Summary
这里介绍的是一个方案，用于在胚胎雪铁龙大脑中使用子宫电穿孔进行基因操作。此方法允许在体内神经祖细胞靶向神经祖细胞。
Abstract
在胚胎发育过程中，在体内操作基因表达是分析个体基因在哺乳动物发育中的作用时的首选方法。在子宫电穿孔是一种关键技术，用于操纵胚胎哺乳动物大脑体内的基因表达。这里介绍了一种用于子宫电穿孔的子宫电穿孔的龙肉，一种小型食肉动物。雪铁龙正越来越多地被用作新皮质发育的模型，因为它的新皮质表现出一系列解剖、组织学、细胞和分子特征，这些特征也存在于人类和非人类灵长类动物中，但在啮齿动物模型中却不存在，如小鼠或大鼠。在子宫电穿孔是在胚胎日（E）33，在雪铁龙的中创阶段进行。在子宫电穿孔中，目标是脑的横向心室内的神经祖细胞。在神经生成过程中，这些祖细胞产生所有其他神经细胞类型。本工作显示了E37、产后日（P）1和P16的代表性结果和分析，分别对应于子宫电穿孔后4天、9天和24天。在早期阶段，靶向细胞的后代主要由各种神经祖细胞子型组成，而在后期阶段，大多数标记的细胞是后位神经元。因此，在子宫电穿孔中，可以研究基因操纵对各类神经细胞的细胞和分子特征的影响。通过它对各种细胞群的影响，在子宫电穿孔也可用于操纵组理学和解剖特征的雪铁龙新皮质。重要的是，所有这些影响都是急性的，并且由用户确定时空特异性。
Introduction
新皮质是哺乳动物大脑的外层,，是认知功能1、2、3、4、52,34的更高认知功能。1为了在胚胎发育过程中在体内哺乳动物新皮质中实现急性基因操作，探索了两种不同的方法：病毒感染6和子宫电穿孔7。这两种方法都允许有效定位新皮质细胞，但存在一些限制。与病毒感染相比，子宫电穿孔的主要优点是能够实现新皮质内的空间特异性，这是通过调节电场方向来实现的。
自从电穿孔首次被证明有助于DNA进入体外8细胞以来，它已被应用到体内的各种脊椎动物中传递DNA。在发育神经科学中，在小鼠新皮质的子宫电穿孔中，第一次报告于2001年,9，10。该方法包括注射胚胎脑横向心室的DNA混合物，以及随后使用钳子电极应用电场，从而允许空间精度,7，11。在子宫电穿孔已应用提供核酸，以操纵内源或异位添加基因在小鼠新皮质的表达。最近，通过应用CRISPR/Cas9的细胞基在小鼠新皮质中通过子宫电穿孔进行基因组编辑的方法，在后细胞12、13和神经,祖细胞14、（2）基因组15和表观基因组16编辑中执行（1）基因破坏，取得了重要进展。13
在小鼠首次报告后不久，在子宫电穿孔中应用于胚胎鼠新皮质17，18。,18非啮齿动物仍然是一个挑战，直到第一次在子宫电穿孔雪铁龙，一种小型食肉动物，在2012年19，20。19,此后，在铁杉的子宫电穿孔中，通过标记神经祖细胞,和神经元,,20、21、22、23、操纵内源基因的表达，包括使用CRISPR/Cas9技术24，以及传递异位基因22,23,2121、22、25，包括人类特异性25基因2226，应用于研究新皮质发育21的机制。此外，在子宫电穿孔的雪铁龙已被用来解决人类新皮质发育的特点在病理条件27，28。27,
在新皮质发育的背景下，与小鼠相比，使用雪铁龙作为模型有机体的优点是，雪铁龙可以更好地概括一系列人类特征。在解剖层面，雪铁龙表现出皮质折叠的特征模式，这种折叠在人类和大多数其他灵长类动物中也存在，但在,小鼠或大鼠4、29、30、31,29,30中完全不存在。在组织学层面，雪铁龙有两个不同的辅助细菌区，分别称为内缘和外侧补助区（ISVZ和OSVZ）32、33，由内纤维层32,3323隔开。这些功能也与灵长类动物共享，包括人类，但不是与小鼠34。雪铁龙和人类中的 ISVZ 和 OSVZ 都含有丰富的神经祖细胞，而小鼠的辅助区 （SVZ） 只含有稀疏的神经祖细胞 21、32、35、36。