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Neuroscience

यूटेरो इलेक्ट्रोपॉनेशन द्वारा फेरेट नियोकॉर्टे में न्यूरल प्रोजेनिटर कोशिकाओं को लक्षित करने में वीवो में

Published: May 6, 2020 doi: 10.3791/61171
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 4, 1
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2Human Technopole, 3Landesdirektion Sachsen, 4Department of Medical Neuroscience, Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University

Summary

यहां प्रस्तुत गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉरेशन में उपयोग कर भ्रूण फेरेट मस्तिष्क में आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। यह विधि वीवो में नियोकॉर्टेक्स में तंत्रिका जनक कोशिकाओं को लक्षित करने की अनुमति देती है।

Abstract

भ्रूणीय विकास के दौरान वीवो में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर स्तनधारी विकास के दौरान व्यक्तिगत जीन की भूमिका का विश्लेषण करते समय पसंद की विधि है। गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉनेशन में वीवो में भ्रूण स्तनधारी मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। एक छोटे मांसाहारी, फेरेट्स के भ्रूणीय नियोकॉर्टेक्स के गर्भाशय विद्युतीकरण में एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। फेरेट का उपयोग नियोकॉर्टेक्स विकास के लिए एक मॉडल के रूप में तेजी से किया जा रहा है, क्योंकि इसका नियोकॉर्टेक्स शारीरिक, हिस्टोलॉजिकल, सेलुलर और आणविक विशेषताओं की एक श्रृंखला प्रदर्शित करता है जो मानव और अमानवीय वानरों में भी मौजूद हैं, लेकिन कृंतक मॉडलों में अनुपस्थित हैं, जैसे माउस या चूहा। गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन में भ्रूणीय दिवस (ई) 33 में किया गया था, जो फेरेट में एक मिडनेरोजेनेसिस चरण था। गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉशन में मस्तिष्क के पार्श्व वेंट्रिकल्स को अस्तर करने वाली तंत्रिका जनक कोशिकाओं को लक्षित करता है। न्यूरोजेनेसिस के दौरान, ये जनक कोशिकाएं अन्य सभी तंत्रिका कोशिका प्रकारों को जन्म देती हैं। यह काम क्रमशः गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉशन में 4, 9 और 24 दिनों के बाद E37, प्रसवोत्तर दिन (पी) 1, और P16 पर प्रतिनिधि परिणाम और विश्लेषण दिखाता है। पहले के चरणों में, लक्षित कोशिकाओं की संतान में मुख्य रूप से विभिन्न तंत्रिका जनक उपप्रकार होते हैं, जबकि बाद के चरणों में अधिकांश लेबल वाली कोशिकाएं पोस्टमिटोटिक न्यूरॉन्स होती हैं। इस प्रकार, गर्भाशय इलेक्ट्रोप्यूरेशन में विभिन्न प्रकार की तंत्रिका कोशिकाओं की सेलुलर और आणविक विशेषताओं पर आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। विभिन्न सेल आबादी पर इसके प्रभाव के माध्यम से, गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉर्मेशन में फेरेट नियोकॉर्टेक्स की हिस्टोलॉजिकल और शारीरिक विशेषताओं के हेरफेर के लिए भी उपयोग किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, ये सभी प्रभाव तीव्र हैं और उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित एक स्थानिक विशेषता के साथ किए जाते हैं।

Introduction

नियोकॉर्टेक्स स्तनधारी सेरेब्रम की बाहरी शीट है और उच्च संज्ञानात्मक कार्यों की सीट1,2 ,3,34,,55है। भ्रूणीय विकास के दौरान वीवो में स्तनधारी नियोकॉर्टेक्स में तीव्र आनुवंशिक हेरफेर प्राप्त करने के लिए, दो अलग-अलग तरीकों का पता लगाया गया है: वायरल संक्रमण 6 औरगर्भाशय इलेक्ट्रोपॉरेशन7में। दोनों विधियां नियोकॉर्टिकल कोशिकाओं को कुशल रूप से लक्षित करने की अनुमति देती हैं लेकिन कुछ सीमाओं से पीड़ित होती हैं। वायरल संक्रमण की तुलना में गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉनेशन में प्रमुख लाभ नियोकॉर्टेक्स के भीतर स्थानिक विशिष्टता प्राप्त करने की क्षमता है, जो विद्युत क्षेत्र की दिशा को विनियमित करके हासिल की जाती है।

चूंकि इलेक्ट्रोपॉशन को पहली बार विट्रो8में कोशिकाओं में डीएनए के प्रवेश को सुगम बनाने के लिए दिखाया गया था, इसलिए इसे वीवो में विभिन्न कशेरुकी में डीएनए देने के लिए लागू किया गया है । विकासात्मक तंत्रिका विज्ञान में, माउस नियोकॉर्टेक्स के गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉर्मेशन में पहली बार 20019,,10में सूचित किया गया था। इस विधि में भ्रूणीय मस्तिष्क के पार्श्व वेंट्रिकल में डीएनए मिश्रण का एक इंजेक्शन होता है और चिमटी इलेक्ट्रोड का उपयोग करके विद्युत क्षेत्र के बाद के अनुप्रयोग होते हैं, जो स्थानिक परिशुद्धता7,,11की अनुमति देता है। गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉशन में माउस नियोकॉर्टेक्स में अंतर्जात या एक्टोपिकल रूप से जोड़े गए जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए न्यूक्लिक एसिड देने के लिए लागू किया गया है। हाल ही में माउस नियोकॉर्टेक्स में यूटेरो इलेक्ट्रोपॉशन के माध्यम से CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन की पद्धति को लागू करके महत्वपूर्ण प्रगति की गई है (1) पोस्टमिटोटिक न्यूरॉन्स12, 13,13 और तंत्रिका जनक कोशिकाओं14में जीन व्यवधान, और (2) जीनोम15 और एपिजेनोम16 संपादन ।

