Summary
Präsentiert wird ein Protokoll zur Isolierung von humanen und tierischen ventrikulären Kardiomyozyten aus vibratomegeschnittenen Myokardscheiben. Hohe Erträge von kalziumtoleranten Zellen (bis zu 200 Zellen/mg) können aus kleinen Gewebemengen (<50 mg) gewonnen werden. Das Protokoll gilt für Myokard, das bis zu 36 h kalten Ischämien ausgesetzt ist.
Abstract
Die Isolierung ventrikulärer Herzmyozyten aus tierischen und menschlichen Herzen ist eine grundlegende Methode in der Herzforschung. Tierische Kardiomyozyten werden häufig durch koronare Perfusion mit Verdauungsenzymen isoliert. Die Isolierung menschlicher Kardiomyozyten ist jedoch eine Herausforderung, da menschliche Myokardproben in der Regel keine koronare Perfusion zulassen und alternative Isolationsprotokolle zu schlechten Erträgen lebensfähiger Zellen führen. Darüber hinaus sind humane Myokardproben selten und nur regelmäßig in Einrichtungen mit Herzchirurgie vor Ort verfügbar. Dies erschwert die Übersetzung von Befunden von tierischen in menschliche Kardiomyozyten. Hier wird ein zuverlässiges Protokoll beschrieben, das eine effiziente Isolierung ventrikulärer Myozyten von menschlichem und tierischem Myokard ermöglicht. Um das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen zu erhöhen und gleichzeitig die Zellschädigung zu minimieren, werden aus Myokardproben mit einem Vibram eine Dicke von 300 m dicke Myokardscheiben erzeugt. Gewebescheiben werden dann mit Protease und Kollagenase verdaut. Rattenmyokard wurde verwendet, um das Protokoll zu bestimmen und die Erträge lebensfähiger, kalziumtoleranter Myozyten durch strömungszytometrische Zellzählung zu quantifizieren. Der Vergleich mit der häufig verwendeten Gewebe-Chunk-Methode zeigte signifikant höhere Erträge von stabförmigen Kardiomyozyten (41,5 x 11,9 vs. 7,89 x 3,6 %, p < 0,05). Das Protokoll wurde in versagendes und nicht versagendes menschliches Myokard übersetzt, wo die Erträge ähnlich waren wie bei Rattenmyokard und wiederum deutlich höher als bei der Gewebe-Chunk-Methode (45,0 x 15,0 vs. 6,87 x 5,23 Zellen/mg, p < 0,05). Insbesondere mit dem vorgelegten Protokoll ist es möglich, eine angemessene Anzahl lebensfähiger menschlicher Kardiomyozyten (9–200 Zellen/mg) aus minimalen Gewebemengen (<50 mg) zu isolieren. So ist die Methode auf gesundes und versagendes Myokard sowohl von menschlichen als auch tierischen Herzen anwendbar. Darüber hinaus ist es möglich, erregbare und kontraktile Myozyten aus menschlichen Gewebeproben zu isolieren, die bis zu 36 h in kalter kardioplegischer Lösung gelagert werden, was die Methode besonders nützlich für Laboratorien in Einrichtungen ohne Herzchirurgie vor Ort macht.
Introduction
Eine wegweisende Technik, die den Weg zu wichtigen Einblicken in die Kardiomyozytenphysiologie geebnet hat, ist die Isolierung lebender ventrikulärer Kardiomyozyten von intakten Herzen1. Isolierte Kardiomyozyten können verwendet werden, um normale zelluläre Struktur und Funktion zu studieren, oder die Folgen von In-vivo-Experimenten; zum Beispiel, um Veränderungen in der zellulären Elektrophysiologie oder Anregungs-Kontraktionskopplung in Tiermodellen von Herzerkrankungen zu bewerten. Darüber hinaus können isolierte Kardiomyozyten für Zellkultur, pharmakologische Interventionen, Gentransfer, Tissue Engineering und viele andere Anwendungen verwendet werden. Effiziente Methoden zur Kardiomyozytenisolation sind daher von grundlegender Bedeutung für die Grundlagen- und Translational-Herzforschung.
Kardiomyozyten von kleinen Säugetieren, wie Nagetieren, und von größeren Säugetieren, wie Schweinen oder Hunden, werden häufig durch koronare Perfusion des Herzens mit Lösungen isoliert, die rohe Kollagenatonse und/oder Proteasen enthalten. Dies wurde als die "Goldstandard"-Methode für die Kardiomyozytenisolation beschrieben, was zu Erträgen von bis zu 70% der lebensfähigen Zellen2führt. Der Ansatz wurde auch mit menschlichen Herzen verwendet, was zu akzeptablen Kardiomyozytenerträgen3,4,5. Da jedoch eine koronare Perfusion nur möglich ist, wenn das intakte Herz oder ein großer Myokardkeil mit einem koronaren Herzzweig zur Verfügung steht, sind die meisten menschlichen Herzproben aufgrund ihrer geringen Größe und des Mangels an geeigneter Gefäße für diesen Ansatz nicht geeignet. Daher ist die Isolierung menschlicher Kardiomyozyten eine Herausforderung.
Menschliche Myokardproben bestehen meist aus Gewebestücken variabler Größe (ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm bis 2 x 2 x 2 cm), die durch endomyocardiale Biopsien6, septale Myektomien7, VAD-Implantationen8oder aus explantierten Herzen9. Die häufigsten Verfahren für die Kardiomyozytenisolation beginnen mit dem Hacken des Gewebes mit einer Schere oder einem Skalpell. Zell-zu-Zell-Kontakte werden dann durch Eintauchen in kalziumfreie oder kalziumarme Puffer gestört. Es folgen mehrere Verdauungsschritte mit Rohenzymextrakten oder gereinigten Enzymen wie Proteasen (z.B. Trypsin), Kollagenase, Hyaluronidase oder Elastase, was zu einem Zerfall der extrazellulären Matrix und der Befreiung von Kardiomyozyten führt. In einem letzten, kritischen Schritt muss eine physiologische Kalziumkonzentration sorgfältig wiederhergestellt werden, oder zelluläre Schäden können aufgrund des Calcium-Paradoxons10,11,12auftreten. Dieser Isolationsansatz ist praktisch, aber in der Regel ineffizient. Eine Studie ergab beispielsweise, dass fast 1 g Myokardgewebe erforderlich waren, um eine ausreichende Anzahl von Kardiomyozyten zu erhalten, die für nachfolgende Experimente geeignet sind13. Ein möglicher Grund für niedrige Erträge ist die relativ harte Methode, das Gewebe zu hacken. Dies kann besonders kardiomyozyten an den Klodrändern beschädigen, obwohl diese Myozyten am ehesten durch enzymatische Verdauung freigesetzt werden.
Ein weiterer Aspekt, der die Isolationseffizienz und -qualität der aus menschlichen Proben gewonnenen Zellen beeinflussen kann, ist die Dauer der Gewebeischämie. Die meisten Protokolle nennen kurze Transportzeiten ins Labor als Voraussetzung für gute Ergebnisse. Dies beschränkt die Untersuchung von humanventrikulären Kardiomyozyten auf Laboratorien mit nahe gelegenen Herzchirurgie-Einrichtungen. Zusammen behindern diese Einschränkungen die Überprüfung wichtiger Erkenntnisse von Tiermodellen in menschlichen Kardiomyozyten. Verbesserte Isolationsprotokolle, die hohe Kardiomyozytenausbeuten aus kleinen Gewebemengen ermöglichen, vorzugsweise ohne schwerwiegende Schäden nach längeren Transportzeiten, sind daher wünschenswert.
