウム耐性細胞の高収率(最大200細胞/mg)は、少量の組織(<50mg)から得ることができます。このプロトコルは、最大36時間の冷たい虚血にさらされた心筋に適用可能です。
Abstract
動物およびヒトの心臓から心室心筋細胞を分離することは、心臓研究の基本的な方法である。動物の心筋細胞は、一般的に消化酵素と冠状動脈灌流によって単離される。しかし、ヒト心筋細胞の単離は、ヒト心筋標本が冠状灌流を許容しないのが通常であり、代替分離プロトコルは生存細胞の収率が悪いため、困難である。さらに、ヒト心筋標本はまれであり、オンサイト心臓手術を受けた機関でのみ定期的に入手可能である。これは、動物からヒト心筋細胞への所見の翻訳を妨げる。ここで説明する信頼性の高いプロトコルは、心室筋細胞をヒトおよび動物心筋膜から効率的に分離することを可能にする。細胞の損傷を最小限に抑えながら表面対体積比を高めるために、300μm厚の心筋組織スライスは、ビブラートメを用いた心筋標本から生成される。その後、組織スライスをプロテアーゼとコラゲアーゼで消化します。ラット心筋は、フロー細胞測定細胞計数によって、プロトコルを確立し、生存可能なカルシウム耐性筋細胞の収量を定量化するために使用された。一般的に使用される組織チャンク法との比較は、棒状心筋細胞の有意に高い収率を示した(41.5±11.9対7.89±3.6%、p<0.05)。このプロトコルは、ラット心筋と同様に収率が著しく高い失敗したヒト心筋(45.0 ±15.0対6.87±5.23細胞/mg、p<0.05)に翻訳された。特に、提示されたプロトコルでは、生存可能なヒト心筋細胞(9〜200細胞/mg)の合理的な数を最小限の組織(<50mg)から分離することが可能である。したがって、この方法は、人間と動物の両方の心臓からの健康で失敗した心筋に適用可能である。さらに、冷たい心肢麻痺溶液中で最大36時間保存されたヒト組織標本から興奮性および収縮性筋細胞を分離することができ、オンサイト心臓手術を受けずに機関の実験室に特に有用な方法を作り出す。
Introduction
心筋細胞生理学に関する重要な洞察への道を開いた精膜技術は、無傷の心臓から生きている心室心筋細胞の分離である1.分離された心筋細胞は、正常な細胞構造と機能、または生体内実験の結果を研究するために使用することができます。例えば、心疾患の動物モデルにおける細胞電生理学または興奮収縮結合の変化を評価する。さらに、分離された心筋細胞は、細胞培養、薬理学的介入、遺伝子導入、組織工学、および他の多くの用途に使用することができる。したがって、心筋細胞の分離のための効率的な方法は、基礎的および翻訳的な心臓研究にとって基本的な価値がある。
げっ歯類などの小さな哺乳類や、豚やイヌなどの大型哺乳類の心筋細胞は、一般的に、粗なコラゲアーゼおよび/またはプロテアーゼを含む溶液で心臓の冠状灌流によって単離される。これは心筋細胞単離のための「ゴールドスタンダード」法として説明されており、その結果、生存細胞の70%までの収率が2となる。このアプローチは人間の心臓でも使用されており、その結果、許容可能な心筋細胞の収量は,3、4、5,5である。しかし冠状動脈灌流は、無傷の心臓や冠状動脈枝を含む大きな心筋のくさびが利用できる場合にのみ実現可能であるため、ほとんどのヒト心臓検体は、その小さなサイズと適切な血管構造の欠如のために、このアプローチには適していません。したがって、ヒト心筋細胞の単離は困難です。
ヒト心筋標本は主に可変サイズの組織塊(約0.5 x 0.5 x 0.5 cm〜2 x 2 x 2 x 2 cm)から成り、心外筋生検6、中隔筋切除術7、VAD移植8、または外植体9から得られる。心筋細胞の分離のための最も一般的な手順は、はさみまたはメスを使用して組織をミンチから始める。細胞間接触は、カルシウムフリーまたは低カルシウムバッファーに浸漬することによって破壊される。その後、粗酵素抽出物またはプロテアーゼ(トリプシン)、コラゲラーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼなどの酵素を含む複数の消化ステップが続き、細胞外マトリックスの崩壊および心筋細胞の解放が生じる。最終的な重要なステップでは、生理的カルシウム濃度を注意深く回復しなければならないか、カルシウムパラドックス10、11、1211,12による細胞損傷が起こり得る。10この分離アプローチは便利ですが、通常は非効率的です。例えば、ある研究では、13の実験に適した十分な数の心筋細胞を得るために、ほぼ1gの心筋組織が必要であることがわかった。低収量の考えられる理由は、組織をミンチする比較的過酷な方法です。これは、これらの筋細胞が酵素消化によって放出される可能性が最も高いが、チャンクエッジに位置する心筋細胞に特に損傷を与える可能性がある。
ヒト検体から得られる細胞の分離効率と質に影響を与える可能性のあるもう一つの側面は、組織虚血の持続時間である。ほとんどのプロトコルは、良い結果のための前提条件として実験室への短い輸送時間を言及しています。これは、近くの心臓手術施設を持つ実験室にヒト心室心筋細胞の研究を制限します。これらの制限は、ヒト心筋細胞の動物モデルからの重要な知見の検証を妨げる。したがって、少量の組織からの高い心筋細胞収量を可能にする改善された分離プロトコルは、輸送時間の延長後に重大な損傷を受けることなく、望ましい。
