Summary
在这里，我们介绍和描述广泛的方法，利用一些多功能线虫模型，包括高活性离子通道诱导坏死和蛋白质聚合诱导神经毒性，以监测和解剖年龄相关的神经退行性疾病的细胞和分子基础。
Abstract
对抗人类神经退行性疾病并管理其普遍的社会经济影响正成为全球优先事项。尽管它们对人的生命质量和保健系统有有害影响，但大多数人类神经退行性疾病仍然无法治愈和不可预防。因此，针对此类疾病开发新的治疗干预措施正成为当务之急。神经元回路和功能的年龄相关恶化在像低蠕虫卡诺哈布迪炎和人类等不同生物体中进化地得到Caenorhabditis elegans保存，这表示在底层细胞和分子机制上具有相似性。C. elegans是一种高度可塑性的基因模型，它提供了良好的神经系统、身体透明度以及多种遗传和成像技术，用于评估衰老期间的神经元活动和质量控制。在这里，我们介绍和描述利用一些多功能线虫模型的方法，包括高活性离子通道诱导坏死（例如，deg-3（d）和mec-4（d）和蛋白质聚合（例如，α-syunclein和多聚谷氨酸）诱导神经毒性，以监测和解剖与年龄相关的神经元分解的细胞和分子基础。这些动物神经退化模型，加上细胞死亡调节剂的遗传和药理学屏幕，将导致对神经元功能与年龄相关的分解的前所未有的理解，并提供与人类健康和生活质量具有广泛相关性的关键见解。
Introduction
在过去的二十年里，C.elegans被广泛用作研究坏死细胞死亡的分子机制的模型有机体。C. elegans提供特别良好的特征和映射的神经系统、透明的身体结构和多种遗传和成像方法，以监测体内细胞功能和整个衰老过程中的生存。因此，已经开发了几个C.elegans神经退化的遗传模型来评估神经元的生存能力。特别是，描述良好的线虫模型包括多活性离子通道诱发坏死1,1，2，3,3和细胞死亡触发增加蛋白质聚集4，5，6，7，8，9，105,6,7,8,9,10和中暑411，12，等等。11,12
短期暴露在亚致命温度下，对坏死细胞死亡产生抵抗力，由线虫和哺乳动物神经元11的后续热应激触发。有趣的是，线虫在温和的高温下每天预置，可防止神经退化，而神经退化是由多种刺激引起的，例如离子不平衡（例如，mec-4（u231）和/或deg-3（u662）和蛋白质聚集（例如，α-合成素和聚Q40）11，13。11,13
在这里，我们描述了使用 C.elegans来 监测和评估人类疾病成熟模型中依赖年龄的神经退化的通用方法，如兴奋性触发细胞死亡、帕金森氏症和亨廷顿舞蹈症。此外，我们强调热预置在几种神经退化模型中的神经保护作用。这些技术与遗传和/或药理学筛选相结合，将识别和鉴定新型细胞死亡调节剂，具有潜在的治疗兴趣。
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Protocol
1. 由超活性离子通道引起的坏死细胞死亡
注：在退化素的基因家族，包括mec-4 和 deg-3 等，功能增益突变导致产生多活性离子通道，触发蠕虫3中机械化所需的六个接触受体神经元的坏死细胞死亡。退化素的异常刺激引起的坏死与哺乳动物的兴奋毒性有若干机械和形态相似性。维持能量代谢和钙平衡对坏死11期间神经元的生存起着至关重要的作用。以下菌株可用于监测由超活性离子通道，mec-4（u231）X和deg-3（u662）V触发的坏血细胞死亡。
- 维持、同步和制备突变蠕虫，以检查坏死细胞死亡
- 第1天：在线虫生长介质上选取M.4（u231）或deg-3（u662）突变线虫的L4幼虫（NGM;表1）使用解剖立体显微镜用大肠杆菌 （OP50） 播种的板。
- 每个种子NGM板放置10个L4线虫，并在20°C的标准温度下生长。
- 第5天：用1 mL的M9缓冲液清洗盘子（表1），用1.5mL管收集动物。
- 以 10，000 x g 的 30 s 离心并取出上一代。
- 加入 0.5 mL 漂白溶液（7 mL 的 H2O、1 mL 的 5 N NaOH 和 2 mL 的漂白剂）。
注：漂白溶液逐渐失去效率;因此，它应该每天准备。 - 漩涡和定期监测，直到蠕虫溶解。
注：避免漂白时间超过5分钟，因为胚胎的生存能力将受到影响。 - 以 10，000 x g 的 30 s 离心并取出上一代。
