Summary
Presenteras här är ett protokoll för att utföra genetisk manipulation i embryonala iller hjärnan med hjälp av in utero elektroporation. Denna metod möjliggör inriktning av neurala stamceller i neocortex in vivo.
Abstract
Manipulering av genuttryck in vivo under embryonal utveckling är metod för val vid analys av enskilda geners roll under däggdjursutvecklingen. In utero elektroporation är en nyckelteknik för manipulering av genuttryck i den embryonala däggdjurs hjärnan in vivo. Ett protokoll för in utero elektroporation av den embryonala neocortex av illrar, en liten köttätare, presenteras här. Illern används alltmer som modell för neocortex utveckling, eftersom dess neocortex uppvisar en serie anatomiska, histologiska, cellulära och molekylära funktioner som också finns i mänskliga och icke-mänskliga primater, men frånvarande i gnagare modeller, såsom mus eller råtta. In utero elektroporation utfördes på embryonala dag (E) 33, en midneurogenesis skede i illern. In utero elektroporation mål neurala stamceller foder laterala ventriklarna i hjärnan. Under neurogenes ger dessa progenitorceller upphov till alla andra neurala celltyper. Detta arbete visar representativa resultat och analyser vid E37, postnatal dag (P) 1, och P16, motsvarande 4, 9, och 24 dagar efter in utero elektroporation, respektive. I tidigare skeden består avkomman av riktade celler huvudsakligen av olika neurala progenitor subtyper, medan i senare skeden mest märkta celler är postmitotiska nervceller. Således, in utero elektroporation möjliggör studiet av effekten av genetisk manipulation på cellulära och molekylära funktioner i olika typer av neurala celler. Genom sin effekt på olika cellpopulationer kan in utero-elektroporation också användas för manipulering av histologiska och anatomiska drag hos illerns neocortex. Viktigt, alla dessa effekter är akuta och utförs med en spatiotemporal specificitet bestäms av användaren.
Introduction
Neocortex är det yttre arket av däggdjurshjärnan och sätet för högre kognitivafunktioner 1,2,3,4,5. För att uppnå en akut genetisk manipulation i däggdjurs neocortex in vivo under den embryonala utvecklingen har man utforskat två olika metoder: virusinfektion6 och in utero electroporation7. Båda metoderna möjliggör effektiv inriktning av neokortikala celler men lider av vissa begränsningar. Den stora fördelen med in utero elektroporation jämfört med virusinfektion är förmågan att uppnå rumslig specificitet inom neocortex, vilket uppnås genom att reglera riktningen för det elektriska fältet.
Sedan electroporation visades först för att underlätta inresa av DNA i cellerna in vitro8, har det tillämpats för att leverera DNA i olika ryggradsdjur in vivo. I utvecklingsneurovetenskap, in utero elektroporation av musen neocortex rapporterades först i 20019,10. Denna metod består av en injektion av DNA-blandningen i den laterala ventrikeln i den embryonala hjärnan och efterföljande tillämpning av det elektriska fältet med hjälp av pincettelektroder, som tillåter rumslig precision7,11. In utero elektroporation har sedan dess tillämpats för att leverera nukleinsyror för att manipulera uttrycket av endogena eller ectopically lagt gener i musen neocortex. Viktiga framsteg har gjorts nyligen genom att tillämpa metodiken för CRISPR/Cas9-medierad genomredigering via in utero elektroporation i musen neocortex att utföra (1) gen störningar i postmitotiska nervceller12,13 och neurala provigare celler14, och (2) arvsmassan15 och epigenome16 redigering.
Mycket snart efter den första rapporten i mus, in utero elektroporation tillämpades på den embryonala råttan neocortex17,18. Icke-gnagare förblev en utmaning tills den första in utero elektroporation av illrar, en liten köttätare, rapporterades i 201219,20. Sedan dess har in utero elektroporation av illrar tillämpats för att studera mekanismerna för neocortex utveckling genom märkning neurala stamceller och nervceller20,21,22,23, manipulera uttryck av endogena gener, inklusive användning av CRISPR/Cas9 teknik 24 , och genom att leverera ektopiska gener21,22,25, inklusive human-specifika gener26.26 Vidare har in utero elektroporation av illrar använts för att ta itu med funktioner i mänskliga neocortex utveckling i patologiska förhållanden27,28.