ここで説明する分離プロトコルは、ビブラート膜14,15,15で生成された薄い心筋組織スライスの酵素消化に基づく。我々は、組織スライスからの分離は、はさみで刻まれた組織塊からのよりはるかに効率的であることを実証する。この方法は、少量の心筋組織から生じるヒト心筋細胞の高収量を可能にするだけでなく、最大36時間の冷たい心肢麻痺溶液中に保存または輸送された標本にも適用可能である。
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Protocol
ラットを用いた実験はすべて、ドイツのバイエルン州ミッテルフランケン動物ケア・使用委員会によって承認されました。ヒト心臓組織サンプルの収集と使用は、エアランゲン・ニュルンベルク大学とルール大学ボーフム校の機関審査委員会によって承認されました。研究は、ヘルシンキの宣言のガイドラインに従って行われました.患者は組織採取前に書面によるインフォームド・コンセントを与えた。
雌ウィスターラット(150〜200g)を商業的に得て、100mg/kgのチオペンタールナトリウム腹腔内に注入し、子宮頸部脱臼で安楽死させ、続いて胸部の胸部切開術と切除を行った。ヒト心臓組織サンプルは、機械的補助装置の移植中に左心室の心臓核から採取された、中隔筋切除術から、ファロー矯正手術の四徴から、または、外植された心臓の自由な左室壁から採取した。以下のプロトコルは、ヒト心室組織からの分離について説明する。ラット心筋細胞の単離は、それに応じて行われたが、異なる酵素で行われた(材料表を参照)。このプロトコルの概略的なワークフローを図 1に示します。
1. バッファー、溶液、酵素の調製
- 表 1に示すように、バッファとソリューションを準備します。
- ウォームアップソリューション1、2、3と37°Cに変更されたタイロードのソリューション。 使用するまで、4°Cで切削液を保管してください。
注:1~2個の心筋スライスでは、35mm組織培養皿1種での分離には、合計約15mL、8mL、および5mLの溶液1、2、および3が必要です。複数の皿の同時の筋細胞の分離のためにそれに応じてスケールアップ。切断液は、凍結し、数ヶ月間-20°Cで保つことができます。 - プレチル15 mL遠心チューブに1mgのプロテイナーゼXXIV( 材料表を参照)を秤量し、使用するまで氷の上に保存します。これは、1つのサンプルを処理するためのものです。それに応じて量をスケールアップします。プロテイナーゼとコラゲナーゼを混ぜないでください。
- 8mgのコラゲラーゼCLSI( 材料表を参照)をプレチル15 mL遠心チューブに計量し、使用するまで氷の上に保存します。これは、1つのサンプルを処理するためのものです。それに応じて量をスケールアップします。プロテイナーゼとコラゲナーゼを混ぜないでください。
注意:フェイスマスクを着用するか、ヒュームフードの下で働き、酵素粉末の吸入を避けてください。
注:酵素活性は、異なるロットで異なる場合があります。したがって、最適濃度は異なる場合があり、新たに購入した各酵素16で決定する必要があります。
2. 心筋組織の保管と輸送
- 冷却された4°C切断溶液でヒト心臓サンプルを貯蔵・輸送する(表1)。
- さらに組織処理やビブラートメのスライスに同じ溶液を使用してください。
注:生検と外科心臓サンプルは、4°Cで切断溶液にすぐに移管され、このプロトコルの適用前に最大36時間4°Cで保存または輸送することができます。
3. 組織の加工とスライス
注:組織スライスのプロトコルは、フィッシャーら15.
- 組織ブロックのトリミング
注意:ヒト心臓組織は感染する可能性がある。常に保護摩耗を使用し、あなたの機関の安全規則に従ってください。使用済みブレードを注意深く取り扱い、安全容器に捨てます。- 20 mLの冷たい切断液を充填した100mmの組織培養皿に試料を入れ、冷却された4°Cプレートに保管します。
- 過剰な線維組織と外心脂肪をメスで除去します。経壁標本の場合は、内心の近くの柱状および組織層を除去する。
注:線維組織は硬く、白く見えます。脂肪は通常柔らかく、黄色に白く表示されます。放射性組織層と心筋組織層は、外心層の心筋と比較して、緩い組織組成および非整列繊維配向から同定することができる - 最適なビブラートメ加工のために、より大きな組織標本からメスで約8 mm x 8 mm x 8 mm の長方形の組織ブロックを切断します。より小さな生検のためにこのステップをスキップし、アガロース埋め込みに移動します。
- 低融点アガロースへの心臓組織の埋め込み
- ガラスビーカーで10mLの切断液で400mgの低融点アガロースを沸騰させる。
注意:火傷を避けるために手袋と安全メガネを着用してください。熱保護摩耗だけで熱いガラス製品を扱う。 - 熱い、溶解したアガロースゲルで10 mLの注射器を充填する。注射器を密封し、アガロースを37°Cの水浴で少なくとも15分間平衡させます。
- 鉗子を使用して、トリミングされた心臓標本または生検を、心外膜を下に向けた清潔な35mm組織培養皿に入れ、滅菌綿棒で余分な液体を取り除きます。
- 平衡したアガロース(ステップ3.2.2)を、シリンジを空にして組織の上に注ぎます。アガロースを注ぎながら鉗子で動きに対して組織を固定します。組織がアガロースに完全に浸かっていることを確認してください。
- すぐに皿を氷の上に置き、アガロースを10分間固めます。
- ガラスビーカーで10mLの切断液で400mgの低融点アガロースを沸騰させる。
- 心筋をスライスする
