Summary
Здесь представлен протокол для выполнения генетических манипуляций в эмбриональном мозге хорька с использованием в утробе матери электропорации. Этот метод позволяет таргетирование нейронных клеток прародителя в неокортексе in vivo.
Abstract
Манипуляция экспрессией генов in vivo во время эмбрионального развития является методом выбора при анализе роли отдельных генов при развитии млекопитающих. В утробе матери электропорация является ключевым методом для манипулирования экспрессией генов в эмбриональном мозге млекопитающих in vivo. Здесь представлен протокол в утробе матери электропорации эмбрионального неокортекса хорьков, маленького хищника. Хорек все чаще используется в качестве модели для развития неокортекса, потому что его неокортекс демонстрирует ряд анатомических, гистологических, клеточных и молекулярных особенностей, которые также присутствуют у человека и нечеловеческих приматов, но отсутствуют в моделях грызунов, таких как мышь или крыса. В утробе матери электропорация проводилась в эмбриональный день (Е) 33, стадии миднейрогенеза у хорька. В утробе электропорации цели нервных клеток-предшественников накладки бокового желудочка мозга. Во время нейрогенеза, эти клетки-предшественники дают начало всем другим типам нервных клеток. Эта работа показывает репрезентативные результаты и анализы на E37, послеродовой день (P) 1, и P16, соответствующие 4, 9 и 24 дней после в утробе матери электропорации, соответственно. На более ранних стадиях потомство целевых клеток состоит в основном из различных подтипов нейронных прародителя, в то время как на более поздних стадиях большинство помеченных клеток являются постмитотические нейроны. Таким образом, в утробе матери электропорация позволяет изучать влияние генетических манипуляций на клеточные и молекулярные особенности различных типов нервных клеток. Благодаря своему влиянию на различные популяции клеток, в утробе матери электропорации также могут быть использованы для манипуляции гистологических и анатомических особенностей неокортекса хорька. Важно отметить, что все эти эффекты являются острыми и выполняются с spatiotemporal специфики определяется пользователем.
Introduction
Неокортекс является внешним листом головного мозга млекопитающих и местом высшихкогнитивных функций 1,,2,,3,,4,,5. Для достижения острой генетической манипуляции в млекопитающих neocortex in vivo во время эмбрионального развития, были изучены два различных метода: вируснаяинфекция 6 и в утробе матери электропорации7. Оба метода позволяют эффективной ориентации неокортикальные клетки, но страдают от некоторых ограничений. Основным преимуществом в электропорации матки по сравнению с вирусной инфекцией является способность достичь пространственной специфичности в неокортексе, которая достигается путем регулирования направления электрического поля.
Так как электропорация была впервые показана для облегчения вступленияДНК в клеткиin vitro 8 , она была применена для доставки ДНК в различных позвоночных in vivo. В развитии неврологии, в утробе матери электропорации мыши неокортекс был впервые зарегистрирован в 2001году 9,10. Этот метод состоит из инъекции смеси ДНК в боковой желудочек эмбрионального мозга и последующего применения электрического поля с использованием пинцетовых электродов, что позволяетпространственную точность 7,,11. В утробе электропорации с тех пор были применены для доставки нуклеиновых кислот для того, чтобы манипулировать экспрессией эндогенных или эктопически добавленных генов в неокортексе мыши. Важный прогресс был достигнут в последнее время, применяя методологию CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генома через в утробе матери электропорации в неокортексе мыши для выполнения (1) генного нарушенияв постмитотических нейронах 12,,13 и нейронныхклетках-предшественниках 14, и (2)геном 15 и эпигеноме16 редактирования.
Очень скоро после первого сообщения в мыши, в утробе электропорации был применен к эмбриональной крысы neocortex17,18. Не-грызунов остается проблемой до первого в утробе матери электропорации хорьков, небольшой хищник, было сообщено в 2012году 19,20. С тех пор в утробе матери электропорация хорьков была применена для изучения механизмов развития неокортекса путем маркировки нейронных прародителейи нейронов 20,,21,,22,23, манипулируя экспрессией эндогенных генов, в том числе с использованием технологии CRISPR/Cas924, и путем доставки эктопических генов21,,22,,25,в том числечеловеческих генов 26. Кроме того, в утробе матери электропорация хорьков была использована для решения особенностей развития неокортекса человека впатологических условиях 27,28.
