Summary
Hier gepresenteerd is een protocol om genetische manipulatie uit te voeren in de embryonale fret hersenen met behulp van in utero elektroporatie. Deze methode maakt het mogelijk om neurale voorlopercellen in de neocortex in vivo te targeten.
Abstract
Manipulatie van genexpressie in vivo tijdens de embryonale ontwikkeling is de methode van keuze bij het analyseren van de rol van individuele genen tijdens de ontwikkeling van zoogdieren. In utero elektroporatie is een belangrijke techniek voor de manipulatie van genexpressie in de embryonale zoogdier hersenen in vivo. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor in utero elektroporatie van de embryonale neocortex van fretten, een kleine carnivoor. De fret wordt steeds vaker gebruikt als een model voor neocortex ontwikkeling, omdat de neocortex vertoont een reeks van anatomische, histologische, cellulaire, en moleculaire kenmerken die ook aanwezig zijn in menselijke en niet-menselijke primaten, maar afwezig in knaagdier modellen, zoals muis of rat. In utero elektroporatie werd uitgevoerd op embryonale dag (E) 33, een midneurogenese stadium in fret. In utero elektroporatie richt neurale voorloper cellen langs de laterale ventrikels van de hersenen. Tijdens neurogenese, deze voorloper cellen aanleiding geven tot alle andere neurale celtypes. Dit werk toont representatieve resultaten en analyses op E37, postnatale dag (P) 1 en P16, wat overeenkomt met respectievelijk 4, 9 en 24 dagen na utero-elektroporatie. In eerdere stadia bestaat het nageslacht van gerichte cellen voornamelijk uit verschillende neurale voorloper subtypes, terwijl in latere stadia de meeste gelabelde cellen postmitotische neuronen zijn. Dus, in utero elektroporatie maakt de studie van het effect van genetische manipulatie op de cellulaire en moleculaire kenmerken van verschillende soorten neurale cellen. Door het effect ervan op verschillende celpopulaties, in utero elektroporatie kan ook worden gebruikt voor de manipulatie van histologische en anatomische kenmerken van de fret neocortex. Belangrijk is dat al deze effecten acuut zijn en worden uitgevoerd met een spatiotemporale specificiteit bepaald door de gebruiker.
Introduction
De neocortex is het buitenste blad van de zoogdiercerebrum en de zetel van hogere cognitieve functies1,2,3,4,5. Om een acute genetische manipulatie in de zoogdiernetrocortex in vivo te bereiken tijdens de embryonale ontwikkeling, zijn twee verschillende methoden onderzocht: virale infectie6 en in utero elektroporatie7. Beide methoden maken efficiënte targeting van neocorticale cellen mogelijk, maar hebben last van enkele beperkingen. Het grote voordeel van in utero elektroporatie in vergelijking met virale infectie is het vermogen om ruimtelijke specificiteit te bereiken binnen de neocortex, die wordt bereikt door het reguleren van de richting van het elektrische veld.
Sinds elektroporatie voor het eerst werd aangetoond dat het de binnenkomst van DNA in de cellen in vitro8vergemakkelijkt, is het toegepast om DNA te leveren in verschillende gewervelde dieren in vivo. In de ontwikkelingsneurowetenschappen werd in utero-elektroporatie van de muis neocortex voor het eerst gemeld in 20019,10. Deze methode bestaat uit een injectie van het DNA-mengsel in de laterale ventrikel van de embryonale hersenen en de daaropvolgende toepassing van het elektrische veld met behulp van pincet-elektroden, die ruimtelijke precisie7,11mogelijk maakt . In utero elektroporatie is sindsdien toegepast om nucleïnezuren te leveren om de expressie van endogene of ectopisch toegevoegde genen in de muis neocortex te manipuleren. Belangrijke vooruitgang is onlangs geboekt door de toepassing van de methodologie van CRISPR/ Cas9-gemedieerde genoombewerking via in utero elektroporatie in de muis neocortex uit te voeren (1) genverstoring in postmitotische neuronen12,,13 en neurale voorloper cellen14, en (2) genoom15 en epigenome16 bewerken.
