Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

في فيتفو استهداف الخلايا السلف العصبية في النمس نيوكورتكس من قبل في الكهربائية الرحمية

Published: May 6, 2020 doi: 10.3791/61171

Summary

هنا هو بروتوكول لأداء التلاعب الجيني في الدماغ النمس الجنيني باستخدام في كهربائي الرحم. هذه الطريقة تسمح لاستهداف الخلايا السلف العصبي في القشرة العصبية في الجسم الحي.

Abstract

التلاعب في التعبير الجيني في الجسم الحي أثناء التطور الجنيني هو الطريقة المفضلة عند تحليل دور الجينات الفردية أثناء تطور الثدييات. في كهربائي الرحم هو تقنية رئيسية لتلاعب التعبير الجيني في الدماغ الثديي الجنيني في الجسم الحي. يتم تقديم بروتوكول لكهربية الرحم من القشرة الجديدة الجنينية من النمس، آكلة اللحوم الصغيرة، هنا. يتم استخدام النمس بشكل متزايد كنموذج لتطوير القشرة الجديدة ، لأن القشرة الجديدة يعرض سلسلة من الميزات التشريحية والهلوسية والخلوية والجزيئية الموجودة أيضًا في الرئيسيات البشرية وغير البشرية ، ولكنها غائبة في نماذج القوارض ، مثل الفئران أو الفئران. في الرحم الكهربائي تم تنفيذها في يوم الجنين (E) 33، مرحلة منتصف النشأة في النمس. في الإلكتروبور الرحمي يستهدف الخلايا السلف العصبية بطانة البطينين الجانبي للدماغ. أثناء تكوين الخلايا العصبية، هذه الخلايا السلف تؤدي إلى جميع أنواع الخلايا العصبية الأخرى. يُظهر هذا العمل النتائج والتحليلات التمثيلية في E37، ويوم ما بعد الولادة (P) 1، و P16، بما يعادل 4 و9 و24 يوماً بعد الحمل الكهربائي الرحمي، على التوالي. في المراحل السابقة، وذرية الخلايا المستهدفة يتكون أساسا من مختلف الأنواع الفرعية السلف العصبي، في حين أن في المراحل اللاحقة معظم الخلايا المسماة هي الخلايا العصبية ما بعد التورم. وهكذا، في كهربائي الرحم تمكن من دراسة تأثير التلاعب الجيني على السمات الخلوية والجزيئية لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية. من خلال تأثيره على مجموعات الخلايا المختلفة، في القطب الرحمي يمكن أيضا أن تستخدم للتلاعب في الخصائص النسيجية والتشريحية من النمس القشرة الجديدة. الأهم من ذلك ، كل هذه الآثار حادة ويتم تنفيذها مع خصوصية اصمية يحددها المستخدم.

Introduction

القشرة الجديدة هي الورقة الخارجية للدماغ النخاعي الثديي ومقعد الوظائف المعرفية العليا1,2,3,4,5. من أجل تحقيق تلاعب وراثي حاد في القشرة الثديية في الجسم الحي خلال التطور الجنيني ، تم استكشاف طريقتين مختلفتين: العدوى الفيروسية6 وفي الإلكتروبورات الرحمية7. كلتا الطريقتين تسمحان باستهداف الخلايا القشرية الجديدة بكفاءة ولكنها تعاني من بعض القيود. الميزة الرئيسية في الإلكتروبورات الرحمية مقارنة بالعدوى الفيروسية هي القدرة على تحقيق خصوصية المكان داخل القشرة الجديدة ، والتي تتحقق من خلال تنظيم اتجاه المجال الكهربائي.

منذ أن تبين لأول مرة الكهربائي لتسهيل دخول الحمض النووي إلى الخلايا في المختبر8، فقد تم تطبيقه على تسليم الحمض النووي إلى مختلف الفقاريات في الجسم الحي. في علم الأعصاب التنموي، في كهربائي الرحم من الماوس نيوكورتيكس ذكرت لأول مرة في 20019،10. هذه الطريقة تتكون من حقن خليط الحمض النووي في البطين الجانبي للدماغ الجنيني وتطبيق لاحق من المجال الكهربائي باستخدام أقطاب الملاقط، والذي يسمح الدقة المكانية7،11. في الرحم الكهربائي ومنذ ذلك الحين تم تطبيقها لتقديم الأحماض النووية من أجل التعامل مع التعبير عن الجينات الذاتية أو مُضافة خارج الرحم في الماوس نيوكورتيكس. وقد أحرز تقدم هام في الآونة الأخيرة من خلال تطبيق منهجية تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 بوساطة عبر في الإلكتروبور في الفيرريكتيكس الماوس لأداء (1) اضطراب الجينات في الخلايا العصبية ما بعد الديمومتوية12,13 والخلايا السلف العصبي14, و (2) الجينوم15 و epigenome16 التحرير.