माउस में पहली रिपोर्ट के तुरंत बाद, गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉरेशन में भ्रूण चूहा नियोकॉर्टेक्स17, 18,18पर लागू किया गया था। गैर-कृंतक तब तक चुनौती बने रहे जब तक कि 2012 19, 20 में एक छोटे मांसाहारी, फेरेट्स के गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन में पहली बार रिपोर्ट नहीं किया गया19,था। तब से, गर्भाशय,22,में 20,21, 22,,23,एनोजेनिक जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करके, क्रिस्पआर/कैस9 प्रौद्योगिकी24के उपयोग सहित, और मानव-विशिष्ट24जीन26सहित एक्टोपिक जीन21,,22,,25को वितरित करके नियोकॉर्टेक्स विकास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है। इसके अलावा, गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में27,,28रोग स्थितियों में मानव नियोकॉर्टेक्स विकास की विशेषताओं को संबोधित करने के लिए इसका उपयोग किया गया है।

नियोकॉर्टेक्स विकास के संदर्भ में, चूहों की तुलना में एक मॉडल जीव के रूप में फेरेट्स का उपयोग करने के फायदे इस तथ्य के कारण हैं कि फेरेट्स मानव जैसी विशेषताओं की एक श्रृंखला को बेहतर मानते हैं। शारीरिक स्तर पर, फेरेट्स कॉर्टिकल फोल्डिंग का एक विशिष्ट पैटर्न प्रदर्शित करते हैं, जो मानव और अधिकांश अन्य वानरों में भी मौजूद है, लेकिन चूहों या चूहों में पूरी तरह से अनुपस्थित है4,,29,,30, 31।,31 हिस्टोलॉजिकल स्तर पर फेरेट्स में दो अलग-अलग सबवेंट्रिकुलर जर्मिनल ज़ोन होते हैं, जिन्हें आंतरिक और बाहरी सबवेंट्रिकुलर जोन (आईएसवीजेड और ओएसवीजेड, क्रमशः)32,33,आंतरिक फाइबर परत23से अलग किया जाता है।, इन सुविधाओं को मनुष्यों सहित वानरों के साथ भी साझा किया जाता है, लेकिन चूहों34के साथ नहीं। फेरेट्स और मनुष्यों में आईएसवीजेड और ओएसवीजेड प्रचुर मात्रा में तंत्रिका जनक कोशिकाओं के साथ आबादी वाले हैं, जबकि चूहों के सबवेंट्रिकुलर जोन (एसवीजेड) में केवल विरल तंत्रिकाजनक 21,32,,,35, 36,36होते हैं। सेलुलर स्तर पर, फेरेट्स मुख्य या बाहरी रेडियल ग्लिया (आरजी या ओआरजी, क्रमशः) के रूप में संदर्भित तंत्रिका जनकों के उपप्रकारों का एक उच्च अनुपात प्रदर्शित करते हैं, जिन्हें स्तनधारी नियोकॉर्टेक्स,34,37, 38,के विकासवादी विस्तार के लिए महत्वपूर्ण मानाजाताहै। बीआरजी इसलिए भ्रूण मानव और भ्रूण फेरेट नियोकॉर्टेक्स में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में हैं, लेकिन वे भ्रूण माउस नियोकॉर्टेक्स35, 36,36में बहुत दुर्लभ हैं। इसके अलावा, फेरेट bRG मानव bRG के समान रूपात्मक विषमता दिखाता है, जो माउस bRG21से कहीं बेहतर है। अंत में, आणविक स्तर पर, फेरेट नियोकॉर्टेक्स विकसित करने से जीन अभिव्यक्ति पैटर्न भ्रूण मानव नियोकॉर्टेक्स के समान दिखाई देता है, जो अन्य चीजों के अलावा कॉर्टिकल फोल्डिंग के विकास को नियंत्रित करने के लिए माना जाता है39।

फेरेट बीआरजी की कोशिका जैविक और आणविक विशेषताएं उन्हें मानव bRG के समान अत्यधिक प्रसारित करती हैं। इसके परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स का उत्पादन बढ़ा और विस्तारित और अत्यधिक जटिल नियोकॉर्टेक्स34का विकास हुआ । ये विशेषताएं नियोकॉर्टेक्स विकास की मानव जैसी विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए फेरेट्स उत्कृष्ट मॉडल जीव बनाती हैं जिन्हें चूहों26,,40में मॉडल नहीं किया जा सकता है। एक मॉडल जीव के रूप में फेरेट का पूरा लाभ उठाने के लिए प्रस्तुत विधि विकसित की गई थी। इसमें एक सर्वव्यापी प्रमोटर, सीएजी के नियंत्रण में जीएफपी (पीजीएफपी) को व्यक्त करने वाले प्लाज्मिड के साथ E33 फेरेट भ्रूण के गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन में शामिल हैं। विद्युतीकृत भ्रूण तो भ्रूण या postnatally विश्लेषण किया जा सकता है । बलिदान किए गए जानवरों की संख्या को कम करने के लिए, मादा फेरेट्स (जिल्स) को हिस्टेरेक्टॉमी द्वारा निष्फल किया जाता है और पालतू जानवर के रूप में गोद लेने के लिए दान किया जाता है। यदि लक्षित भ्रूण भ्रूण चरणों में काटा जाता है, तो एक दूसरी सर्जरी की जाती है और भ्रूण को सीजेरियन सेक्शन द्वारा हटा दिया जाता है, जबकि जिल्स हिस्टेरेक्टोमाइज्ड होते हैं। यदि लक्षित भ्रूण का विश्लेषण प्रसवोत्तर चरणों में किया जाता है, तो पिल्ले को छुड़ाने या बलिदान करने के बाद जिल्स को हिस्टेरेक्टोमाइज्ड किया जाता है। इसलिए, जिल्स के हिस्टेरेक्टॉमी के लिए एक प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किया जाता है।