Beschrieben wird hier ein Isolationsprotokoll, das auf der enzymatischen Verdauung dünner Myokardgewebescheiben basiert, die mit einem Vibratom14,15erzeugt werden. Wir zeigen, dass die Isolierung von Gewebescheiben viel effizienter ist als die von Gewebestücken, die mit einer Schere gehackt werden. Die beschriebene Methode ermöglicht nicht nur hohe Erträge lebensfähiger menschlicher Kardiomyozyten aus kleinen Mengen Myokardgewebe, sondern ist auch auf Proben anwendbar, die in kalter kardioplegischer Lösung bis zu 36 h gelagert oder transportiert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Versuche mit Ratten wurden vom Tierschutz- und Einsatzausschuss Mittelfranken, Bayern, genehmigt. Die Entnahme und Verwendung menschlicher Herzgewebeproben wurde von den Institutionellen Fachkollegien der Universität Erlangen-Nürnberg und der Ruhr-Universität Bochum genehmigt. Die Studien wurden gemäß den Richtlinien der Helsinki-Erklärung durchgeführt. Die Patienten gaben ihre schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage vor der Gewebeentnahme ab.
Weibliche Wistar-Ratten (150–200 g) wurden kommerziell erhalten, durch Injektion von 100 mg/kg Thiopental-Natrium intraperitoneal anentäbt und durch Zervixdislokation, gefolgt von Thorakotomie und Exzision des Herzens eingeschläfert. Menschliche Herzgewebeproben wurden aus dem linksventrikulären apikalen Kern während der Implantation mechanischer Hilfsvorrichtungen, aus der Septalmyektomie, aus der Tetralogie der Fallot-Korrekturchirurgie oder von der freien linksventrikulären Wand von explantierten Herzen entnommen. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung aus dem menschlichen ventrikulären Gewebe. Die Isolierung von Rattenkardiomyozyten wurde entsprechend durchgeführt, jedoch mit verschiedenen Enzymen (siehe Tabelle der Materialien). Ein schematischer Workflow des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Herstellung von Puffern, Lösungen und Enzymen
- Bereiten Sie Puffer und Lösungen vor, wie in Tabelle 1aufgeführt.
- Aufwärmlösungen 1, 2, 3 und die modifizierte Tyrodes Lösung auf 37 °C. Bewahren Sie die Schneidlösung bei 4 °C bis zum Gebrauch auf.
HINWEIS: Für 1–2 Myokardscheiben werden insgesamt ca. 15 ml, 8 ml und 5 ml der Lösungen 1, 2 und 3 für die Isolierung in einer 35 mm Gewebekulturschale benötigt. Skalieren Sie entsprechend für gleichzeitige Myozytenisolationen in mehreren Gerichten. Schneidlösung kann eingefroren und bei -20 °C für mehrere Monate gehalten werden. - Wiegen Sie 1 mg Proteinase XXIV (siehe Materialtabelle) in ein vorgechilltes 15 ml Zentrifugenrohr und lagern Sie es bis zur Verwendung auf Eis. Dies dient der Verarbeitung eines Beispiels. Skalieren Sie den Betrag entsprechend. Mischen Sie die Proteinase und Kollagenase nicht.
- Wiegen Sie 8 mg Kollagennase CLSI (siehe Materialtabelle)in ein vorgechilltes 15 ml Zentrifugenrohr und lagern Sie bis zur Verwendung auf Eis. Dies dient der Verarbeitung eines Beispiels. Skalieren Sie den Betrag entsprechend. Mischen Sie die Proteinase und Kollagenase nicht.
VORSICHT: Tragen Sie eine Gesichtsmaske oder arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube, um das Einatmen von Enzympulver zu vermeiden.
HINWEIS: Die Enzymaktivität kann in verschiedenen Losen variieren. Daher kann die optimale Konzentration abweichen und sollte mit jedem neu erworbenen Enzym bestimmt werden16.
2. Lagerung und Transport von Myokardgewebe
- Menschliche Herzproben in gekühlter 4 °C Schneidlösung lagern und transportieren (Tabelle 1).
- Verwenden Sie die gleiche Lösung für die weitere Gewebeverarbeitung und Vibratome-Slicing.
HINWEIS: Biopsien und chirurgische Herzproben sollten sofort bei 4 °C auf die Schneidlösung übertragen werden und können dann vor Anwendung dieses Protokolls bei 4 °C für maximal 36 h gelagert oder transportiert werden.
3. Verarbeitung und Schneiden des Gewebes
HINWEIS: Das Protokoll für das Schneiden von Gewebefolgt Fischer et al.15.
- Trimmen des Gewebeblocks
VORSICHT: Menschliches Herzgewebe ist potenziell infektiös. Verwenden Sie immer Schutzkleidung und befolgen Sie die Sicherheitsvorschriften Ihrer Institution. Behandeln Sie gebrauchte Klingen sorgfältig und entsorgen Sie sie in Sicherheitsbehältern.- Die Probe in eine 100 mm Gewebekulturschale geben, die mit 20 ml Kaltschnittlösung gefüllt ist, und auf einer gekühlten 4 °C-Platte aufbewahren.
- Entfernen Sie überschüssiges fibrotisches Gewebe und Epikardialfett mit einem Skalpell. Bei einer transmuraalen Probe Trabekulae und Gewebeschichten in der Nähe des Endokards entfernen.
HINWEIS: Fibrotisches Gewebe ist steif und erscheint weiß. Fett ist in der Regel weich und erscheint weiß bis gelb. Trabeculae- und Endokardgewebeschichten lassen sich anhand ihrer lockeren Gewebezusammensetzung und einer bündnisfreien Faserausrichtung im Vergleich zu Myokard der Epikardenschichten identifizieren - Für eine optimale Vibrambearbeitung rechteckige Gewebeblöcke von ca. 8 mm x 8 mm x 8 mm mit einem Skalpell aus einer größeren Gewebeprobe schneiden. Für kleinere Biopsien überspringen Sie diesen Schritt und bewegen Sie sich zur Agarose-Einbettung.
- Einbettung von Herzgewebe in Niedrigschmelzpunkt-Agarose
- 400 mg Niedrigschmelzpunkt-Agarose in 10 ml Schneidlösung in einem Glasbecher kochen.
VORSICHT: Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrillen, um Verbrennungen zu vermeiden. Behandeln Sie heißeglaswaren geräte nur mit Wärmeschutzverschleiß. - Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit dem heißen, gelösten Agarosegel. Versiegeln Sie die Spritze und lassen Sie die Agarose in einem 37 °C-Wasserbad für mindestens 15 min ausbaquiern.
- Verwenden Sie Zangen, um die getrimmte Herzprobe oder Biopsie in eine saubere 35 mm Gewebekulturschale mit dem Nachteilen des Epikardiens zu legen und überschüssige Flüssigkeit mit einem sterilen Tupfer zu entfernen.
- Gießen Sie die ausgeglichene Agarose (Schritt 3.2.2) über das Gewebe, indem Sie die Spritze entleeren. Sichern Sie das Gewebe gegen Bewegung mit Zange, während Sie die Agarose gießen. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig in Agarose eingetaucht ist.
- Die Schale sofort auf Eis legen und die Agarose 10 min erstarren lassen.
- 400 mg Niedrigschmelzpunkt-Agarose in 10 ml Schneidlösung in einem Glasbecher kochen.
- Schneiden des Myokards
- Montieren Sie eine neue Rasierklinge am Klingenhalter des Vibratom und kalibrieren Sie das Vibratom, indem Sie die Z-Ablenkung der Klinge nach Möglichkeit einstellen.
