Summary
여기에 제시된 자궁 전기화에서 사용하는 배아 페렛 뇌에서 유전자 조작을 수행하는 프로토콜이 있다. 이 방법은 생체 내의 신피질에서 신경 전구 세포를 표적으로 하는 것을 허용합니다.
Abstract
배아 발달 중 생체 내에서 유전자 발현의 조작은 포유류 발달 중 개별 유전자의 역할을 분석할 때 선택하는 방법입니다. 자궁에서 전기화는 생체 내에서 배아 포유류 뇌에서 유전자 발현의 조작을 위한 핵심 기술이다. 페렛의 배아 신피질의 자궁 전포화, 작은 육식 생물에 대한 프로토콜이 여기에 제시된다. 페렛은 신피질 발달을 위한 모델로 점점 더 이용되고 있습니다, 그것의 신피질은 인간과 비인간적인 영장류에 또한 존재하는 해부학, 조직학, 세포 및 분자 특징의 시리즈를 전시하기 때문에, 마우스 또는 쥐와 같은 설치류 모형에 없습니다. 자궁에서 전기기는 배아일(E) 33, 페렛의 중증 신경 발생 단계에서 수행되었다. 자궁 전기기는 뇌의 측면 심실을 안감 신경 전구 세포를 대상으로합니다. 신경 발생 하는 동안, 이러한 전조 세포 다른 모든 신경 세포 유형을 발생. 본 작품은 E37, 산후일(P) 1 및 P16에서 의대표적인 결과 및 분석을 나타내며, 자궁 전기기화에서 각각 4, 9, 24일에 대응하는 것을 나타낸다. 초기 단계에서, 표적으로 한 세포의 자손은 각종 신경 선조 아형의 주로 이루어져 있는 반면, 나중에 대부분의 표지된 세포는 포스트 미토틱 뉴런입니다. 따라서, 자궁 에서 전기화는 다양한 유형의 신경 세포의 세포 및 분자 특징에 대한 유전 조작의 효과에 대한 연구를 가능하게한다. 다양한 세포 집단에 미치는 영향을 통해 자궁 전기 기화에서도 페렛 신피질의 조직학적 및 해부학적 특징을 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 이러한 모든 효과 급성 및 사용자에 의해 결정 된 지 각 측성 특이성으로 수행.
Introduction
신피질은 포유류 뇌의 외부 시트와 더 높은 인지 기능1,,2,,3,,4,,5의시트이다. 배아 발달 중 생체 내에서 포유류 신피질에서 급성 유전적 조작을 달성하기 위해 바이러스 감염6 및 자궁전기기전7의두 가지 방법이 탐구되었다. 두 방법 모두 신구 세포의 효율적인 타겟팅을 허용하지만 몇 가지 제한으로 고통받습니다. 바이러스 감염에 비해 자궁 전기 포기의 주요 장점은 전기장의 방향을 조절하여 달성되는 신피질 내의 공간 특이성을 달성 할 수있는 능력입니다.
전기기는 시험관내 8에서세포로 DNA의 입력을 용이하게 하기 위해 처음 표시되었기 때문에, 생체 내에서 다양한 척추동물로 DNA를 전달하기 위해 적용되었다. 발달 신경과학에서, 마우스 신피질의 자궁 전기포기에서 2001년9,,10에서처음 보고되었다. 이 방법은 배아 뇌의 측면 심실에 DNA 혼합물을 주입하고 공간 정밀도7,,11을허용하는 트위저 전극을 사용하여 전기장의 후속 적용으로 구성된다. 자궁에서 전기화는 마우스 신피질에 내인성 또는 외토적으로 추가된 유전자의 발현을 조작하기 위해 핵산을 전달하기 위해 적용되었다. 중요한 진전은 최근에 마우스 신피질에서 자궁 전기화에서 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집의 방법론을 적용하여 (1) 후미토성뉴런(12,,13 및 신경 전구 세포14)및 (2) 게놈15 및 후성 유전체16 편집에서 유전자 중단을 수행하였다.