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Protocol

लैंडेस्डिरिक्शन सचसेन (लाइसेंस TVV 2/2015 और TVV 21/2017) द्वारा अनुमोदन के बाद जर्मन पशु कल्याण कानून के साथ समझौते में सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं आयोजित की गई थीं ।

1. यूटेरो इलेक्ट्रोपाउशन में तैयारी

  1. डीएनए मिश्रण तैयार करें। इस प्रोटोकॉल में पीजीएफपी के 1 μg/μL की अंतिम एकाग्रता का उपयोग किया जाता है। पीबीएस में डीएनए को भंग करें और दृश्य की सुविधा के लिए 0.1% फास्ट ग्रीन के साथ पूरक करें। एक बार तैयार होने के बाद, डीएनए मिश्रण को कई बार या उंगली टैप करके ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। उपयोग होने तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    नोट: coelectroporations के लिए, डीएनए मिश्रण PBS में पतला pGFP के ०.५ μg/μL के साथ ब्याज की एक जीन एन्कोडिंग प्लाज्मिड के 1 μg/μL की अंतिम एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए तैयार है ।
  2. सभी आवश्यक उपकरणों और उपकरणों के साथ सर्जरी तालिका तैयार करें।
  3. माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग कर ग्लास केशिकाएं खींचें। केशिका के उस कटे हुए भाग को काटकर केशिका के व्यास को समायोजित करें जो पहले बताए गए41के अनुसार संदंश का उपयोग करके किया गया था .

2. सर्जरी के लिए फेरेट्स की तैयारी

  1. उल्टी के जोखिम को कम करने के लिए सर्जरी से पहले कम से कम 3 घंटे के लिए E33 उपवास पर भ्रूण के साथ गर्भवती जिल्स रखें।
  2. सर्जरी से पहले ऑटोक्लेविंग द्वारा सभी उपकरणों को निष्फल करें। संदूषण के संभावित स्रोतों को खत्म करने के लिए एसेप्टिक स्थितियों में एक विशेष रूप से सौंपे गए कमरे में सर्जरी करें।
  3. गर्भवती जिल को 4% आइसोफ्लुन के साथ नार्कोसिस बॉक्स में रखें।
  4. एनेस्थेट होने पर, फेरेट को हीट पैड के साथ ऑपरेशन टेबल पर रखें और नाक में लगातार 2-3% आइसोफ्लोरैन प्रवाह के साथ नार्कोसिस मास्क संलग्न करें। संज्ञाहरण के उचित स्तर को सुनिश्चित करने के लिए, निम्नलिखित सजगता की कमी की जांच करें:
    1. पेरिओक्यूरल त्वचा को छूकर पालपेब्रल पलटा
    2. दोनों पिछले अंगों के2 और3,या3 और 4 पैर की अंगुली के बीच त्वचा चुटकी द्वाराआनन-फानन पलटा
    3. यदि पालपेब्रल पलटा अनुपस्थित है और फ्लेक्सर पलटा स्पष्ट रूप से कम हो गया है, तो प्रत्येक हिंद अंग के एक पैर के पैर के पैर की अंगुली को चुटकी देकर दर्द पलटा की जांच करें।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो हृदय गति और लय की निगरानी के लिए हाथ में एक स्टेथोस्कोप होना सुनिश्चित करें।
  5. फेरेट को एनाल्जेसिक (मेटामिज़ोल का 0.1 मिलील, शरीर के वजन का 50 मिलीग्राम/किलो), एंटीबायोटिक (01 मिलीएमएल/किलोग्राम शरीर के वजन का 20 मिलीग्राम/किलो अमोक्सीसिलिन + क्लावुलानिक एसिड) और ग्लूकोज (5% ग्लूकोज समाधान का 10 मिलीएल) के साथ इंजेक्ट करें।
  6. सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान आंखों के निर्जलीकरण को रोकने के लिए आंखों पर आंखों के मरहम के घोल की एक बूंद रखें।
  7. शेवर का उपयोग करके फेरेट पेट को शेव करें।
  8. त्वचा को पानी और साबुन से साफ करें, पेट को 70% इथेनॉल स्क्रब से कीटाणुरहित करें, आयोडीन के साथ 2x कीटाणुरहित करें, और इसे सूखने दें।