I samband med neocortex utveckling beror fördelarna med att använda illrar som modellorganism jämfört med möss på att illrar bättre rekapitulerar en rad människoliknande drag. På anatomisk nivå uppvisar illrar ett karakteristiskt mönster av kortikala vikning, som också förekommer i mänskliga och de flesta andra primater, men är helt frånvarande hos möss eller råttor4,29,30,31. På den histologiska nivån har illrar två distinkta subventrikulära germinalzoner, benämnda de inre och yttre subventrikulära zonerna (ISVZ respektive OSVZ)32,33, åtskilda av det inre fiberskiktet23. Dessa funktioner delas också med primater, inklusive människor, men inte med möss34. ISVZEN och OSVZ iller och människor befolkas med överflödande neurala progenitorceller, eftersom subventricular zonplanerar (SVZ) av möss innehåller endast glesa neurala progenitors21,32,35,36. På cellnivå uppvisar illrar en hög andel av en subtyp av neurala föregångare som kallas basala eller yttre radiella glia (bRG eller oRG, respektive), som bedöms som instrumentella för den evolutionära expansionen av däggdjurs neocortex34,37,38. bRG är därför mycket riklig i fostrets mänskliga och embryonala iller neocortex, men de är mycket sällsynta i den embryonala musen neocortex35,36. Vidare visar iller bRG morfologiska heterogenitet liknande den hos mänskliga bRG, vida överlägsen mus bRG21. Slutligen, på molekylär nivå, utveckla iller neocortex visar genuttryck mönster mycket lik de av fetala mänskliga neocortex, som antas styra utvecklingen av när vikning, bland annat39.
Cellbiologiska och molekylära egenskaper hos illerbRG gör dem mycket proliferativa, liknande mänskliga bRG. Detta resulterar i en ökad produktion av nervceller och utveckling av en utökad och mycket komplex neocortex34. Dessa egenskaper gör illrar utmärkta modellorganismer för att studera människoliknande drag av neocortexutveckling som inte kan modelleras hos möss26,40. För att dra full nytta av illern som en modell organismen den presenterade metoden utvecklades. Den består av in utero-elektroporation av E33-illerembryon med en plasmid som uttrycker GFP (pGFP) under kontroll av en allestädes närvarande promotor, CAG. De elektroporerade embryona kan sedan analyseras embryonalt eller postnatally. För att minska antalet offrade djur, är hona illrar (jills) steriliseras av hysterektomi och doneras för antagande som husdjur. Om de riktade embryona skördas på embryonala stadier utförs en andra operation och embryona avlägsnas genom ett kejsarsnitt, medan jills är hysterektomiserade. Om de riktade embryona analyseras i postnatala stadier hysterektomiseras jills efter att ungarna har avvanda eller offrats. Därav presenteras också ett protokoll för hysterektomi av jills.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden genomfördes i samförstånd med den tyska djurskyddslagstiftningen efter godkännande av Landesdirektion Sachsen (licenser TVV 2/2015 och TVV 21/2017).
1. Förberedelse för in utero elektroporation
- Förbered DNA-blandningen. I detta protokoll används en slutlig koncentration av 1 μg/μL av pGFP. Lös DNA i PBS och komplettera med 0,1% Fast Green för att underlätta visualisering. När du har förberett, blanda DNA-blandningen genom pipettering upp och ner flera gånger eller genom fingerring. Förvaras i rumstemperatur tills användning.
OBS: För coelectroporations är DNA-blandningen beredd att innehålla en slutlig koncentration på 1 μg/μL av plasmid kodning en gen av intresse tillsammans med 0,5 μg/μL pGFP utspädd i PBS. - Förbered operationsbordet med alla erforderliga verktyg och instrument.
- Dra i glas kapillärer med hjälp av mikropipettedragaren. Justera kapillärspetsens diameter genom att skära av kapillärens distala del med hjälp av forceps som tidigare beskrivits41.
2. Beredning av illrar för kirurgi
- Håll de gravida jills med embryon på E33 fasta i minst 3 h före operationen för att minska risken för kräkningar.
- Före operationen sterilisera alla verktyg genom autoklavering. Utför operationen i ett speciellt tilldelat rum i aseptiska förhållanden för att eliminera potentiella kontamineringskällor.