В контексте развития неокортекса преимущества использования хорьков в качестве образцового организма по сравнению с мышами обусловлены тем, что хорьки лучше резюмируют ряд человеческих особенностей. На анатомическом уровне хорьки демонстрируют характерный узор коркового складывания, который также присутствует у человека и большинства других приматов, но полностью отсутствует умышей или крыс 4,,29,,30,,31. На гистологическом уровне хорьки имеют две различные субвентрикулярные гермезинальные зоны, называемые внутренними и внешними субвентрикулярными зонами (ISV и OSV, соответственно)32,33, разделенные слоемвнутреннего волокна 23. Эти функции также совместно с приматами, в том числе людей, но не смышами 34. ISV и OSV у хорьков и людей населены обильными нейронными клетками-предшественниками, в то время как субвентрикулярная зона (СВЗ) мышей содержит только редкие нейронные прародители21,32,35,36. На клеточном уровне хорьки обладают высокой долей подтипа нейронных прародителей, называемых базальной или внешней радиальной глией (bRG или oRG, соответственно), которые считаются инструментальными для эволюционного расширения неокортексамлекопитающих 34,37,38. bRG, следовательно, весьма обильные в плода человека и эмбрионального неокортекса хорька, но они очень редки в эмбриональной мыши neocortex35,36. Кроме того, хорек bRG показывает морфологическую неоднородность, похожую на человеческую bRG, намного превосходя мышь bRG21. Наконец, на молекулярном уровне, развивающихся хорька неокортекс показывает модели экспрессии генов очень похожи на плода человека неокортекса, которые, как предполагается, контролировать развитие корковых складывания, средипрочего 39.
Клеточные биологические и молекулярные характеристики хорька bRG делают их высокоо распространения, похожие на человека bRG. Это приводит к увеличению производства нейронов и развитию расширенного и очень сложного неокортекса34. Эти характеристики делают хорьков отличными модельными организмами для изучения человеческих особенностей развития неокортекса, которые не могут быть смоделированыу мышей 26,,40. Чтобы в полной мере использовать хорька в качестве образцового организма, был разработан представленный метод. Он состоит из в утробе матери электропорации эмбрионов хорька E33 с плазмидной экспрессии GFP (pGFP) под контролем вездесущего промоутера, CAG. Электропомерные эмбрионы могут быть проанализированы эмбрионально или постнатально. Для того, чтобы уменьшить количество принесенных в жертву животных, самки хорьков (джиллс) стерилизованы гистерэктомией и пожертвованы для усыновления в качестве домашних животных. Если целевые эмбрионы собирают на эмбриональных стадиях, проводится вторая операция и эмбрионы удаляются кесаревой сечением, в то время как джиллы гистерэктомизируются. Если целевые эмбрионы анализируются на послеродовой стадии, джиллс гистерэктомизированы после того, как щенки были отутены или принесены в жертву. Таким образом, протокол для гистерэктомии jills также представлен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с немецким законодательством о защите животных после одобрения Landesdirektion Sachsen (лицензии TVV 2/2015 и TVV 21/2017).
1. Подготовка к электропорации матки
- Подготовь смесь ДНК. В этом протоколе используется окончательная концентрация 1 мкг/кЛ pGFP. Растворите ДНК в PBS и дополнить 0,1% Быстрый зеленый для облегчения визуализации. После того, как подготовлены, смешать смесь ДНК путем трубопроводов вверх и вниз несколько раз или пальцем нажав. Хранить при комнатной температуре до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для coelectroporations, смесь дна подготовлена для того чтобы содержать окончательную концентрацию 1 мкг/йл плазмидной кодируя ген интереса вместе с 0.5 мкг/йл pGFP разбавленного в PBS. - Подготовь стол для операций со всеми необходимыми инструментами и инструментами.
- Потяните стеклянные капилляры с помощью шкив микропипта. Отрегулируйте диаметр кончика капилляра, отрезав дистальной части капилляра с помощью типсов, как описаноранее 41.
2. Подготовка хорьков к операции
- Держите беременных jills с эмбрионами на E33 поста, по крайней мере 3 ч до операции, чтобы уменьшить риск рвоты.