Zeer snel na het eerste rapport in de muis, in utero elektroporatie werd toegepast op de embryonale rat neocortex17,18. Niet-knaagdieren bleven een uitdaging tot de eerste in utero elektroporatie van fretten, een kleine carnivoor, werd gemeld in 201219,20. Sindsdien is in utero elektroporatie van fretten toegepast om de mechanismen van neocortexontwikkeling te bestuderen door neurale voorlopers en neuronen20,21 ,22,2223,te manipuleren, waarbij de expressie van endogene genen wordt gemanipuleerd, inclusief het gebruik van CRISPR/Cas9-technologie24, en door ectopische genen te leveren21,22,25, inclusief mensspecifieke genen26. Bovendien is in utero-elektroporatie van fretten gebruikt om kenmerken van de ontwikkeling van menselijke neocortex in pathologische omstandigheden27,28aan te pakken .
In de context van de ontwikkeling van neocortex zijn de voordelen van het gebruik van fretten als modelorganisme ten opzichte van muizen te wijten aan het feit dat fretten een reeks menselijke kenmerken beter samenvatten. Op anatomisch niveau vertonen fretten een karakteristiek patroon van corticale vouwen, dat ook aanwezig is in menselijke en meeste andere primaten, maar volledig afwezig is bij muizen of ratten4,29,30,31. Op histologisch niveau hebben fretten twee verschillende subventriculaire kiminale zones, aangeduid als de binnenste en buitenste subventriculaire zones (respectievelijk ISVZ en OSVZ)32,33, gescheiden door de binnenste vezellaag23. Deze functies worden ook gedeeld met primaten, waaronder mensen, maar niet met muizen34. De ISVZ en OSVZ in fretten en mensen zijn bevolkt met overvloedige neurale voorlopercellen, terwijl de subventriculaire zone (SVZ) van muizen bevat slechts schaarse neurale voorlopers21,32,35,36. Op cellulair niveau vertonen fretten een groot deel van een subtype neurale voorlopers die respectievelijk basale of buitenste radialeglia (bRG of oRG) worden genoemd, die als instrumenteel worden beschouwd voor de evolutionaire expansie van de zoogdiernecitator34,37,38. bRG zijn dus zeer overvloedig in de foetale menselijke en embryonale fret neocortex, maar ze zijn zeer zeldzaam in de embryonale muis neocortex35,36. Bovendien vertoont ferret bRG morfologische heterogeniteit vergelijkbaar met die van de menselijke bRG, veel beter dan muis bRG21. Ten slotte vertoont de ontwikkeling van fret neocortex op moleculair niveau genexpressiepatronen die sterk lijken op die van foetale menselijke neocortex, waarvan wordt aangenomen dat ze de ontwikkeling van corticale vouwen controleren, onder andere39.
De cel biologische en moleculaire kenmerken van fret bRG maken ze zeer proliferative, vergelijkbaar met de menselijke bRG. Dit resulteert in een verhoogde productie van neuronen en de ontwikkeling van een uitgebreide en zeer complexe neocortex34. Deze kenmerken maken fretten uitstekend model organismen voor het bestuderen van mens-achtige kenmerken van neocortex ontwikkeling die niet kunnen worden gemodelleerd in muizen26,40. Om optimaal gebruik te maken van de fret als modelorganisme werd de gepresenteerde methode ontwikkeld. Het bestaat uit in utero elektroporatie van E33 fret embryo's met een plasmide uitdrukken GFP (pGFP) onder de controle van een alomtegenwoordige promotor, CAG. De geëlektreerde embryo's kunnen vervolgens embryonaal of postnatally worden geanalyseerd. Om het aantal geofferde dieren te verminderen, worden vrouwelijke fretten (jills) gesteriliseerd door hysterectomie en gedoneerd voor adoptie als huisdier. Als de beoogde embryo's in embryonale stadia worden geoogst, wordt een tweede operatie uitgevoerd en worden de embryo's verwijderd door een keizersnede, terwijl de jills hysterectomized zijn. Als de beoogde embryo's worden geanalyseerd in postnatale stadia, worden de jills hysterectomized nadat de pups zijn gespeend of geofferd. Daarom wordt ook een protocol gepresenteerd voor de hysterectomie van jills.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse dierenwelzijnswetgeving na goedkeuring door de Landesdirektion Sachsen (licenties TVV 2/2015 en TVV 21/2017).