- ビブラートメのブレードホルダーに新しいカミソリの刃を取り付け、可能であればブレードのz偏向を調整してビブラートメをキャリブレーションします。
注:このプロトコルは、赤外線アシストキャリブレーションデバイスを備えたビブラートメを使用して、最小のz偏向(測定された偏向<0.1 μm)で水平位置にブレードを整列させます。 - メスを使用して、ビブラートメの標本ホルダーに合ったアガロース組織ブロックを切除します。安定性を確保するために、組織がまだ十分にアガロース(アガロースマージン≥ 8 mm)に浸漬されていることを確認してください。
- シアノアクリル酸接着剤と穏やかな圧力の薄い層で標本ホルダーにアガロースブロックを固定します。
- 組織を持つ標本ホルダーをビブラートメ浴に入れる。切断液で浴を充填し、ビブラートメの外側冷却タンクに充填された砕いた氷で加工全体を通して4〜6°Cに保ちます。
- 300 μm 厚いスライスを生成し、速度は≤0.1 mm/s、振動周波数は 80 Hz、横振幅は 1.5 mm、ブレード角度は 15°です。スライスを扱うときは、組織自体の代わりにアガロースを保持し、組織の損傷を避けます。スライスは、必要に応じて最大2時間4°Cで切削液に保管してください。
注:心筋細胞は、心外膜に平行に配向されています。したがって、過度の筋細胞損傷を避けるために、外心に平行に切断することが重要である。分離には均一な厚さのスライスのみを使用する必要がありますので、最初の1〜3スライスを破棄することをお勧めします。しかし、小さな組織生検の場合は、最初のスライスのみを廃棄します。 - 40-100xの倍率の標準的な軽い顕微鏡の下で心筋細胞の位置合わせを点検しなさい。
- ビブラートメのブレードホルダーに新しいカミソリの刃を取り付け、可能であればブレードのz偏向を調整してビブラートメをキャリブレーションします。
4. 組織消化
- ラボシェーカーにヒートプレートを置き、37°Cに温めます。 ラボシェーカーを65 rpmで起動します。
- プロテイナーゼ(ステップ1.3で調製)を溶液1(ステップ1.1および1.2)の2mLに溶解し、使用するまで37°Cでインキュベートする。プロテイナーゼとコラゲナーゼを混ぜないでください。
- 2 mLの溶液1(ステップ1.1および1.2)にコラゲターゼ(ステップ1.4で調製)を溶解し、使用するまで37°Cでインキュベートする。プロテイナーゼとコラゲナーゼを混ぜないでください。
注意:溶存酵素は皮膚や目の怪我を引き起こす可能性があるため、保護眼鏡と手袋を着用してください。 - クロリドカルシウム(CaCl2)をコラゲナーゼ含有溶液(ステップ4.3で調製)に加え、5μMの最終濃度にします。
- 鉗子を使用して、ビブラートメ浴から5 mLのプレチル切断溶液(ステップ1.1および1.2)で満たされたきれいな60mmの組織培養皿に組織スライスを移し、氷の上に置きます。
- 慎重にブレードまたは鉗子で心筋組織からアガロースを除去します。
注意:心筋細胞に損傷を与える可能性があるため、心筋切れに余分な張力やせん断応力を避けてください。 - 最初の洗浄を行うために、ヒートプレートに清潔な35mmティッシュ培養皿を置き、2mLのプリウォーム(37°C)溶液1で満たします。1~2本の心筋スライスを鉗子で準備した皿に移します。溶液を1 mLピペットで吸引し、洗浄工程2xを実行して切削液の残骸を除去する。
注:心臓スライスを吸引しないでください。溶液とスライスは、攪拌熱板上の35°Cの一定温度に留まる必要があります。必要に応じて、ヒートプレートの温度を調整します。 - 溶液1を皿から取り出し、2mLのプロテイナーゼ溶液を加える(ステップ4.2)。ヒートプレート上で65rpmで12分間インキュベートする。
- 2mLのプレウォーム溶液1(37°C)で2倍洗浄します。
- 皿から溶液1を取り出し、コラゲナーゼ溶液2mLを加える(ステップ4.3および4.4)。ヒートプレート上で少なくとも30分間、65rpmでインキュベートする。
- 軽顕微鏡で皿を置くことによって30、35、40分等の自由な個々の筋細胞を点検しなさい。ソリューションの大幅な冷却を避けるために迅速に作業します。
注:必要な消化時間は、組織の体質や線維化の程度によって異なる場合があります。組織が目に見えて柔らかくなり、穏やかに引っ張られたときに容易に解約するとすぐに、最適な消化時間に達した。十分な組織が利用可能な場合は、いくつかのスライスを様々な消化時間と並行して消化することができます。 - 組織が消化され、個々の筋細胞が見える(ステップ4.11)場合は、2mLのプリウォーム溶液2(37°C)で2倍洗浄し、2mLで再び充填します。
5. 組織解離
- 慎重に繊維を引き離すことによって鉗子で消化された組織スライスを解離します。
- 1回使用パスツールピペット(開口径>2mm)でピペットを数回慎重に使用してください。
注:鉗子およびピペットの使用は、機械的ストレスを誘発し、心筋細胞損傷を引き起こす可能性があります。しかし、細胞の分離には重要なステップです。細かい鉗子を使用して細胞の損傷を最小限に抑え、スライスを慎重に小さく切り分けます。 - 軽顕微鏡下で解放された棒状心筋細胞がないか確認します。
生理的カルシウム濃度の再導入
- 熱板上で35°Cで撹拌しながら、カルシウム濃度を5μMから1.5mMにゆっくりと増加させます。10 mM および 100 mM CaCl2 ストックソリューションを使用してください。推奨ステップ:20、40、80、100、150、200、400、800、1,200、1,500 μM.各ステップ間の5分のインキュベーション間隔で増加したカルシウムレベルに細胞を適応させます。