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet ein Vibratom mit einem infrarotunterstützten Kalibriergerät, um das Blatt in einer horizontalen Position mit minimaler Z-Ablenkung auszurichten (gemessene Durchbiegung <0,1 m). - Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Agarose-Gewebeblock zu verbrauchen, der auf den Probenhalter des Vibratom passt. Um die Stabilität zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass das Gewebe noch ausreichend in Agarose (Agarose-Ränder von 8 mm) getaucht ist.
- Befestigen Sie den Agaroseblock mit einer dünnen Schicht Cyanoacrylatkleber und sanftem Druck am Probenhalter.
- Legen Sie den Probenhalter mit dem Gewebe in das Vibrambad. Füllen Sie das Bad mit Schneidlösung und halten Sie bei 4–6 °C während der gesamten Verarbeitung mit zerkleinertem Eis, in den äußeren Kühltank des Vibrames gefüllt.
- Erzeugen Sie 300 m dicke Scheiben mit einer Vorgeschwindigkeit von 0,1 mm/s, einer Oszillationsfrequenz von 80 Hz, einer seitlichen Amplitude von 1,5 mm und einem Klingenwinkel von 15°. Halten Sie beim Umgang mit den Scheiben die Agarose anstelle des Gewebes selbst, um Gewebeschäden zu vermeiden. Bewahren Sie die Scheiben in der Schneidlösung bei 4 °C bei Bedarf maximal 2 h auf.
HINWEIS: Kardiomyozyten sind parallel zum Epikardium ausgerichtet. Daher ist es wichtig, parallel zum Epikardi um übermäßigen Myozytenschaden zu schneiden. Es wird empfohlen, die ersten 1–3 Scheiben zu verwerfen, da für die Isolierung nur einheitliche Scheiben mit konstanter Dicke verwendet werden sollten. Bei kleinen Gewebebiopsien jedoch nur die erste Scheibe wegwerfen. - Überprüfen Sie die Cardiomyozytenausrichtung unter einem Standard-Lichtmikroskop mit einer Vergrößerung von 40-100x.
- Montieren Sie eine neue Rasierklinge am Klingenhalter des Vibratom und kalibrieren Sie das Vibratom, indem Sie die Z-Ablenkung der Klinge nach Möglichkeit einstellen.
4. Gewebeverdauung
- Die Wärmeplatte auf den Laborschüttler legen und auf 37 °C erwärmen. Starten Sie den Labor-Shaker bei 65 Rpm.
- Die Proteinase (in Schritt 1.3) in 2 ml Lösung 1 (Schritt 1.1 und 1.2) auflösen und bei 37 °C bis zur Verwendung inkubieren. Mischen Sie die Proteinase und Kollagenase nicht.
- Die Kollagenase (in Schritt 1.4) in 2 ml Lösung 1 (Schritt 1.1 und 1.2) auflösen und bei 37 °C bis zur Verwendung inkubieren. Mischen Sie die Proteinase und Kollagenase nicht.
VORSICHT: Tragen Sie Schutzbrillen und Handschuhe, da gelöste Enzyme Haut- und Augenverletzungen verursachen können. - Calciumchlorid (CaCl2) der kollagennasehaltigen Lösung (in Schritt 4.3) zu einer Endkonzentration von 5 m hinzufügen.
- Verwenden Sie Zangen, um eine Gewebescheibe aus dem Vibram-Bad in eine saubere 60-mm-Gewebekulturschale zu übertragen, die mit 5 ml vorgekühlter Schneidlösung (Schritt 1.1 und 1.2) gefüllt ist, und auf Eis zu bleiben.
- Entfernen Sie die Agarose vorsichtig mit Klinge oder Zange aus dem Myokardgewebe.
HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßige Spannung und Scherbelastung der Myokardscheiben, da sie die Kardiomyozyten beschädigen können. - Um die erste Wäsche durchzuführen, legen Sie eine saubere 35 mm Gewebekulturschale auf die Wärmeplatte und füllen Sie sie mit 2 ml vorgewärmter (37 °C) Lösung 1. 1:2 Myokardscheiben mit Zange auf die vorbereitete Schale übertragen. Aspirieren Sie die Lösung mit einer 1 ml Pipette und führen Sie die Waschschritte 2x durch, um Reste der Schneidlösung zu entfernen.
HINWEIS: Die Herzscheiben nicht ansaugen. Die Lösungen und die Scheiben sollten auf der rührigen Wärmeplatte bei einer konstanten Temperatur von 35 °C bleiben. Stellen Sie bei Bedarf die Temperatur der Wärmeplatte ein. - Lösung 1 aus der Schale nehmen und 2 ml der Proteinase-Lösung hinzufügen (Schritt 4.2). 12 min auf der Wärmeplatte bei 65 R/min inkubieren.
- 2x mit 2 ml vorgewärmter Lösung 1 (37 °C) waschen.
- Lösung 1 aus der Schale nehmen und 2 ml Kollagenaselösung hinzufügen (Schritte 4.3 und 4.4). Mindestens 30 min auf der Wärmeplatte bei 65 Umdrehungen pro Minute inkubieren.
- Prüfen Sie nach kostenlosen individuellen Myozyten bei 30, 35, 40 min usw., indem Sie die Schale unter ein Lichtmikroskop stellen. Arbeiten Sie schnell, um eine signifikante Kühlung der Lösung zu vermeiden.
HINWEIS: Die erforderliche Verdauungszeit kann je nach Gewebekonstitution und Dem Grad der Fibrose variieren. Sobald das Gewebe beim sanftgezogenen sanftgezogen enden wird und sich leicht löst, ist die optimale Verdauungszeit erreicht. Wenn genügend Gewebe zur Verfügung steht, können mehrere Scheiben parallel zu unterschiedlichen Verdauungszeiten verdaut werden. - Wenn das Gewebe verdaut wird und einzelne Myozyten sichtbar sind (Schritt 4.11), 2x mit 2 ml vorgewärmter Lösung 2 (37 °C) waschen und mit 2 ml wieder füllen.
5. Gewebedissoziation
- Dissoziieren Sie die verdauten Gewebescheiben mit Zangen, indem Sie die Fasern vorsichtig auseinander ziehen.
- Sorgfältige Pipette mehrmals mit einer Einweg-Pasteur-Pipette (Öffnungsdurchmesser >2 mm).
HINWEIS: Der Einsatz von Zangen und Pipetten kann mechanische Beanspruchung verursachen und Kardiomyozytenschäden verursachen. Es ist jedoch ein entscheidender Schritt für die Trennung der Zellen. Verwenden Sie feine Zangen, um Zellschäden zu minimieren und die Scheiben sorgfältig zu kleineren Stücken zu trennen. - Prüfen Sie die befreiten stabförmigen Kardiomyozyten unter dem Lichtmikroskop.
6. Wiedereinführung der physiologischen Kalziumkonzentration
- Erhöhen Sie langsam die Kalziumkonzentration von 5 m auf 1,5 mM, während Sie bei 35 °C auf der Wärmeplatte aufregen. Verwenden Sie 10 mM und 100 mM CaCl2 Stofflösungen. Empfohlene Schritte: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 m. Lassen Sie die Zellen sich in 5 min Inkubationsintervallen zwischen jedem Schritt an die erhöhten Kalziumspiegel anpassen.
- Entfernen Sie unverdaute Gewebestücke vorsichtig mit Zangen oder filtern Sie die Zellsuspension durch ein Nylongewebe mit 180 m Porengröße am Ende der Kalziumzunahme.
7. Entfernung des mechanischen Entkopplungsmittels
- Stoppen Sie die Rührung und entfernen Sie langsam ein Drittel der Lösung (ca. 700 l) von der Oberseite mit einer 1.000 l Pipette. Vermeiden Sie das Streben der Kardiomyozyten.