1. Voorbereiding op utero-elektroporatie
- Bereid het DNA-mengsel voor. In dit protocol wordt een uiteindelijke concentratie van 1 μg/μL pGFP gebruikt. Los DNA op in PBS en vul aan met 0,1% Fast Green om visualisatie te vergemakkelijken. Eenmaal bereid, meng het DNA-mengsel door pipetten op en neer meerdere malen of door vinger te tikken. Bewaar op kamertemperatuur tot gebruik.
OPMERKING: Voor coelectoraties is het DNA-mengsel bereid om een uiteindelijke concentratie van 1 μg/μL plasmide te bevatten die een be belang is, samen met 0,5 μg/μL pGFP verdund in PBS. - Bereid de operatietafel voor met alle benodigde gereedschappen en instrumenten.
- Trek glazen haarvaten met behulp van de micropipet trekker. Pas de diameter van de capillaire punt aan door het distale deel van de capillaire af te snijden met tangen zoals eerder beschreven41.
2. Voorbereiding van fretten voor chirurgie
- Houd de zwangere jills met embryo's op E33 vasten voor ten minste 3 uur voor de operatie om het risico van braken te verminderen.
- Voorafgaand aan de operatie steriliseren alle instrumenten door autoclaving. Voer de operatie uit in een speciaal toegewezen ruimte in aseptische omstandigheden om mogelijke bronnen van besmetting te elimineren.
- Plaats de zwangere jill in de narcose box met 4% isoflurane.
- Wanneer verdoofd, plaats de fret op de operatietafel met een warmtekussen en bevestig het narcosemasker met een constante 2-3% isoflurane stroom naar de neus. Controleer om het juiste niveau van anesthesie te waarborgen, op het ontbreken van de volgende reflexen:
- De palpebral reflex door het aanraken van de perioculaire huid
- De flexor reflex door knijpen de huid tussen de2e en 3e, of 3e en 4e teen van beide achterste ledematen
- Als de palpebral reflex afwezig is en flexor reflex is duidelijk verminderd, controleer op de pijnreflex door knijpen een teen van elke achterste ledemaat.
LET OP: Zorg ervoor dat u een stethoscoop bij de hand hebt om de hartslag en het ritme indien nodig te controleren.
- Injecteer de fret onderhuids met pijnstillend (0,1 mL metamizol, 50 mg/kg lichaamsgewicht), antibioticum (0,1 mL/kg lichaamsgewicht van 20 mg/kg amoxicilline + clavulanic acid) en glucose (10 mL van 5% glucoseoplossing).
- Plaats een druppel oogzalf oplossing op de ogen om uitdroging van de ogen te voorkomen tijdens de chirurgische ingreep.
- Scheer de fretbuik met een scheerapparaat.
- Reinig de huid met water en zeep, desinfecteer de buik met 70% ethanol scrub, desinfecteer 2x met jodium en laat het drogen.
3.
- Zorg ervoor dat het chirurgische gebied steriel is: plaats steriele chirurgische hulpmiddelen op steriele weefsels en verander jas en handschoenen.
- Plaats een steriel chirurgische gordijn op het dier.
- Met behulp van een scalpel, operatief open de buik op de linea alba met een ~ 5 cm lange snede.
- Snijd de spierlaag met een schaar.
- Plaats gaastentjes rond de incisieplaats en maak ze nat met PBS. De gaastenstaafjes absorberen de extra PBS die tijdens de operatie worden toegevoegd.
LET OP: Houd warmte- en PBS-ondersteuning tijdens de operatie. - Bloot de fret baarmoeder en plaats het op de gaas wattenstaafjes.
- Laad een glazen capillair met de injectieoplossing met behulp van een pipet met een lange laadpunt. Zorg ervoor dat het laadvolume ongeveer tussen 5-20 μL ligt, afhankelijk van het aantal embryo's en het aantal verschillende experimentele omstandigheden. Het gemiddelde geïnjecteerde volume per embryo is 3-5 μL. Bevestig de geladen glazen capillaire aan een houder en sluit de andere kant van de houder aan op een buis en een mondstuk.