بعد وقت قصير جدا من التقرير الأول في الماوس، في كهربائي الرحم تم تطبيقها على الجرثان الجنينية17،18. ظلت غير القوارض تحديا حتى الأول في كهربائي الرحم من النمس, آكلة اللحوم الصغيرة, وذكرت في 201219,20. ومنذ ذلك الحين، في الكهربائي الرحمي من النمس وقد طبقت لدراسة آليات تطوير القشرة الجديدة من خلال وضع العلامات على السلف العصبية والخلايا العصبية20،21،22،23، التلاعب في التعبير عن الجينات الذاتية ، بما في ذلك استخدام CRISPR / Cas9 التكنولوجيا24، وتقديم الجينات خارج الرحم21،22،25، بما في ذلك الجينات البشريةالمحددة 26. وعلاوة على ذلك، في كهربائي الرحم من النمس وقد استخدمت لمعالجة ملامح التنمية في القشرة البشرية في الظروف المرضية27،28.

في سياق تطور القشرة الجديدة ، تعود مزايا استخدام النمس ككائن حي نموذجي مقارنة بالفئران إلى حقيقة أن النمس تُلخي بشكل أفضل سلسلة من الميزات الشبيهة بالبشر. على المستوى التشريحي، تظهر النمس نمطاً مميزًا للطي القشري، والذي هو موجود أيضًا في الإنسان ومعظم الرئيسيات الأخرى، ولكنه غائب تمامًا في الفئران أو الفئران4،29،30،31. على مستوى النسيج النمس اثنين من مناطق فرعية فرعية متميزة، ويشار إلى المناطق الفرعية البطينية الداخلية والخارجية (ISVZ وOSVZ، على التوالي)32،33، مفصولة طبقة الألياف الداخلية23. يتم أيضا تقاسم هذه الميزات مع الرئيسيات، بما في ذلك البشر، ولكن ليس مع الفئران34. وSSVZ وOSVZ في النمس والبشر هي المأهولة مع خلايا السلف العصبية وفيرة، في حين أن المنطقة دون البطينية (SVZ) من الفئران تحتوي فقط على السلف العصبية21،32،35،36. على المستوى الخلوي، تظهر النمس نسبة عالية من نوع فرعي من السلف العصبية المشار إليها باسم glia القاعدية أو الخارجية شعاعي (bRG أو oRG، على التوالي)، والتي تعتبر مفيدة للتوسع التطوري للcorcortex الثدييات34،37،38. bRG وبالتالي وفيرة للغاية في الجنينية النمس النمس النضر ، لكنها نادرة جدا في الماوس الجنيني35،36. وعلاوة على ذلك، يظهر bRG النمس التجانس المورفولوجية مماثلة لتلك التي من bRG الإنسان، متفوقة بكثير على الماوس bRG21. وأخيرا، على المستوى الجزيئي، وتطوير النمس القشرة الجديدة يظهر أنماط التعبير الجيني مشابهة جدا لتلك التي من العصر الجديد الإنسان الجنيني، والتي يفترض أن السيطرة على تطوير للطي القشرية، من بين أمور أخرى39.

الخصائص البيولوجية والجزيئية الخلية من bRG النمس جعلها تكاثرية للغاية، على غرار bRG الإنسان. وهذا يؤدي إلى زيادة إنتاج الخلايا العصبية وتطوير34neocortex موسعة ومعقدة للغاية . هذه الخصائص تجعل النمس كائنات نموذجية ممتازة لدراسة السمات الشبيهة بالبشر من التنمية القشرة الجديدة التي لا يمكن نمذجة في الفئران26،40. للاستفادة الكاملة من النمس ككائن حي نموذجي تم تطوير الطريقة المقدمة. وهو يتألف من كهربائي الرحم من الأجنة النمس E33 مع plasmid التعبير عن GFP (pGFP) تحت سيطرة المروج في كل مكان، CAG. ويمكن بعد ذلك تحليل الأجنة الكهربائية الجنينية أو بعد الولادة. من أجل تقليل عدد الحيوانات التي تم التضحية بها ، يتم تعقيم النمس الإناث (جيلس) عن طريق استئصال الرحم ويتم التبرع بها لاعتمادها كحيوانات أليفة. إذا تم حصاد الأجنة المستهدفة في مراحل جنينية ، يتم إجراء عملية جراحية ثانية وإزالة الأجنة عن طريق عملية قيصرية ، في حين أن الجيل يتم استئصال الرحم. إذا تم تحليل الأجنة المستهدفة في مراحل ما بعد الولادة ، يتم استئصال الجيل بعد فتومة الجراء أو التضحية بها. وبالتالي ، يتم تقديم بروتوكول لاستئصال الرحم من جيلس أيضا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية بالاتفاق مع التشريعات الألمانية لرعاية الحيوان بعد موافقة Landesdirektion Sachsen (تراخيص TVV 2/2015 و TVV 21/2017).