21,32,35,36在细胞水平上，雪铁龙表现出称为基底或外径向胶质（bRG或oRG）的神经祖细胞亚型的高比例，这些亚型被认为有助于哺乳动物新皮质34、37、38,37,的进化扩张。因此，bRG在胎儿人类和胚胎雪铁龙新皮质中非常丰富，但它们在胚胎小鼠新皮质35，36,中是非常罕见的。此外，雪铁龙bRG显示形态异质性类似于人类bRG，远远优于小鼠bRG21。最后，在分子水平上，发展雪铁龙新皮质显示基因表达模式与胎儿人类新皮质非常相似，假定它们能够控制皮质折叠的发展，除其他外，39。
雪铁龙bRG的细胞生物学和分子特性使其具有很高的增殖性，类似于人类bRG。这导致神经元的产生增加和扩展和高度复杂的新皮质34的发展。这些特性使雪铁龙成为研究新皮质发育的人类特征的优秀模型生物，这种特征在小鼠26、40,中无法建模。为了充分利用雪铁龙作为模型有机体，提出了该方法。它包括E33雪铁龙胚胎的子宫电穿孔与质粒表达GFP（pGFP）在一个无处不在的启动子CAG的控制之下。然后，可以胚胎或产后对电穿孔胚胎进行分析。为了减少牺牲动物的数量，雌性雪铁龙（吉尔）通过子宫切除术进行绝育，并捐赠给宠物收养。如果目标胚胎在胚胎阶段收获，则进行第二次手术，通过剖腹产切除胚胎，而小鼠被子宫切除。如果在产后阶段分析目标胚胎，在幼崽被洗奶或牺牲后，这些幼崽被子宫切除。因此，还提出了一个用于吉尔的子宫切除术的协议。
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Protocol
所有实验程序都是与德国动物福利立法的一致，经土地福利法（TVV 2/2015和TVV 21/2017号许可）批准后进行。
1. 子宫电穿孔的准备
- 准备DNA混合物。在此协议中，使用 1 μg/μL 的 pGFP 最终浓度。将DNA溶解在PBS中，并补充0.1%的快速绿色，以方便可视化。一旦准备好，通过上下移液几次或用手指敲击混合DNA混合物。储存在室温下，直到使用。
注：对于共电体，DNA混合物准备含有1μg/μL质粒的最终浓度编码感兴趣的基因，以及0.5μg/μL的pGFP稀释在PBS中。 - 使用所有必需的工具和仪器准备手术台。
- 使用微移管拉拔器拉玻璃毛细管。调整毛细管尖端的直径，使用前文所述的钳子切断毛细管的外端部分。
2. 为手术准备雪铁龙
- 在手术前，在E33禁食时保持带胚胎的怀孕球，至少3小时，以减少呕吐的风险。
- 手术前，通过高压灭菌消毒所有工具。在无菌条件下在专门分配的房间里进行手术，以消除潜在的污染源。
- 将怀孕的吉尔放在4%异氟兰的嗜睡盒中。
- 麻醉时，用热垫将雪铁龙放在手术台上，并用恒定的2~3%异氟流附着在鼻子上。为确保麻醉水平适当，请检查是否缺乏以下反射：
- 触摸眼皮的眼皮的眼皮反射
- 通过捏紧皮肤在两个后肢的第二和第三，或第三和第四脚趾之间捏皮肤的屈曲反射
- 如果 palpebral 反射不存在，屈肌反射明显减少，则通过捏每个后肢的一个脚趾来检查疼痛反射。
注：如果需要，确保手头有听诊器，以监测心率和节律。
- 将雪铁龙皮下注射镇痛剂（0.1 mL的美米佐尔，50毫克/千克的体重），抗生素（0.1 mL/kg的体重20毫克/千克阿莫西林+克拉夫拉尼奇酸）和葡萄糖（10 mL的5%葡萄糖溶液）。
- 在手术过程中，将一滴眼药膏溶液放在眼睛上，以防止眼睛脱水。
- 用剃须刀剃雪铁龙肚子。
- 用水和肥皂清洁皮肤，用70%乙醇磨砂消毒腹部，用碘消毒2倍，让它干燥。
3. 在雪铁龙的子宫电穿孔
- 确保手术区域无菌：将无菌手术工具放在无菌组织上，并更换外套和手套。
- 在动物上放置一个无菌的手术窗帘。
- 使用手术刀，手术打开腹部在线阿尔巴与+5厘米长的切口。
- 用剪刀切割肌肉层。