HINWEIS: Wenn unverdautes Gewebe entfernt wurde, sammeln sich die Kardiomyozyten in der Mitte der Schale an, was das Absehnen einer zellfreien Lösung erleichtert. Wenn nicht, übertragen Sie die Zelllösung in ein 15 ml Zentrifugenrohr und lassen Sie die Zellen 10 min bei 35 °C sedimentieren, dann 700 l des Überstandes aspirieren und entsorgen, die Zellen wieder aussetzen, in eine 35 mm Gewebekulturschale zurückübertragen und mit Schritt 7.2 fortfahren. - Fügen Sie 700 l Lösung 3 in die Zellen, setzen Sie die Agitation auf der Wärmeplatte fort und brüten sie 10 min.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.1 und 7.2.
- Übertragen Sie die Lösung auf ein 15 ml Zentrifugenrohr und lassen Sie die Kardiomyozyten für mindestens 10 min und maximal 30 min bei Raumtemperatur sedimentieren oder bei 50 x g für 1 min drehen. Entfernen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie ihn in modifizierter Tyrodes Lösung oder dem gewünschten Experimentierpuffer wieder auf.
HINWEIS: Cardiomyozyten können in modifizierter Tyrodes Lösung (Tabelle 1) mehrere Stunden bei 37 °C und 5%CO2 vor Gebrauch gelagert werden. - Überprüfen Sie die Zellqualität mit einem Standard-Lichtmikroskop mit 40- und 200-facher Vergrößerung.
HINWEIS: Etwa 30–50% der Kardiomyozyten sollten stabförmig, glatt ohne Membranbs sein und klare Querstreifen aufweisen. Nur 5–10% der lebensfähigen Zellen sollten spontane Kontraktionen zeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um die Isolationseffizienz zu überprüfen, wurde das Protokoll mit Rattenmyokard verwendet und die resultierende Anzahl lebensfähiger Myozyten wurde mit den Zahlen verglichen, die durch Isolierung durch koronare Perfusion und durch Isolierung von kleinen Gewebestücken (Chunk-Isolation, Abbildung 2). Chunk Isolation und Isolierung von Gewebescheiben wurden von den gleichen Herzen durchgeführt. Für die Isolierung durch koronare Perfusion wurde jedoch das ganze Herz verwendet. Die koronare Perfusion führte zu überwiegend stabförmigen und kreuzgestreiften Kardiomyozyten. Bei Isolationen von Myokardscheiben wurde ein geringerer Anteil von stabförmigen Zellen beobachtet, aber die Gesamtzahl war immer noch hoch. Im Gegensatz dazu wurden nach der Isolierung von Gewebebrocken nur wenige stabförmige ZellenAbbildung 2A). Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Ergebnisse quantitativ zu vergleichen. Aufgrund ihrer relativ großen Größe und Kreuzdehnung zeigen Kardiomyozyten in der Regel große Werte für vorwärts und seitlich. Diese Eigenschaften wurden verwendet, um stabförmige Myozyten mit einem strömungszytometrischen Zellanalysator zu zählen, wobei ein einfaches Gating-Schema angewendet wurde, das stabförmige von hypervertraglichen und abgerundeten Kardiomyozyten unterscheidet. (Ergänzende Abbildung 1). Repräsentative Punktplots sind in Abbildung 2B. Die statistische Analyse zeigte im Kardiomyozytentor CM1 deutlich höhere Werte für die Isolierung von Scheiben als aus Gewebebrocken (41,5 x 11,9 vs. 7,89 x 3,6 %; n =3 Isolationen; p < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (Abbildung 2C). So erreicht die Isolierung von Kardiomyozyten aus Gewebescheiben nicht die durch koronare Perfusion erhaltene Ausbeute, sondern führt zu einer wesentlich größeren Anzahl von stabförmigen Myozyten als die Isolierung aus Gewebebrocken, die genügend Zellen für nachfolgende Experimente liefern. Neben der Zellzahl wurden auch die strukturellen Parameter von Rattenkardiomyozyten quantifiziert. Zelllänge, Zellbreite und Sarcomere-Länge unterschieden sich nicht in Zellen, die durch Perfusion oder aus Gewebescheiben isoliert wurden (Länge = 110,0 x 5,4 m vs. 99,4 x 3,2 m, p > 0,05; Breite = 33,9 x 1,9 m vs. 30,6 x 1,2 m, p > 0,05, für n = 19 bzw. n = 21 Zellen; Sarcomere-Länge = 1,62 x 0,04 m vs. 1,68 x 0,04 m, p = 0,28, n = 24 bzw. n = 23 Zellen) (1,68 x 0,04 m, p = 0,28, n = 24 bzw. n = 23 Zellen) (1,64 m) (1,68 x 0,04 m, p = 0,28, n = 24 bzw. n = 23 Zellen) (1,04 m) (1,68 x 0,04 m, p = 0,28, n = 24 bzw. n = 23 Zellen) (1,04 x m) (1,68 x 0,04 m, p = 0,28, n = 24 bzw. n = 23 Zellen) (1,68 x 1,68 , 0,04 m, p = 0,28, n = 24 bzw. n = 23 Zellen) (1,04 x m) (1,68 x 0,04 m, p = 0,28, n = 24Ergänzende Abbildung 2A–C). Verwendung von Fluo-4 geladenen Myozyten, die einer elektrischen Feldstimulation unterzogen werden17 funktionale Parameter wurden ebenfalls bewertet (Ergänzende Figur 2D–F). Mittlere Aktivierungszeit (27,5 x 1,5 vs. 23,6 x 2,5 ms, n = 100 vs. n = 31 Zellen; Perfusion vs. Scheibe, p > 0,05) (Ergänzende Figur 2D) und relative Verkürzung (12,2 x 1,1 vs. 11,3 x 2,5 %, n = 42 vs. n= 7 Zellen, Perfusion vs. Scheibe, p > 0,05) (Ergänzende Abbildung 2F) von Kardiomyozyten, die auf die Stimulation reagierten, unterschieden sich zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant. Die calciumtransiente Amplitude (maximal normalisierte Ca2+, F/F0) (Ergänzende Abbildung 2E) wurde in Kardiomyozyten, die aus Scheiben isoliert sind, im Vergleich zu durch Perfusion isolierten Kardiomyozyten leicht erhöht (4,9 x 0,2 vs. 5,7 x 0,3, n = 104 vs. n = 25 Zellen, Perfusion vs. Scheibe, p < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (Ergänzende Abbildung 2G). Um die Zellqualität nach der Kultivierung zu beurteilen, wurde der Prozentsatz der Myozyten bestimmt, die sich als Reaktion auf die elektrische Feldstimulation nach 48 h in der Zellkultur kontrahieren.17. Der Anteil der antwortenden Zellen wurde in beiden Gruppen um etwa die Hälfte reduziert (41,9 x 3,6 % vs. 31,5 x 2,3 %, Perfusion vs. Scheibe, p < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (Ergänzende Figur 2H).