3. फेरेट्स के गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में

  1. सुनिश्चित करें कि शल्य चिकित्सा क्षेत्र बाँझ है: बाँझ ऊतकों पर बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरण जगह है, और कोट और दस्ताने बदल जाते हैं।
  2. जानवर पर एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा रखें।
  3. एक स्केलपेल का उपयोग करके, शल्य चिकित्सा से ~ 5 सेमी लंबे कट के साथ लाइना अल्बा पर पेट खोलें।
  4. कैंची का उपयोग कर मांसपेशियों की परत काटें।
  5. चीरा साइट के चारों ओर धुंध झाड़ू रखें और उन्हें पीबीएस के साथ गीला करें। धुंध झाड़ू अतिरिक्त PBS कि सर्जरी के दौरान जोड़ा जाएगा अवशोषित करेगा ।
    नोट: सर्जरी के दौरान गर्मी और PBS समर्थन बनाए रखें ।
  6. फेरेट गर्भाशय का पर्दाफाश करें और इसे धुंध झाड़ू पर रखें।
  7. एक लंबे लोडिंग टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करके इंजेक्शन समाधान के साथ एक ग्लास केशिका लोड करें। सुनिश्चित करें कि लोडिंग मात्रा भ्रूण की संख्या और विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों की संख्या के आधार पर लगभग 5-20 माइक्रोन के बीच है। प्रति भ्रूण औसत इंजेक्शन मात्रा 3-5 माइक्रोन है। लोडेड ग्लास केशिका को धारक से अटैच करें और धारक के दूसरे पक्ष को एक ट्यूब और मुखपत्र से जोड़ें।
  8. पहले भ्रूण का निरीक्षण करें और सिर ढूंढें।
  9. दृश्य की सुविधा के लिए भ्रूण के सिर के बगल में फाइबर ऑप्टिक प्रकाश स्रोत रखें।
    नोट: फेरेट गर्भाशय की दीवारें बहुत अंधेरी होती हैं, और जब तक कि प्रकाश सीधे उन पर चमक नहीं जाता है, तब तक उनके माध्यम से देखना मुश्किल है।
  10. मस्तिष्क गोलार्द्धों में से एक के वेंट्रिकल में एक एकल इंट्रावेंट्रिकुलर इंजेक्शन करें और दूसरे गोलार्द्ध को आंतरिक नियंत्रण के रूप में काम करने के लिए बरकरार रखें। वेंट्रिकल खुद को आंखों से आसानी से अलग नहीं है, इसलिए इसका स्थान पिगमेंटेड आईरिस के स्थान के आधार पर अनुमानित है, जो दिखाई देता है। इंट्रावेंट्रिकुलर इंजेक्शन कांच के केशिका से जुड़े धारक को लेने और कांच के केशिका की नोक के साथ त्वचा, खोपड़ी और मस्तिष्क ऊतक को भेदने से किया जाता है।
    नोट: प्लेसेंटा को नुकसान न पहुंचाएं, जो मुरीन प्लेसेंटा की तुलना में गहरा है।
    1. जब ग्लास केशिका की नोक वेंट्रिकल में हो, तो ग्लास केशिका धारक से जुड़े मुखपत्र का उपयोग करके मुंह-पाइपिंग द्वारा इंजेक्शन समाधान के लगभग 3-5 माइक्रोन इंजेक्ट करें। क्योंकि इंजेक्शन समाधान 0.1% तेजी से हरे रंग की होते हैं, इंजेक्शन वेंट्रिकल अब गहरे हरे रंग की बारी होगी, और एक गुर्दे के आकार की संरचना के रूप में दिखाई देगा।
  11. चिमटी इलेक्ट्रोड को भ्रूण के सिर के ऊपर गर्भाशय पर रखें ताकि सकारात्मक ध्रुव को उस क्षेत्र के ऊपर रखा जाए जिसे लक्षित किया जाएगा और इंजेक्शन क्षेत्र के नीचे नकारात्मक ध्रुव।
  12. इलेक्ट्रोपोरेटर पर निम्नलिखित इलेक्ट्रोपॉरेशन की स्थिति निर्धारित करें: पल्स लंबाई = 50 एमएस; पल्स वोल्टेज = 100 V; पल्स अंतराल = 1 एस; दालों की संख्या = 5। इसके बाद इलेक्ट्रोपोरेटर पर'पल्स'बटन दबाएं।
  13. इलेक्ट्रोपोजेटेड भ्रूण पर गर्म 1x पीबीएस की कई बूंदों को जल्दी से छोड़ दें।
  14. सभी भ्रूण के लिए प्रक्रिया दोहराएं। गर्भाशय को गर्म पीबीएस से लगातार गीला रखें।
    नोट: यदि योनि का सामना करने वाले पहले भ्रूण आसानी से सुलभ नहीं हैं, तो उन्हें इलेक्ट्रोपाउरेट नहीं करना सबसे अच्छा है।
  15. जब सभी भ्रूण इलेक्ट्रोपेटेड हों, तो गर्भाशय को वापस पेरिटोनियल गुहा में रखें।
  16. 4-0 सीवन का उपयोग करके पेरिटोनम के साथ मांसपेशियों की परत को सीवन करें।
  17. एक ही मोटाई का उपयोग कर त्वचा सीवन और एल्यूमीनियम स्प्रे के साथ घाव स्प्रे।
  18. जानवर को पिंजरे में रखें और इसे गर्मी के स्रोत के साथ गर्म रखें। जानवर को तब तक सावधानी से मॉनिटर करें जब तक कि वह जाग न जाए।

4. डाकपरिचालक देखभाल और लक्षित जानवरों के आवास

  1. सर्जरी के बाद 3 दिनों के लिए यह सुनिश्चित करें कि जानवरों के बाद पश्चात देखभाल के दौर से गुजर रहे हैं: 20 मिलीग्राम/किलो amoxicillin (एंटीबायोटिक) 1x दैनिक; 25 मिलीग्राम/किलो मेटामिजॉल (एनाल्जेसिक) 3x रोजाना ।
  2. सुनिश्चित करें कि फेरेट्स व्यक्तिगत रूप से रखे गए हैं।
  3. सुनिश्चित करें कि फेरेट्स की जांच प्रतिदिन कम से कम 1x पशु चिकित्सा द्वारा की जाती है।
  4. सुनिश्चित करें कि फेरेट्स डिलीवरी के दौरान जितना संभव हो उतना कम परेशान हैं।
  5. पिल्ले को छुड़ाने या बलिदान करने के बाद, हिस्टेरेक्टॉमी के लिए जिल्स तैयार करें।