- 鉗子で未消化のティッシュチャンクを注意深く取り除くか、カルシウム増加の終わりに180 μmの細孔サイズのナイロンメッシュを通して細胞懸濁液をろ過する。
7. 機械的アンカップリング剤の除去
- 撹拌を停止し、1,000 μL ピペットで溶液の1/3(約700 μL)を上からゆっくりと取り除きます。心筋細胞の吸引を避けてください。
注:未消化の組織が除去された場合、心筋細胞は、無細胞溶液の吸引を容易にする皿の中心に蓄積します。そうでなければ、細胞溶液を15mL遠心管に移し、細胞が35°Cで10分間沈降させ、700μLの上清を吸引し、廃棄し、細胞を再懸濁し、35mm組織培養皿に戻し、ステップ7.2に進みます。 - 700 μLの溶液3を細胞に加え、ヒートプレート上で撹拌を再開し、10分間インキュベートする。
- 手順 7.1 と 7.2 を繰り返します。
- 溶液を15 mL遠心分離管に移し、心筋細胞を最低10分間、室温で最大30分間沈み、50 x g で1分間回転させます。上清を完全に取り除き、変更されたTyrodeの溶液または所望の実験バッファーで再中断します。
注意:心筋細胞は、使用前に37°Cおよび5%CO2で数時間、変性タイローデの溶液(表1)に保存することができます。 - 40倍と200倍の倍率で標準的な光学顕微鏡で細胞の品質を確認します。
注:心筋細胞の約30〜50%は、膜ブレブなしで棒状、滑らかで、明確なクロスストリオンを表示する必要があります。生存可能な細胞の5〜10%だけが自発的な収縮を示すべきである。
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Representative Results
分離効率を検証するために、ラット心筋と共にプロトコルを使用し、その結果生じる生存可能な筋細胞の数を冠血球灌流による単離および小組織チャンクからの分離(チャンク分離、 図 2).同じ心臓から組織スライスからのチャンク分離と分離を行った。しかし、冠状灌流による単離のために、心臓全体が使用された。冠状灌流は主に棒状および交差する心筋細胞を生み出した。心筋切れから分離すると、棒状細胞の割合は低かったが、総数は依然として高かった。対照的に、組織チャンクから分離した後、回収された棒状細胞はごくわずかである(図 2A).フローサイトメトリーを用いて、結果を定量的に比較した。比較的大きなサイズとクロスストリケーションのために、心筋細胞は通常、前方および側面散乱の両方に大きな値を示す。これらの特性は、フローサイトメトリック細胞分析装置を用いて棒状の筋細胞を数えるために使用され、ハイパー収縮および丸みを帯びた心筋細胞から棒状を識別する単純な格子状スキームを適用した。(補足図 1).代表的なドットプロットは、 図 2B.統計的分析は、組織チャンク(41.5 ±11.9対7.89±3.6%、それぞれ;n=3分離;p)よりもスライスから分離するための心筋細胞ゲートCM1で顕著に高いカウントを示した。 < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (図2C).したがって、組織スライスからの心筋細胞の分離は、冠状灌流によって得られた収量に達しないが、組織チャンクからの単離よりもかなり多くの棒状筋細胞をもたらし、その後の実験に十分な細胞を提供する。細胞数に加えて、ラット心筋細胞の構造パラメータを定量化した。細胞長、細胞幅、サルコメアの長さは、灌流または組織スライスから分離された細胞で異ならなかった(長さ = 110.0 ± 5.4 μm対99.4 ±3.2 μm、 p > 0.05; 幅 = 33.9 ± 1.9 μm 対 30.6 ± 1.2 μm、 p > 0.05、n = 19 および n = 21 セルそれぞれ; サルコメア長 = 1.62 ± 0.04 μm 対 1.68 ± 0.04 μm, p = 0.28, n = 24 セル(補足図 2A-C).電界刺激を受けたFluo-4負荷筋細胞を用いた17 機能パラメータも評価された(補足図2D–F).平均活性化時間(27.5 ±1.5対23.6±2.5ミリ秒、n =100対n=31セル;灌流対スライス、p > 0.05)補足図2D)および相対短縮(12.2 ± 1.1対11.3±2.5%、n = 42対n=7細胞、灌流対スライス、p > 0.05)補足図 2F)刺激に反応した心筋細胞の2つの群の間で有意に異なっていなかった。カルシウム過渡振幅(最大限正規化されたCa2+、F/F0) (補足図 2E)は、灌流によって分離された心筋細胞(4.9±0.2対5.7±0.3、n=104対n=25細胞、灌流対スライス、p.スライス、p)と比較して、スライスから分離された心筋細胞においてわずかに増強された。 < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (補足図2G).培養後の細胞質を評価するために、細胞培養における48時間後の電界刺激に応答して収縮する筋細胞の割合を決定した。17.応答細胞の割合は、両方のグループで約半分に減少しました(41.9 ± 3.6%対31.5 ± 2.3%、灌流対スライス、p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (補足図2H).