Als nächstes wurde das Protokoll auf humanes Myokard angewendet. Die Anzahl der stabförmigen und lebensfähigen isolierten humanventrikulären Kardiomyozyten, die aus Gewebescheiben gewonnen wurden, wurde paarweise mit der Anzahl verglichen, die aus Gewebestücken derselben Myokardproben gewonnen wurde (Abbildung 3). Wir fanden heraus, dass die Isolierung von Myokardscheiben einen großen Anteil an stabförmigen und nur einen kleinen Anteil an abgerundeten Kardiomyozyten ergab (Abbildung 3A). Wir zählten stabförmige Myozyten aus Weitfeldbildern und normalisierten ihre Anzahl durch das für die Isolierung verwendete Gewebe-Nassgewicht. Die Quantifizierung zeigte, dass die Isolierung von Myokardscheiben zu einer auffallend höheren Anzahl von stabförmigen Myozyten führte als die Isolierung von Gewebebrocken (45,0 x 15,0 vs. 6,87 x 5,23 Zellen/mg, n = 7 Isolationen, p < 0,05, gepaart er zweischwanzig t-test) (Abbildung 3B). Darüber hinaus wurde die Lebensfähigkeit mit einem MTT-Lebensfähigkeitstest14bewertet, der die photometrische Formazan-Absorption auf die Gesamtmenge des Proteins im Zelllysat normalisierte. Die photometrische Quantifizierung bestätigte eine wesentlich höhere Myozytenlebensfähigkeit nach Isolierung von Myokardscheiben (4,76 x 0,47 vs. 1,09 x 0,18 AE, n = 3 Isolationen, p < 0,05, gepaart er mit zweischwänendem t-Test) (Abbildung 3C).
Insgesamt wurde die Methode auf Myokardproben aus 30 menschlichen Herzen mit Transportzeiten von bis zu 36 h angewendet. Aus 23 der 30 probenfähigen Zellen wurden für nachfolgende Experimente gewonnen (siehe auch Ergänzende Tabelle 1). Ein Beispiel für ein erfolgloses Experiment (d. h. <100 Zellen pro Schale) ist in der ergänzenden Abbildung 3dargestellt. Hier vertrageen die meisten Zellen kein hohes extrazelluläres Kalzium und hypercontracted. Wir bewerteten die Kontraktilität in Myozyten aus 14 Isolationen, und in zwei Fällen reagierten die Zellen nicht auf elektrische Stimulation. Beachten Sie, dass die Technik nicht nur mit großen Exemplaren aus erwachsenen Herzen, sondern auch mit kleinen Biopsien (nur 40 mg) aus Kinderherzen funktionierte (Ergänzungsfigur 4).
Um zu zeigen, dass menschliche Zellen, die mit dem beschriebenen Protokoll isoliert sind, einer Strukturanalyse unterzogen werden können, wurden sie mit Alpha-Actinin, den EC-Kopplungsproteinen L-Typ Calciumkanal (LTCC) und Ryanodinrezeptor (RyR) sowie der Zellmembran und Kernen gefärbt, nach einer kürzlich beschriebenen Färbemethode in Rattenmyozyten17 (Abbildung 4). Die Alpha-Actinin-Färbung ergab ein dichtes, regelmäßiges Z-Linien-Muster und eine mittlere Sarkome-Länge von 1,92 x 0,06 m in ruhenden Kardiomyozyten (n = 4, Abbildung 4A). LTCC und RyR zeigten klare Cluster und wurden erwartungsgemäß in der Nähe der Zellmembran und der T-Tubuli kolokalisiert (Abbildung 4B).
Der potentiometrische Farbstoff FluoVolt18 und der kalziumempfindliche Farbstoff Fluo-417 wurden verwendet, um zu zeigen, dass menschliche Kardiomyozyten, die mit dem beschriebenen Protokoll isoliert wurden, erregbar waren und für Studien zur zellulären Elektrophysiologie oder Anregungs-Kontraktionskopplung verwendet werden konnten (Abbildung 5). Das Aktionspotential (AP) Form und Dauer wurden analysiert (Abbildung 5A,B). Die Werte von 50% und 90% AP-Dauer (APD50: 400,6 x 41,1 ms, APD90: 748,9 x 56,6 ms, n = 10 Zellen) lagen im bereich, der von anderen für ventrikuläre Kardiomyozyten von versagenden menschlichen Herzen4,6,7,9berichtet wurde. Die Kalziumtransienten, die durch konfokales Line-Scanning von Fluo4-belasteten Zellen aufgezeichnet wurden (Abbildung 5C,D) zeigten einen deutlichen Auftrieb nach der Stimulation und ein akzeptables Signal-Rausch-Verhältnis. Die transiente Calciumamplitude (maximal F/F0) betrug 2,9 x 0,5 (n = 31 Zellen). Die Kardiomyozytenverkürzung durch Kontraktion kann im Beispiel an der Umlenkung der unteren Zellgrenze gesehen werden, die einen Mittelwert von 4,6 x 0,8 % (n = 31 Zellen) hatte.
Abbildung 1: Workflow des Isolationsprotokolls aus menschlichen Herzgewebescheiben. Gewebeblöcke oder Biopsien aus humanem Myokard (oben links) sind in Niedrigschmelzpunkt-Agarose eingebettet und 300 m dicke Scheiben werden mit der oszillierenden Klinge eines Vibratom (obere Mitte) erzeugt. Die Scheiben werden auf ein Kulturgericht übertragen und aus der umgebenden Agarose (oben rechts) entfernt. Die Gewebeverdauung erfolgt bei 35 °C und 65 Umdrehungen pro Minute auf einer erhitzten und aufgewimverbesserten Platte (Mitte, links) und umfasst: (Schritt 4.8) Inkubation in nominell kalziumfreier Lösung, ergänzt mit Proteinase, (Schritt 4.10) Verdauung der extrazellulären Matrix mit Kollagennase, (Schritt 5) Dissoziation und Befreiung einzelner Kardiomyozyten mit Zangen und Pipettieren. (Schritt 6) Langsamer Anstieg der extrazellulären Calciumkonzentration von 5 m auf 1,5 mM in Intervallen von 5 min. (Schritt 7) Schrittweise Entfernung des mechanischen Entkopplers 2,3-Butandionmonoxim (BDM). Rodförmige und kreuzgestreifte menschliche Kardiomyozyten werden geborgen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kardiomyozytenerträge von Myokardscheibe, Perfusion und Chunk-Isolierung. (A) Repräsentative Lichtmikroskopie von Rattenkardiomyozyten, die entweder über koronare Perfusion (Perfusion), aus Vibratome-Schnittgewebe (Myokardscheiben) oder aus Hackfleisch (Gewebebrocken) isoliert werden. (B) Entsprechende repräsentative Durchflusszytometrie-Punktdiagramme aus Kardiomyozytenisolationen, die in Abeschrieben sind. Als Indikatoren für die zelluläre Granularität bzw. Größe wurden Die Seitenstreufläche (SSC-Bereich) bzw. die Vorwärtsstreufläche (FSC-Bereich) verwendet. Das Gatingschema des Gattensystems CM1 für Kardiomyozyten wird durch die schwarze Linie angezeigt und die jeweiligen Bruchteile der Gesamtanzahl in Prozent werden angezeigt. (C) Mittelwert - Standardfehler der Fraktionen von Kardiomyozyten (CM1), die durch strömungszytometrische Analyse bewertet werden, wie in B beschrieben von n = 3 Zellisolationen pro Gruppe. Die Isolierung von Myokardscheiben und Gewebestücken wurde von den gleichen Herzen durchgeführt (gepaarter zweischwanzigem t-Test). Die Isolierung durch Perfusion wurde von ganzen Herzen verschiedener Tiere durchgeführt und durch den ungepaarten zweischwanzigen t-Test verglichen. *p < 0.05, nach