5. फेरेट्स का हिस्टेरेक्टोमी

नोट: एक हिस्टेरेक्टॉमी बलिदान जानवरों की संख्या को कम करने के लिए किया जाता है ताकि निष्फल जानवरों पालतू जानवर के रूप में गोद लेने के लिए दान किया जा सकता है । हिस्टेरेक्टॉमी के लिए प्रीसर्जिकल प्रक्रिया चरण 2 में समान है।

  1. शेव करें और फेरेट पेट को स्टरलाइज करें जैसा कि चरण 3.1 और 3.2 में वर्णित है।
  2. शल्य चिकित्सा से लाइना अल्बा पर पेट खोलें। मांसपेशियों की परत काटें। मांसपेशियों की परत को उठाएं और मांसपेशियों की परत को पूरी तरह से खोलते हुए एक उंगली से आंत को आश्रय दें।
  3. चीरा साइट के चारों ओर धुंध झाड़ू रखें और उन्हें बाँझ PBS के साथ गीला करें। फेरेट गर्भाशय और अंडाशय का पर्दाफाश करें और उन्हें धुंध झाड़ू पर रखें।
  4. एक तरफ हिस्टेरेक्टॉमी की शुरुआत धमनी ओवेरिका और वेना ओवेरिका कपाल को मेसोवावर से करके करें। लिगेशन के प्रत्येक पक्ष पर एक क्लैंप लगाएं और क्लैंप के लिए एक और लिगाशन कपाल प्रदर्शन करें। उन्हें बचाने के लिए लिगेशन के सिरों पर तीसरा क्लैंप संलग्न करें। दूसरी तरफ दोहराएं।
  5. क्लैंप के बीच कट और दोनों तरफ मेसेंट्री से कॉर्नुआ गर्भाशय को अलग करें।
  6. दोनों गर्भाशय पक्षों पर धमनी गर्भाशय को ओस्टियम गर्भाशय के लिए कौडल करें। इसके बाद योनि को लिगेट करें और लिगेचर को ठीक करें। उन्हें बचाने के लिए लिगेशन के सिरों पर क्लैंप संलग्न करें। लिगेचर के लिए दो क्लैंप कपाल रखो। क्लैंप के बीच काटें और योनि से गर्भाशय को अलग करें। गर्भाशय और अंडाशय को निकालें और उन्हें निपटाएं। गर्भाशय बट से अवशिष्ट म्यूकस झिल्ली को कुरेदें।
  7. शेष सभी क्लैंप को अलग करें और लिगेचर समाप्त होता है को छोटा करें। क्लैंप हटाने के बाद रक्तस्राव के लिए नियंत्रण सुनिश्चित करें।
  8. मांसपेशियों की परत और त्वचा के रूप में चरण 3.16 और 3.17 में वर्णित सीवन। चरण 3.18 और 4.1-4.3 के रूप में पश्चात प्रोटोकॉल का पालन करें। नियमित पशु चिकित्सा यात्राओं के साथ पशुओं को कम से कम 2 सप्ताह तक जानवरों की सुविधा में रखें। जानवरों के पूरी तरह ठीक होने के बाद उन्हें गोद लेने के लिए दान किया जा सकता है।

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Representative Results

E33 में फेरेट्स के गर्भाशय इलेक्ट्रोपंट्रेशन में भ्रूणीय नियोकॉर्टेक्स(चित्र 1)की वेंट्रिकुलर सतह को अस्तर करने वाली तंत्रिका जनक कोशिकाओं को लक्षित किया गया। इन कोशिकाओं को एपिकल प्रोजेनिटर कहा जाता है और यह अत्यधिक प्रसारात्मक होते हैं, जो विकास के दौरान अन्य सभी कोशिका प्रकारों को जन्म देते हैं। असममित विभाजन पर, एपिकल जनक ने एक और एपिकल प्रोजेनिटर और एक अधिक विभेदित कोशिका उत्पन्न की, आमतौर पर एक बेसल प्रोजेनिटर (बीपी), जो वेंट्रिकुलर सतह से कम होता है। बीपीएस माध्यमिक अंकुरित क्षेत्र, एसवीजेड में चले गए । जब इलेक्ट्रोपाउशन E33 पर किया गया था, कई नवजात बीपीएस एसवीजेड के बेसल-अधिकांश भाग में चले गए, जहां उन्होंने OSVZ22का गठन किया।

जब इलेक्ट्रोपॉशन के प्रभाव की जांच 4 दिन बाद E37 में की गई, तो अधिकांश लक्षित कोशिकाएं और उनकी संतान अभी भी अंकुरित क्षेत्रों (वीजेड, आईएसवीजेड और ओएसवीजेड) में थे, चित्रा 2Aदेखें) और कोशिकाएं शायद ही कभी कॉर्टिकल प्लेट (सीपी) में आगे मौजूद थीं। लक्षित कोशिकाओं की संतान मुख्य रूप से तंत्रिका जनक प्रकार और नवजात न्यूरॉन्स शामिल थे। प्लंजेनिटर पहचान की जांच साइकिलिंग कोशिकाओं के मार्कर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा की जा सकती है, जैसे पीसीएनए26 (चित्रा 2 बी, सी),जबकि माइटोसिस से गुजरने वाले जनकों का एक सबसेट फॉस्फोथस्टोन 3 (पीएच 3)21 (चित्रा 2D)जैसे मार्कर द्वारा दिखाया जा सकता है।