- 将纱布棉签在切口部位周围，用 PBS 将纱布擦拭。纱布拭子将吸收手术期间添加的额外PBS。
注：在整个手术过程中保持热量和PBS支持。 - 暴露雪铁龙子宫，并放在纱布拭子上。
- 使用带长装脚尖的移液器，使用喷射溶液装载玻璃毛细管。确保负载体积大约在 5~20 μL 之间，具体取决于胚胎数量和不同实验条件的数量。每个胚胎的平均注射体积为3~5μL。将装有的玻璃毛细管连接到支架上，将支架的另一侧连接到管子和喉舌上。
- 检查第一个胚胎并找到头部。
- 将光纤光源放在胚胎头部旁边，以方便可视化。
注：铁子宫壁非常暗，除非光线直接照在它们上，否则很难看穿它们。 - 对大脑半球之一的心室进行单次静脉注射，保持另一个半球完好无损，以作为内部控制。心室本身不容易被眼睛区别开来，因此根据色素虹膜的位置来估计它的位置，这是可见的。静脉注射通过将支架连接到玻璃毛细管，并穿透皮肤、头骨和脑组织与玻璃毛细管的尖端。
注：确保不要损坏胎盘，胎盘比蒙丁胎盘暗。- 当玻璃毛细管的尖端位于心室中时，使用连接到玻璃毛细管支架的喉舌，通过口蹄管注射约 3~5 μL 的喷射溶液。由于注射溶液含有0.1%的快速绿色，注射心室现在将变成深绿色，并将可见为肾形结构。
- 将钳子电极放在胚胎头部上方的子宫上，使正极位于目标区域上方，负极置于注射区域下方。
- 在电穿孔器上设置以下电穿孔条件：脉冲长度 = 50 ms;脉冲电压 = 100 V;脉冲间隔 = 1 s;脉冲数 = 5。然后，按下电穿孔器上的"脉冲"按钮。
- 快速在电穿孔胚胎上滴几滴热 1x PBS。
- 对所有胚胎重复手术。用温暖的PBS使子宫不断湿润。
注：如果面对阴道的第一个胚胎不容易获得，最好不要电化它们。 - 当所有的胚胎都进行电穿孔时，将子宫放回腹腔。
- 使用 4-0 缝合用内膜缝合肌肉层。
- 用相同厚度缝合皮肤，用铝喷雾喷洒伤口。
- 将动物放在笼子里，用热源保暖。仔细监测动物，直到它醒来。
4. 术后护理和目标动物的住房
- 手术后3天确保动物接受以下术后护理：每天20毫克/千克阿莫西林（抗生素）1倍;25毫克/千克美米米佐尔（镇痛）每天3倍。
- 确保雪铁龙单独存放。
- 确保兽医每天至少检查1次雪铁龙。
- 确保雪铁龙在交货过程中受到尽可能少的干扰。
- 幼崽被分奶或牺牲后，准备子宫切除术。
5. 雪铁龙的子宫切除术
注：进行子宫切除术以减少牺牲的动物数量，以便消毒的动物可以作为宠物捐赠收养。子宫切除术的手术前手术与步骤2相同。
- 如步骤 3.1 和 3.2 所述，对雪铁龙腹部进行剃须和消毒。
- 手术打开肚子在线阿尔巴。切肌肉层。抬起肌肉层，用手指遮挡肠道，同时完全打开肌肉层。
- 将纱布棉签在切口部位周围，用无菌 PBS 将纱布擦拭。暴露雪铁龙子宫和卵巢，并把它们放在纱布拭子上。
- 开始子宫切除术的一侧，通过连接艺术的瓦瓦里卡和维娜瓦里卡颅到中视。在结扎的每一侧放一个夹子，对夹执行另一个结扎颅。将第三个夹子连接到连接末端以保存它们。在另一侧重复。
- 在夹子之间切割，将玉米从两侧的内肠中分离出来。
- 将子宫两侧的子宫的子宫都烧到子宫。然后将阴道并固定连结。将夹子连接到夹具的末端以保存它们。将两个夹子放在连结上。在夹子之间切割，将子宫从阴道中分离出来。取出子宫和卵巢并处置它们。从子宫屁股上刮掉残留的粘膜。
- 拆下所有剩余的夹具并缩短连字末端。拆下夹子后，确保控制出血。
- 缝合肌肉层和皮肤，如步骤3.16和3.17所述。按照术后协议，如步骤3.18和4.1~4.3。定期进行兽医检查，将动物留在动物设施中至少2周。动物完全康复后，可以捐赠收养。
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Representative Results