次に、プロトコルをヒト心筋に適用した。組織スライスから得られた棒状および生存可能な単離されたヒト心室心筋細胞の数を、同じ心筋標本の組織塊から得られた数と対比して比較した(図3)。心筋切れから分離すると、棒状の大部分が大きく、丸みを帯びた心筋細胞の割合がごくわずかであることがわかりました(図3A)。広視野画像から棒状の筋細胞を数え、その数を分離に使用される組織湿潤重量で正規化した。この定量化は、心筋切れから分離すると、組織チャンクからの単離よりもロッド型筋細胞の数が著しく多いことを示した(45.0 ± 15.0対6.87 ± 5.23細胞/mg、n = 7分離、p<0.05、ペアの2つテールtテスト) (図3B)。さらに、生存率をMTT生存アッセイ14で評価し、細胞ライセート中のタンパク質の全量に対するフォトメトリックフォーマザン吸収を正規化した。フォトメトリック定量化は、心筋切れから分離した後に実質的に高い筋細胞生存率を確認した(4.76± 0.47対1.09 ± 0.18 AU、n = 3分離、p<0.05、ペアの二尾t-test)。Figure 3C
合計で、この方法は、30人の心臓からの心筋標本に適用され、輸送時間は最大36時間であった。30個の標本の生存細胞のうち23個から、その後の実験のために得られた(補足表1も参照)。失敗した実験の例 (例えば、1 皿あたり <100 セル) を補足図 3に示します。ここで、ほとんどの細胞は高い細胞外カルシウムおよび過収縮を許容しなかった。我々は、14の隔離から筋細胞の収縮性を評価し、2つのケースでは細胞が電気刺激に反応しなかった。この技術は、大人の心臓から得られた大きな標本だけでなく、小児の心臓からの小さな生検(わずか40mg)でも働いていることに注意してください(補足図4)。
記載されたプロトコルで単離されたヒト細胞を構造解析に供することができることを実証するために、それらはα−アクチニン、EC結合タンパク質L型カルシウムチャネル(LTCC)およびリアノジン受容体(RyR)、ならびに細胞膜および核を染色し、最近ラットの筋細胞17に記載された染色法に従って(図4)。アルファアクチニン染色は、静休み心筋細胞における緻密で規則的なz線パターンおよび平均サルコマー長1.92±0.06μmを明らかにした(n = 4、図4A)。LTCCとRyRは明確なクラスターを示し、予想通り、細胞膜とt-tubuleの近くで共局した(図4B)。
このポテンショメトリック色素FluoVolt18とカルシウム感受性色素Fluo-417は、記述されたプロトコルで単離されたヒト心筋細胞が興奮可能であり、細胞電気生理学または興奮収縮結合に関する研究に使用できることを実証するために使用された(図5)。アクションポテンシャル(AP)の形状と持続時間を解析した(図5A、B)。BAP持続時間50%および90%の値(APD 50:400.6±41.1 ms、APD90:748.9±56.6ms、n=10細胞)は、人間の心臓障害から心室心筋細胞の他の人によって報告50された範囲であった4、6、7、9。6,7,94Fluo4にロードされた細胞の共焦点線スキャンによって記録されたカルシウム過渡量(図5C、D)は、刺激後の明確なアップストロークと許容可能なシグナル対雑音比を示した。Dカルシウム過渡振幅(最大F/F0)は2.9±0.5(n=31細胞)であった。収縮による心筋細胞の短縮は、4.6±0.8%(n=31細胞)の平均を有した下側細胞境界の偏向から例に見ることができる。
図1:ヒト心臓組織スライスからの分離プロトコルのワークフロー。ヒト心筋からの組織ブロックまたは生検(左上)は低融点アガロースに埋め込まれ、300μm厚いスライスはビブラートオームの振動ブレード(上中央)で生成されます。スライスは文化皿に移され、周囲のアガロース(右上)から取り除かれます。組織消化は、加熱および攪拌されたプレート(中、左)上で〜35°Cおよび65rpmで行われ、(ステップ4.8)タンパク質酵素を補った公称的にカルシウムフリー溶液中のインキュベーション、(ステップ4.10)細胞外マトリックスコラーゲンの消化、(ステップ5)個々の心筋筋筋術とピペットによる解放を含む。(ステップ6)5 μMから1.5mMまでの細胞外カルシウム濃度の遅い上昇を5分間隔で(ステップ7)機械的なアンカプラー2,3-ブタンジオン単軸(BDM)のステップワイズ除去。ロッド状および交差したヒト心筋細胞を回収する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:心筋細胞の心筋切れ、灌流、およびチャンク分離(A) ラット心筋細胞の代表的な光顕微鏡写真は、冠状灌流(灌流)、ビブラートカット組織(心筋切り)、または細かい組織(組織チャンク)から分離した。(B) Aに記載されている心筋細胞の分離からのそれぞれの代表的なフローサイトメトリードットプロット.側面散乱領域(SSC-Area)および前方散乱領域(FSC-Area)をそれぞれ細胞の粒度およびサイズの指標として使用した。心筋細胞用ゲートCM1のゲーティングスキームは黒線で示され、合計カウントの各端数はパーセントで表示されます。(C)1群当たりn=3細胞分離から B に記載されているようにフローサイトメトリック解析により評価された心筋細胞(CM1)の画分の平均±標準誤差。心筋の切片および組織の塊からの分離は同じ心臓から行われた(対の両側t検定)。灌流による分離は、異なる動物の全心から行われ、対になっていない二尾t検定によって比較された。*p < 0.05,多重比較訂正後。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:心筋切れと細かい組織チャンクからの分離後のヒト心筋細胞の収量と生存率の比較(A)組織スライスから分離した後のカルシウム耐性ヒト心室心筋細胞の代表的な画像。ロッド状および線条状心筋細胞は優勢であり(黒矢印)、丸みを帯びた細胞とハイパーコントラクトされた細胞(白い矢印)はわずかである。(B)広いフィールド顕微鏡写真から数え、n= 7対分離から入力材料の湿重量(ミリグラム)に正規化された心筋切れまたは組織チャンクから、平行に分離されたカルシウム耐性の棒状筋細胞の定量化。(C) MTTアッセイ後のフォルマザン色素吸光度のフォトメトリック測定による心筋細胞生存率の定量化吸光度を全タンパク量に正規化し、n=3対分離からBCAアッセイにより評価した。*p < 0.05, **p < 0.01 (ペアの両側t検定)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:分離後のヒト心筋細胞の微細構造特性(A)α-アクチニン(緑色)と4′,6-ディアアミジン-2-フェニリンドール(DAPI、ブルー)を用いた核染色の免疫染色後の代表的な共焦点顕微鏡像。