इलेक्ट्रोपाउशन के 8 दिन बाद पी0 में, लक्षित कोशिकाओं की संतान सभी हिस्टोलॉजिकल परतों(चित्र 3 ए, बी)में फैल गई। इस स्तर पर, बीपीएस विशेष रूप से प्रचुर मात्रा में थे और BRG आसानी से पहचाने जाते थे । ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर मार्कर के संयोजन का उपयोग करके, विभिन्न बीपी आबादी का पता चला जा सकता है। Sox2 उत्पादक जनक कोशिकाओं का एक मार्कर है, जिसमें bRG26शामिल है । टीबीआर2 न्यूरोजेनिक बीपी का एक मार्कर है, जो मुख्य रूप से मध्यवर्तीजनक 26 (चित्रा 3 बी)हैं। क्योंकि भ्रूण को प्लाज्मिड एन्कोडिंग जीएफपी के साथ सह-इलेक्ट्रोपेटेड किया गया था, इसलिए जीएफपी सिग्नल को ट्रैक करके तंत्रिका जनकों की आकृति विज्ञान की जांच की जा सकती थी। यह बीपीएस के संदर्भ में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जो दो प्रमुख मॉर्फोटाइप में आते हैं: बहुध्रुवीय कोशिकाएं, जो काफी हद तक मध्यवर्ती जनक हैं, और रेडियल कोशिकाएं, जो BRG21हैं। इसलिए, ओएसवीजेड में रेडियल सेल सोक्स2+ टीबीआर 2- BRG26का अध्ययन करने के लिए ब्याज की प्रमुख सेल आबादी हैं।

P16 तक, लक्षित कोशिकाओं के बहुमत को विभाजित करना बंद कर दिया और न्यूरॉन्स और ग्लिया में विभेदित । इसलिए, इन सेल प्रकारों को इस स्तर पर सबसे अच्छी तरह से जांचा जाता है। विभिन्न न्यूरोनल और ग्लियल उपप्रकारों के अलावा, फेरेट पी 16 नियोकॉर्टेक्स ने फोल्डिंग(चित्र 3 सी)की विशेषताओं के पैटर्न का प्रदर्शन किया। इस स्तर पर अधिकांश प्रमुख जायरी और सल्सी पहले से ही मौजूद थे और भावी मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान की जा सकतीहै। फेरेट मस्तिष्क P16 के बाद परिपक्व हो रहा है, जब myelination और synaptogenesis जैसी प्रक्रियाएं होती हैं।

Figure 1
चित्र 1: फेरेट नियोकॉर्टेक्स के यूटेरो इलेक्ट्रोपॉर्मेशन में तंत्रिका कोशिकाओं को लक्षित करना। E33 में फेरेट नियोकॉर्टेक्स के गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉर्मेशन में एपिकल प्रोजेनिटर्स को लक्षित किया गया। विकास के दौरान ये कोशिकाएं अन्य सभी कोशिका प्रकारों को जन्म देती हैं। बेसल जनकों को बाद में भ्रूण (E37) और प्रसवकालीन (P0) चरणों में सबसे अच्छा अध्ययन किया गया। न्यूरॉन्स सबसे अच्छा इस तरह के P16 के रूप में प्रसवोत्तर चरणों में अध्ययन किया गया । कॉर्टिकल परतें: वीजेड = वेंट्रिकुलर जोन; आईएसवीजेड = इनर सबवेंट्रिकुलर जोन; ओएसवीजेड = बाहरी सबवेंट्रिकुलर जोन; IZ = मध्यवर्ती क्षेत्र; सीपी = कॉर्टिकल प्लेट; जीजेड = अंकुरित क्षेत्र (वीजेड+ एसवीजेड); WM = सफेद पदार्थ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: E33 पर यूटरो इलेक्ट्रोपॉशन के बाद E37 फेरेट नियोकॉर्टेक्स का उदाहरण। (E37 फेरेट नियोकॉर्टेक्स काए और बी)सेक्शन; इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं (जीएफपी) की हरी, संतान; नीला(ए)सेल न्यूक्लियी (DAPI); मजेंटा(बी),साइक्लिंग सेल (पीसीएनए) । बॉक्स (चौड़ाई = 777 माइक्रोन)(सी)में उच्च आवर्धन पर दिखाए गए क्षेत्र को इंगित करता है। स्केल बार = 1 मिमी। कॉन्ट्रालेटरल (गैर-विद्युतीकृत गोलार्द्ध) में जीएफपी सिग्नल की कमी पर ध्यान दें, जो आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। (सी और डी)लक्षित क्षेत्र के उच्च आवर्धन; इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं (जीएफपी) की हरी, संतान; मजेंटा(सी),साइकिलिंग सेल (पीसीएनए); लाल(डी),माइटोटिक कोशिकाएं (फॉस्फोहिस्टोन 3, पीएच 3)। ध्यान दें कि लक्षित कोशिकाओं की संतान का बहुमत इस स्तर पर एसवीजेड में था। चित्रा 1के रूप में कॉर्टिकल परतें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: E33 में यूटरो इलेक्ट्रोपॉशन के बाद पी0 और पी 16 फेरेट नियोकॉर्टेक्स के उदाहरण। (पी0 फेरेट नियोकॉर्टेक्स काए और बी)सेक्शन; इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं (जीएफपी) की हरी, संतान; नीला(ए)सेल न्यूक्लियी (DAPI); सियान(B),Sox2; मजेंटा(B),Tbr2.(B)इलेक्ट्रोपोरेटेड क्षेत्र का उच्च आवर्धन। स्केल बार = 1 मिमी(ए),100 माइक्रोन(बी)। चित्रा 1के रूप में कॉर्टिकल परतें । (ग)P16 फेरेट नियोकॉर्टेक्स का खंड; इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं (जीएफपी) की हरी, संतान; ग्रे, सेल न्यूक्लियी (DAPI); मजेंटा, एस्ट्रोसाइट्स (जीएफएपी)। स्केल बार = 1 मिमी। इस आंकड़े को कालेबिक एट अल25से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