- Перед операцией стерилизовать все инструменты путем автоклавирования. Выполните операцию в специально отведенном помещении в асептических условиях для устранения потенциальных источников загрязнения.
- Поместите беременную джилл в наркозную коробку с 4% изофлюраном.
- При анестезии поместите хорька на стол работы с тепловой площадкой и прикрепите маску наркоза с постоянным 2-3% изофлюранового потока к носу. Чтобы обеспечить надлежащий уровень анестезии, проверьте на отсутствие следующих рефлексов:
- Палебральный рефлекс, касаясь периокулярной кожи
- Рефлекс сгибателя путем щипать кожу между 2nd и 3 rd,или 3rd и 4th toe обеих задних лимбов
- Если палебральный рефлекс отсутствует и рефлекс сгибателя явно уменьшается, проверьте на болевой рефлекс, ущипнув один палец каждой задней конечности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что стетоскоп под рукой, чтобы контролировать пульс и ритм, если это необходимо.
- Вводить хорьку подкожно с анальгетиком (0,1 мл метамизола, 50 мг/кг массы тела), антибиотиком (0,1 мл/кг массы тела 20 мг/кг амоксициллина и клавулановой кислоты) и глюкозой (10 мл 5% раствора глюкозы).
- Поместите каплю раствора мази глаза на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание глаз во время хирургической процедуры.
- Бритье живота хорька с помощью бритвы.
- Очистите кожу водой и мылом, дезинфицировать живот 70% этанола скраб, дезинфицировать 2x с йодом, и дайте ему высохнуть.
3. В утробе матери электропорации хорьков
- Убедитесь, что хирургическая область стерильна: поместите стерильные хирургические инструменты на стерильные ткани, а также измените пальто и перчатки.
- Поместите стерильную хирургическую драпировку на животное.
- Используя скальпель, хирургическим путем откройте живот на линеа альба с вырезом длиной 5 см.
- Вырезать мышечный слой с помощью ножниц.
- Поместите марленые тампоны вокруг места разреза и промокнуть их с PBS. Марленые тампоны будут поглощать дополнительные PBS, которые будут добавлены во время операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание тепла и поддержки PBS на протяжении всей операции. - Выставить матку хорька и поместить его на марленые тампоны.
- Загрузите стеклянную капиллярную крышку с помощью инъекционного раствора с помощью пипетки с длинным наконечником загрузки. Убедитесь, что объем нагрузки составляет примерно от 5 до 20 мкл в зависимости от количества эмбрионов и количества различных экспериментальных условий. Средний впрыскиваемый объем на эмбрион составляет 3-5 мл. Прикрепите загруженное стеклянное капиллярное дело к держателю и соедините другую сторону держателя с трубкой и мундштуком.
- Осмотрите первый эмбрион и найдите голову.
- Поместите волоконно-оптический источник света рядом с головой эмбриона, чтобы облегчить визуализацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стены матки ферре очень темные, и трудно увидеть через них, если свет светит непосредственно на них. - Выполните одну внутрижелудочковую инъекцию в желудочек одного из полушарий головного мозга и держите другое полушарие нетронутым, чтобы служить внутренним контролем. Сам желудочек не легко отличается от глаз, поэтому его расположение оценивается на основе расположения пигментированной радужной оболочки глаза, которая видна. Внутрижелудочковая инъекция делается путем принятия держателя прилагается к стеклянной капиллярной и проникающей кожи, черепа и мозговой ткани с кончиком стеклянной капиллярной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что не повредить плаценту, которая темнее, чем мурин плаценты.- Когда кончик стеклянной капиллярной находится в желудочки, ввиснуть примерно 3-5 йл инъекционного раствора, рот-пипетки с помощью мундштук подключен к держатель стеклянных капилляров. Поскольку инъекционный раствор содержит 0,1% Fast Green, инъекционный желудочек теперь станет темно-зеленым, и будет виден как структура в форме почки.
- Поместите электроды пинцета на матку над головой эмбриона так, чтобы положительный полюс был помещен над областью, которая будет направлена, и отрицательным полюсом ниже инъекционной области.
- Установите следующие условия электропорации на электропораторе: длина пульса 50 мс; Импульсное напряжение 100 В; Интервал пульса 1 с; Количество импульсов 5. Затем нажмите кнопку«Пульс»на электропораторе.