- Inspecteer het eerste embryo en vind het hoofd.
- Plaats de glasvezellichtbron naast het hoofd van het embryo om visualisatie te vergemakkelijken.
OPMERKING: Ferret baarmoederwanden zijn erg donker, en het is moeilijk om te zien door hen, tenzij het licht is direct scheen op hen. - Voer een enkele intraventriculaire injectie in de hartkamer van een van de hersenhelften en houd de andere hemisfeer intact om te dienen als een interne controle. De ventrikel zelf is niet gemakkelijk te onderscheiden door het oog, dus de locatie wordt geschat op basis van de locatie van de gepigmenteerde iris, die zichtbaar is. De intraventriculaire injectie wordt gedaan door het nemen van de houder aan de glazen capillaire en penetreren van de huid, schedel, en hersenweefsel met de punt van de glazen capillaire.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de placenta niet beschadigt, wat donkerder is dan murine placenta's.- Wanneer de punt van de glazen capillaire zich in de ventrikel bevindt, injecteer ongeveer 3-5 μL van de injectieoplossing door mond-pipetting met behulp van het mondstuk aangesloten op de glazen capillaire houder. Omdat de geïnjecteerde oplossing 0,1% Fast Green bevat, wordt de geïnjecteerde ventrikel nu donkergroen en zal zichtbaar zijn als niervormige structuur.
- Plaats de pincet elektroden op de baarmoeder boven het hoofd van het embryo, zodat de positieve pool wordt geplaatst boven het gebied dat zal worden gericht en de negatieve pool onder het geïnjecteerde gebied.
- Stel de volgende elektroporatievoorwaarden in op de elektroporator: Pulslengte = 50 ms; Pulsspanning = 100 V; Pulsinterval = 1 s; Aantal pulsen = 5. Druk vervolgens op de knop" Pulse" op de elektroporator.
- Laat snel enkele druppels warme 1x PBS vallen op het geëlektreerde embryo.
- Herhaal de procedure voor alle embryo's. Houd de baarmoeder constant nat met warme PBS.
OPMERKING: Als de eerste embryo's die naar de vagina staan niet gemakkelijk toegankelijk zijn, is het het beste om ze niet te elektropen. - Wanneer alle embryo's worden geëlektrooeerd, plaats de baarmoeder terug in de buikholte.
- Hecht de spierlaag met het buikvlies met behulp van een 4-0 hechting.
- Hecht de huid met dezelfde dikte en spuit de wond met aluminium spray.
- Plaats het dier in een kooi en houd het warm met een warmtebron. Houd het dier goed in de gaten tot het wakker wordt.
4. Postoperatieve zorg en huisvesting van gerichte dieren
- Gedurende 3 dagen na de operatie wordt ervoor gezorgd dat de dieren de volgende postoperatieve zorg ondergaan: 20 mg/kg amoxicilline (antibioticum) 1x per dag; 25 mg/kg metamizol (pijnstillend) 3x per dag.
- Zorg ervoor dat de fretten individueel worden gehuisvest.
- Zorg ervoor dat de fretten ten minste 1x per dag door een dierenarts worden onderzocht.
- Zorg ervoor dat de fretten zo min mogelijk gestoord worden tijdens de levering.
- Nadat de pups zijn gespeend of geofferd, bereid de jills voor hysterectomie.
5. Hysterectomie van fretten
OPMERKING: Een hysterectomie wordt uitgevoerd om het aantal geofferde dieren te verminderen, zodat de gesteriliseerde dieren kunnen worden gedoneerd voor adoptie als huisdier. De prechirurgische procedure voor hysterectomie is hetzelfde als in stap 2.
- Scheer en steriliseer de fretbuik zoals beschreven in de stappen 3.1 en 3.2.
- Operatief open de buik op de linea alba. Snijd de spierlaag door. Til de spierlaag op en beschut de darm met een vinger terwijl u de spierlaag volledig opent.
- Plaats gaastentjes rond de incisieplaats en maak ze nat met steriele PBS. Bloot de fret baarmoeder en de eierstokken en leg ze op het gaas wattenstaafjes.