Aサルコメアの長さは1.92 ±0.06μm(n = 4筋細胞)で、フーリエスペクトルを解析して決定した。(B)L型カルシウムチャネル(LTCC)および心臓リノジン受容体(RyR)に対して共免疫化された固定ヒト心室心筋細胞の代表的な共焦点顕微鏡画像。また、RyR及びLTCC(オーバーレイ)のオーバーレイと、小麦胚芽凝集剤(WGA、マゼンタ)による細胞外マトリックスの染色も示されている。核はDAPI(青色)で染色した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ヒト心室筋細胞における作用電位及び細胞内カルシウム過渡性。(A)ポテンショメトリック色素フルオボルト(緑色、488nm励起波長)を搭載した単離されたヒト心筋細胞の2次元共焦点像。赤色のボックスは、0.5Hzでの電界刺激時に高速線スキャンで測定されたtチューブラー系の元素を示し、Aに記載されているように共焦点イメージングによって得られた5つの連続した作用電位の平均およびベースライン正規化蛍光(F/F0)を示す。0(C)縦方向の細胞軸に沿ったカルシウム感受性色素Fluo-4 AM(488nm励起波長)を搭載した単離されたヒト心筋細胞のラインスキャン画像。蛍光強度はグレー値[AU]で示され、青い点はスキャンされた線に沿って各ピクセルの蛍光強度(dF/dtmax)の最大上昇を示します。サンプリングレートは、Cで画像からCの画像から、そして刺激前のベースライン値に正規化から、スキャンラインに沿って各ピクセルの蛍光を平均したカルシウム過渡量を529Hz(D)であった(F/F0)。0全ての実験を室温で行った。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前 | mmol/Lの組成 | サプリメント | 博士 | mL で必要なボリューム |
| ソリューション 1 | 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2,10 グルコース, 70 グルタミン酸, 20 タウリン, 10 β-ヒドロキシブチレート, 30 BDM | 2 mg/ml ウシ血清アルブミン | 7.3 と KOH | 300 |
| 解決策 2 | 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2,10 グルコース, 70 グルタミン酸, 20 タウリン, 10 β-ヒドロキシブチレート, 0.005 CaCl2,30 BDM | 10 mg/ml ウシ血清アルブミン | 7.3 と KOH | 300 |
| ソリューション 3 | 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2,10 グルコース, 70 グルタミン酸, 20 タウリン, 10 β-ヒドロキシブチレート, 1.5 CaCl2 | 10 mg/ml ウシ血清アルブミン | 7.3 と KOH | 300 |
| 変更されたタイロードのソリューション | 130 NaCl, 0.4 NaH2PO4, 5.8 NaHCO3, 5.4 KCl, 0.5 MgCl 2 , 1.5 CaCl2,25 HEPES, 22 グルコース2 | 2 mg/ml ウシ血清アルブミン | 7.3 NaOH で 5 % CO2 | 100 |
| カッティングソリューション | 138 NaCl, 0.33 NaH2PO4, 5.4 KCl, 2 MgCl2, 0.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 グルコース, 30 BDM | 7.3 と NaOH | 500 |
表 1: バッファーとソリューション 必要なバッファーとソリューションの構成。
補足図1:心筋細胞(CM1)の格子化スキームの検証。 フローサイトメトリーからのドットプロットは、対照サンプル(CTRL)中の検出された細胞のサイズと粒度を示す前方および側面散乱領域(FSC-A、SSC-A)を測定し、10mmカルシウムを含む改変タイロードの溶液中で37mCで15分間の心筋細胞を培養した後に測定する。高い細胞外カルシウムは、棒状心筋細胞の過収縮および丸めを引き起こし、細胞の減少をもたらす(87.6%対6.00%)定義されたゲート(CM1)内で。 こちらをダウンロードしてください。
補足図2:心筋細胞特性は、灌流またはスライスから分離した。細胞長(A)および細胞幅(B)は、灌流による直接の分離後のラット心筋細胞、または顕微鏡による心筋切れから直立して固定されたラット心筋細胞(それぞれn=19およびn=21細胞)から求めた。サルコメアの長さ(C)は、α-アクチニンおよびフーリエ分析(n =24およびn=23細胞)による免疫染色後の顕微鏡画像から決定した。平均活性化時間(D)、最大F/F0(E)および相対的短縮(F)は、灌流または心筋切れによって単離されたFluo-4負荷心筋細胞から評価され、電気刺激に応答する(n = 100/31筋細胞D、n= 104/25 myocytesはEで104/25/750 E電気刺激で収縮した棒状心筋細胞(G)の割合を、標準的な光顕微鏡で200倍倍倍率で10視野のロッド状細胞と収縮細胞の総数を数えて評価し、灌流およびスライス分離(n=452/276細胞)についてそれぞれ評価した。(H)Gで行うが、培養の48時間後(n=371/329細胞)で行われる分析。こちらをダウンロードしてください。
補足図3:低収率でヒト心筋細胞分離。 主に過収縮(青)または丸みを帯びた細胞(黒)と少数の棒状および線条体細胞(白)を有する単離からの筋細胞の代表的な光顕微鏡画像。 こちらをダウンロードしてください。
補足図4:乳児心臓生検からの心筋細胞分離。 (A)乳児におけるファロー四徴性矯正手術で得られた心外心生検(約40mg)の画像。(B) Aに示す組織からの心筋スライス 、アガロースに埋め込まれる。(C) Bに示すように心筋切れから隔離された心筋細胞 こちらをダウンロードしてください。
補足表1:ヒト患者データ。 この研究に含まれるヒト患者からのサンプル数のリストが与えられる。サンプルは、手術の種類、年齢、病因、輸送時間に応じて分類され、それぞれのサンプルの総数と成功した筋細胞分離の数が示されました。 こちらの表をダウンロードしてください。
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Discussion