在E33的雪铁龙的子宫电穿孔中，导致在胚胎新皮质的心室表面内衬的神经祖细胞瞄准（图1）。这些细胞被称为脂肪祖细胞，并且是高度增殖的，在发育过程中产生所有其他细胞类型。在不对称分裂时，脂肪祖体产生另一个蛋白亲和一个更分化的细胞，通常是基底祖代（BP），从心室表面去层。BPs 迁移到辅助细菌区 SVZ。当电穿孔在E33进行时，许多新生的BPs迁移到SVZ的最基础部分，在那里他们形成了OSVZ22。
4天后在E37检查电穿孔效应时，大多数靶向细胞及其后代仍处于生殖区（VZ、ISVZ和OSVZ，见图2A），细胞很少进一步存在于皮质板（CP）中。靶细胞的祖体主要由神经祖细胞类型和新生神经元组成。前代体身份可以通过免疫荧光检查循环细胞的标记，如PCNA26（图2B，C），而接受线粒体C病的祖体子集可以通过血红素3（PH3）21（图2D）等标记来显示。21
在P0，电穿孔后8天，靶向细胞的后代扩散到所有组织学层（图3A，B）。 B在这个阶段，BPs特别丰富，bRG很容易识别。使用转录因子标记的组合，可以揭示不同的BP种群。Sox2是增殖祖细胞的标记，包括bRG26。Tbr2 是神经原生 BPs 的标记，它主要是中间祖体26 （图 3B） 。由于胚胎与质粒编码GP共电，因此可以通过跟踪GP信号来检查神经祖细胞的形态。这一点在BPs中尤其重要，BPs有两种主要形态型：多极细胞，主要是中间代细胞，径向细胞，即bRG21。因此，OSVZ中的Sox2+Tbr2+径向细胞是研究bRG26的关键细胞群体。
通过P16，大多数靶向细胞停止分裂和分化成神经元和胶质。因此，在此阶段最好检查这些细胞类型。除了各种神经元和胶质亚型外，雪铁龙P16新皮质还表现出折叠的特征模式（图3C）。在这个阶段，大多数主要的陀螺和磺胺已经存在，未来的大脑区域可以确定31。在P16之后，当诸如脑功能和突触发生等过程发生时，费雷特大脑继续成熟。
图1：通过雪铁龙新皮质的子宫电穿孔瞄准神经细胞。在E33雪铁龙新皮质的子宫电穿孔中，导致瞄准了动物祖先。在发育过程中，这些细胞产生所有其他细胞类型。基础祖细胞在胚胎（E37）和围产期（P0）晚期研究最好。神经元最好在产后阶段研究，如P16。皮质层：VZ = 心室区;ISVZ = 内侧补助区;OSVZ = 外部补助区;IZ = 中间区域;CP = 皮质板;GZ = 细菌区 （VZ+SVZ）;WM = 白色物质。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：E33的子宫电穿孔后E37雪铁龙新皮质示例。（A 和 B） E37 雪铁龙新皮质部分;绿色，电分细胞的后代（GFP）;蓝色 （A） 细胞核 （DAPI ）;品红色 （B）， 循环细胞 （PCNA）.框（宽度 = 777 μm）表示在 （ C ） 中以较高放大率显示的区域。比例线 = 1 mm。请注意，在作为内部控制的反向（非电子化半球）中缺少 GFP 信号。（C 和 D） 目标区域的放大率较高;绿色，电分细胞的后代（GFP）;品红色 （C）， 循环细胞 （PCNA ）;红色 （D），线粒细胞（磷石 3，PH3）。请注意，在这个阶段，目标细胞的大多数后代在SVZ中。皮质层，如图 1所示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：E33的子宫电穿孔后P0和P16雪铁龙新皮质的例子。（A 和 B） P0 雪铁龙新皮质部分;绿色，电分细胞的后代（GFP）;蓝色 （A） 细胞核 （DAPI ）;青色 （B）， Sox2 ;品红色 （B）， Tbr2. （B） 电分面积的放大率更高。比例线 = 1 mm （A）， 100 μm （B） 。皮质层，如图 1所示。（C） P16雪铁龙新皮质部分;绿色，电分细胞的后代（GFP）;灰色，细胞核（DAPI）;品红色，星细胞（GFAP）。比例线 = 1 mm。这个数字已经修改了从卡莱比奇等人25。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在铁的子宫电穿孔是一种重要的技术，与其他方法相比，有优缺点。此方法有关键步骤和限制，以及潜在的修改和未来的应用程序需要记住。
