Summary
Presentert her er en protokoll for å utføre genetisk manipulasjon i den embryonale ilderhjernen ved hjelp av utero elektroporasjon. Denne metoden gjør det mulig å målrette mot nevrale stamceller i neocortex in vivo.
Abstract
Manipulering av genuttrykk in vivo under embryonisk utvikling er den metoden for valg når man analyserer rollen til individuelle gener under pattedyrutvikling. In utero elektroporasjon er en viktig teknikk for manipulering av genuttrykk i den embryonale pattedyrhjernen in vivo. En protokoll for in utero elektroporasjon av embryonale neocortex av ilder, en liten kjøtteter, presenteres her. Ilderen blir i økende grad brukt som modell for neocortex utvikling, fordi neocortex viser en rekke anatomiske, histologiske, cellulære og molekylære egenskaper som også er tilstede i menneskelige og ikke-menneskelige primater, men fraværende i gnagermodeller, for eksempel mus eller rotte. In utero elektroporasjon ble utført på embryonisk dag (E) 33, et midneurogenesestadium i ilder. In utero elektroporasjon retter seg mot nevrale stamceller som fôrer hjernens laterale ventrikler. Under nevrogenese gir disse stamcellene opphav til alle andre nevrale celletyper. Dette arbeidet viser representative resultater og analyser på henholdsvis E37, postnatal dag (P) 1 og P16, tilsvarende henholdsvis 4, 9 og 24 dager etter in uteroelektroporasjon. I tidligere stadier består avkom av målrettede celler hovedsakelig av ulike nevrale stamceller, mens de fleste merkede celler i senere stadier er postmitotiske nevroner. Dermed muliggjør in utero elektroporasjon studiet av effekten av genetisk manipulasjon på cellulære og molekylære egenskaper ved ulike typer nevrale celler. Gjennom sin effekt på ulike cellepopulasjoner kan in utero elektroporasjon også brukes til manipulering av histologiske og anatomiske egenskaper i den ilderne neocortex. Viktigere, alle disse effektene er akutte og utføres med en spatiotemporal spesifisitet bestemmes av brukeren.
Introduction
Neocortex er det ytre arket av pattedyr cerebrum og setet for høyere kognitive funksjoner1,,2,,3,,4,,5. For å oppnå en akutt genetisk manipulasjon i pattedyr neocortex in vivo under embryonal utvikling, to forskjellige metoder har blitt utforsket: virusinfeksjon6 og in utero elektroporasjon7. Begge metodene tillater effektiv målretting av neokortikale celler, men lider av noen begrensninger. Den største fordelen med in utero elektroporasjon sammenlignet med virusinfeksjon er evnen til å oppnå romlig spesifisitet innen neocortex, som oppnås ved å regulere retningen av det elektriske feltet.
Siden elektroporasjon først ble vist å lette inntreden av DNA i cellene in vitro8,har det blitt brukt til å levere DNA i ulike virveldyr in vivo. I utviklingsnevrovitenskap ble in utero elektroporasjon av musen neocortex først rapportert i 20019,10. Denne metoden består av en injeksjon av DNA-blandingen i den laterale ventrikkelen i den embryonale hjernen og påfølgende påføring av det elektriske feltet ved hjelp av pinsettelektroder, noe som tillater romlig presisjon7,11. In utero elektroporasjon har siden blitt brukt til å levere nukleinsyrer for å manipulere uttrykket av endogene eller ektopisk tilsatt gener i musen neocortex. Viktige fremskritt har blitt gjort nylig ved å anvende metodikken til CRISPR / Cas9-mediert genomredigering via in utero elektroporasjon i musen neocortex å utføre (1) genavbrudd i postmitotiske nevroner12,,13 og nevrale stamceller14,og (2) genom15 og epigenome16 redigering.
Kort tid etter den første rapporten i musen ble in utero elektroporasjon påført den embryonale rotte neocortex17,18. Ikke-gnagere forble en utfordring til den første in utero elektroporasjon av ilder, en liten kjøtteter, ble rapportert i 201219,20. Siden da har det blitt brukt in utero elektroporasjon av ildere for å studere mekanismene for neocortex utvikling ved å merke nevrale stamceller og nevroner20,21,22,23, manipulere uttrykket av endogene gener, inkludert bruk av CRISPR / Cas9 teknologi24, og ved å levere ektopiske gener21,22,25, inkludert menneskespesifikke gener26. Videre har in utero elektroporering av ildere blitt brukt til å ta opp trekk ved menneskelig neocortex utvikling i patologiske forhold27,28.