- Быстро падение несколько капель теплого 1x PBS на электропогрятый эмбрион.
- Повторите процедуру для всех эмбрионов. Держите матку постоянно мокрой с теплым PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если первые эмбрионы, стоящие перед влагалищем, не легко доступны, лучше не электропотать их. - Когда все эмбрионы будут электропотеми, поместите матку обратно в брюшную полость.
- Шов мышечного слоя с брюшной поли с помощью 4-0 шва.
- Шов кожи с использованием той же толщины и спрей раны с алюминиевым спреем.
- Поместите животное в клетку и держать его в тепле с источником тепла. Тщательно следите за животным, пока оно не проснется.
4. Послеоперационный уход и жилье целевых животных
- В течение 3 дней после операции убедитесь, что животные проходят следующий послеоперационный уход: 20 мг/кг амоксициллина (антибиотика) 1x ежедневно; 25 мг/кг метамизола (анальгетики) 3x ежедневно.
- Убедитесь, что хорьки размещаются индивидуально.
- Убедитесь, что хорьки обследуются ветеринаром не менее 1 раза в день.
- Убедитесь, что хорьки нарушаются как можно меньше во время доставки.
- После того, как щенки отучаются или приносятся в жертву, подготовить джиллс для гистерэктомии.
5. Гистерэктомия хорьков
ПРИМЕЧАНИЕ: Гистерэктомия выполняется, чтобы уменьшить количество жертвы животных, так что стерилизованные животные могут быть пожертвованы для принятия в качестве домашних животных. Предхирургическая процедура гистерэктомии такая же, как и в шаге 2.
- Бритье и стерилизовать живот хорька, как описано в шагах 3.1 и 3.2.
- Хирургически открыть живот на Linea Альба. Вырежьте мышечный слой. Поднимите мышечный слой и укрыть кишечник пальцем, полностью открывая мышечный слой.
- Поместите марленые тампоны вокруг места разреза и промокнете их стерильным PBS. Выставить хорька матки и яичников и поместить их на марленые тампоны.
- Начните гистерэктомию с одной стороны, перевязав артерию оварика и вена ovarica cranial к mesovar. Положите зажим на каждой стороне перевязки и выполнить еще одну перевязку черепа к зажимам. Прикрепите третий зажим на концах перевязки, чтобы спасти их. Повторите на другой стороне.
- Вырезать между зажимами и отделить роговицы матки от мезентерии с обеих сторон.
- Ligate артерия матки с обеих сторон матки caudal к утробе матки. Затем ligate влагалище и исправить лигатуры. Прикрепите зажим на концах лиг, чтобы спасти их. Положите два зажима черепа к лигатуре. Вырезать между зажимами и отделить матку от влагалища. Удалить матки и яичников и распоряжаться ими. Очисти остаточную слизистую оболочку от приклада матки.
- Отсоедините все оставшиеся зажимы и сократите концы лигатуры. Убедитесь в том, чтобы контролировать кровотечение после зажимы были удалены.
- Шов мышечного слоя и кожи, как описано в шагах 3,16 и 3,17. Следуйте послеоперационному протоколу шагами 3.18 и 4.1-4.3. Держите животных в животном объекте, по крайней мере 2 недели с регулярными ветеринарными визитами. После того, как животные полностью выздоровеют, они могут быть пожертвованы на усыновление.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В утробе электропорации хорьков на E33 привело к ориентации нейронных клеток-предшественников, выстилающих желудочковой поверхности эмбрионального неокортекса(рисунок 1). Эти клетки называются апическими прародителями и являются высокоо распространения, что порождает все другие типы клеток во время развития. При асимметричном деление, апические прародители генерировали другого апического прародителя и более дифференцированную клетку, как правило, базального прародителя (BP), который деламигенировал с желудочковой поверхности. BPs мигрировали во вторичную герметальную зону, СВЗ. Когда электропорация была выполнена на E33, многие новорожденные BPs мигрировали в базально-большую часть СВЗ, где они сформировали OSV22.