- Placera den gravida jillen i narkoslådan med 4 % isofluran.
- När den sövs, placera illern på operationsbordet med en värmedyna och fäst narkosmasken med ett konstant 2–3 % isfluranflöde på näsan. För att säkerställa lämplig nivå av anestesi, kontrollera om det saknas följande reflexer:
- Den palpebralt reflex genom att röra vid den periokulära huden
- Flexorreflexen genom att nypa huden mellan den 2och 3rd, eller 3rd och4 tå av båda bakbenen
- Om den palpebrala reflexen är frånvarande och flexorreflexen är klart reducerad, kontrollera om smärtreflexen genom att nypa en tå av varje bakben.
OBS: Se till att ha ett stetoskop till hands för att övervaka puls och rytm om det behövs.
- Injicera illern subkutant med smärtstillande medel (0,1 mL metamizol, 50 mg/kg kroppsvikt), antibiotikum (0,1 mL/kg kroppsvikt på 20 mg/kg amoxicillin + bulvensyra), och glukos (10 mL av 5% glukoslösning).
- Placera en droppe ögonsalva lösning på ögonen för att förhindra ögonuttorkande under det kirurgiska ingreppet.
- Raka illermagen med hjälp av en rakapparat.
- Rengör huden med vatten och tvål, desinficera magen med 70% etanolskrubb, desinficera 2x med jod, och låt den torka.
3. In utero elektroporation av illrar
- Se till att operationsområdet är sterilt: placera sterila kirurgiska verktyg på sterila vävnader, och byt kappa och handskar.
- Placera en steril kirurgisk drapera på djuret.
- Med hjälp av en skalpell, kirurgiskt öppna magen vid linea alba med en ~ 5 cm lång snitt.
- Skär muskelskiktet med hjälp av sax.
- Placera gaskompresser runt snittet och blöt dem med PBS. Gaspressarna kommer att absorbera ytterligare PBS som kommer att läggas till under operationen.
OBS: Bibehåll värme och PBS stöd under hela operationen. - Exponera illern livmodern och placera den på gaskompresserna.
- Lasta en glaskafillär med injektionslösningen med hjälp av en pipett med lång lastspets. Se till att lastningsvolymen ligger ungefär mellan 5–20 μL beroende på antalet embryon och antal olika försöksförhållanden. Den genomsnittliga injicerade volymen per embryo är 3–5 μL. Fäst den belastade glaskafillären på en hållare och anslut hållarens andra sida till ett rör och ett munstycke.
- Inspektera det första embryot och hitta huvudet.
- Placera den fiberoptiska ljuskällan bredvid embryots huvud för att underlätta visualiseringen.
OBS: Iller livmoderväggar är mycket mörka, och det är svårt att se igenom dem om inte ljuset skins direkt på dem. - Utför en enda intraventrikulär injektion i ventrikeln av en av de cerebrala halvklot och hålla den andra halvklotet intakt att fungera som en intern kontroll. Själva ventrikeln är inte lätt distinkt med ögat, så dess placering uppskattas baserat på placeringen av den pigmenterade irisen, som är synlig. Den intraventrikulära injektionen görs genom att hållaren fäst vid glas kapillären och penetrerande huden, skallen, och cerebral vävnad med spetsen av glas kapillären.
OBS: Se till att inte skada moderkakan, som är mörkare än murine placentas.- När spetsen på glaskammarröret är i ventrikeln, injicerar du cirka 3–5 μL av injektionslösningen genom att munstycket används med hjälp av munstycket som är anslutet till kapillärhållaren i glas. Eftersom den injicerade lösningen innehåller 0,1% Fast Green, kommer den injicerade ventrikeln nu att bli mörkgrön, och kommer att synas som en njurformad struktur.
- Placera pincettelektroderna på livmodern ovanför embryots huvud så att den positiva polen placeras ovanför det område som kommer att riktas och den negativa polen under det injicerade området.
- Ställ in följande elektroporationsförhållanden på elektroporatorn: Pulslängd = 50 ms; Pulsspänning = 100 V; Pulsintervall = 1 s; Antal pulser = 5. Tryck sedan på knappen "Puls" på elektroporatorn.