Mehrfachvergleichskorrektur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vergleich von Ertrag und Lebensfähigkeit menschlicher Kardiomyozyten nach Isolierung von Myokardscheiben und gehackten Gewebestücken. (A) Repräsentatives Bild von kalziumtoleranten humanventrikulären Kardiomyozyten nach Isolierung von Gewebescheiben. Rod-förmige und gestreifte Kardiomyozyten sind vorherrschend (schwarzer Pfeil), mit nur wenigen abgerundeten und hypercontracted Zellen (weißer Pfeil). (B) Quantifizierung von calciumtoleranten, stabförmigen Myozyten, die parallel isoliert werden, entweder aus Myokardscheiben oder Gewebestücken, die aus Weitfeldmikroskopen gezählt und auf das Nassgewicht des Eingangsmaterials (in Milligramm) von n = 7 gepaarten Isolierungen normalisiert werden. (C) Quantifizierung der Kardiomyozytenlebensfähigkeit durch photometrische Messung der Formazan-Farbstoffabsorption nach MTT-Assay. Die Absorption wurde auf die Gesamteinstandmenge des Proteins normalisiert, die durch BCA-Assay aus n = 3 gepaarten Isolierungen bewertet wurde. *p < 0.05, **p < 0.01 (gepaarter zweischwanz-t-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Mikrostrukturelle Charakterisierung menschlicher Kardiomyozyten nach Isolation. (A) Repräsentatives konfokales mikroskopisches Bild nach Immunfärbung von Alpha-Actinin (grün) und Kernfleck mit 4,6-Diamidin-2-Phenylindol (DAPI, blau). Die Sarkome-Länge betrug 1,92 x 0,06 m (n = 4 Myozyten), die durch die Analyse des Fourier-Spektrums bestimmt wurde. (B) Repräsentative konfokale mikroskopische Bilder eines festen humanen ventrikulären Kardiomyozyten, das für den L-Typ Calciumkanal (LTCC) und den kardialen Ryanodinrezeptor (RyR) koimmunostainiert ist. Die Überlagerung von RyR und LTCC (Overlay) und die Färbung der extrazellulären Matrix mit Weizenkeim Agglutinin (WGA, Magenta) wird ebenfalls gezeigt. Nuclei wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Wirkungspotential und intrazelluläres Calcium transient in humanen ventrikulären Myozyten. (A) Zweidimensionales konfokales Bild einer isolierten menschlichen Kardiomyozyten, die mit dem potentiometrischen Farbstoff FluoVolt (grün, 488 nm Anregungswellenlänge) beladen ist. Das rote Feld zeigt ein Element des t-tubularen Systems an, das mit einem schnellen Linienscan während der elektrischen Feldstimulation bei 0,5 Hz gemessen wurde. (B) Gemittelte und basistast-normalisierte FluoVolt-Fluoreszenz (F/F0) von fünf aufeinanderfolgenden Aktionspotentialen, die durch konfokale Bildgebung erhalten wurden, wie in A beschrieben. (C) Linienbild einer isolierten menschlichen Kardiomyozyten, die mit dem kalziumempfindlichen Farbstoff Fluo-4 AM (488 nm Anregungswellenlänge) entlang der Längszellachse beladen ist. Die Fluoreszenzintensität wird in grauer Werte [AU] angezeigt und die blauen Punkte zeigen den maximalen Anstieg der Fluoreszenzintensität (dF/dtmax) jedes Pixels entlang der gescannten Linie an. Die Abtastrate betrug 529 Hz. (D) Calciumtransient, der durch Mittelung der Fluoreszenz jedes Pixels entlang der gescannten Linie vom Bild in C und Normalisierung zu Basiswerten vor der Stimulation (F/F0) erreicht wurde. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Namen | Zusammensetzung in mmol/L | Ergänzungen | Ph | Erforderliches Volumen in mL |
| Lösung 1 | 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 Glukose, 70 Glutaminsäure, 20 Taurin, 10 Beta-Hydroxybutyrat, 30 BDM | 2 mg/ml Rinderserumalbumin | 7.3 mit KOH | 300 |
| Lösung 2 | 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 Glukose, 70 Glutaminsäure, 20 Taurin, 10 Beta-Hydroxybutyrat, 0,005 CaCl2, 30 BDM | 10 mg/ml Rinderserumalbumin | 7.3 mit KOH | 300 |
| Lösung 3 | 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 Glukose, 70 Glutaminsäure, 20 Taurin, 10 Beta-Hydroxybutyrat, 1,5 CaCl2 | 10 mg/ml Rinderserumalbumin | 7.3 mit KOH | 300 |
| Geänderte Tyrodes Lösung | 130 NaCl, 0.4 NaH2PO4, 5.8 NaHCO3, 5.4 KCl, 0.5 MgCl2, 1.5 CaCl2, 25 HEPES, 22 Glucose | 2 mg/ml Rinderserumalbumin | 7.3 mit NaOH bei 5 %CO2 | 100 |
| Schneidlösung | 138 NaCl, 0.33 NaH2PO4, 5.4 KCl, 2 MgCl2, 0.5 CaCl2, 10 HEPES, 10 Glucose, 30 BDM | 7.3 mit NaOH | 500 |
Tabelle 1: Puffer und Lösungen. Zusammensetzung der erforderlichen Puffer und Lösungen.
Ergänzende Abbildung 1: Validierung des Kardiomyozyten-Gating-Schemas (CM1). Punktdiagramme aus der Durchflusszytometrie, Messung des Vorwärts- und Seitenstreubereichs (FSC-A, SSC-A), die Größe und Granularität der nachgewiesenen Zellen in einer Kontrollprobe (CTRL) aus perfusionsisolierten Rattenkardiomyozyten und nach Inkubation von Kardiomyozyten aus der gleichen Zubereitung für 15 min bei 37 °C in modifizierter Tyrodes-Lösung mit 100 mM Calcium (Calcium) anzeigen. Das hohe extrazelluläre Kalzium verursacht Hyperkontraktion und Rundung von stabförmigen Kardiomyozyten, was zu einer Verringerung der Zellen führt (87,6% vs. 6,00%) im definierten Gate (CM1). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Kardiomyozyteneigenschaften, die durch Perfusion oder aus Scheiben isoliert werden. Zelllänge (A) und Zellbreite (B) wurden aus Rattenkardiomyozyten ermittelt, die direkt nach Derisolation durch Perfusion oder aus Myokardscheiben mittels Mikroskopie fixiert wurden (n = 19 bzw. n = 21 Zellen). Die Sarkomelänge (C) wurde aus mikroskopischen Bildern nach Immunfärbung mit Alpha-Actinin- und Fourier-Analyse (n = 24 bzw. n = 23 Zellen) bestimmt. Die mittlere Aktivierungszeit (D), die maximale F/F0 (E) und die relative Verkürzung (F) wurden aus Fluo-4 geladenen Kardiomyozyten bewertet, die durch Perfusion oder aus Myokardscheiben isoliert und auf elektrische Stimulation reagieren (n = 100/31 Myozyten in D, n = 104/25 Myozyten in E und n = 42/7 Myozyten in F). Der Anteil der stabförmigen Kardiomyozyten (G), die sich bei elektrischer Stimulation zusammensetzten, wurde anhand der Gesamtzahl der stabförmigen Zellen und der kontraktilen Zellen in zehn Sichtfeldern bei 200-facher Vergrößerung in einem Standardlichtmikroskop auf Perfusion und Scheibenisolierung (n = 452/276 Zellen) bewertet. (H) Analyse wie in G, aber nach 48 h Kultivierung (n = 371/329 Zellen). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Menschliche Kardiomyozytenisolation mit geringer Ausbeute. Repräsentatives Lichtmikroskopbild von Myozyten aus einer Isolation mit überwiegend hypervertraglichen (blauen) oder abgerundeten Zellen (schwarz) und nur wenigen stabförmigen und gestreiften Zellen (weiß). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 4: Kardiomyozytenisolation von Herzbiopsien bei Säuglingen. (A) Bild einer endomyokardialen Biopsie (Nassgewicht ca. 40 mg), die während der Korrekturoperation zur Tetralogie von Fallot bei einem Säugling erhalten wurde. (B) Myokardscheibe aus dem in Adargestellten Gewebe, eingebettet in Agarose. (C) Kardiomyozyten isoliert aus einer Myokardscheibe, wie in Bgezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Patientendaten. Eine Liste der In-Studien enthaltenen Proben von menschlichen Patienten wird angegeben. Die Proben wurden nach Operationstypen, Alter, Krankheitsätiologie und Transportzeit kategorisiert, wobei die jeweilige Gesamtzahl der Proben und die Anzahl der erfolgreichen Myozytenisolationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Obwohl die Isolation lebender Kardiomyozyten vor mehr als 40 Jahren etabliert wurde und immer noch eine Voraussetzung für viele experimentelle Ansätze in der Herzforschung ist, bleibt sie eine schwierige Technik mit unvorhersehbaren Ergebnissen. Die Kardiomyozytenisolation durch Perfusion der Herzkranzgefäße mit Enzymlösung wird häufig für Herzen von Kleintieren verwendet und liefert eine große Anzahl lebensfähiger Zellen. Dies erfordert jedoch ein relativ komplexes System und Fachwissen. Darüber hinaus sind die meisten menschlichen Gewebeproben aufgrund ihrer geringen Größe oder des Fehlens von koronaren Arterienzweigen für diese Methode nicht geeignet, was neue Methoden zur Isolierung menschlicher Kardiomyozyten wünschenswert macht. Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der atraumatischen Erzeugung dünner Herzgewebescheiben, die dann einer enzymatischen Verdauung unterzogen werden. Es kann auf Myokardproben aus Tierherzen und humanem Myokard wie apikalen Kernen aus linksventrikulärer Assist-Device-Implantation, Endomyokardialbiopsien aus septaler Myektomie oder explantierten Herzen angewendet werden (siehe Ergänzende Tabelle 1), und produziert zuverlässig ausreichende Mengen an lebensfähigen, calcium-toleranten Kardiomyozyten, die für nachfolgende Experimente verwendet werden können, wie Kardiomyozyten.17
Ein Hauptgrund für höhere Erträge von Myozyten aus Vibratome-geschnittenen Gewebescheiben als aus gehackten Gewebestücken könnte ein geringerer Grad an Myozytenschäden während des Schneidens sein. Wenn eine koronare Perfusion nicht möglich ist, ist das Schneiden oder Hacken der Gewebeprobe notwendig, um die Kontaktfläche für die Verdauung von Enzymen zu erhöhen. Die Scheibenabmessungen von ca. 8 mm x 8 mm x 0,3 mm ermöglichen einen guten Zugang zu Enzymen durch ein relativ großes Flächen-Volumen-Verhältnis (ca. 7 mm-1). Mit einer Schere kann ein ähnliches Flächen-Volumen-Verhältnis (ca. 6 mm-1) erreicht werden, indem die Proben in kleine Stücke von ca. 1 mm x 1 mm x 1 mm zerkleinert werden. Obwohl Myozytenschäden in Scheiben und gehackten Stücken vor der enzymatischen Verdauung nicht quantifiziert wurden, verursacht das Schneiden auf einem Vibratom wahrscheinlich deutlich weniger Schaden, da es ein schonendes Schneiden in Faserrichtung ermöglicht. In der Tat wurde geschätzt, dass in Vibratome-geschnittenen Scheiben weniger als 5% der Myozyten19beschädigt sind. Die Ergebnisse zeigen, dass menschliche Kardiomyozyten sehr effizient mit dem bereitgestellten Protokoll isoliert werden können, mit einem viel höheren Anteil lebensfähiger Zellen im Vergleich zu Gewebestücken. Dies entspricht einem Protokoll, das Scheiben aus Demobichgewebe20verwendet. Unsere Methode liefert bis zu 200 kalziumtolerante ventrikuläre Myozyten pro Milligramm Gewebe und bietet die Möglichkeit, Herzgewebe bis zu 36 h vor der Isolierung zu lagern oder zu transportieren. Damit ist das Protokoll für Laboratorien ohne Herzchirurgie vor Ort anwendbar und erweitert damit die Möglichkeiten für Kooperationen.
Kritische Schritte im Protokoll sind die korrekte Verarbeitung von Myokard auf Scheiben auf einem Vibram und deren Verdauung sowie die letzten Schritte der Kalzium-Wiedereinführung und des Auswaschens von BDM. Im Gegensatz zu anderen Methoden19,21ist das Herzgewebe in Agarose mit einer niedrigen Schmelztemperatur eingebettet, um Bewegung während des Schneidverfahrens zu vermeiden14,15. Dies war notwendig, um den Gewebeblock zu stabilisieren und gleichmäßige Scheiben zu erzeugen. Beim Einbetten des Gewebes sollte die Agarose noch flüssig sein, aber die Temperatur sollte 37–38 °C nicht überschreiten, um Zellschäden durch Hyperthermie zu vermeiden. Umgekehrt, wenn die Agarose zu kalt ist (<35 °C), bindet sie nicht gut an den Gewebeblock und kann während des Schneidens brechen. Um die Myozytenlebensfähigkeit nach der Vibratom-Verarbeitung zu testen, wird ein einfacher MTT-Assay vorgeschlagen, der eine schnelle Auswertung der Zelllebensfähigkeit durch Lichtmikroskopie und auch für die Quantifizierung durch photometrische Analyse ermöglicht14,22. Kardiomyozytenschäden können auch bei der Wiedereinführung von extrazellulärem Kalzium nach einer Inkubationszeit in der kalziumfreien Lösung23,24auftreten. Dieses Calciumparadoxonphänomen in isolierten Zellen kann durch eine langsame, schrittweise Erhöhung des Kalziumspiegels gemildert werden, um die Anpassung der Kardiomyozyten zu ermöglichen. Dieser Schritt sollte bei kontinuierlichem Rühren bei 35 °C und mit Intervallen von 5 min sorgfältig durchgeführt werden. Leichte Hypothermie (21 °C) erhöht die Calciumtoleranz von Rattenkardiomyozyten während der Wiedereinführung, was im Einklang mit früheren Berichten25ist. Menschliche Kardiomyozyten zeigten jedoch keine großen Unterschiede in der Calciumtoleranz bei 35 °C oder 21 °C. Die Verwendung von BDM beim Schneiden, Verdauen und Wiedereinleiten von Kalzium verhindert Myozytenkontraktion und zellulären Energieaufwand sowie Hyperkontraktion und ist daher schützend. Für nachfolgende Experimente zur Beurteilung der Kardialkontraktilität oder Anregungs-Kontraktionskopplung muss BDM jedoch26entfernt werden. Ein allmähliches Auswaschen wurde angewendet, um spontane Hyperkontraktionen zu minimieren. BDM kann weggelassen werden, aber dies wird die Menge an hypervertraglichen Myozyten deutlich erhöhen, wie in früheren Experimenten undStudien6 beobachtet.
Das beschriebene Protokoll verwendet eine Lösung, die hohes Kalium und nur Spuren von Natrium für die Verdauung enthält. Diese Lösung lieferte die höchsten Erträge an stabförmigen, kreuzgestreiften Kardiomyozyten. Für die enzymatische Verdauung erforderte es jedoch eine höhere Konzentration von Kollagennase (4 mg/ml) im Vergleich zur Verdauung in der normalen Tyrodes-Lösung (1,5 mg/ml). Hohes extrazelluläres Natrium kann zu einer intrazellulären Natriumüberlastung führen, wodurch die negativen Auswirkungen des Calciumparadoxons noch verschärft werden, wodurch die Zellausbeute27reduziert wird. Daher wird empfohlen, Lösungen mit hohem Kalium und niedrigem Natriumgehalt zu verwenden. Eine hohe extrazelluläre Magnesiumkonzentration wird häufig in kardiomyozyten Isolationsprotokollen3,28, eingesetzt und hat gezeigt, dass Ischämie-Reperfusionsverletzung29,30 zu reduzieren und die Herzfunktion nach längeren Perioden der kalten Ischämie zu verbessern31. Daher enthält die hier angewandte Lösung auch eine hohe Magnesiumkonzentration (10 mM). Es wurde jedoch gezeigt, dass Erregbarkeit, Kontraktionskraft und Leitungsgeschwindigkeit durch hohe Magnesiumkonzentrationen32reduziert werden können. Obwohl sich gezeigt hat, dass diese Effekte reversibel sind, können Auswirkungen auf isolierte Kardiomyozyten nicht ausgeschlossen werden. So kann die Verwendung von Magnesium in physiologischen Konzentrationen (1–2 mM) zu einer geringeren Gesamtzellausbeute führen, aber die Erregbarkeit verbessern.
Die optimale Verdauungszeit ist recht variabel, da die Menge an extrazellulärer Matrix oder Fibrose im menschlichen Versagensmyokard erheblich variieren kann. Sollte das Gewebe zum Zeitpunkt der Dissoziation noch fest verbunden sein, mit nur wenigen lebensfähigen Myozyten freigesetzt, Erhöhung der Verdauungszeit in Schritten von 5 min und regelmäßige Überprüfung auf freie Myozyten und die Textur der Scheiben wird empfohlen. Wenn das Gewebe nach längeren Zeiträumen unverdaut bleibt (>45 min), wird empfohlen, die Konzentration von Kollagennase in Schritten von 1 mg/ml zu erhöhen oder eine andere Enzymcharge zu testen16. Die jeweiligen Werte, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, können als Grundierung für eine robuste Isolierung von Kardiomyozyten dienen, aber die Bedingungen für eine optimale Ausbeute und Lebensfähigkeit können in jedem Labor unter Berücksichtigung der großen Variabilität von Enzymaktivitäten und Gewebekonstitutionen verfeinert werden. Ein Vorteil der Methode ist, dass aufgrund der geringen Mengen an benötigtem Gewebe und des einfachen Arbeitsablaufs in Kleinserien mehrere Tests parallel durchgeführt werden können. So kann schnell ein optimales Protokoll erreicht werden.
Die Erzeugung hochwertiger Myokardscheiben erfordert ein hochpräzises Vibratom. Die Notwendigkeit eines hochpräzisen Gewebeschneiders oder Vibratoms ist ein möglicher Nachteil der Methode, da sie nicht in jedem Labor leicht erhältlich ist. Das für diese Studie verwendete Gerät wird an anderer Stelle näher beschrieben14,15. Verschiedene Geräte wurden erfolgreich verwendet, um Myokardscheiben von anderen Gruppen33,34,35zu generieren. Wenn also die Einstellungen für die Vorfahrtsgeschwindigkeit, die Messeramplitude und die Schwingungsfrequenz erfüllt werden können und eine horizontale Klingenausrichtung mit einer Z-Ablenkung unter 0,1 m verfügbar ist, sollte ein erfolgreiches Schneiden und Isolation mit anderen Vibratomen möglich sein. Darüber hinaus ist das Gewebeschneiden aufwendig und verlängert die Dauer des Protokolls signifikant (ca. 1–2 h). Die Verwendung von BDM als mechanisches Entkopplungsmittel hat schützende Wirkung durch verringerung der zellulären Energieexposition, ischämischen Verletzungen und Hyperkontraktion26,36,37. Obwohl die negative inotrope Wirkung von BDM sich nach dem Auswaschen38,39als schnell reversibel erwiesen hat, ist nicht klar, ob BDM unbekannte Folgen für die Kardiomyozytenfunktion haben kann40. Diese Studie zeigt, dass Zellen mit hohen Erträgen nach Gewebelagerzeiten von bis zu 36 Stunden isoliert werden können und dass menschliche Kardiomyozyten bis zu drei Tage nach der Isolierung mit dieser Methode kultiviert werden können17. Wir haben keine funktionellen oder strukturellen Unterschiede zwischen Myozyten mit kurzen und langen Lagerzeiten bemerkt. Dies wurde jedoch nicht systematisch bewertet. Auf der anderen Seite zeigte sich für ganze Kaninchenherzen, dass funktionelle Unterschiede zwischen frischen Herzen und Herzen, die kalter Ischämie in extrazellulärer Lösung mit 30 mM BDM ausgesetzt waren, vernachlässigbar waren31, und das gleiche kann in diesem Fall der Fall sein.
Das vorgestellte Protokoll bietet eine solide Grundlage für alle Arten von Experimenten mit isolierten ventrikulären Kardiomyozyten und könnte besonders wertvoll für die Forschung an menschlichen Myokardproben sein. Mit einigen Anpassungen scheint auch die Isolierung anderer Herzzellen, wie Fibroblasten oder Endothelzellen, möglich41. Da es nur geringe Mengen an Gewebe erfordert, die in Kühlspeicherlösung von anderen Laboratorien versendet werden können, kann die Anwendung des Protokolls die Anzahl der geopferten Labortiere reduzieren. Tatsächlich wurde das Protokoll erfolgreich auf das Herzgewebe von Kaninchen und Schweinen angewendet. Darüber hinaus, wie Experimente mit langfristig kultivierten Myokardgewebescheiben erhöhen21,33,42 und werden ständig verbessert, um optimale Kulturbedingungen zu bieten15,43,44, die Methode kann leicht nach der Kultivierung der Scheibe angewendet werden. Die Isolation von Einzelzellvon kultiviertem Myokard kann daher dazu beitragen, Veränderungen in Kardiomyozyten nach pharmakologischen oder physikalischen Eingriffen in vitro zu charakterisieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Andreas Dendorfer vom Walter-Brendel-Zentrum für Experimentelle Medizin, LMU München, für die Hilfe beim Schneideprotokoll. Für die Bereitstellung menschlicher Myokardgewebeproben danken wir Ghazali Minabari und Christian Heim von der Klinik für Herzchirurgie, Universitätsklinikum Erlangen, Hendrik Milting vom Erich & Hanna Klessmann Institut, Ruhr-Universität Bochum und Muhannad Alkassar von der Klinik für Kinderkardiologie, Universitätsklinikum Erlangen. Für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie danken wir Simon Völkl und Kollegen vom Translational Research Center (TRC), Universitätsklinikum Erlangen. Wir danken auch Lorenz McCargo und Celine Grüninger vom Institut für Zell- und Molekularphysiologie Erlangen für die hervorragende technische Unterstützung.
Unterstützt wurde diese Arbeit vom DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung), vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) am Universitätsklinikum der Universität Erlangen-Nürnberg und dem Universitätsbund Erlangen-Nürnberg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| 2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
| Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
| CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
| Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
| Glucose | Merck | 50-99-7 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
| L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
| Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
| MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
| FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
| Enzymes | |||
| Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
| Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
| Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
| Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
| Material | |||
| Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
| Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
| Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
| Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
| Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
| TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
| TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
| Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |
References
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
- Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
- Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
- Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
- Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116 (2014).
- Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
- Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
- Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
- Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
- Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
- Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
- Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
- Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47 (2019).
- Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
- Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
- Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
- Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
- Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
- Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
- Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
- Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
- Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
- Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
- Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
- Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
- Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
- Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
- Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
- Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
- Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
- Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
- Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
- Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).