마우스에서 첫 번째 보고 후 곧, 자궁 에서 전기기화배쥐신피질(17,18)에18적용되었다. 비 설치류는 2012년19일,20일,20일, 작은 육식신페레의 자궁 전기기화에서 최초로 보고되기 전까지는어려움을유지했다. 그,이후, 페렛의 자궁 전기포기는 신경 전구및 뉴런(20,21,,22,,23)을라벨링하여 신피질 개발의 메커니즘을 연구하기 위해 적용되었으며, CRISPR/Cas9기술(24)의사용을 포함한 내인성 유전자의 발현을 조작하고, 자궁 내피유전자(21,22, 25)및 자궁내피유전자 를2121,22,25,인간 유전자를 전달함으로써26.26 더욱이, 페렛의 자궁 전기포공은 병리학적조건(27,,28)에서인간 신피질 발달의 특징을 해결하기 위해 사용되어 왔다.
신피질 발달의 맥락에서, 페렛을 마우스에 비해 모델 유기체로 사용하는 장점은 페렛이 인간과 같은 일련의 특징을 더 잘 재구성하기 때문입니다. 해부학 적 수준에서, 페렛은 인간및 대부분의 다른 영장류에도 존재하지만, 쥐 또는쥐에완전히 결석피질 접이식의 특징적인 패턴을 나타낸다4,29,,30,,31. 조직학적 수준에서 페렛은 내부 및 외부 지하 영역(ISVZ 및 OSVZ)으로 지칭되는 두 개의 뚜렷한 심실 발아 영역을 가지며,32,,33,내부섬유층(23)에의해 분리된다. 이러한 특징은 또한 인간을 포함하여 영장류와 공유되지만 마우스(34)는공유되지 않습니다. 페렛과 인간에서 ISVZ와 OSVZ는 풍부한 신경 전구 세포로 채워지며, 마우스의 하위 원반 영역 (SVZ)은 스파스 신경전구만 포함하는반면,32,,35,,36. 세포 수준에서, 페렛은,포유류 신피질34,,37,38의진화적 확장을 위한 도구로 간주되는 기저 또는 외부 방사형 glia(bRG 또는 oRG)라고 불리는 신경 전구체의 하위 형의 높은 비율을 나타낸다. bRG는 태아 인간 및 배아 페렛 신피질에서 이렇게 높게 풍부하지만 배아 마우스신피질(35,,36)에서는매우 드물다. 더욱이, 페렛 bRG는 마우스bRG(21)보다훨씬 우수한 인간 bRG와 유사한 형태학적 이질성을 나타낸다. 마지막으로, 분자 수준에서, 페렛 네오피질개발은 피질 접이식의 발달을 조절할 것으로 추정되는 태아 인간 신피질의 유전자 발현 패턴을 매우 유사하다는 것을나타낸다( 39).
페렛 bRG의 세포 생물학적 및 분자 특성은 인간 bRG와 유사한 매우 증식성 렌더링합니다. 이것은 확장되고 매우 복잡한 신피질34의뉴런 생산 및 개발의 증가 생산 결과. 이러한 특성은 페렛이마우스(26,,40)에서모델링할 수 없는 신피질 발달의 인간과 같은 특징을 연구하기 위한 우수한 모델 유기체를 만든다. 페렛을 모델 유기체로서 최대한 활용하기 위해 제시된 방법이 개발되었다. 그것은 유비쿼터스 프로모터, CAG의 통제하에 GFP (pGFP)를 표현하는 플라스미드를 가진 E33 페렛 배아의 자궁 전기화로 이루어져 있습니다. 전극배는 배아 또는 후산적으로 분석될 수 있다. 희생된 동물의 수를 줄이기 위해 여성 페렛(질)은 자군 절제술에 의해 살균되어 애완동물로 입양하도록 기부됩니다. 표적 배아가 배아 단계에서 수확되는 경우, 두 번째 수술이 수행되고 태아는 제왕 절개에 의해 제거되는 반면 질은 히스테리화됩니다. 표적 배아가 산후 단계에서 분석되는 경우, 새끼가 짜거나 희생된 후 질은 히스테리화됩니다. 따라서, 질의 자군 절제술에 대한 프로토콜도 제시된다.
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Protocol
모든 실험 절차는 Landesdirektion Sachsen (라이센스 TVV 2/2015 및 TVV 21/2017)의 승인 후 독일 동물 복지 법규와 합의하여 수행되었습니다.