- Start de hysterectomie aan de ene kant door het ligating van de arteria ovarica en vena ovarica craniale aan de mesovar. Zet een klem aan elke kant van de ligatie en voer een andere ligatie craniale aan de klemmen. Bevestig de derde klem aan de uiteinden van de ligatie om ze te redden. Herhaal dit aan de andere kant.
- Snijd tussen de klemmen en los de cornua uteri van de mesenterie aan beide zijden.
- Ligate de arteria uterina aan beide zijden van de baarmoeder caudal aan de ostium uteri. Dan ligate de vagina en bevestig de ligatuur. Bevestig de klem aan de uiteinden van de ligaties om ze te redden. Zet twee klemmen craniale aan de ligatuur. Snijd tussen de klemmen en los de baarmoeder van de vagina. Verwijder de baarmoeder en eierstokken en gooi ze weg. Schraap het resterende slijmvlies uit de baarmoederkui.
- Maak alle resterende klemmen los en verkort de ligatuureinden. Zorg ervoor dat u het bloeden onder controle houdt nadat de klemmen zijn verwijderd.
- Hecht de spierlaag en de huid zoals beschreven in stappen 3.16 en 3.17. Volg het postoperatieve protocol zoals in de stappen 3.18 en 4.1–4.3. Bewaar de dieren ten minste 2 weken in de diereninrichting met regelmatige veterinaire bezoeken. Nadat de dieren volledig zijn hersteld, kunnen ze worden gedoneerd voor adoptie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In utero elektroporatie van fretten op E33 resulteerde in targeting van de neurale voorloper cellen langs het ventriculaire oppervlak van de embryonale neocortex (Figuur 1). Deze cellen worden apicale voorlopers genoemd en zijn zeer proliferative, wat aanleiding geeft tot alle andere celtypen tijdens de ontwikkeling. Bij asymmetrische verdeling, apicale voorlopers gegenereerd een andere apicale voorloper en een meer gedifferentieerde cel, meestal een basale voorloper (BP), die gedelamineerd uit het ventriculaire oppervlak. BPs gemigreerd naar de secundaire kiminale zone, de SVZ. Toen de elektroporatie werd uitgevoerd op E33, veel pasgeboren BPs gemigreerd naar de basale-grootste deel van de SVZ, waar ze vormden de OSVZ22.
Toen de effecten van elektroporatie 4 dagen later op E37 werden onderzocht, waren de meeste beoogde cellen en hun nakomelingen nog in de kiemzones (VZ, ISVZ en OSVZ, zie figuur 2A) en waren cellen zelden meer basaal aanwezig in de corticale plaat (CP). Het nageslacht van gerichte cellen bestond voornamelijk uit neurale voorlopertypes en pasgeboren neuronen. De voorvaderidentiteit zou kunnen worden onderzocht door immunofluorescentie voor markers van fietscellen, zoals PCNA26 (figuur 2B, C), terwijl een subset van voorouders die mitose ondergaan, kan worden aangetoond door markers zoals fossjefossteen 3 (PH3)21 (Figuur 2D).
Bij P0, 8 dagen na elektroporatie, verspreidde het nageslacht van gerichte cellen zich in alle histologische lagen(figuur 3A, B). In dit stadium waren de BP's bijzonder overvloedig en bRG waren gemakkelijk identificeerbaar. Met behulp van een combinatie van transcriptie factor markers, verschillende BP populaties kunnen worden onthuld. Sox2 is een marker van proliferative voorlopercellen, waaronder bRG26. Tbr2 is een marker van neurogene BPs, die voornamelijk tussenliggende voorlopers26 (Figuur 3B). Omdat de embryo's werden geco-geëlektrooeerd met een plasmide codering GFP, de morfologie van neurale voorouders kon worden onderzocht door het volgen van de GFP signaal. Dit is vooral belangrijk in de context van BPs, die komen in twee belangrijke morfotypes: multipolaire cellen, die grotendeels tussenliggende voorlopers, en radiale cellen, die bRG21. Vandaar dat Sox2+ Tbr2– radiale cellen in de OSVZ de belangrijkste celpopulatie zijn die van belang is voor het bestuderen van bRG26.