फेरेट में गर्भाशय इलेक्ट्रोपोशन में एक महत्वपूर्ण तकनीक है, जिसमें अन्य तरीकों के संबंध में फायदे और नुकसान हैं। इस विधि के लिए महत्वपूर्ण कदम और सीमाएं हैं, साथ ही संभावित संशोधन और भविष्य के अनुप्रयोगों को ध्यान में रखना है।

चूंकि विक्टर बोरेल और उनके सहयोगियों के मुख्य चिकित्सा कार्य के बाद से इलेक्ट्रोपॉनेशन,या वायरल इंजेक्शन35,42,43के माध्यम से पोस्टनेटल फेरेट नियोकॉर्टेक्स के आनुवंशिक हेरफेर पर, फेरेट एक आनुवंशिक रूप से सुलभ मॉडल जीव बन गया है।, गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉन्यूशन19,,20 में भ्रूणीय विकास के दौरान आनुवंशिक हेरफेर की स्थापना ने पहले के विकासात्मक चरणों में तंत्रिका जनक कोशिकाओं को लक्षित करने की अनुमति देकर नए अनुसंधान संभावनाओं को खोला। प्रसवोत्तर हेरफेर की तुलना में, गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉर्जेशन में नियोकॉर्टेक्स के बड़े क्षेत्रों और कम विभेदित तंत्रिका जनकों को लक्षित करने में सक्षम बनाता है जो क्रमिक रूप से अन्य सभी सेल प्रकार के नियोकॉर्टेक्स उत्पन्न करते हैं। महत्वपूर्ण बात, वायरल लक्ष्यीकरण की तुलना में, गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन में लक्ष्यीकरण की स्थानिक परिशुद्धता के लिए अनुमति देता है।

विधि का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा सर्जरी ही है। फेरेट नियोकॉर्टेक्स के गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉनेशन में चूहों में प्रक्रिया की तुलना में काफी जटिल और मुश्किल है। गर्भाशय की दीवारें गहरे रंग की होती हैं, और भ्रूण को अलग करना अधिक कठिन होता है। इसके अतिरिक्त, वयस्क फेरेट्स में अधिक पशुपालन और पशु चिकित्सा आवश्यकताएं होती हैं। विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण पिल्ले के जन्म के आसपास की अवधि है। फेरेट्स उस अवधि में बहुत संवेदनशील होते हैं और अनावश्यक रूप से परेशान नहीं होते हैं। दृष्टिकोण की प्रमुख सीमाएं स्वयं लक्ष्यीकरण की दक्षता से संबंधित हैं। गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉन्स्ट्रेशन में हमेशा तंत्रिका जनकों की पच्चीकारी को लक्षित करने का परिणाम होता है। यह तंत्रिका जनक या न्यूरॉन्स के सेल जैविक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए आदर्श है, लेकिन यह बड़े हिस्टोलॉजिकल और शारीरिक क्षोभ पैदा करने के लिए उप-अनुकूल है, जैसे कि नियोकॉर्टिकल फोल्डिंग में बदलाव। यदि यह आवश्यक है, तो सबसे अच्छा तरीका प्रक्रिया के दौरान रोस्ट्रोकाउडल अक्ष के साथ इलेक्ट्रोड को स्थानांतरित करना है ताकि नियोकॉर्टेक्स के बड़े हिस्से को कवर किया जा सके। हालांकि, पूरे अंग विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा तरीका जिगोट चरण44से शुरू होने वाले ट्रांसजेनिक फेरेट्स का उत्पादन है।

भ्रूणीय चरण जिस पर गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन (E33) किया गया था बेसल जनकों का अध्ययन करने के लिए आदर्श है। दरअसल , इस स्तर पर इलेक्ट्रोपॉज और वायरल टार्गेटिंग को ओएसवीजेड22 की शुरुआत के समय के साथ - साथ बेसल जनकों की विभिन्न कोशिका जैविक विशेषताओं को प्रकट करने के लिए लागू किया गया है जो उनकी आकृति विज्ञान और प्रसार21,25, 26,26के लिए प्रासंगिक है ।, हालांकि, एक अध्ययन के वैज्ञानिक उद्देश्य के आधार पर, इलेक्ट्रोपाउशन के समय को आसानी से विधि19,,20में महत्वपूर्ण संशोधनों के बिना बदला जा सकता है। लौकिक विशिष्टता के अलावा, गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउरेशन में स्थानिक विशिष्टता के आसान संशोधनों के लिए अनुमति देता है। रोस्ट्रोकॉडल एक्सिस के साथ रोमेमेडियल स्थिति में शयनागार नियोकॉर्टेक्स को लक्षित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप मोटर और सोमाटोसेंसरी क्षेत्रों की लेबलिंग हुई। इलेक्ट्रोड के प्लेसमेंट और विद्युत क्षेत्र की दिशा को समायोजित करके अन्य नियोकॉर्टिकल क्षेत्रों को भी लक्षित किया जा सकता है। माउस में, मध्य नियोकॉर्टेक्स45 और वेंट्रल टेलेंसेफलन46 को गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉशन में उपयोग करने का लक्ष्य रखा गया है, जिससे यह सुझाव दिया गया है कि इसी तरह के दृष्टिकोणों का उपयोग फेरेट्स में किया जा सकता है।