- 用 1 mL 的 M9 缓冲液清洗两倍的颗粒（鸡蛋）。
- 洗涤后，在200μL的M9缓冲液中重新煎蛋，并在34°C的水浴中孵育25分钟。
- 在 20°C 下保持一组单独的控制样品（鸡蛋）。
- 移液 100 μL 控制或热冲击处理鸡蛋，并把它们放在非种子NGM板。每个盘子至少含有100-200个鸡蛋。
- 在20°C下孵化卵子，直到孵化。
- 使用差分干涉对比度安装 L1 幼虫以进行检查（DIC;诺马斯基）显微镜
- 准备2%的加糖垫。
- 使用 1 mL 的 M9 缓冲液清洗板，并在 1.5 mL 管中收集 L1 幼虫线虫。
- 30 s 的离心机为 10，000 x g。
- 拆下上一液并保留颗粒（线虫）。
- 加入 100 μL 的 20 mM M9/levamisole 缓冲液，对线虫进行麻醉。
注：避免作为麻醉剂使用亚齐德钠。阿齐德钠触发线粒体损伤和氧化应激，最终导致细胞死亡诱导 - 含有L1蠕虫的M9/levamisole缓冲液10μL，并安装在2%的气垫上（表1）。
- 轻轻地将盖玻片放在样品顶部。
注：用指甲油密封盖玻片，在整个成像过程中保持湿度。 - 使用差分干扰对比度观察蠕虫（DIC;诺马斯基）显微镜。
- 通过计算具有每个线虫特有的 vacud 外观的细胞，对六个接触受体神经元的神经退化进行评分。
2. 蛋白质聚合诱导神经退化
注：以下菌株可用于研究蛋白质聚合引起的神经毒性：（A） 多巴胺神经元中人类β-合成素的过表达， UA44： Is是 [baIn1; pdat-1]- syn， pdat-1Gfp] 和 （B） 过度表达人类多聚葡萄糖胺蛋白 （PolyQ） 泛神经， AM101： rmsIs110[prgef-1Q40：YFP] 6，10。6
- 神经退化测定转基因线虫的维护、同步和制备
- 使用解剖立体显微镜来监测 C.elegans的 发育和生长。
- 第1天：通过采摘和转移15-20个L4幼虫在新鲜OP50种子的NGM盘上，同步转基因线虫的种群。
注：每个条件至少使用三个应变板。 - 孵育，让线虫在20°C的标准温度下生长。
- 第2天：在34°C的培养箱中转移板，每天进行30分钟的预置。然后，将预置线虫返回20°C的标准温度。
注：不同的遗传背景可能长期对高温敏感。 - （A） 如果调查多巴胺神经元中人类[-合成素）的过度表达，UA44：是[baIn1;pdat-1+-syn，pdat-1GFP]：在第9天，监测7天大的转基因线虫多巴胺神经细胞死亡。
- （B） 如果调查人类多糖胺蛋白（PolyQ）泛神经元的表达过度，AM101：rmsIs110 [prgef-1Q40：：YFP]：在第5天，测量4天大转基因动物头部区域的神经元聚氨酯聚集物，表达Q40：YFP。
- 安装样品进行显微检查
- 准备2%的加糖垫（表1）。
- 在阿加罗斯垫的中心加入 10 μL 的 20 mM M9/levamisole 缓冲液滴。
- 挑选各自的转基因线虫，并在M9/levamisole滴中转移它们。
注：每滴放置20-30个线虫。 - 轻轻地在样品顶部放置盖玻片。
注：用指甲油密封盖玻片，在整个成像过程中保持湿度。 - 继续对各自的样品进行微观检查。
- 多巴胺神经元中转基因线虫共表达β-合成素和细胞细胞细胞性GP的采集过程和数据分析
- 使用与相机结合的荧光显微镜（例如，EVOS FL Auto 2）。
- 以 20 倍的放大倍率检测和捕获头部区域的 z 堆栈图像。
- 保存并收集最大强度投影图像。
- 继续分析获取的图像。
- 通过评分以下细胞特征检查转基因蠕虫的神经退化，（i） 在 dat-1 的启动下，从表达 GFP的神经元中失去荧光，（ii） 神经元显示索玛和/或斧头出血、生长或树突损失。
- 使用软件包（例如 Excel）导入和分析数据。
3. 转基因线虫的采集过程和数据分析，表达泛神经聚Q40与YFP融合
- 使用与相机结合的荧光显微镜（例如，EVOS FL Auto 2）。
- 以 20 倍的放大倍率检测和捕获头部区域的 z 堆栈图像。
- 保存并收集最大强度投影图像。
- 继续使用斐济软件分析采集的图像。
- 打开图像与斐济程序14.