Door P16, een meerderheid van de beoogde cellen gestopt met verdelen en gedifferentieerd in neuronen en glia. Daarom kunnen deze celtypen in dit stadium het best worden onderzocht. Naast verschillende neuronale en glia subtypes vertoonde fret P16 neocortex het eigenschappenpatroon van vouwen(figuur 3C). In dit stadium waren de meeste grote gyri en sulci al aanwezig en potentiële hersengebieden konden worden geïdentificeerd31. Ferret hersenen voortgezet rijpen na P16, wanneer processen zoals myelinatie en synaptogenese plaatsvinden.
Figuur 1: Neurale cellen targeten door in utero elektroporatie van de fret neocortex. In utero elektroporatie van de fret neocortex op E33 resulteerde in targeting van apicale voorlopers. Tijdens de ontwikkeling geven deze cellen aanleiding tot alle andere celtypen. Basale voorouders werden het best bestudeerd op latere embryonale (E37) en perinatale (P0) stadia. Neuronen werden het best bestudeerd in postnatale stadia, zoals P16. Corticale lagen: VZ = ventriculaire zone; ISVZ = binnensubventriculaire zone; OSVZ = buitenste subventriculaire zone; IZ = tussenzone; CP = corticale plaat; GZ = kiminale zones (VZ+SVZ); WM = witte stof. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld van E37 ferret neocortex na in utero elektroporatie bij E33. (A en B) Deel van de E37 ferret neocortex; groen, nakomelingen van geëlektreerde cellen (GFP); blauwe (A) celkernen (DAPI); magenta (B), fietscellen (PCNA). Vak (breedte = 777 μm) geeft gebied aan dat wordt weergegeven bij een hogere vergroting in (C). Schaalbalk = 1 mm. Let op het ontbreken van GFP-signaal in de contralaterale (niet-geflecteerde hemisfeer), die dient als een interne controle. (C en D) Hogere vergrotingen van het beoogde gebied; groen, nakomelingen van geëlektreerde cellen (GFP); magenta (C), fietscellen (PCNA); rood (D), mitotische cellen (fosfohistone 3, PH3). Merk op dat de meerderheid van het nageslacht van gerichte cellen was in de SVZ in dit stadium. Corticale lagen zoals in figuur 1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Voorbeelden van P0 en P16 ferret neocortex na in utero elektroporatie op E33. (A en B) Deel van de P0 ferret neocortex; groen, nakomelingen van geëlektreerde cellen (GFP); blauwe (A) celkernen (DAPI); cyaan (B), Sox2; magenta (B), Tbr2. (B) Hogere vergroting van het geëlektrificeerde gebied. Schaalbalken = 1 mm (A), 100 μm (B). Corticale lagen zoals in figuur 1. cC) afdeling van de P16 ferret neocortex; groen, nakomelingen van geëlektreerde cellen (GFP); grijze, celkernen (DAPI); magenta, astrocyten (GFAP). Schaalbalk = 1 mm. Dit cijfer is gewijzigd van Kalebic et al.25. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In utero elektroporatie in fret is een belangrijke techniek, met voor- en nadelen met betrekking tot andere methoden. Er zijn kritieke stappen en beperkingen aan deze methode, evenals mogelijke wijzigingen en toekomstige toepassingen om in gedachten te houden.
Sinds het pionierswerk van Victor Borrell en collega's over genetische manipulatie van de postnatale fret neocortex via elektroporatie of virale injectie35,42,43, is de fret een genetisch toegankelijk modelorganisme geworden. Het vaststellen van genetische manipulatie tijdens embryonale ontwikkeling via in utero elektroporatie19,20 opende nieuwe onderzoeksmogelijkheden door het toestaan van targeting van neurale voorlopercellen in eerdere ontwikkelingsstadia. In vergelijking met postnatale manipulatie, in utero elektroporatie maakt targeting van grotere gebieden van de neocortex en minder gedifferentieerde neurale voorlopers die sequentiële genereren alle andere celtypes van de neocortex. Belangrijk, in vergelijking met virale targeting, in utero elektroporatie zorgt voor ruimtelijke precisie van targeting.