I sammenheng med neocortex utvikling, fordelene ved å bruke ilder som modell organisme sammenlignet med mus skyldes det faktum at ildere bedre rekapulere en rekke menneskelignende funksjoner. På anatomisk nivå viser ildere et karakteristisk mønster av kortikal folding, som også er tilstede i menneskelige og de fleste andre primater, men er helt fraværende hos mus eller rotter4,29,30,31. På histologisk nivå ildere har to forskjellige subventrikulære germinal soner, referert til som indre og ytre subventrikulære soner (ISVZ og OSVZ, henholdsvis)32,33, atskilt av indre fiber lag23. Disse funksjonene deles også med primater, inkludert mennesker, men ikke med mus34. ISVZ og OSVZ hos ildere og mennesker er befolket med rikelig nevrale stamceller, mens subventrikulær sone (SVZ) av mus inneholder bare sparsommerale forfedre21,,32,,35,,36. På cellenivå viser ildere en høy andel av en undertype av nevrale stamfarer referert til som basal eller ytre radial glia (henholdsvis bRG eller oRG), som anses som medvirkende for den evolusjonære utvidelsen av pattedyret neocortex34,37,38. bRG er derfor svært rikelig i fosterets menneskelige og embryonale ilder neocortex, men de er svært sjeldne i embryonal mus neocortex35,36. Videre viser ilder bRG morfologisk heterogenitet som ligner på menneskelig bRG, langt bedre enn mus bRG21. Til slutt, på molekylært nivå, viser utvikling av ilder neocortex genuttrykksmønstre som ligner på fosterets humane neocortex, som antas å kontrollere utviklingen av kortikal folding, blant annet39.
Cellebiologiske og molekylære egenskaper av ilder bRG gjør dem svært proliferative, lik menneskelig bRG. Dette resulterer i økt produksjon av nevroner og utvikling av en utvidet og svært kompleks neocortex34. Disse egenskapene gjør ildere gode modellorganismer for å studere menneskelignende egenskaper av neocortex utvikling som ikke kan modelleres hos mus26,40. For å dra full nytte av ilderen som modellorganisme ble den presenterte metoden utviklet. Den består av i utero elektroporasjon av E33 ilder embryoer med en plasmid uttrykker GFP (pGFP) under kontroll av en allestedsnærværende promotor, CAG. De elektroporerte embryoene kan deretter analyseres embryonalt eller postnatalt. For å redusere antall ofret dyr, kvinnelige ildere (jills) steriliseres av hysterektomi og donert for adopsjon som kjæledyr. Hvis de målrettede embryoene høstes på embryonale stadier, utføres en ny operasjon og embryoene fjernes av en keisersnitt, mens jills er hysterektomiisert. Hvis de målrettede embryoene analyseres på postnatale stadier, blir jills hysterektomiisert etter at valpene har blitt avvent eller ofret. Derfor presenteres også en protokoll for hysterektomi av jills.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med den tyske dyrevelferdslovgivningen etter godkjenning av Landesdirektion Sachsen (lisenser TVV 2/2015 og TVV 21/2017).
1. Forberedelse til in utero elektroporasjon
- Forbered DNA-blandingen. I denne protokollen brukes en endelig konsentrasjon på 1 μg/μL pGFP. Oppløs DNA i PBS og supplere med 0,1% Fast Green for å lette visualiseringen. Når den er klargjort, bland DNA-blandingen ved å pipering opp og ned flere ganger eller ved finger tapping. Oppbevares ved romtemperatur til bruk.
MERK: For koelektroporasjoner er DNA-blandingen forberedt på å inneholde en endelig konsentrasjon på 1 μg/μL plasmidkoding av et gen av interesse sammen med 0,5 μg/μL pGFP fortynnet i PBS. - Forbered operasjonsbordet med alle nødvendige verktøy og instrumenter.
- Trekk glasskapillærer ved hjelp av mikropipettetrekkeren. Juster diameteren på kapillærspissen ved å kutte av den distale delen av kapillæren ved hjelp av tang som tidligere beskrevet41.
2. Fremstilling av ildere for kirurgi
- Hold de gravide jills med embryoer på E33 fasting i minst 3 timer før operasjonen for å redusere risikoen for oppkast.
- Før operasjonen sterilisere alle verktøyene ved autoklavering. Utfør operasjonen i et spesielt tildelt rom under aseptiske forhold for å eliminere potensielle forurensningskilder.
- Plasser den gravide jillen i narkoseboksen med 4% isofluran.
- Når den bedøves, plasser ilderen på operasjonsbordet med en varmepute og fest narkosemasken med en konstant isofluranstrøm på 2–3 % til nesen. For å sikre riktig nivå av anestesi, se etter mangel på følgende reflekser:
- Palpebralrefleksen ved å berøre den periocular huden
- Flexorrefleksen ved å klemme huden mellom 2nd og 3rd,eller 3rd og4 th tå av begge baklemmer
- Hvis palpebralrefleksen er fraværende og flexorrefleksen er tydelig redusert, se etter smerterefleksen ved å klemme en tå av hvert baklem.
MERK: Sørg for å ha et stetoskop for hånden for å overvåke hjertefrekvens og rytme om nødvendig.
- Injiser ilderen subkutant med smertestillende (0,1 ml metamizol, 50 mg/kg kroppsvekt), antibiotika (0,1 ml/kg kroppsvekt på 20 mg/kg amoxicillin + klavulansyre) og glukose (10 ml 5 % glukoseoppløsning).
- Plasser en dråpe øyesalveløsning på øynene for å forhindre øyedehydrering under kirurgisk prosedyre.
- Barber ildermagen med en barbermaskin.
- Rengjør huden med vann og såpe, desinfiser magen med 70% etanolskrubb, desinfiser 2x med jod, og la den tørke.
3. In utero elektroporering av ildere
- Sørg for at det kirurgiske området er sterilt: Plasser sterile kirurgiske verktøy på sterilt vev, og bytt frakk og hansker.
- Plasser en steril kirurgisk drapering på dyret.
- Ved hjelp av en skalpell, kirurgisk åpne magen på linea alba med en ~ 5 cm lang kutt.
- Klipp muskellaget ved hjelp av saks.
- Plasser gasbind vattpinner rundt snittområdet og våt dem med PBS. Gasbind vattpinnene vil absorbere den ekstra PBS som vil bli lagt til under operasjonen.
MERK: Oppretthold varme- og PBS-støtte gjennom hele operasjonen. - Utsett ilderlivmoren og plasser den på gasbindvattpinnene.
- Legg i en glasskapiler med injeksjonsoppløsningen ved hjelp av en pipette med en lang lastspiss. Sørg for at lastevolumet er ca. 5–20 μL, avhengig av antall embryoer og antall ulike eksperimentelle tilstander. Gjennomsnittlig injisert volum per embryo er 3–5 μL. Fest det lastede glasskapileriet til en holder og koble den andre siden av holderen til et rør og et munnstykke.
- Inspiser det første embryoet og finn hodet.
- Plasser den fiberoptiske lyskilden ved siden av embryoets hode for å lette visualiseringen.
MERK: Ilderens livmorvegger er veldig mørke, og det er vanskelig å se gjennom dem med mindre lyset skinner direkte på dem. - Utfør en enkelt intraventrikulær injeksjon i ventrikkelen på en av hjernehalvkulene og hold den andre halvkule intakt for å tjene som en intern kontroll. Ventrikkelen i seg selv er ikke lett forskjellig av øye, så plasseringen er estimert basert på plasseringen av pigmentert iris, som er synlig. Den intraventrikulære injeksjonen gjøres ved å ta holderen festet til glasskapillæren og trenge inn i huden, skallen og hjernevevet med spissen av glasskapillæret.
MERK: Pass på at du ikke skader morkaken, noe som er mørkere enn murine placentas.- Når spissen av glasskapillæren er i ventrikkelen, injiser du ca. 3–5 μL av injeksjonsoppløsningen ved munnpipettering ved hjelp av munnstykket som er koblet til glasskapillærholderen. Fordi den injiserte oppløsningen inneholder 0,1% Fast Green, vil den injiserte ventrikkelen nå bli mørk grønn, og vil være synlig som en nyreformet struktur.
- Plasser pinsettelektrodene på livmoren over embryoets hode slik at den positive stangen er plassert over området som vil bli målrettet og den negative polen under det injiserte området.
- Still inn følgende elektroporasjonsforhold på elektroporatoren: Pulslengde = 50 ms; Pulsspenning = 100 V; Pulsintervall = 1 s; Antall pulser = 5. Trykk deretter på tasten "Pulse"på elektroporatoren.
- Slipp raskt flere dråper varm 1x PBS på det elektroporerte embryoet.
- Gjenta prosedyren for alle embryoene. Hold livmoren konstant våt med varm PBS.
MERK: Hvis de første embryoene som vender mot skjeden ikke er lett tilgjengelige, er det best å ikke elektroporate dem. - Når alle embryoene er elektroporert, plasser livmoren tilbake i bukhulen.
- Sutur muskellaget med bukhinnen ved hjelp av en 4-0 sutur.
- Sutur huden ved hjelp av samme tykkelse og spray såret med aluminiumspray.
- Legg dyret i et bur og hold det varmt med en varmekilde. Overvåk dyret forsiktig til det våkner.
4. Postoperativ omsorg og bolig av målrettede dyr
- I 3 dager etter operasjonen sikrer du at dyrene gjennomgår følgende postoperative omsorg: 20 mg / kg amoxicillin (antibiotika) 1x daglig; 25 mg/kg metamizol (smertestillende) 3x daglig.
- Sørg for at ilderne er plassert individuelt.
- Sørg for at ilderne undersøkes av en veterinær minst 1x per dag.
- Sørg for at ilderne forstyrres så lite som mulig under levering.
- Etter at valpene er avvent eller ofret, forberede jills for hysterektomi.
5. Hysterektomi av ildere
MERK: En hysterektomi utføres for å redusere antall ofret dyr slik at de steriliserte dyrene kan doneres til adopsjon som kjæledyr. Den prekirurgiske prosedyren for hysterektomi er den samme som i trinn 2.
- Barber og steriliser ildermagen som beskrevet i trinn 3.1 og 3.2.
- Kirurgisk åpne magen på linea alba. Kutt muskellaget. Løft muskellaget og ly tarmen med en finger mens du åpner muskellaget fullt ut.
- Plasser gasbind vattpinner rundt snittstedet og våt dem med steril PBS. Utsett ilderlivmoren og eggstokkene og legg dem på gasbindvattpinnene.
- Start hysterektomi på den ene siden ved å ligating arterieovarica og vena ovarica kranial til mesovar. Sett en klemme på hver side av ligation og utføre en annen ligation kranial til klemmene. Fest den tredje klemmen i endene av ligation for å redde dem. Gjenta på den andre siden.
- Klipp mellom klemmene og løsne cornua uteri fra mesenteriet på begge sider.
- Ligate arterien uterina på begge livmor sider caudal til ostium uteri. Deretter ligate vagina og fikse ligaturen. Fest klemmen i endene av ligations for å redde dem. Sett to klemmer kranial til ligaturen. Klipp mellom klemmene og løsne livmoren fra skjeden. Fjern livmoren og eggstokkene og kast dem. Skrap rester slimhinnen fra livmorslimen.
- Ta av alle de gjenværende klemmene og forkort ligaturendene. Sørg for å kontrollere for blødning etter at klemmene er fjernet.
- Sutur muskellaget og huden som beskrevet i trinn 3.16 og 3.17. Følg den postoperative protokollen som i trinn 3.18 og 4.1–4.3. Hold dyrene i dyreanlegget i minst 2 uker med regelmessige veterinærbesøk. Etter at dyrene er fullstendig gjenopprettet, kan de doneres for adopsjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In utero elektroporasjon av ildere ved E33 resulterte i målretting av nevrale stamceller som fôrer ventrikulær overflate av embryonale neocortex (figur 1). Disse cellene kalles apical stamfar og er svært proliferative, noe som gir opphav til alle andre celletyper under utvikling. Ved asymmetrisk divisjon genererte a apiske forfedre en annen apical stamfar og en mer differensiert celle, vanligvis en basal stamfar (BP), som delaminerte fra ventrikulær overflate. BPs migrerte inn i den sekundære germinalsonen, SVZ. Da elektroporasjonen ble utført på E33, migrerte mange nyfødte BPer til basal-mesteparten av SVZ, hvor de dannet OSVZ22.
Da effekten av elektroporasjon ble undersøkt 4 dager senere på E37, var de fleste av de målrettede cellene og deres avkom fortsatt i germinalsonene (VZ, ISVZ og OSVZ, se figur 2A) og cellene var sjelden til stede ytterligere basalt i kortikalplaten (CP). Stamfaren til målrettede celler besto hovedsakelig av nevrale stamceller og nyfødte nevroner. Stamfaridentiteten kan undersøkes ved immunofluorescens for markører av sykkelceller, for eksempel PCNA26 (figur 2B, C), mens en undergruppe av forfedre som gjennomgår mitose kan vises av markører som fosfohistone 3 (PH3)21 (figur 2D).
Ved P0, 8 dager etter elektroporasjon, spredte avkom av målrettede celler i alle histologiske lag (figur 3A, B). På dette stadiet var BPs spesielt rikelig og bRG var lett identifiserbare. Ved hjelp av en kombinasjon av transkripsjonsfaktormarkører kunne forskjellige BP-populasjoner avsløres. Sox2 er en markør for proliferative stamceller, inkludert bRG26. Tbr2 er en markør for nevrogene BPs, som hovedsakelig er mellomliggende forfedre26 (figur 3B). Fordi embryoene ble co-elektroporated med en plasmid koding GFP, morfologien til nevrale stamfare kunne undersøkes ved å spore GFP signalet. Dette er spesielt viktig i sammenheng med BPs, som kommer i to store morfotyper: multipolare celler, som i stor grad er mellomliggende forfedre og radiale celler, som er bRG21. Derfor er Sox2 + Tbr2– radialceller i OSVZ den viktigste cellepopulasjonen av interesse for å studere bRG26.
Ved P16 sluttet et flertall av målrettede celler å dele seg og differensiert i nevroner og glia. Derfor undersøkes disse celletypene best på dette stadiet. I tillegg til ulike nevronale og glial undertyper, ilder P16 neocortex utstilt egenskapene mønster av folding (Figur 3C). På dette stadiet var de fleste store gyri og sulci allerede tilstede, og potensielle hjerneområder kunne identifiseres31. Ilderhjerne fortsatte å modnes etter P16, når prosesser som myelinasjon og synaptogenesis finner sted.
Figur 1: Målretting av nevrale celler ved in utero elektroporasjon av ilder neocortex. In utero elektroporasjon av ilder neocortex på E33 resulterte i målretting av a apiske stamfarer. Under utviklingen disse cellene gi opphav til alle andre celletyper. Basal stamfar ble best studert ved senere embryonale (E37) og perinatal (P0) stadier. Nevroner ble best studert ved postnatale stadier, som P16. Kortikale lag: VZ = ventrikkel sone; ISVZ = indre subventrikulær sone; OSVZ = ytre subventrikulær sone; IZ = mellomsone; CP = kortikal plate; GZ = germinal soner (VZ + SVZ); WM = hvit materie. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på E37 ilder neocortex etter in utero elektroporasjon på E33. (A og B) Delen av E37 ilder neocortex; grønn, avkom av elektroporerte celler (GFP); blå (A) cellekjerner (DAPI); magenta (B), sykkelceller (PCNA). Eske (bredde = 777 μm) indikerer område vist ved høyere forstørrelse i (C). Vektstangen = 1 mm. Legg merke til mangelen på GFP-signal i den kontralaterale (ikke-lektriserte halvkule), som fungerer som en intern kontroll. (C og D) Høyere forstørrelser av det målrettede området; grønn, avkom av elektroporerte celler (GFP); magenta (C), sykkelceller (PCNA); røde (D), mititotiske celler (fosfofistone 3, PH3). Merk at flertallet av avkom av målrettede celler var i SVZ på dette stadiet. Kortikale lag som i figur 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempler på P0 og P16 ilder neocortex etter in utero elektroporasjon på E33. (A og B) Delen av P0 ilder neocortex; grønn, avkom av elektroporerte celler (GFP); blå (A) cellekjerner (DAPI); cyan (B), Sox2; magenta (B), Tbr2. (B) Høyere forstørrelse av det elektroporerte området. Vektstenger = 1 mm (A), 100 μm (B). Kortikale lag som i figur 1. (C) Delen av P16 ilder neocortex; grønn, avkom av elektroporerte celler (GFP); grå, cellekjerner (DAPI); magenta, astrocytter (GFAP). Vektstangen = 1 mm. Dette tallet er endret fra Kalebic et al.25. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In utero elektroporasjon i ilder er en viktig teknikk, med fordeler og ulemper med hensyn til andre metoder. Det er kritiske trinn og begrensninger for denne metoden, samt potensielle endringer og fremtidige programmer å huske på.
Siden det banebrytende arbeidet til Victor Borrell og kolleger om genetisk manipulering av postnatal ilder neocortex via elektroporasjon eller viral injeksjon35,42,43, har ilderen blitt en genetisk tilgjengelig modell organisme. Etablering av genetisk manipulasjon under embryonisk utvikling via in utero elektroporasjon19,,20 åpnet opp nye forskningsmuligheter ved å tillate målretting av nevrale stamceller i tidligere utviklingsstadier. Sammenlignet med postnatal manipulasjon muliggjør in utero elektroporasjon målretting av større områder av neocortex og mindre differensierte nevrale stamceller som sekvensielt genererer alle andre celletyper av neocortex. Viktigere, sammenlignet med viral målretting, in utero elektroporasjon gir romlig presisjon av målretting.
Den mest kritiske delen av metoden er selve operasjonen. In utero elektroporering av ilder neocortex er betydelig mer komplisert og vanskelig i forhold til prosedyren hos mus. Livmorveggene er mørkere, og embryoene er vanskeligere å skille mellom. I tillegg har voksne ildere større krav til husdyrhold og veterinær. Spesielt utfordrende er perioden rundt fødselen av valpene. Ildere er svært følsomme i den perioden og er best ikke forstyrret unødvendig. De store begrensningene i selve tilnærmingen er knyttet til effektiviteten av målretting. In utero elektroporasjon resulterer alltid i målretting av en mosaikk av nevrale forfedre. Dette er ideelt for å studere cellebiologiske aspekter av nevrale stamfar eller nevroner, men det er suboptimalt for å forårsake store histologiske og anatomiske perturbasjoner, for eksempel en endring i neokortikale folding. Hvis dette er nødvendig, er den beste tilnærmingen å flytte elektrodene langs rostrocaudalaksen under prosedyren for å dekke store deler av neocortex. Men for hele orgelanalyse er den beste tilnærmingen generasjon av transgene ildere fra zygote stadium44.
Det embryonale stadiet hvor in uteroelektroporasjonen ble utført (E33) er ideell for å studere basale forfedre. Faktisk har elektroporasjoner og viral målretting på dette stadiet blitt brukt for å avsløre tidspunktet for utbruddet av OSVZ22, samt ulike cellebiologiske egenskaper av basale forfedre som er relevante for deres morfologi og spredning21,25,26. Men avhengig av det vitenskapelige formålet med en studie, kan tidspunktet for elektroporasjon enkelt endres uten betydelige endringer i metoden19,20. Bortsett fra temporal spesifisitet, in utero elektroporasjon gir enkel modifikasjoner av romlig spesifisitet. Den dorsolaterale neocortex på rostromedial posisjon langs rostrocaudal aksen ble målrettet, noe som resulterte i merking av motor- og somatosensoriske områder. Andre neokortikale områder kan også målrettes ved å justere plasseringen av elektrodene og retningen på det elektriske feltet. I musen har medial neocortex45 og ventral telencephalon46 blitt målrettet ved hjelp av in utero elektroporasjon, noe som tyder på at lignende tilnærminger kan brukes i ildere.
Til slutt, i utero elektroporasjon kan lett kombineres med de nyeste genom og epigenom redigeringteknikker 13,14,16,25, hvor CRISPR / (d) Cas9 komponenter kan leveres som en plasmid eller som et kompleks av rekombinant Cas9 protein og guide RRAs14, med sistnevnte forkorte tiden som kreves for genom redigering skal finne sted. Det er sannsynlig at ytterligere teknologiske forbedringer i genomredigering vil bli kombinert med in utero elektroporasjon hos både mus og ildere for å generere presise genomiske mutasjoner som er viktige for å forstå normal hjerneutvikling og spesielt for å modellere menneskelige patologiske forhold. I denne sammenheng, i utero elektroporasjon blir stadig mer brukt som målretting metode for valg for påfølgende ulike encellede omics tilnærminger og levende bildebehandling for å forstå molekylære signaturer og dynamisk oppførsel av målrettede celler og deres avkom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for tjenestene og fasilitetene til Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics for den enestående støtten som tilbys, spesielt hele teamet av Biomedical services (BMS) for det utmerkede husdyrholdet til ildere og J. Peychl og hans team av Light Microscopy Facility. Vi er spesielt takknemlige til Katrin Reppe og Anna Pfeffer fra BMS for eksepsjonell veterinærstøtte og Lei Xing fra Huttner-gruppen for å bistå med ilderoperasjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. Evolution of Nervous Systems 2e. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