- Snabbt släppa flera droppar av varma 1x PBS på det elektroporerade embryot.
- Upprepa proceduren för alla embryon. Håll livmodern ständigt våt med varm PBS.
OBS: Om de första embryon som vetter mot slidan inte är lättåtkomliga, är det bäst att inte elektroportera dem. - När alla embryon är elektroporerade, placera livmodern tillbaka in i peritoneal hålighet.
- Suturera muskellagret med peritoneum med hjälp av en sutur på 4-0.
- Suturera huden med samma tjocklek och spraya såret med aluminiumspray.
- Placera djuret i en bur och hålla det varmt med en värmekälla. Övervaka djuret försiktigt tills det vaknar.
4. Postoperativ vård och inhysning av riktade djur
- För 3 dagar efter operationen se till att djuren genomgår följande postoperativa vård: 20 mg/kg amoxicillin (antibiotikum) 1x dagligen; 25 mg/kg metamizol (smärtstillande) 3x dagligen.
- Se till att illrarna inhyses individuellt.
- Se till att illrarna undersöks av en veterinär minst 1x per dag.
- Se till att illrarna störs så lite som möjligt under leveransen.
- Efter att ungarna är avvanda eller offrade, förbered jills för hysterektomi.
5. Hysterektomi av illrar
OBS: En hysterektomi utförs för att minska antalet offrade djur så att de steriliserade djuren kan doneras för adoption som husdjur. Det prekirurgiska förfarandet för hysterektomi är detsamma som i steg 2.
- Raka och sterilisera illerns mage enligt beskrivningen i steg 3.1 och 3.2.
- Kirurgiskt öppna magen vid linea alba. Skär muskellagret. Lyft muskellagret och skydda tarmen med ett finger samtidigt som du öppnar muskellagret helt.
- Placera gaskompresser runt snittplatsen och blöt dem med steril PBS. Exponera illern livmodern och äggstockarna och placera dem på gaskompresserna.
- Starta hysterektomi på ena sidan genom att ligating arteria ovarica och vena ovarica hjärnskålen till mesovar. Sätt en klämma på varje sida av ligering och utföra en annan ligatur hjärnskålen till klämmorna. Fäst den tredje klämman i ligeringens ändar för att spara dem. Upprepa på andra sidan.
- Skär mellan klämmorna och lossa cornua uteri från mesenteri på båda sidor.
- Ligate den arteria uterina på båda livmoderns sidor caudal till ostium uteri. Sedan ligate slidan och fixa ligaturen. Fäst klämman i ändarna av ligeringarna för att spara dem. Sätt två klämmor kranial till ligaturen. Skär mellan klämmorna och lossa livmodern från vagina. Ta bort livmodern och äggstockarna och kassera dem. Skrapa den kvarvarande slemhinnan från livmodern rumpan.
- Lossa alla återstående klämmor och förkorta ligaturändarna. Se till att kontrollera för blödning efter klämmorna har tagits bort.
- Suturera muskellagret och huden enligt beskrivningen i steg 3.16 och 3.17. Följ det postoperativa protokollet som i steg 3.18 och 4.1–4.3. Förvara djuren i djuranläggningen i minst 2 veckor med regelbundna veterinärbesök. Efter att djuren är helt återställda, kan de doneras för adoption.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In utero elektroporation av illrar vid E33 resulterade i inriktning av de neurala stamcellerna som kantar ventrikulära ytan av den embryonala neocortex (Figur 1). Dessa celler kallas apikala progenitorer och är mycket proliferativa, vilket ger upphov till alla andra celltyper under utveckling. Vid asymmetrisk uppdelning genererade apikala stamfader en annan apikal stamfader och en mer differentierad cell, typiskt en basal stamfader (BP), som delaminated från ventrikulära ytan. BPs migrerade in i den sekundära germinal zonen, SVZ. När elektroporationen utfördes vid E33 migrerade många nyfödda BPs till den basala delen av SVZ, där de bildade OSVZ22.