生きている心筋細胞の分離は40年以上前に確立され、心臓研究における多くの実験的アプローチの前提条件であるが、予測不可能な結果を伴う困難な技術のままである。酵素溶液を用いた冠状動脈の灌流による心筋細胞の単離は、一般的に小動物の心臓に使用され、多数の生存細胞を生み出す。しかし、これには比較的複雑なシステムと専門知識が必要です。さらに、ほとんどのヒト組織サンプルは、その小さなサイズまたは冠状動脈枝の欠如のために、この方法には適しておらず、ヒト心筋細胞の単離のための新しい方法が望ましい。ここで説明するプロトコルは、薄い心臓組織スライスの外傷性発生に基づいており、その後酵素消化を受ける。左心室補助装置移植からの頭頂核、中隔筋切除術からの心外膜生検、または外植された心臓(補足表1参照)などの動物心臓およびヒト心筋からの心筋標本に適用することができ、その後の実験に使用できる十分な量の生存可能なカルシウム耐性心筋細胞を確実に産生する。17
シンチ組織チャンクよりもビブラートカット組織スライスからの筋細胞の収量が高い主な理由は、スライス中の筋細胞損傷の程度が低い可能性があります。冠状動脈灌流が不可能な場合、消化酵素の接触面を大きくするためには、組織標本をスライスまたはミンチする必要がある。約8mm x 8mm x 0.3mmのスライス寸法は、比較的大きな表面対体積比(〜7mm-1)による酵素の良好なアクセスを可能にする。はさみを使用して、同様の表面容積比(〜6mm-1)を、試料を約1mm x 1mm x 1 mmの小片に細かく刻むことで達成できます。酵素消化前のスライスやひき肉のミオサイト損傷は定量化されなかったが、ビブラートメ上でのスライスは繊維方向の穏やかな切断を可能にするため、かなり少ない損傷を引き起こす可能性が高い。実際、ビブラートカットスライスでは、5%未満の筋細胞が損傷していると推定された。その結果、ヒト心筋細胞は、組織チャンクと比較して生存可能な細胞の割合がはるかに高く、提供されるプロトコルで非常に効率的に単離することができることが示された。これは、心房組織20からのスライスを用いたプロトコルに従っている。我々の方法は、組織のミリグラムあたり最大200のカルシウム耐性心室筋細胞を生み出し、隔離する前に最大36時間心臓組織を保存または輸送する可能性を提供する。これは、オンサイト心臓手術を受けていない実験室に適用可能なプロトコルをレンダリングし、それによってコラボレーションの可能性を拡張します。
プロトコルの重要なステップは、ビブラートメのスライスへの心筋の正しい処理とその消化だけでなく、BDMのカルシウム再導入と洗い流れの最終ステップです。他の方法19,21とは対照的に、21心臓組織は、スライス手順14,15,15の間に動きを避けるために低融解温度を有するアガロースに埋め込まれる。これは、組織ブロックを安定化させ、均一なスライスを生成するために必要でした。組織を埋め込むとき、アガロースは液体である必要がありますが、温熱による細胞の損傷を避けるために温度が37〜38°Cを超えるべきではありません。逆に、アガロースが冷たすぎる場合(<35°C)、組織ブロックにうまく結合せず、スライス中に壊れることがあります。ビブラートメ処理後の筋細胞生存率を試験するために、光顕微鏡による細胞生存率の迅速な評価及び光メトリック解析による定量を可能にする単純なMTTアッセイが14,22,22に示唆される。心筋細胞損傷は、カルシウムを含まない溶液23,24,におけるインキュベーションの期間後に細胞外カルシウムを再導入する際にも起こり得る。単離細胞におけるこのカルシウムパラドックス現象は、心筋細胞が適応できるように、カルシウムレベルのゆっくりと段階的な増加によって軽減することができる。このステップは、35°Cでの連続撹拌中、および5分間隔で慎重に行われるべきです。わずかな低体温(21°C)は、再導入中にラット心筋細胞のカルシウム耐性を増加させ、これは以前の報告25に従っている。しかし、ヒト心筋細胞は35°Cまたは21°Cでカルシウム耐性に大きな差を示さなかった。 カルシウムの切断、消化、再導入中のBDMの使用は、筋細胞収縮および細胞エネルギー支出ならびに過収縮を防ぎ、したがって保護である。しかし、心臓収縮性または励起収縮結合を評価するその後の実験では、BDMを26を除去する必要がある。自発的な過収縮を最小限に抑えるために段階的な洗浄が施された。BDMは省略できますが、これは以前の実験と研究6で観察されるように、過収縮筋細胞の量を著しく増加させます。
記載されたプロトコルは、高カリウムを含み、消化のためのナトリウムの痕跡のみを含む溶液を使用しています。この溶液は、棒状の交差性心筋細胞の最高収率を与えた。酵素消化には、通常のタイロード溶液(1.5mg/mL)の消化と比較して、コラゲナーゼ(4mg/mL)の濃度が高い必要があります。高細胞外ナトリウムは、細胞内ナトリウム過負荷を引き起こし、カルシウムパラドックスの負の影響を悪化させ、細胞収率を27に低下させる。したがって、高カリウムと低ナトリウムの溶液を使用することが示唆されている。高い細胞外マグネシウム濃度は、心筋細胞分離プロトコル3,2828において頻3繁に採用され、虚血再灌流傷害29,30を減少させ29、30寒冷虚血31の延長期間後に心機能を改善することが示されている。従って、ここで塗布した溶液はマグネシウム(10mM)の高濃度も含む。しかし、高マグネシウム濃度32により興奮性、収縮力、伝導速度が低下することが示された。これらの効果は可逆的であることが示されたが、孤立した心筋細胞への影響は排除できない。したがって、生理的濃度(1〜2 mM)でマグネシウムを使用すると、全体的な細胞収量は低下するが、興奮性は向上する可能性がある。
最適な消化時間は、細胞外マトリックスまたは線維症の量がヒトの不全心筋でかなり異なるため、非常に可変的である。解離時に組織がまだしっかりと接続されている場合、生存可能な筋細胞が放出されるだけで、5分のステップで消化時間を長くし、定期的に遊離筋細胞およびスライスの質感をチェックすることが推奨される。長期間(>45分)後に組織が未消化のままである場合、1mg/mLのステップでコラゲラーゼの濃度を増加させるか、別の酵素バッチをテストすることをお勧めします16。この研究で提示されるそれぞれの値は、心筋細胞の強固な単離のための入門書として役立ちますが、最適な収量と生存率の条件は、酵素活性と組織体質の大きな変動性を考慮して、各研究室で洗練することができます。この方法の利点は、少量の必要な組織と、少量のバッチでの簡単なワークフローのために、いくつかのテストを並行して行うことができるということです。したがって、最適なプロトコルを迅速に実現できます。