1- الاستعداد للكهربة في الرحم

  1. إعداد خليط الحمض النووي. في هذا البروتوكول يتم استخدام تركيز نهائي من 1 ميكروغرام/ميكرولتر من pGFP. حل الحمض النووي في برنامج تلفزيوني والملحق مع 0.1٪ الأخضر السريع لتسهيل التصور. مرة واحدة على استعداد، مزيج خليط الحمض النووي عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات أو عن طريق التنصت على الإصبع. يُحفظ في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
    ملاحظة: بالنسبة للcoelectroporations، يتم إعداد خليط الحمض النووي لاحتواء تركيز نهائي من 1 ميكروغرام/ميكرولتر من بلازميد ترميز جين من الاهتمام جنبا إلى جنب مع 0.5 ميكروغرام /ميكرولتر من pGFP المخفف في برنامج تلفزيوني.
  2. إعداد طاولة الجراحة مع جميع الأدوات والأدوات المطلوبة.
  3. سحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام جرة micropipette. ضبط قطر طرف شعرية بقطع الجزء من الشعرية باستخدام ملقط كما سبق وصفه41.

2. إعداد النمس للجراحة

  1. الحفاظ على جيل الحوامل مع الأجنة في E33 الصيام لمدة 3 ساعات على الأقل قبل الجراحة للحد من خطر القيء.
  2. قبل الجراحة تعقيم جميع الأدوات عن طريق autoclaving. إجراء عملية جراحية في غرفة مخصصة خصيصا في ظروف معقمة للقضاء على المصادر المحتملة للتلوث.
  3. وضع جيل الحوامل في مربع المخدرات مع isoflurane 4٪ .
  4. عندما تخدير, وضع النمس على طاولة العملية مع وسادة الحرارة وإرفاق قناع المخدرات مع تدفق isoflurane ثابت 2-3% إلى الأنف. لضمان المستوى المناسب للتخدير ، تحقق من عدم وجود ردود الفعل التالية:
    1. منعكس palpebral من خلال لمس الجلد حولية
    2. منعكس من خلال قرص الجلد بين 2و 3rd، أو 3و 4th إصبع القدم من كلا الأطراف الخلفية
    3. إذا كان رد الفعل palpebral غائبة ويتم تقليل منعكس بوضوح، والتحقق من رد الفعل الألم عن طريق معسر إصبع القدم واحد من كل طرف خلفي.
      ملاحظة: تأكد من وجود سماعة في متناول اليد لمراقبة معدل ضربات القلب والإيقاع إذا لزم الأمر.
  5. حقن تحت الجلد النمس مع مسكن (0.1 مل من ميتاميزول, 50 ملغ / كغ من وزن الجسم), مضاد حيوي (0.1 مل / كغ من وزن الجسم من 20 ملغم / كغم من أموكسيسيلين + حمض clavulanic), والجلوكوز (10 مل من 5% محلول الجلوكوز).
  6. ضع قطرة من محلول مرهم العين على العينين لمنع جفاف العين أثناء العملية الجراحية.
  7. حلق بطن النمس باستخدام آلة الحلاقة.
  8. تنظيف الجلد بالماء والصابون، وتطهير البطن مع فرك الإيثانول 70٪، وتطهير 2x مع اليود، والسماح لها الجافة.