När effekterna av elektroporation undersöktes 4 dagar senare vid E37, de flesta av de riktade cellerna och deras avkomma var fortfarande i de germinal zoner (VZ, ISVZ och OSVZ, se figur 2A) och celler var sällan närvarande ytterligare basally i den kortikala plattan (CP). Avkomman av riktade celler bestod huvudsakligen av neurala progenitor typer och nyfödda nervceller. Progenitoridentiteten kunde undersökas genom immunofluorescens för markörer av cykelceller, såsom PCNA26 (Figur 2B, C), medan en undergrupp av progenitorer som genomgår mitos kunde visas med markörer som phosphohistone 3 (PH3)21 (Figur 2D).
Vid P0, 8 dagar efter elektroporation, sprids avkomman av riktade celler i alla histologiska lager (Figur 3A, B). I detta skede var BPs särskilt riklig och bRG var lätt identifierbara. Med hjälp av en kombination av transkriptionsfaktor markörer, olika BP populationer kan avslöjas. Sox2 är en markör för proliferativa progenitorceller, inklusive bRG26. Tbr2 är en markör för neurogena BPs, som huvudsakligen är mellanliggande progenitorer26 (Figur 3B). Eftersom embryona var co-electroporated med en plasmid kodning GFP, morfologi neurala stamceller kan undersökas genom att spåra GFP signalen. Detta är särskilt viktigt i samband med BPs, som finns i två stora morfityper: multipolära celler, som till stor del är mellanliggande föregångare, och radiella celler, som är bRG21. Därav, Sox2 + Tbr2– radiella celler i OSVZ är nyckeln cellpopulationen av intresse för att studera bRG26.
Genom P16, en majoritet av riktade celler slutade dela och differentieras till nervceller och glia. Därför undersöks dessa celltyper bäst i detta skede. Förutom olika neuronala och glial subtyper, utställda iller P16 neocortex de egenskaper mönster av vikning (Figur 3C). I detta skede de flesta stora gyri och sulci var redan närvarande och blivande hjärnområden kunde identifieras31. Iller hjärnan fortsatte mogna efter P16, när processer som myelination och synaptogenes äga rum.
Bild 1: Inriktning på neurala celler genom in utero-elektroporation av illerns neocortex. In utero elektroporation av illern neocortex vid E33 resulterade i inriktning av apikala progenitors. Under utveckling dessa celler ger upphov till alla andra celltyper. Basala progenitorer studerades bäst vid senare embryonala (E37) och perinatal (P0) stadier. Nervceller studerades bäst på postnatala stadier, såsom P16. Kortikala lager: VZ = ventrikulär zon; ISVZ = inre subventricular zon; OSVZ = yttre subventrikulär zon; IZ = mellanzon; CP = kortikala platta; GZ = germinal zoner (VZ+SVZ); WM = vit materia. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på E37 iller neocortex efter in utero elektroporation vid E33. (A och B) Sektionen av E37-illerns neocortex; grön, avkomma av elektroporerade celler (GFP); blå (A) cellkärnor (DAPI); magenta (B), cykelceller (PCNA). Box (bredd = 777 μm) anger område som visas vid högre förstoring i (C). Skalstång = 1 mm. Notera bristen på GFP-signal i den kontralaterala (nonelectroporated halvklotet), som fungerar som en intern kontroll. (C och D) Högre förstoringar av det riktade området; grön, avkomma av elektroporerade celler (GFP); magenta (C), cykelceller (PCNA); röda (D), mitotiska celler (fosfohistone 3, PH3). Observera att majoriteten av avkomman av riktade celler var i SVZ i detta skede. Kortikala lager som i figur 1. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på P0 och P16 iller neocortex efter in utero elektroporation vid E33. (A och B) Sektion av P0 iller neocortex; grön, avkomma av elektroporerade celler (GFP); blå (A) cellkärnor (DAPI); cyan (B), Sox2; magenta (B), Tbr2. (B) Högre förstoring av det elektroporerade området. Skalstreck = 1 mm (A), 100 μm (B). Kortikala lager som i figur 1. (C) Sektion av P16-illerns neocortex, grön, avkomma av elektroporerade celler (GFP); grå, cellkärnor (DAPI); magenta, astrocyter (GFAP). Skalstång = 1 mm. Denna siffra har modifierats från Kalebic et al.25. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In utero elektroporation i illern är en viktig teknik, med fördelar och nackdelar med avseende på andra metoder. Det finns kritiska steg och begränsningar för den här metoden, samt potentiella modifieringar och framtida program att tänka på.