1. 자궁 전기 기화 준비
- DNA 혼합물을 준비합니다. 이 프로토콜에서 pGFP의 1 μg/μL의 최종 농도가 사용된다. PBS에 DNA를 용해하고 시각화를 용이하게하기 위해 0.1 % 빠른 녹색으로 보충하십시오. 일단 준비되면, 위아래로 여러 번 피펫또는 손가락 두드리는하여 DNA 혼합물을 혼합. 사용 전까지 실온에 보관하십시오.
참고: coelectroporations의 경우, DNA 혼합물은 PBS에서 희석된 pGFP의 0.5 μg/μL과 함께 관심 유전자를 코딩하는 플라스미드의 1 μg/μL의 최종 농도를 포함하도록 제조된다. - 필요한 모든 도구와 악기로 수술 테이블을 준비하십시오.
- 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세 혈관을 당깁니다. 모세관팁의 직경을 조절하여 이전에 설명된41과같이 집게를 사용하여 모세관의 탈부를 차단한다.
2. 수술을 위한 페렛 준비
- 구토의 리스크를 감소시키기 위하여 수술 의 앞에 적어도 3 시간 단식에 E33 단식에서 태아를 가진 임신한 질을 유지하십시오.
- 수술 전에 자동 으로 모든 도구를 살균. 오염의 잠재적인 근원을 제거하기 위하여 무균 조건에서 특별히 할당된 방에서 수술을 수행하십시오.
- 임신 한 질을 나르코시스 상자에 4 %의 이소플루란으로 놓습니다.
- 마취시, 열 패드와 수술 테이블에 페렛을 배치하고 코에 일정한 2-3 %의 이소플루란 흐름과 함께 나르코스 마스크를 부착. 마취의 적절한 수준을 확인하려면 다음 반사 신경의 부족을 확인하십시오.
- 백리오안 피부를 만져 서 팔페브랄 반사
- 2nd와 3rd사이 피부를 꼬집는 굴곡 반사, 또는 두 뒷다리의 3rd 와 4번째 발가락
- 팔페브랄 반사가 결석하고 굴곡 반사가 명확하게 감소되면 각 뒷다리의 발가락을 하나씩 꼬집어 통증 반사를 확인하십시오.
참고: 필요한 경우 심박수와 리듬을 모니터링하기 위해 청진기를 손에 들고 있어야 합니다.
- 페렛을 진통제(메타미졸 0.1mL, 체중 50 mg/kg), 항생제(아모시실린+클라불란산 20 mg/kg의 체중 0.1mL/kg), 포도당(5% 포도당 용액 10mL)으로 피하한다.
- 수술 시 눈 탈수를 방지하기 위해 눈 연고 용액을 눈에 떨어 뜨립니다.
- 면도기로 페렛 배를 면도합니다.
- 물과 비누로 피부를 청소하고, 70% 에탄올 스크럽으로 배를 소독하고, 요오드로 2배를 소독하고, 건조시키십시오.
3. 페렛의 자궁 전기화
- 수술 부위가 멸균되었는지 확인하십시오 : 멸균 조직에 멸균 수술 도구를 배치하고 외투와 장갑을 교체하십시오.
- 동물에 멸균 수술 커튼을 놓습니다.
- 메스를 사용하여 ~ 5cm 길이의 컷으로 리나 알바에서 배를 수술로 엽니다.
- 가위를 사용하여 근육 층을 잘라.
- 절개 부위 주위에 거즈 면봉을 놓고 PBS로 적시하십시오. 거즈 면봉은 수술 중에 추가 될 추가 PBS를 흡수합니다.
참고: 수술 내내 열 및 PBS 지원을 유지합니다. - 페렛 자궁을 노출하고 거즈 면봉에 놓습니다.
- 긴 로딩 팁이 있는 파이펫을 사용하여 주입 용액으로 유리 모세관을 적재합니다. 배아 의 수와 다른 실험 조건의 수에 따라 적재 부피가 약 5-20 μL 사이인지 확인합니다. 배아당 평균 주입량은 3-5 μL입니다. 로드된 유리 모세관을 홀더에 부착하고 홀더의 반대편을 튜브와 마우스피스에 연결한다.