3. في الرحم الكهربائي من النمس

  1. تأكد من أن المنطقة الجراحية معقمة: ضع أدوات جراحية معقمة على الأنسجة المعقمة، وتغيير المعطف والقفازات.
  2. وضع الستائر الجراحية العقيمة على الحيوان.
  3. باستخدام مشرط، جراحيا فتح البطن في ألبا linea مع ~ 5 الطول قطع طويلة.
  4. قطع طبقة العضلات باستخدام مقص.
  5. ضع مسحات الشاش حول موقع الشق ونبتلها بـ PBS. سوف تمتص مسحات الشاش برنامج تلفزيوني إضافي سيتم إضافته أثناء الجراحة.
    ملاحظة: الحفاظ على الحرارة ودعم برنامج تلفزيوني طوال الجراحة.
  6. كشف الرحم النمس ووضعها على مسحات الشاش.
  7. تحميل الشعيرات الدموية الزجاج مع محلول الحقن باستخدام ماصة مع طرف تحميل طويلة. تأكد من أن حجم التحميل يتراوح بين 5 و20 ميكرولتر تقريبًا حسب عدد الأجنة وعدد الحالات التجريبية المختلفة. يبلغ متوسط حجم الحقن لكل جنين 3-5 ميكرولتر.
  8. افحص أول جنين والعثور على الرأس.
  9. ضع مصدر ضوء الألياف البصرية بجوار رأس الجنين لتسهيل التصور.
    ملاحظة: جدران الرحم النمس مظلمة جدا، وأنه من الصعب أن نرى من خلالها ما لم يتم تلمع ضوء مباشرة عليها.
  10. إجراء حقنة واحدة داخل البطين في البطين من نصفي الدماغ والحفاظ على نصف الكرة الأرضية الآخر سليمة لتكون بمثابة عنصر تحكم داخلي. البطين نفسه ليس من السهل تمييزها عن طريق العين ، لذلك يتم تقدير موقعه على أساس موقع القزحية المصطبغة ، والتي هي مرئية. يتم الحقن داخل البطين عن طريق أخذ حامل تعلق على الشعرية الزجاجية واختراق الجلد والجمجمة، والأنسجة الدماغية مع غيض من الشعرية الزجاجية.
    ملاحظة: تأكد من عدم إتلاف المشيمة، التي هي أكثر قتامة من مشيمة المورين.
    1. عندما يكون طرف الشعيرات الدموية الزجاجية في البطين، يحقن حوالي 3-5 ميكرولتر من محلول الحقن عن طريق أنبوب الفم باستخدام لسان الفم المتصل بصاحب الشعيرات الدموية الزجاجية. لأن الحل المحقون يحتوي على 0.1٪ أخضر سريع، فإن البطين المحقون سوف يتحول الآن إلى اللون الأخضر الداكن، وسيكون مرئيًا كبنية على شكل كلية.
  11. ضع أقطاب الملاقط على الرحم فوق رأس الجنين بحيث يتم وضع القطب الإيجابي فوق المنطقة التي سيتم استهدافها والقطب السلبي تحت المنطقة المحقونة.
  12. تعيين الظروف الكهربائية التالية على electroporator: نبض طول = 50 مللي ثانية; نبض الجهد = 100 V؛ الفاصل الزمني النبض = 1 s؛ عدد النبضات = 5. ثم، اضغط على زر"نبض"على electroporator.
  13. إسقاط بسرعة عدة قطرات من برنامج تلفزيوني 1x دافئ على الجنين الكهربائي.
  14. كرر الإجراء لجميع الأجنة. إبقاء الرحم الرطب باستمرار مع برنامج تلفزيوني دافئ.
    ملاحظة: إذا لم يكن من السهل الوصول إلى الأجنة الأولى التي تواجه المهبل، فمن الأفضل عدم كهربها.
  15. عندما يتم كهربية جميع الأجنة، ضع الرحم مرة أخرى في تجويف البريتوني.
  16. خياطة طبقة العضلات مع الصفاق باستخدام خياطة 4-0.
  17. خياطة الجلد باستخدام نفس سمك ورذاذ الجرح مع رذاذ الألومنيوم.
  18. ضع الحيوان في قفص وأبقيه دافئًا مع مصدر حراري. مراقبة بعناية الحيوان حتى يستيقظ.

4- الرعاية اللاحقة للزُرَب وسكن الحيوانات المستهدفة

  1. لمدة 3 أيام بعد الجراحة تأكد من أن الحيوانات تخضع للرعاية التالية بعد الجراحة: 20 ملغم / كجم أموكسيسيلين (مضاد حيوي) 1x يوميا؛ 20 ملغم /كغ أموكسيسيلين (مضاد حيوي) 1x يوميا; 25 ملغم / كغ metamizol (مسكن) 3x يوميا.
  2. تأكد من أن النمس يتم إيواءها بشكل فردي.
  3. تأكد من فحص النمس من قبل البيطرية على الأقل 1x في اليوم الواحد.
  4. تأكد من أن يتم إزعاج النمس أقل قدر ممكن أثناء الولادة.
  5. بعد فُتم الجراء أو التضحية بها، أعدّي الجيل لاستئصال الرحم.