- 通过"图像和颜色"下拉菜单选择"拆分通道"命令。
注：保留绿色通道图像。 - 使用 徒手选择 工具手动设置感兴趣的荧光区域（ROI;例如头部）。
- 通过分析和工具下拉菜单在 ROI 管理器中添加相应的 ROI。
- 通过选择"过程"和"减去背景"将背景减去 50%。
- 通过菜单命令"图像" 设置和应用阈 值 | 调整 | 阈值。在整个实验的图像分析中保持并设置相同的阈值。
- 从 ROI 管理器中选择相应的 ROI。
- 使用菜单命令"分析和分析粒子"分析蛋白质聚集体的数量。
- 对每个采集的图像重复步骤 3.5-3.12。
- 从单独的"结果"窗口复制显示值。
- 使用软件包粘贴/导入和分析结果。
4. 报告统计分析
- 每个实验条件至少使用 30 个线虫。执行三个生物复制。
- 使用统计分析软件进行学生 t-测试（两组之间的比较）或 ANOVA（多个组之间的比较）进行统计分析，p < 0.05 为重要。
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Representative Results
过度活跃的离子通道引起的坏死细胞死亡
使用此处介绍的程序，mec-4（u231）和deg-3u662）突变胚胎要么在34°C下孵育25分钟，要么保持在20°C的标准温度下。孵化后，在两组动物的L1幼虫阶段确定神经元细胞尸体的数量。从热冲击预置卵子中孵化的线虫中，坏死细胞死亡减少（图1A-1B）。
蛋白质聚合诱导神经退化
转基因线虫过度表达 （A） 人类 + - 合成素和细胞质 GFP 在多巴胺能神经元和 （B） 人多粘胺蛋白 （PolyQ） 与 YFP 泛神经融合， 每天暴露在 34 °C 下 30 分钟.热休克预感促进神经保护，防止7天大成人草本细胞死亡时的神经保护（图2A），减少Q40：YFP蛋白质聚集体在4天大成人的头部区域（图2B和图3）。
图1：高活性离子通道诱发坏死。（A） 代表DIC显微镜图像的mec-4（u231） L1幼虫，箭头指示特征坏死真空。在神经退化的早期阶段，肿胀的核显示在细胞内。图像是使用 40 倍对角镜头获得的。比例杆，20 μm。（B） 每100只携带神经毒性mec-4（u231）或deg-3（u662）等位基因的动物，在 L1 幼虫发育阶段的神经元细胞尸体数量。与未经治疗的幼虫相比，从预产卵孵化的L1幼虫中抑制坏死细胞死亡（每基因型和测定动物n= 100只动物）;数据表示未经处理与预用的数据表示 +S.E.M.，***P < 0.001;Pt- 测试） 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在34°C下进行每日预置，可对β-合成素进行神经保护，并降低C.elegans中的聚Q聚合。（=） 前多巴胺神经元（CEPs和ADEs）在未经治疗和预源性线虫中生存，与人类+-合成素共同表达细胞质GP。与未经治疗的线虫相比，预源线虫表现出增强的神经保护。神经细胞体（星号）和斧珠（箭头）的残余物在未经治疗的线虫（顶板）中出现。索马（星号）和神经元过程（箭头）在预置时都保留。使用 20 倍对角镜头获得的图像，并描绘最大强度 z 投影。收购详情：亮，0.15。比例杆，20 μm。在成年的第七天，蠕虫被评分用于前多巴胺神经元的神经元存活。（B） 在成年后第四天在未经治疗和预源性转基因线虫的头部区域检测到的神经元聚Q聚集体。与未经治疗的蠕虫相比，预源性转基因蠕虫的神经元Q40：YFP聚集体较少。头部区域的代表性图像用箭头显示，指示神经元细胞中的多Q蛋白聚合。使用 20 倍对角镜头获得的图像，并描绘最大强度 z 投影。收购详情：光明，0.0175。比例杆，20 μm。在三个独立的实验中，每个实验都对30-35只动物进行了量化。数据表示均值 +S.E.M.，***P < 0.05，未配对t-test。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：使用斐济软件进行图像分析。1. 使用斐济软件打开获得的图像; 2. 通过"图像"和"颜色"下拉菜单选择"拆分通道"命令以转换图像;3， 4. 保持"绿色通道"形象，并使用"手绘选择"工具，包装感兴趣的荧光区域（ROI;例如头部）。通过"分析"和"工具"下拉菜单在"ROI 管理器"中添加相应的 ROI; 5， 6. 通过选择"过程"和"减去背景"将背景减为 50%; 7， 8. 通过菜单命令"图像"，"调整"和"阈值"设置和应用阈值; 9. 从"ROI 管理器"中选择相应的投资回报率; 10-12. 使用菜单命令"分析"和"分析颗粒"分析蛋白质聚集体的数量。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 试剂 | 食谱 | |
| 2% 阿加罗斯垫 | 1. 在圆柱形玻璃烧杯中，重量为 0.5 g 的葡萄糖。 | |
| 2. 添加 25 mL 的 M9 缓冲液。 | ||
| 3. 在微波炉中加热，直到接近沸腾。拿出来，用移液器尖搅拌，再煮沸。重复，直到糖溶解。 | ||
| 4. 将空显微镜幻灯片放在长凳上。 | ||
| 5. 在幻灯片中间滴（±50 μL）新鲜2%的阿加罗斯溶液。 | ||
| 6. 拿第二张显微镜幻灯片，放在加糖滴的顶部。轻轻按下以压平掉落。 | ||
| 7. 让红糖硬化 30 秒，轻轻取下顶部显微镜幻灯片。 | ||
| 8. 立即进行样品制备，因为加糖垫将在大约 5 分钟内开始干燥。 | ||
| 提示： 将顶部显微镜幻灯片作为盖，以延长湿度（± 1 小时）。因此，在实验过程中可以快速准备和使用几种阿加罗斯垫。 | ||
| M9 缓冲区 | 1. 溶解 3 g KH2PO4， 6 g Na2HPO4， 5 g NaCl 在 1 L 蒸馏水和自动处理器中。 | |
| 2. 冷却并添加 1 mL 的 1 M MgSO4 （无菌）。 | ||
| 3. 将 M9 缓冲液存放在 4 °C。 | ||
| 线虫生长介质 （NGM） 阿加板 | 1. 混合3克NaCl，2.5克巴托普酮，0.2克链霉素，17克加糖，加入900 mL的蒸馏水。高压 釜。 | |
| 2. 冷却至55-60°C。 | ||
| 3. 加入1 mL胆固醇库存溶液，1 m L 1 M CaCl2，1mL 1 M MgSO4，1mL 的尼他汀库存溶液，25 mL 无菌 1 M 磷酸盐缓冲液，pH 6.0，蒸馏无菌水高达 1 L。 | ||
| 4. 每培养皿10 mL的培养，并留下凝固。 | ||
| 5. 将盘子存放在 4 °C 下，直到使用。 | ||
表1：常用试剂的推荐配方。 此处概述了所述协议中使用的所有试剂配方。
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Discussion
在这里，我们介绍和描述广泛访问的方法，增长，同步和微观检查一些多功能的C.elegans模型研究年龄依赖性神经退化。特别是，我们使用高活性离子通道诱发坏死和蛋白质聚集诱导,神经毒性,,,,1、2、3、4、5、7、9、10、11,2来评估和剖析与年龄相关的神经元崩溃的7,细胞,和34分子基础。
虽然所述体内细胞死亡评估的程序简单明了，在任何实验室都可以轻松执行，但需要考虑一些关键步骤。众所周知，热量限制和饥饿会诱发多种应激途径，如自噬，这些通路可能会干扰神经退化或蛋白质聚集13、15、16。13,15,16因此，应使用喂养良好的、不饥饿的线虫。热休克预置给予神经保护对几个神经退行性刺激，并被用作一个既定的细胞死亡调节器11，13。11,然而，一些突变体容易长时间暴露在高温下。因此，每次使用对高温敏感的不同遗传背景的动物时，应根据试验确定热休克预置的适当发育阶段、年龄和持续时间。在衰老期间观察到线虫肠道自荧光的逐渐增加。因此，在 AM101 菌株的成像过程中，应避免靠近肠道区域的神经元细胞体和过程。聚焦位于头部和/或尾部区域的神经元细胞，以绕过肠道衍生的自荧光。使用M9缓冲液代替水生成M9/levamisome缓冲液和2%的加糖垫。M9 缓冲器可确保有利的渗透环境，防止线虫在整个微观可视化和分析过程中干燥。
所述方法强调，神经退化线虫模型与细胞死亡调节剂的遗传和药理学屏幕相结合，可导致对神经回路年龄相关损伤的空前理解，并促进针对神经退行性疾病的新治疗干预措施的发展，促进人类健康和生活质量。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感谢查尼奥塔基斯 M. 和库纳基斯 K. 的录像录制和编辑。K.P. 由希腊研究和创新基金会（HFRI）和研究与技术总秘书处（GSRT）提供赠款。N.T. 的资金来自欧洲研究理事会 （ERC – GA695190 – MANNA）、欧盟委员会框架方案和希腊教育部的赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
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