Когда эффекты электропорации были изучены 4 дня спустя на E37, большинство целевых клеток и их потомство все еще находились в зародышевых зонах (ВЗ, ISV и OSV, см. Рисунок 2A) и клетки редко присутствовали дальше базально в корковой пластине (CP). Потомство целевых клеток в основном состояло из нейронных типов прародителя и новорожденных нейронов. Личность прародителя может быть изучена с помощью иммунофлуоресценции для маркеров велосипедных клеток, таких как PCNA26 (рисунок 2B, C), в то время как подмножество прародителей, проходящих митоз может быть показано маркерами, такими как фосфохистон 3 (PH3)21 (Рисунок 2D).
При P0, через 8 дней после электропорации, потомство целевых клеток распространяется во всех гистологическихслоях (рисунок 3A, B). На данном этапе, BPs были особенно обильными и bRG были легко идентифицировать. Используя комбинацию маркеров транскрипционных факторов, могут быть выявлены различные популяции BP. Sox2 является маркером пролиферативных клеток-предшественников, включая bRG26. Tbr2 является маркером нейрогенных BPs, которые в основном промежуточныепрародители 26 (рисунок 3B). Поскольку эмбрионы были совместно электропотезированы с плазмидной кодированием GFP, морфология нейронных прародителей может быть изучена путем отслеживания сигнала GFP. Это особенно важно в контексте BPs, которые приходят в двух основных морфотипов: многополярные клетки, которые в основном промежуточные прародители, и радиальные клетки, которые bRG21. Таким образом, Sox2' Tbr2- радиальные клетки в OSV являются ключевой популяцией клеток, представляющих интерес для изучения bRG26.
По P16, большинство целевых клеток перестали делиться и дифференцированы на нейроны и глии. Таким образом, эти типы клеток лучше всего изучить на данном этапе. В дополнение к различным нейрональным и глиальным подтипам, хорек P16 neocortex выставлены характеристики картины складывания(рисунок 3C). На данном этапе наиболее крупных гири и sulci уже присутствовали и перспективных областей мозга могут быть определены31. Мозг ферре продолжал созревать после P16, когда происходят такие процессы, как миелинизация и синаптогенез.
Рисунок 1: Ориентация нервных клеток в утробе матери электропорации неокортекса хорька. В утробе матери электропорация неокортекса хорька на E33 привела к ориентации апических прародителей. Во время развития эти клетки дают начало всем другим типам клеток. Базальные прародители лучше всего изучали на более поздних эмбриональных (E37) и перинатальных (P0) стадиях. Нейроны лучше всего изучать на послеродовых стадиях, таких как P16. Кортикальные слои: ВЗ и желудочковой зоны; ИСВЗ - внутренняя субвентрикулярная зона; ОСВЗ - внешняя субвентрикулярная зона; ИЗ - промежуточная зона; CP и корковая пластина; ГЗ и герминальные зоны (ВЗВЗ); WM и белое вещество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Пример неокортекса хорька E37 после электропорации матки на E33. (A и B) Раздел неокортекса хорька E37; зеленый, потомство электропопорированных клеток (GFP); синие(A)ядра клеток (DAPI); пурпурный (B), велосипедные клетки (PCNA). Коробка (ширина 777 мкм) указывает на область, показанную при более высоком увеличении в (c). Масштабная планка 1 мм. Обратите внимание на отсутствие сигнала GFP в контралатеральной (неэлектродорированном полушарии), который служит внутренним контролем. (C и D)Более высокие увеличения целевой области; зеленый, потомство электропопорированных клеток (GFP); пурпурный (C), велосипедные клетки (PCNA); красный(D),митотические клетки (фосфохистон 3, PH3). Обратите внимание, что большинство потомков целевых ячеек на данном этапе было в СВЗ. Кортикальные слои, как на рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Примеры P0 и P16 неокортекс хорька после в утробе матери электропорации на E33. (A и B) Раздел неокортекса хорька P0; зеленый, потомство электропопорированных клеток (GFP); синие(A)ядра клеток (DAPI); cyan(B), Sox2; пурпурный (B), Tbr2.( B) Высшее увеличение электропороготной области. Шкала баров 1 мм( A), 100 мкм (B). Кортикальные слои, как на рисунке 1. (C)Раздел неокортекса хорька P16; зеленый, потомство электропопорированных клеток (GFP); серые, клеточные ядра (DAPI); пурпурный, астроциты (GFAP). Масштабная планка 1 мм. Эта цифра была изменена с Kalebic et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В утробе матери электропорация хорька является важным методом, с преимуществами и недостатками по отношению к другим методам. Есть критические шаги и ограничения для этого метода, а также потенциальные изменения и будущие приложения, чтобы иметь в виду.