5- استئصال الرحم من النمس

ملاحظة: يتم إجراء استئصال الرحم لتقليل عدد الحيوانات التي يتم التضحية بها بحيث يمكن التبرع بالحيوانات المعقمة لاعتمادها كحيوانات أليفة. الإجراء ما قبل الجراحة لاستئصال الرحم هو نفسه كما هو الحال في الخطوة 2.

  1. حلاقة وتعقيم بطن النمس كما هو موضح في الخطوتين 3.1 و 3.2.
  2. جراحيا فتح البطن في ألبا linea. قطع طبقة العضلات. رفع طبقة العضلات والمأوى القناة الهضمية مع إصبع في حين فتح طبقة العضلات تماما.
  3. ضع مسحات الشاش حول موقع الشق ونبتلها بـ PBS العقيم. كشف الرحم النمس والمبايض ووضعها على مسحات الشاش.
  4. بدء استئصال الرحم على جانب واحد عن طريق ربط الشريان ovarica وفينا ovarica الجمجمة إلى الميزوفار. وضع المشبك على كل جانب من ربط وتنفيذ آخر ربط الجمجمة إلى المشابك. إرفاق المشبك الثالث في نهايات الربط لإنقاذهم. كرر على الجانب الآخر.
  5. قطع بين المشابك وفصل uteri cornua من mesentery على كلا الجانبين.
  6. Ligate الشريانية uterina على جانبي الرحمcaudal إلى أوستيوم uteri. ثم ligate المهبل وإصلاح الرباط. إرفاق المشبك في نهايات الربط لإنقاذها. ضع مشابك حفّة على الرباط قطع بين المشابك وفصل الرحم من المهبل. إزالة الرحم والمبايض والتخلص منها. كشط الغشاء المخاطي المتبقي من بعقب الرحم.
  7. فصل جميع المشابك المتبقية وتقصير نهايات الرباط. تأكد من السيطرة على النزيف بعد إزالة المشابك.
  8. خياطة طبقة العضلات والجلد كما هو موضح في الخطوتين 3.16 و 3.17. اتبع بروتوكول ما بعد الجراحة كما في الخطوتين 3.18 و 4.1-4.3. إبقاء الحيوانات في منشأة الحيوانات لمدة أسبوعين على الأقل مع زيارات بيطرية منتظمة. بعد أن يتم استرداد الحيوانات بالكامل ، يمكن التبرع بها للتبني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في الصعق الكهربائي الرحمي للنمس في E33 أدى إلى استهداف الخلايا السلف العصبية بطانة سطح البطين من القشرة الجديدة الجنينية (الشكل 1). وتسمى هذه الخلايا السلف apical وهي تكاثرية للغاية، مما يؤدي إلى جميع أنواع الخلايا الأخرى أثناء التنمية. عند التقسيم غير المتماثل، ولدت السلفة apical آخر السلف والخلايا أكثر تميزا، وعادة ما يكون سلف القاعدية (BP)، التي delaminated من سطح البطين. BPs هاجرت إلى المنطقة الجرثومية الثانوية، وSVZ. عندما تم إجراء الكهرباء في E33، هاجر العديد من الأطفال حديثي الولادة BPs إلى الجزء الأساسي الأكبر من SVZ، حيث شكلوا OSVZ22.

عندما تم فحص آثار الكهربة بعد 4 أيام في E37 ، كانت معظم الخلايا المستهدفة وذريتها لا تزال في المناطق الجرثومية (VZ و ISVZ و OSVZ ، انظر الشكل 2A) ونادراً ما كانت الخلايا موجودة بشكل أساسي في الصفائح القشرية (CP). تألفت ذرية الخلايا المستهدفة بشكل رئيسي من أنواع السلف العصبي والخلايا العصبية حديثي الولادة. ويمكن فحص هوية السلف عن طريق immunofluorescence لعلامات من خلايا ركوب الدراجات، مثل PCNA26 (الشكل 2B، C)،في حين أن مجموعة فرعية من السلفونات التي تمر الانقسام يمكن أن تظهر من قبل علامات مثل phosphohistone 3 (PH3)21 (الشكل 2D).