Sedan Victor Borrells och kollegors banbrytande arbete med genetisk manipulering av den postnatala illern neocortex via elektroporation eller viral injektion35,42,43, har illern blivit en genetiskt tillgänglig modellorganism. Upprättande av genetisk manipulation under embryonal utveckling via in utero electroporation19,20 öppnade nya forskningsmöjligheter genom att möjliggöra inriktning av neurala stamceller i tidigare utvecklingsstadier. I jämförelse med postnatal manipulation möjliggör in utero-elektroporation inriktning av större områden i neocortex och mindre differentierade neurala stamfader som sekventiellt genererar alla andra celltyper av neocortexen. Viktigt, jämfört med viral inriktning, in utero elektroporation möjliggör rumslig precision inriktning.
Den mest kritiska delen av metoden är själva operationen. In utero elektroporation av illern neocortex är betydligt mer komplex och svårt i jämförelse med förfarandet hos möss. Livmoderväggarna är mörkare, och embryona är svårare att urskilja. Dessutom har vuxna illrar större djurhållning och veterinärkrav. Särskilt utmanande är perioden kring ungarna födelse. Illrar är mycket känsliga under den perioden och är bäst inte störs i onödan. De stora begränsningarna i själva ansatsen är relaterade till målinriktningens effektivitet. In utero elektroporation alltid resulterar i inriktning av en mosaik av neurala föregångare. Detta är idealiskt för att studera cellbiologiska aspekter av neurala stamfader eller nervceller, men det är suboptimal för att orsaka stora histologiska och anatomiska perturbations, såsom en förändring i neocortical vikning. Om detta krävs är det bästa tillvägagångssättet att flytta elektroderna längs rostrocaudal-axeln under förfarandet för att täcka stora delar av neocortex. Men för hela organanalys det bästa tillvägagångssättet är generation av transgena illrar med början från zygotsteg44.
Det embryonala stadium där in utero-elektroporationen utfördes (E33) är idealisk för att studera basala stamfader. Faktum är att elektroporationer och viral inriktning i detta skede har tillämpats för att avslöja tidpunkten för början av OSVZ22 samt olika cellbiologiska funktioner i basala stamfader som är relevanta för deras morfologi och spridning21,25,26. Beroende på det vetenskapliga syftet med en studie kan dock tidpunkten för elektroporation enkelt ändras utan betydande ändringar av metoden19,20. Bortsett från tidsmässiga specificitet, in utero elektroporation möjliggör enkla ändringar av den rumsliga specificiteten. Dorsolateral neocortex vid rostromedial position längs rostrocaudal axeln var riktade, vilket resulterade i märkning av de motoriska och somatosensory områdena. Andra neokortikala områden kan också riktas genom att justera elektrodernas placering och riktningen på det elektriska fältet. I musen, den mediala neocortex45 och ventrala telencephalon46 har riktats med in utero elektroporation, vilket tyder på att liknande metoder kan användas i illrar.
Slutligen kan in utero elektroporation enkelt kombineras med den senaste arvsmassan och epigenome redigeringsteknik13,14,16,25, där CRISPR/(d)Cas9 komponenter kan levereras som en plasmid eller som ett komplex av rekombinant Cas9 protein och guide RNAs14, med den senare förkorta den tid som krävs för genomet redigering att äga rum. Det är troligt att ytterligare tekniska förbättringar i genomet redigering kommer att kombineras med in utero elektroporation i både möss och illrar för att generera exakta genomiska mutationer viktigt för att förstå normal hjärnans utveckling och särskilt att modellera mänskliga patologiska tillstånd. I detta sammanhang är in utero elektroporation alltmer används som målmetod för val för efterföljande olika encelliga omics metoder och levande bildbehandling för att förstå molekylära signaturer och dynamiskt beteende av riktade celler och deras avkomma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för de tjänster och faciliteter som max Planck Institutet för molekylär cellbiologi och genetik för enastående stöd, särskilt hela teamet av biomedicinska tjänster (BMS) för utmärkt djurhållning av illrar och J. Peychl och hans team av Light Microscopy Facility. Vi är särskilt tacksamma mot Katrin Reppe och Anna Pfeffer från BMS för exceptionellt veterinärstöd och Lei Xing från Huttner-gruppen för att de hjälper till med illern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