С новаторской работы Виктора Боррелла и его коллег по генетическим манипуляциям послеродового хорька неокортекса с помощьюэлектропорации или вирусной инъекции 35,,42,,43,хорек стал генетически доступным модельным организмом. Создание генетических манипуляций во время эмбрионального развития через вутробе матери электропорации 19,20 открыл новые возможностиисследования,позволяя ориентации нейронных клеток-предшественников на ранних стадиях развития. По сравнению с послеродовой манипуляцией, в утробе электропорации позволяет ориентации больших областей неокортекса и менее дифференцированных нейронных прародителей, которые последовательно генерировать все другие типы клеток неокортекса. Важно отметить, что по сравнению с вирусным таргетингом, в утробе матери электропорации позволяет пространственной точности ориентации.
Наиболее важной частью метода является сама операция. В утробе матери электропорация неокортекса хорька значительно сложнее и сложнее по сравнению с процедурой у мышей. Стенки матки темнее, а эмбрионы труднее различить. Кроме того, взрослые хорьки имеют большие требования к и ветеринарии. Особенно сложным является период вокруг рождения щенков. Хорьки очень чувствительны в этот период и лучше не беспокоить излишне. Основные ограничения самого подхода связаны с эффективностью таргетинга. В утробе электропорации всегда приводит к ориентации мозаики нейронных прародителей. Это идеально подходит для изучения клеточных биологических аспектов нейронных прародителей или нейронов, но это неоптимальный для причинения больших гистологических и анатомических возмущений, таких как изменение неокортикального складывания. Если это необходимо, лучшим подходом является перемещение электродов вдоль оси рострокода во время процедуры, чтобы покрыть большие части неокортекса. Однако для анализа всего органа лучшим подходом является генерация трансгенных хорьков, начиная с зиготной стадии44.
Эмбриональная стадия, на которой было выполнено в утробе матери электропорация (E33) идеально подходит для изучения базальных прародителей. Действительно, электропорации и вирусные ориентации на данном этапе были применены, чтобы выявить сроки начала OSV22, а также различные биологические особенности клеток базальных прародителей, соответствующихих морфологии и распространения 21,25,26. Однако, в зависимости от научной цели исследования, сроки электропорации могут быть легко изменены без значительных измененийв метод 19,20. Помимо временной специфичности, в утробе матери электропорация позволяет легко модифиции пространственной специфичности. Был нанесен удар по дорсолатеральной неокортексу в положении ростомализации вдоль оси рострокода, что привело к маркировке моторных и соматосенсальных участков. Другие неокортические области также могут быть направлены путем корректировки размещения электродов и направления электрического поля. В мыши, медиальной неокортекс45 и брюшной теленцефалон46 были направлены с использованием в утробе матери электропорации, предполагая, что аналогичные подходы могут быть использованы в хорьков.
Наконец, в утробе электропорации можно легко сочетать с последними методами редактированиягенома и эпигенома 13,,14,,16,,25,где компоненты CRISPR/(d)Cas9 могут быть доставлены в качестве плазмиды или как комплекс рекомбинантного белка Cas9 и направлять РНК14,при этом последнее сокращает время, необходимое для редактирования генома. Вполне вероятно, что дальнейшие технологические усовершенствования в редактировании генома будут сочетаться с внутриутробным электропорацией как у мышей, так и у хорьков, с тем чтобы генерировать точные геномные мутации, важные для понимания нормального развития мозга и, в частности, для моделирования патологических состояний человека. В этом контексте, в утробе матери электропорации все чаще используется в качестве метода таргетинга выбора для последующих различных одноклеточных омичи подходов и живой визуализации, чтобы понять молекулярные подписи и динамическое поведение целевых клеток и их потомства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны Службам и Средствам Института молекулярной клеточной биологии и генетики Макса Планка за выдающуюся поддержку, оказанную, в частности, всей команде биомедицинских услуг (BMS) за превосходное место хорьков и J. Peychl и его команда Фонда световой микроскопии. Мы особенно признательны Катрин Реппе и Анне Пфеффер из BMS за исключительную ветеринарную поддержку и Лэй Син из группы Хаттнера за помощь в операциях хорька.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