高品質の心筋スライスの生成は、高精度のビブラートメを必要とします。高精度のティッシュスライサーまたはビブラートームの必要性は、すべての実験室で容易に利用できないため、この方法の可能な欠点である。この研究に使用される装置は、他の14,15,の他の場所でより詳細に説明されている。他のグループ33,,34,35によって心筋スライスを生成するために、さまざまなデバイスが正常に使用されています。したがって、進める速度、ブレードの振幅、および発振周波数の設定が満たされ、0.1 μm未満のz偏向を持つ水平ブレードの向きが利用可能な場合、成功したスライスと分離は他の振動子で実現可能である必要があります。さらに、組織のスライスは精巧であり、プロトコルの持続時間を大幅に延長します(約1〜2時間)。機械的なアンカップリング剤としてのBDMの使用は、細胞エネルギー暴露、虚血性損傷、および過収縮26、36、3736,37を低減することによって保護効果を有する。26BDMの負の抗知性効果は、洗浄後38、39後に素早く可逆的であることが示されたが、BDM39が心筋細胞機能40に未知の結果をもたらす可能性があるかどうかは明らかではない。この研究は、細胞が最大36時間の組織貯蔵時間後に高い収率で単離され、ヒト心筋細胞がこの方法17で単離後最大3日間培養できることを示している。短い貯蔵時間と長い貯蔵時間を持つ筋細胞間の機能的または構造的な違いに気付かなかった。しかし、これは体系的に評価されなかった。一方、ウサギの心臓全体について、30mMBDMを含む細胞外溶液中で冷たい虚血にさらされた新鮮な心臓と心臓の機能的な違いは無視できる31であることが示されたが、この場合も同様である可能性がある。
提示されたプロトコルは、孤立した心室心筋細胞を用いたあらゆる種類の実験に確固たる基礎を提供し、ヒト心筋標本の研究に特に価値があるかもしれない。いくつかの適応によって、線維芽細胞または内皮細胞のような他の心臓細胞の単離も可能と思われる41.他の実験室から冷蔵溶液に送ることができる少量の組織しか必要としないため、プロトコルの適用は犠牲にされた実験動物の数を減らすことができる。実際、プロトコルはウサギとブタの心臓組織にうまく適用されています。さらに、長期培養心筋組織スライスを用いた実験が21、33、42を増加させ、かつ最適な培養条件,422115、43、4443,44を提供するように絶えず改善され、スライス培養後に容易に適用できる方法である。3315したがって、培養された心筋からの単一細胞分離は、体力学的または物理的介入後の心筋細胞の変化を特徴付けるのに役立つ可能性がある。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
LMUミュンヘンのウォルター・ブレンデル実験医学センターのアンドレアス・デンドルファーに、スライスプロトコルの助けに感謝したいと思います。ヒト心筋組織サンプルを提供するために、心臓外科科、アーランゲン大学病院、ヘンドリック・ミルティング、エーリッヒ・アンド・ハンナ・クレシュマン研究所、ルール大学ボーフム、ムハンナド・アルカッサーのヒト心筋組織サンプルに感謝したいと思います。フローサイトメトリーのサポートのために、私たちはサイモン・フェルクルとトランスレーショナル・リサーチ・センター(TRC)、大学病院アーランゲンの同僚に感謝したいと思います。また、セルラー分子生理学研究所のローレンツ・マクカーゴとセリーヌ・グリュニンガーに感謝します。
この研究は、DZHK(ドイツ心臓血管研究センター)、エアランゲン・ニュルンベルク大学病院の学際学領域研究センター(IZKF)、アーランゲン・ヌルンベルク大学、エルランゲン・ニュルンベルク大学によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
| Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
| CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
| Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
| Glucose | Merck | 50-99-7 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
| L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
| Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
| MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
| FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
| Enzymes | |||
| Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
| Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
| Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
| Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
| Material | |||
| Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
| Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
| Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
| Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
| Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
| TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
| TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
| Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |
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