- 첫 번째 배아를 검사하고 머리를 찾습니다.
- 광섬유 광원을 배아의 머리 옆에 놓아 시각화를 용이하게 합니다.
참고 : 페렛 자궁 벽은 매우 어둡고, 빛이 그들에 직접 빛나지 않는 한 그들을 통해 볼 어렵다. - 대뇌 반구 중 하나의 심실에 단일 심폐 소실 주입을 수행하고 내부 제어 역할을 하기 위해 다른 반구를 그대로 유지합니다. 심실 자체는 눈에 의해 쉽게 구별되지 않으므로 그 위치는 눈에 보이는 색소 홍채의 위치에 따라 추정됩니다. 정맥 내 주사는 유리 모세 혈관에 부착 된 홀더를 복용하고 유리 모세관의 끝으로 피부, 두개골 및 뇌 조직을 관통하여 수행됩니다.
참고: 뮤린 태반보다 어두운 태반을 손상시키지 않도록 하십시오.- 유리 모세혈관의 끝이 심실에 있을 때, 유리 모세관 홀더에 연결된 마우스피스를 사용하여 구강 배피팅을 통해 주입 용액의 약 3-5 μL을 주입한다. 주입된 용액에는 0.1% 패스트 그린이 포함되어 있기 때문에 주입된 심실은 이제 짙은 녹색으로 변하고 신장 모양의 구조로 볼 수 있습니다.
- 트위저 전극을 배아의 머리 위에 두어 양성 극이 표적화될 영역 위에 배치되도록 하고 주입된 영역 아래에 음극을 배치합니다.
- 전기포레이터에 다음 전기기전 조건을 설정: 펄스 길이 = 50 ms; 펄스 전압 = 100 V; 펄스 간격 = 1 s; 펄스 수 = 5. 그런 다음 전기 포레이터의"펄스"버튼을 누릅니다.
- 전자화 된 배아에 따뜻한 1x PBS의 여러 방울을 신속하게 떨어 뜨립니다.
- 모든 배아에 대한 절차를 반복합니다. 자궁은 따뜻한 PBS로 지속적으로 젖어 두십시오.
참고: 질을 마주보고 있는 첫번째 태아가 쉽게 접근하지 않는 경우에, 그(것)들을 전기화하지 않는 것이 최선입니다. - 모든 배아가 전소되면 자궁을 복막 구멍에 다시 넣습니다.
- 4-0 봉합사를 사용하여 회합으로 근육 층을 봉합합니다.
- 동일한 두께를 사용하여 피부를 봉합하고 알루미늄 스프레이로 상처를 분사하십시오.
- 동물을 케이지에 넣고 열원으로 따뜻하게 유지합니다. 동물이 깨어날 때까지 조심스럽게 모니터링합니다.
4. 수술 후 치료 및 대상 동물의 주택
- 수술 후 3 일 동안 동물이 수술 후 치료를 받고 있는지 확인 : 20 mg / kg 아목시실린 (항생제) 매일 1 배; 25 mg/ kg 메타미졸 (진통제) 3 배 매일.
- 페렛이 개별적으로 보관되어 있는지 확인합니다.
- 페렛은 하루에 적어도 1배 의수에 의해 검사되는지 확인합니다.
- 페렛이 배달 중에 가능한 한 적게 방해되는지 확인합니다.
- 새끼가 짜거나 희생된 후, 자군 절제술을 위해 질을 준비한다.
5. 페렛의 자군 절제술
참고: 살균된 동물을 애완동물로 입양하기 위해 기증할 수 있도록 희생된 동물의 수를 줄이기 위해 자군 절제술이 수행됩니다. 자군 절제술을 위한 외과 전 절차는 2단계에서와 동일합니다.
- 3.1 및 3.2 단계에 설명된 바와 같이 페렛 배를 면도하고 살균한다.
- 외과적으로 라인나 알바에서 배를 엽니다. 근육 층을 잘라. 근육 층을 들어 올리고 근육 층을 완전히 열면서 손가락으로 용기를 보호하십시오.
- 절개 부위 주위에 거즈 면봉을 놓고 멸균 PBS로 적시하십시오. 페렛 자궁과 난소를 노출하고 거즈 면봉에 놓습니다.
- 아르테리아 바리카와 베나 바바리카 두개골을 메소바르에 리칭하여 한쪽에서 자군 절제술을 시작합니다. 결찰의 각 측면에 클램프를 넣고 클램프에 또 다른 결찰 두개골을 수행합니다. 세 번째 클램프를 결찰 끝에 부착하여 저장합니다. 다른 쪽에서 반복합니다.
- 클램프 사이를 잘라 양쪽의 장간에서 각막 자궁을 분리합니다.
- 두 자궁 에 arteria uterina를 타륨 자궁 자궁에 코달을 리게이트. 그런 다음 질을 리게이트하고 합자를 수정합니다. 클램프를 결찰 끝에 부착하여 저장합니다. 합자에 두 개의 클램프 두개골을 넣습니다. 클램프 사이를 잘라 질에서 자궁을 분리. 자궁과 난소를 제거하고 폐기하십시오. 자궁 엉덩이에서 잔류 점막을 긁어.
- 나머지 클램프를 모두 분리하고 합자 끝을 줄입니다. 클램프를 제거한 후 출혈을 제어해야 합니다.
- 3.16 및 3.17 단계에 설명된 바와 같이 근육 층과 피부를 봉합합니다. 3.18 및 4.1-4.3 단계와 같이 수술 후 프로토콜을 따르십시오. 동물 시설에 동물을 정기적으로 수의방문으로 2주 이상 보관하십시오. 동물이 완전히 회복되면 입양을 위해 기증 할 수 있습니다.
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Representative Results
E33에서 페렛의 자궁 전기포공에서 배아 네오피질의 심실 표면을 일렬로 세우는 신경 전구 세포의 표적화(도1). 이 세포는 apical 선조에게 불리고 발달 도중 그밖 모든 세포 모형을 초래하는 높게 증식합니다. 비대칭 분열시, apical 전구는 또 다른 정포 선조와 더 분화된 세포, 일반적으로 심실 표면에서 분리된 기저 선조(BP)를 생성했습니다. BP는 보조 발아 영역인 SVZ로 마이그레이션되었습니다. E33에서 전기포이션이 수행되었을 때 많은 신생아 BP가 SVZ의 기저 부로 이동하여 OSVZ22를형성했습니다.
4일 후 E37에서 전기기질의 효과를 조사했을 때, 표적 세포와 자손의 대부분은 발아 영역(VZ, ISVZ 및 OSVZ, 그림 2A참조)에 남아 있었고 세포는 피질 판(CP)에서 더 유저로 더 많이 존재하지 않았다. 표적 세포의 자손은 주로 신경 전구 모형 및 신생아 뉴런으로 이루어져 있습니다. 전구 체형은 PCNA26(도 2B, C)과같은 사이클링 세포의 마커에 대한 면역형광에 의해 검사될 수 있었지만, 미토시스를 겪고 있는 전조자의 하위 집합은 인포히스톤 3(PH3)21(도 2D)와같은 마커에 의해 표시될 수 있었다.
P0에서, 8일 후, 표적 세포의 자손은 모든 조직학적층(도 3A, B)에퍼졌다. 이 단계에서, BP는 특히 풍부했고 bRG는 쉽게 식별 할 수 있었습니다. 전사 인자 마커의 조합을 사용하여, 다른 BP 인구는 드러나수 있었습니다. Sox2는 bRG26을포함하는 증식 선조 세포의 마커이다. Tbr2는 주로 중간선조26(도 3B)인신경성 BPs의 마커이다. 배아는 GFP를 코딩하는 플라스미드 인코딩과 함께 전극되었기 때문에, 신경 전조자의 형태는 GFP 신호를 추적하여 검사될 수 있었다. 이것은 두 가지 주요 형태형에서 오는 BPs의 맥락에서 특히 중요합니다: 다극성 세포, 주로 중간 선조인, 및 bRG21인방사형 세포. 따라서, Sox2+ Tbr2 – OSVZ에 있는 방사형 세포는 bRG26을공부하기 위한 관심의 주요 세포 인구입니다.
P16에 의해, 표적으로 한 세포의 대다수는 분할을 중단하고 신경과 glia로 분화했습니다. 따라서 이러한 세포 유형은 이 단계에서 가장 잘 검사됩니다. 다양한 뉴런 및 신경교 아류형 외에도 페렛 P16 신피질은 접는 특성 패턴을 나타내었다(도3C). 이 단계에서 대부분의 주요 자이리와 설시는 이미 존재했고 예비 뇌 영역은31을식별 할 수 있었다. 페렛 뇌는 P16 이후 성숙을 계속, 때 골 수 화와 시 냅 토 발생 등의 과정이 일어날 때.
그림 1: 페렛 신피질의 자궁 전기포이션에 의해 신경 세포를 표적화. E33에서 페렛 신피질의 자궁 전기포화에서 apical 전구체의 표적화가 초래되었다. 개발 하는 동안 이러한 세포 는 다른 모든 세포 유형을 발생. 기저 선조는 후기 배아 (E37) 및 주산기 (P0) 단계에서 가장 잘 연구되었다. 뉴런은 P16과 같은 산후 단계에서 가장 잘 연구되었습니다. 피질 층: VZ = 심실 영역; ISVZ = 내부 심실 영역; OSVZ = 외부 지하 구역; IZ = 중간 영역; CP = 피질 플레이트; GZ = 발아 영역 (VZ + SVZ); WM = 백색 물질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: E33에서 자궁 전기기화 후 E37 페렛 신피질의 예. (A 및 B)E37 페렛 신피질의 섹션; 녹색, 전기 화 세포의 자손 (GFP); 블루(A)세포 핵 (DAPI); 마젠타(B),사이클링 세포 (PCNA). 상자(폭 = 777 μm)는(C)에서더 높은 배율로 표시된 영역을 나타낸다. 스케일 바 = 1mm. 내부 제어 역할을 하는 반대로(비전기화 된 반구)에서 GFP 신호의 부족을 유의하십시오. (C 및 D)표적 영역의 배율 이 높은; 녹색, 전기 화 세포의 자손 (GFP); 마젠타(C),사이클링 세포 (PCNA); 빨강(D),미토 세포 (인포이스톤 3, PH3). 표적 세포의 자손의 대부분은이 단계에서 SVZ에 있었다. 도 1에서와같이 피질 레이어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: E33에서 자궁 전기포레이션 후 P0 및 P16 페렛 신피질의 예. (A 및 B)P0 페렛 신피질의 섹션; 녹색, 전기 화 세포의 자손 (GFP); 블루(A)세포 핵 (DAPI); 시안(B),삭스2; 마젠타(B),Tbr2.(B)전극 영역의 배율이 높다. 스케일 바 = 1mm(A),100 μm(B). 도 1에서와같이 피질 레이어. (C)P16 페렛 신피질의 섹션; 녹색, 전기 화 세포의 자손 (GFP); 회색, 세포 핵 (DAPI); 마젠타, 성상세포 (GFAP). 스케일 바 = 1mm. 이 수치는 Kalebic 외25에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
페렛의 자궁 전기포화는 다른 방법에 대하여 장점과 단점을 갖는 중요한 기술이다. 이 방법에는 중요한 단계와 제한사항뿐만 아니라 잠재적 수정 및 향후 응용 프로그램을 염두에 두어야 합니다.
전기기또는,바이러스주사(35,42, 43)를통해 산후 페렛 신생아의 유전자 조작에 대한 빅터 보렐과 동료들의 선구적인 작업 이후, 페렛은 유전적으로 접근할 수 있는 모델 유기체가 되었다.,43 자궁 전분19을통해 배아 발달 중 유전자 조작을확립하고,20은 초기 발달 단계에서 신경 전구 세포를 표적으로 함으로써 새로운 연구 가능성을 열어주었습니다. 산후 조작에 비해, 자궁 전기포기에서 신피질의 더 큰 영역과 신피질의 다른 모든 세포 유형을 순차적으로 생성하는 덜 분화된 신경 전구를 표적으로 할 수 있습니다. 중요한 것은, 바이러스 타겟팅에 비해, 자궁 전기기화에서 표적화의 공간 정밀도를 허용합니다.
이 방법의 가장 중요한 부분은 수술 자체입니다. 페렛 신피질의 자궁 전기포화에서 마우스의 절차에 비해 훨씬 더 복잡하고 어렵다. 자궁 벽은 어둡고 배아를 구별하기가 더 어렵습니다. 또한, 성인 페렛은 더 큰 축산 및 수의학 요구 사항이 있습니다. 특히 어려운 것은 새끼의 탄생을 둘러싼 기간입니다. 페렛은 그 기간에 매우 민감하며 불필요하게 방해받지 않는 것이 가장 좋습니다. 접근 방식 자체의 주요 제한 사항은 타겟팅효율성과 관련이 있습니다. 자궁 전기포기에서 항상 신경 전구의 모자이크를 표적으로 합니다. 이것은 신경 전구 또는 뉴런의 세포 생물학적 측면을 연구하는 데 이상적이지만 신구체 접이식의 변화와 같은 큰 조직학적 및 해부학 적 혼란을 일으키는 데 최적이 아닙니다. 이것이 필요한 경우, 가장 좋은 방법은 신피질의 큰 부분을 커버하기 위해 절차 중에 로스트로코달 축을 따라 전극을 이동하는 것입니다. 그러나, 전체 장기 분석을 위해 가장 좋은 접근법은 zygote 단계44에서시작하는 형질 전환페렛의 생성이다.
자궁에서 의 전분 전분이 수행된 배아 단계(E33)는 기저 선조를 연구하는 데 이상적입니다. 실제로, 이 단계에서 전기기 및 바이러스 표적화는 OSVZ22의 발병 타이밍뿐만 아니라 그들의 형태 및 증식 및 증식에 관한 기저 선조의 다양한 세포 생물학적 특징을 밝히기 위해 적용되었다21,,25,,26. 그러나, 연구의 과학적 목적에 따라, 전기기공의 타이밍은방법(19,,20)에대한 유의한 수정 없이 쉽게 변경될 수 있다. 측두성 특이성 외에도 자궁 전기 기화에서는 공간 특이성을 쉽게 수정할 수 있습니다. 로스트로코골 축을 따라 로스트로메디칼 위치에 있는 등쪽 신피질이 표적으로 삼아 모터와 소마토감각 부위의 라벨을 부착했습니다. 다른 신코르피컬 영역은 전극의 배치 및 전기장의 방향을 조정하여 표적으로 삼을 수도 있다. 마우스에서, 내측 신피질(45) 및 복부 텔렌스팔론(46)은 자궁 전기 화에서 사용하여 표적으로 삼았으며, 유사한 접근법이 페렛에서 사용될 수 있음을 시사합니다.
마지막으로, 자궁에서 전기기는 가장 최근의 게놈 및 후성유전체 편집기술(13,14,,16,25)과쉽게 결합될 수 있으며, 여기서 CRISPR/(d)Cas9 성분은 플라스미드 또는 재조합 Cas9 단백질 및 가이드 RNA14의복합체로서 전달될 수 있으며, 게놈 편집에 필요한 시간을 단축한다.,, 게놈 편집의 추가 기술 적 개선은 정상적인 뇌 발달을 이해하고 특히 인간의 병리학 적 상태를 모델링하는 데 중요한 정확한 게놈 돌연변이를 생성하기 위해 마우스와 페렛 모두에서 자궁 전기 기화와 결합 될 가능성이 높습니다. 이러한 맥락에서, 자궁 전기기는 표적 세포및 자손의 분자 서명 및 동적 행동을 이해하기 위해 후속적인 다양한 단세포 오믹스 접근 및 라이브 이미징에 대한 선택의 표적 화 방법으로 점점 더 사용되고 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 페렛과 J. Peychl및 빛 현미경 시설의 그의 팀을 위해 생물 의학 서비스 (BMS)의 전체 팀을 제공하는 뛰어난 지원을 위한 분자 세포 생물학 및 유전학의 막스 플랑크 연구소의 서비스 및 시설에 감사드립니다. 우리는 특히 뛰어난 수의학 지원에 대한 BMS에서 카트린 Reppe와 안나 Pfeffer와 페렛 수술을 지원하기위한 헛너 그룹에서 레이 Xing에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
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