في P0، بعد 8 أيام من الكهربة، وذرة الخلايا المستهدفة تنتشر في جميع طبقات النسيج (الشكل 3A، B). وفي هذه المرحلة، كانت برامج BPs وفيرة بشكل خاص وكان من الممكن التعرف على bRG بسهولة. باستخدام مزيج من علامات عامل النسخ ، يمكن الكشف عن مجموعات مختلفة من BP. Sox2 هو علامة على الخلايا التكاثرية السلف، بما في ذلك bRG26. Tbr2 هو علامة من BPs العصبية، والتي هي أساسا ذرية وسيطة26 (الشكل 3B). لأن الأجنة كانت بالكهربية المشتركة مع ترميز بلازميد GFP، يمكن فحص مورفولوجيا السلف العصبية عن طريق تتبع إشارة GFP. وهذا مهم بشكل خاص في سياق BPs ، والتي تأتي في نوعين من المورفولوجيين الرئيسيين: الخلايا متعددة الأقطاب ، والتي هي إلى حد كبير ذرية وسيطة ، وخلايا شعاعية ، وهي bRG21. وبالتالي ، فإن Sox2 + Tbr2 – الخلايا الشعاعية في OSVZ هي الخلايا الرئيسية التي تهم دراسة bRG26.

بواسطة P16، توقفت غالبية الخلايا المستهدفة تقسيم وتفريق في الخلايا العصبية وglia. لذلك، هذه الأنواع الخلايا يتم فحص أفضل في هذه المرحلة. بالإضافة إلى مختلف أنواع فرعية الخلايا العصبية والزبقية، أظهر النمس P16 نيوكورتكس نمط خصائص للطي(الشكل 3C). في هذه المرحلة معظم gyri الرئيسية و sulci كانت موجودة بالفعل ويمكن تحديد مناطق الدماغ المحتملين31. واصل الدماغ النمس النضج بعد P16، عندما تتم عمليات مثل الميلين والتنمين.

Figure 1
الشكل 1: استهداف الخلايا العصبية بواسطة في الإلكتروبورات العصبية للنمس. في الكهربائي الرحمية من النمس النمس في E33 أدى إلى استهداف السلف apical. أثناء تطوير هذه الخلايا تؤدي إلى جميع أنواع الخلايا الأخرى. تمت دراسة السلف القاعدية على أفضل نحو في مراحل الجنين اللاحقة (E37) و ما حول الولادة (P0). تمت دراسة الخلايا العصبية بشكل أفضل في مراحل ما بعد الولادة، مثل P16. طبقات القشرية: VZ = منطقة البطين; ISVZ = المنطقة الداخلية دون البطينية؛ OSVZ = المنطقة الفرعية البطينية الخارجية؛ IZ = منطقة متوسطة؛ CP = لوحة القشرية; GZ = المناطق الجرثومية (VZ +SVZ)؛ WM = المادة البيضاء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مثال على E37 النمس النيكورتكس بعد في كهربائي الرحم في E33. (A و B) قسم من النمس E37 الجدد؛ الأخضر، وذرية الخلايا الكهروبروز (GFP)؛ الأزرق (أ) نواة الخلية (DAPI) ؛ أرجواني (B) ، خلايا ركوب الدراجات (PCNA). يشير المربع (العرض = 777 ميكرومتر) إلى المساحة الموضحة عند التكبير الأعلى في (C). شريط المقياس = 1 مم. لاحظ عدم وجود إشارة GFP في التنانقصان (نصف الكرة الأرضية غير المُتشبَط)، والذي يعمل كضوابط داخلية. (C و D) تكبير أعلى من المنطقة المستهدفة؛ الأخضر، وذرية الخلايا الكهروبروز (GFP)؛ أرجواني (C), خلايا ركوب الدراجات (PCNA); الأحمر (D) ، خلايا ميتوتيك (phosphohistone 3 ، PH3). لاحظ أن معظم ذرية الخلايا المستهدفة كانت في SVZ في هذه المرحلة. طبقات القشرية كما هو الحال في الشكل 1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: أمثلة على P0 وP16 النمس النيكورتكس بعد في الكهربائي الرحمي في E33. (A و B) قسم من الـ P0 النمس النيكورتكس؛ الأخضر، وذرية الخلايا الكهروبروز (GFP)؛ الأزرق (أ) نواة الخلية (DAPI) ؛ سماوي (B) ، Sox2 ؛ أرجواني (B), Tbr2. (B) التكبير العالي للمنطقة الكهربائية. أشرطة المقياس = 1 مم (A) ، 100 ميكرومتر (B). طبقات القشرية كما هو الحال في الشكل 1. (C) قسم من نيكورتكس P16 النمس؛ الأخضر، وذرية الخلايا الكهروبروز (GFP)؛ رمادي، نواة الخلية (DAPI)؛ أرجواني، الخلايا الفلكية (GFAP). شريط المقياس = 1 مم. وقد تم تعديل هذا الرقم من Kalebicوآخرون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في كهربائي الرحم في النمس هو تقنية هامة، مع مزايا وعيوب فيما يتعلق بطرق أخرى. هناك خطوات حاسمة والقيود على هذا الأسلوب، فضلا عن التعديلات المحتملة والتطبيقات المستقبلية أن نضع في اعتبارنا.