अंत में, गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉनेशन में आसानी से सबसे हाल के जीनोम और एपिजेनोम,संपादनतकनीकों 13,14,16,,25के साथ जोड़ा जा सकता है, जहां CRISPR/(d) Cas9 घटकों को प्लाज्मिड के रूप में या पुनर्संयोजन Cas9 प्रोटीन के एक परिसर के रूप में वितरित किया जा सकता है और आरएनए14का मार्गदर्शन किया जा सकता है, बाद में जीनोम संपादन के लिए आवश्यक समय को छोटा करने के साथ जगह लेने के लिए ।, यह संभावना है कि जीनोम संपादन में और तकनीकी सुधार ों को चूहों और फेरेट्स दोनों में गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉशन में जोड़ा जाएगा ताकि सामान्य मस्तिष्क विकास को समझने के लिए और विशेष रूप से मानव रोग स्थितियों को मॉडल करने के लिए महत्वपूर्ण सटीक जीनोमिक उत्परिवर्तन उत्पन्न किया जा सके। इस संदर्भ में, गर्भाशय इलेक्ट्रोप्यूशन में तेजी से बाद के विभिन्न एकल कोशिका ओमिक्स दृष्टिकोण और लाइव इमेजिंग के लिए पसंद की लक्ष्यीकरण विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है ताकि लक्षित कोशिकाओं और उनकी संतान के आणविक हस्ताक्षर और गतिशील व्यवहार को समझा जा सके।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट समर्थन प्रदान करने के लिए मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ मॉलिक्यूलर सेल बायोलॉजी एंड जेनेटिक्स की सेवाओं और सुविधाओं के आभारी हैं, विशेष रूप से फेरेट्स और जे पेइचल के उत्कृष्ट पालन के लिए बायोमेडिकल सर्विसेज (बीएमएस) की पूरी टीम और लाइट माइक्रोस्कोपी सुविधा की उनकी टीम। हम विशेष रूप से असाधारण पशु चिकित्सा समर्थन और फेरेट सर्जरी के साथ सहायता के लिए Huttner समूह से Lei Xing के लिए बीएमएस से Katrin Reppe और अंना Pfeffer के लिए आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1ml syringe BD 309628 Electroporation
4-0 Vicryl suture Ethicon V392ZG Surgery
Aluminium spray cp-pharma 98017 Surgery
Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) WDT 6301 Surgery
Cappilary holder WPI MPH6S12 Electroporation
Dexpanthenol Ointment solution Bayer 6029009.00.00 Surgery
Drape sheet 45x75cm Hartmann 2513052 Surgery
Electrode Tweezer, platinum plated 5mm BTX 45-0489 Electroporation
Electroporator BTX ECM830 Electroporation
Fast Green Sigma F7258-25G Electroporation
Ferret Mustela putorius furo Marshall NA Experimental organism
Fiber optic light source Olympus KL1500LCD Electroporation
Forceps Allgaier instrumente 08-033-130 Surgery
Forceps 3C-SA Rubis Tech 3C-SA Surgery
Forceps 55 Dumostar 11295-51 Surgery
Forceps 5-SA Rubis Tech 5-SA Surgery
Gauze swabs large Hartmann 401723 Surgery
Gauze swabs small Hartmann 401721 Surgery
GFAP antibody Dako Z0334 Antibody
GFP antibody Aves labs GFP1020 Antibody
Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) Sutter Instrument BF120-69-10 Electroporation
Glucose Bela-pharm K4011-02 Surgery
Heat pad Hans Dinslage Sanitas SHK18 Surgery
Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) Meda 997437 Surgery
Isofluran CP 21311 Surgery
Loading tips 20µl Eppendorf #5242 956.003 Electroporation
Metamizol WDT 99012 Surgery
Metzenbaum dissecting scissors Aesculap BC600R Surgery
Micropipette puller Sutter Instrument Model P-97 Electroporation
pCAGGS-GFP NA NA From Kalebic et al., eLife, 2018
PCNA antibody Millipore CBL407 Antibody
pH3 antibody Abcam ab10543 Antibody
Scalpel Aesculap 294200104 Surgery
Shaver Braun EP100 Surgery
Sox2 antibody R+D Systems AF2018 Antibody
Surgical clamp 13cm WDT 27080 Surgery
Surgical double spoon (Williger) WDT 27232 Surgery
Surgical drape WDT 28800 Surgery
Surgical scissors small FST 14090-09 Surgery
Suturing needle holder Aesculap BM149R Surgery
Tbr2 antibody Abcam ab23345 Antibody
Transfer pipette 3ml Fischer scientific 13439108 Surgery
Water bath Julabo TW2 Surgery

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 159 गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉरेशन फेरेट नियोकॉर्टेक्स विकास तंत्रिका जनक कोशिकाओं आनुवंशिक हेरफेर में वीवो में
यूटेरो इलेक्ट्रोपॉनेशन द्वारा फेरेट नियोकॉर्टे में न्यूरल प्रोजेनिटर कोशिकाओं को लक्षित करने में वीवो में
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Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (159), e61171, doi:10.3791/61171 (2020).

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