自从维克多·博雷尔,及其同事在通过电穿孔或病毒注射35、42、43,42对产后雪铁龙新皮质进行基因操作方面进行开创性工作以来，雪铁龙已成为一种基因可访问的模型生物体。通过子宫电穿孔19在胚胎发育过程中建立基因操作，20通过允许在早期发育阶段瞄准神经祖细胞，开辟了新的研究可能性。,与产后操作相比，在子宫电穿孔中，可以瞄准新皮质的较大区域和分化程度较低的神经祖细胞，按顺序生成新皮质的所有其他细胞类型。重要的是，与病毒定位相比，在子宫电穿孔中，可以进行定位的空间精度。
该方法最关键的部分是手术本身。与小鼠的手术相比，在小鼠的子宫电穿孔中，铁杉新皮质的电穿孔更为复杂和困难。子宫壁较暗，胚胎更难分辨。此外，成年雪铁龙对饲养和兽医的要求更高。特别具有挑战性的是幼崽出生的时期。雪铁龙在那个时期非常敏感，最好不要不必要地打扰。方法本身的主要局限性与目标确定的效率有关。在子宫电穿孔总是导致目标的神经祖先的马赛克。这是理想的研究神经祖祖或神经元的细胞生物学方面，但它是不理想的引起大组织学和解剖扰动，如新皮质折叠的变化。如果需要，最好的方法是在手术过程中沿玫瑰花轴移动电极，以覆盖新皮质的大部分地区。然而，对于整个器官分析，最好的方法是从受精卵阶段44开始生成转基因雪铁龙。
进行子宫电穿孔的胚胎阶段（E33）是研究基底祖体的理想。事实上，在这个阶段，电波和病毒靶向已经应用，以揭示OSVZ22发病的时间，以及与它们的形态和增殖相关的基底祖细胞的各种生物特征21，25，26。21,25,26然而，根据研究的科学目的，电穿孔的时间可以很容易地改变，而无需对方法19，20作出重大修改。除了时间特异性，在子宫电穿孔允许轻松修改空间特异性。沿着玫瑰花轴的旋转位置的多索体新皮质被瞄准，从而标记了电机和躯体感觉区域。通过调整电极的位置和电场的方向，也可以定位其他新皮质区域。在小鼠中，内伸新皮质45和腹腔电脑46被定位用于子宫电穿孔，这表明类似的方法可用于雪铁龙。
最后，在子宫电穿孔可以很容易地结合最新的基因组和表观基因组编辑技术,,13，14，16，25，其中CRISPR/（d）Cas9组件可以作为质粒或复合体Cas9蛋白和引导13,14RNA14，后者缩短了基因组编辑进行所需的时间。1625基因组编辑的进一步技术改进很可能与小鼠和雪铁龙的子宫电穿孔相结合，以产生精确的基因组突变，对理解正常大脑发育，特别是对人类病理状况的建模至关重要。在此背景下，在子宫电穿孔中，越来越多地用作后续各种单细胞组学方法和活成像的靶向方法，以了解靶向细胞及其后代的分子特征和动态行为。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢马克斯·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所的服务和设施所提供的出色支持，特别是生物医学服务 （BMS） 的整个团队为雪铁龙和 J. Peychl 及其光显微镜设施团队的出色饲养。我们特别感谢英国医学会的卡特林·雷佩和安娜·普费弗提供出色的兽医支持，以及赫特纳集团的雷星协助雪铁龙手术。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