منذ العمل الرائد من فيكتور بوريل وزملاؤه على التلاعب الجيني من النمس النمس بعد الولادة عن طريق الكهرباء أو الحقن الفيروسي35,42,43, أصبح النمس كائن حي نموذج يمكن الوصول إليها وراثيا. تأسيس التلاعب الجيني خلال التنمية الجنينية عن طريق في كهربائي الرحم19,20 فتحت إمكانيات بحثية جديدة من خلال السماح باستهداف الخلايا السلف العصبية في مراحل النمو في وقت سابق. بالمقارنة مع التلاعب بعد الولادة، في electroporation الرحمية تمكن استهداف مناطق أكبر من القشرة الجديدة والأقل تميزا السلف العصبية التي تولد بشكل متتابع جميع أنواع الخلايا الأخرى من القشرة الجديدة. الأهم من ذلك ، بالمقارنة مع استهداف الفيروسية ، في electroporation الرحم يسمح للدقة المكانية من الاستهداف.

الجزء الأكثر أهمية من الطريقة هي الجراحة نفسها. في الكهربائي الرحمي من القشرة النمسية النمس هو إلى حد كبير أكثر تعقيدا وصعوبة بالمقارنة مع الإجراء في الفئران. جدران الرحم أكثر قتامة، والأجنة أكثر صعوبة للتمييز. بالإضافة إلى ذلك، لدى البالغين تربية أكبر ومتطلبات البيطرية. التحدي بشكل خاص هو الفترة المحيطة بولادة الجراء. النمس حساسة جدا في تلك الفترة وأفضل لا يزعج دون داع. وتتصل القيود الرئيسية التي تحد من النهج نفسه بكفاءة الاستهداف. في الأقطاب الكهربائية الرحمية النتائج دائما في استهداف فسيفساء من السلف العصبية. هذا هو المثل الأعلى لدراسة الجوانب البيولوجية الخلية من السلف العصبية أو الخلايا العصبية، ولكن هو دون المستوى الأمثل للتسبب في الاحتيكال والزقاقات التشريحية الكبيرة، مثل تغيير في طي القشرية الجديدة. إذا كان هذا مطلوباً، فإن أفضل طريقة هي تحريك الأقطاب الكهربائية على طول محور روستروكودال أثناء الإجراء من أجل تغطية أجزاء كبيرة من القشرة الجديدة. ومع ذلك ، بالنسبة لتحليل الجهاز كله فإن أفضل نهج هو توليد النمس المعدلة وراثيا بدءا من مرحلة zygote44.

المرحلة الجنينية التي تم فيها إجراء الكهربية في الرحم (E33) مثالية لدراسة السلف القاعدية. في الواقع، تم تطبيق الأقطاب الكهربائية واستهداف الفيروسية في هذه المرحلة للكشف عن توقيت ظهور OSVZ22، فضلا عن مختلف الميزات البيولوجية الخلية من السلف القاعدية ذات الصلة مورفولوجياوالانتشار 21،25،26. ومع ذلك ، اعتمادا على الغرض العلمي من الدراسة ، توقيت الكهرباء يمكن تغييرها بسهولة دون تعديلات كبيرة على طريقة19،20. وبصرف النظر عن التحديد الزمني، في كهربائي الرحم يسمح لتعديلات سهلة من خصوصية المكان. تم استهداف القشرة الجديدة دورزولاترال في موقف rostromedial على طول محور روستروكال، مما أدى إلى وضع العلامات على مناطق المحرك وsymatosensory. ويمكن أيضا أن تكون المناطق الأخرى ذات القشرة الجديدة المستهدفة عن طريق ضبط موضع الأقطاب الكهربائية واتجاه المجال الكهربائي. في الماوس، تم استهداف القشرة الجديدة الوسيطة45 وتيencephalonالبطنية 46 باستخدام في الكهربائي الرحمي، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام نهج مماثلة في النمس.