Het meest kritische deel van de methode is de operatie zelf. In utero elektroporatie van de fret neocortex is aanzienlijk complexer en moeilijk in vergelijking met de procedure bij muizen. De baarmoederwanden zijn donkerder en de embryo's zijn moeilijker te onderscheiden. Bovendien, volwassen fretten hebben een grotere veehouderij en veterinaire eisen. Bijzonder uitdagend is de periode rond de geboorte van de pups. Fretten zijn zeer gevoelig in die periode en zijn best niet onnodig verstoord. De belangrijkste beperkingen van de aanpak zelf houden verband met de efficiëntie van targeting. In utero elektroporatie resulteert altijd in targeting van een mozaïek van neurale voorouders. Dit is ideaal voor het bestuderen van de cel biologische aspecten van neurale voorouders of neuronen, maar het is suboptimaal voor het veroorzaken van grote histologische en anatomische verstoringen, zoals een verandering in neocorticale vouwen. Als dit nodig is, is de beste aanpak om de elektroden langs de rostrocaudal as te bewegen tijdens de procedure om grote delen van de neocortex te bedekken. Voor hele orgaananalyse is de beste aanpak echter het genereren van transgene fretten vanaf het zygote stadium44.
Het embryonale stadium waarin de in utero elektroporatie werd uitgevoerd (E33) is ideaal voor het bestuderen van basale voorlopers. Inderdaad, elektroporaties en virale targeting in dit stadium zijn toegepast om de timing van het begin van de OSVZ22 te onthullen, evenals verschillende celbiologische kenmerken van basale voorouders die relevant zijn voor hun morfologie en proliferatie21,25,26. Afhankelijk van het wetenschappelijke doel van een studie kan de timing van elektroporatie echter gemakkelijk worden gewijzigd zonder significante wijzigingen in de methode19,20. Afgezien van temporele specificiteit, in utero elektroporatie zorgt voor eenvoudige wijzigingen van de ruimtelijke specificiteit. De dorsolaterale neocortex op de rostromedial positie langs de rostrocaudal as was gericht, wat resulteerde in etikettering van de motor en somatosensorische gebieden. Andere neocorticale gebieden kunnen ook worden aangepakt door de plaatsing van de elektroden en de richting van het elektrische veld aan te passen. Bij de muis zijn de mediale neocortex45 en ventrale telencephalon46 gericht met behulp van utero-elektroporatie, wat suggereert dat soortgelijke benaderingen kunnen worden gebruikt in fretten.
Ten slotte kan in utero-elektroporatie gemakkelijk worden gecombineerd met de meest recente genoom- en epigenoombewerkingstechnieken13,14,16,25, waarbij CRISPR/(d)Cas9-componenten kunnen worden geleverd als plasmide of als een complex van recombinant Cas9-eiwit en RNAs14kunnen begeleiden, waarbij de laatste de tijd verkort die nodig is voor genoombewerking. Het is waarschijnlijk dat verdere technologische verbeteringen in genoombewerking zullen worden gecombineerd met in utero-elektroporatie in zowel muizen als fretten om nauwkeurige genomische mutaties te genereren die belangrijk zijn voor het begrijpen van de normale ontwikkeling van de hersenen en in het bijzonder om menselijke pathologische omstandigheden te modelleren. In deze context wordt in utero-elektroporatie steeds vaker gebruikt als de doelmethode bij uitstek voor latere verschillende eencellige omics-benaderingen en live beeldvorming om de moleculaire handtekeningen en het dynamische gedrag van de beoogde cellen en hun nakomelingen te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn de diensten en faciliteiten van het Max Planck Instituut voor Moleculaire Celbiologie en Genetica dankbaar voor de uitstekende ondersteuning, met name het hele team van de Biomedische diensten (BMS) voor de uitstekende veeteelt van fretten en J. Peychl en zijn team van de Light Microscopie Facility. We zijn Katrin Reppe en Anna Pfeffer van het BMS bijzonder dankbaar voor uitzonderlijke veterinaire ondersteuning en Lei Xing van de Huttner-groep voor het assisteren bij fretoperaties.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