وأخيرا، في كهربائي الرحم يمكن بسهولة أن تكون جنبا إلى جنب مع أحدث الجينوم وتقنيات تحرير الجينوم13،14،16،25، حيث CRISPR / (د) Cas9 يمكن تسليمها مكونات كما plasmid أو كمجمع من بروتين Cas9 المؤتلف ودليل RNAs14، مع هذا الأخير تقصير الوقت اللازم لتحرير الجينوم أن يحدث. ومن المرجح أن يتم الجمع بين المزيد من التحسينات التكنولوجية في تحرير الجينوم مع الإلكتروبور في الرحم في كل من الفئران والنامس من أجل توليد طفرات جينومية دقيقة مهمة لفهم النمو الطبيعي للدماغ وخاصة لوضع نماذج للحالات المرضية البشرية. وفي هذا السياق، تستخدم في الأقطاب الكهربائية الرحمية بشكل متزايد كوسيلة الاستهداف المفضلة للنهج العام المتعدد الخلية الواحدة اللاحقة والتصوير الحي لفهم التواقيع الجزيئية والسلوك الديناميكي للخلايا المستهدفة وذريتها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نحن ممتنون لخدمات ومرافق معهد ماكس بلانك لبيولوجيا الخلايا الجزيئية وعلم الوراثة على الدعم المتميز المقدم ، ولا سيما الفريق بأكمله من الخدمات الطبية الحيوية (BMS) لتربية ممتازة من النمس وJ. Peychl وفريقه من مرفق المجهر الخفيفة. ونحن ممتنون بشكل خاص لكرينت ريبي وآنا فايفر من إدارة المباني للدعم البيطري الاستثنائي ولي شينغ من مجموعة هوتنر للمساعدة في العمليات الجراحية النمس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1ml syringe BD 309628 Electroporation
4-0 Vicryl suture Ethicon V392ZG Surgery
Aluminium spray cp-pharma 98017 Surgery
Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) WDT 6301 Surgery
Cappilary holder WPI MPH6S12 Electroporation
Dexpanthenol Ointment solution Bayer 6029009.00.00 Surgery
Drape sheet 45x75cm Hartmann 2513052 Surgery
Electrode Tweezer, platinum plated 5mm BTX 45-0489 Electroporation
Electroporator BTX ECM830 Electroporation
Fast Green Sigma F7258-25G Electroporation
Ferret Mustela putorius furo Marshall NA Experimental organism
Fiber optic light source Olympus KL1500LCD Electroporation
Forceps Allgaier instrumente 08-033-130 Surgery
Forceps 3C-SA Rubis Tech 3C-SA Surgery
Forceps 55 Dumostar 11295-51 Surgery
Forceps 5-SA Rubis Tech 5-SA Surgery
Gauze swabs large Hartmann 401723 Surgery
Gauze swabs small Hartmann 401721 Surgery
GFAP antibody Dako Z0334 Antibody
GFP antibody Aves labs GFP1020 Antibody
Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) Sutter Instrument BF120-69-10 Electroporation
Glucose Bela-pharm K4011-02 Surgery
Heat pad Hans Dinslage Sanitas SHK18 Surgery
Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) Meda 997437 Surgery
Isofluran CP 21311 Surgery
Loading tips 20µl Eppendorf #5242 956.003 Electroporation
Metamizol WDT 99012 Surgery
Metzenbaum dissecting scissors Aesculap BC600R Surgery
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97 Electroporation
pCAGGS-GFP NA NA From Kalebic et al., eLife, 2018
PCNA antibody Millipore CBL407 Antibody
pH3 antibody Abcam ab10543 Antibody
Scalpel Aesculap 294200104 Surgery
Shaver Braun EP100 Surgery
Sox2 antibody R+D Systems AF2018 Antibody
Surgical clamp 13cm WDT 27080 Surgery
Surgical double spoon (Williger) WDT 27232 Surgery
Surgical drape WDT 28800 Surgery
Surgical scissors small FST 14090-09 Surgery
Suturing needle holder Aesculap BM149R Surgery
Tbr2 antibody Abcam ab23345 Antibody
Transfer pipette 3ml Fischer scientific 13439108 Surgery
Water bath Julabo TW2 Surgery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
  2. Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
  3. Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
  4. Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  5. Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
  6. Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
  8. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  9. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  10. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
  13. Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
  14. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  15. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
  16. Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
  17. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
  18. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
  19. Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
  20. Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
  21. Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
  22. Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
  23. Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
  24. Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
  25. Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
  26. Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
  27. Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
  28. Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
  29. Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
  30. Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
  31. Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
  32. Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
  33. Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
  34. Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
  35. Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
  36. Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
  37. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  38. Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
  39. De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
  40. Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
  41. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
  42. Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
  43. Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
  44. Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
  45. Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
  46. Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).

Tags

علم الأعصاب، العدد 159، في الكهربائي الرحم، النمس، تطوير القشرة الجديدة، الخلايا السلف العصبية، التلاعب الجيني، في الجسم الحي
في فيتفو استهداف الخلايا السلف العصبية في النمس نيوكورتكس من قبل في الكهربائية الرحمية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., More

Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (159), e61171, doi:10.3791/61171 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter