Summary
細胞死の間に放出される細胞外DNA(ecDNA)は炎症を誘発し、炎症に寄与する。傷害部位におけるecDNAの測定は、標的器官における治療の有効性を決定することができる。このプロトコルは、機械学習ツールを使用して腎臓組織のecDNAの測定を自動化する方法を説明します。
Abstract
糸球体細胞死は、骨髄ペルオキシダーゼ抗好中球細胞質抗体関連血管炎(MPO-AAV)の病理学的特徴である。細胞外デオキシリボ核酸(ecDNA)は、アポトーシス、壊死、ネクロトーシス、好中球外細胞トラップ(NETs)およびピロトーシスを含む細胞死の異なる形態の間に放出される。この細胞死の測定は、細胞死の異なる生化学的形態を同定するために必要ないくつかの異なるバイオマーカーで時間がかかる。ecDNAの測定は、一般に、病的損傷が起こる実際の標的器官ではなく、腎損傷の代理として血清および尿において行われる。腎臓のecDNAを調査する上で現在の難しさは、実験的およびアーカイブされたヒト腎臓生検の両方でホルマリン固定パラフィン埋め込み組織(FFPE)の方法の欠如である。このプロトコルは、FFPE組織(ヒトとマウスの両方)でecDNAを染色し、自家蛍光をクエンチし、一般に公開されているオープンソースImageJプラグインのトレーニング可能なWekaセグメンテーションから機械学習ツールを使用して、結果の画像中のecDNAを測定するために必要なステップの概要を提供します。トレーニング可能な Weka セグメンテーションは、プログラムが ecDNA を分類することを学習する糸球体の中の ecDNA に適用されます。この分類器は、後に取得した腎臓画像に適用され、個々の画像の手動注釈の必要性を減らします。トレーニング可能なWekaセグメンテーションの適応性は、実験的なマウス抗MPO糸球体腎炎(GN)から腎臓組織においてさらに実証され、NETおよびecMPOを同定し、抗MPOGNに共通の病理学的寄与者である。この方法は、トレーニング可能なWekaセグメンテーションプログラムが健康な正常な腎臓組織と病気の腎臓組織との間でecDNAを区別できる有効性を明らかに示す腎臓組織におけるecDNAの客観的な分析を提供する。このプロトコルは、他の臓器のecDNA、NETおよびecMPOを同定するために容易に適応することができる。
Introduction
骨髄ペルオキシダーゼ抗好中球細胞質抗体関連血管炎(MPO-AAV)は、腺球体損傷による腎不全を有する自己免疫疾患であり、相当な細胞死および脱酸性ビオ核酸(DNA)1、2。1,2DNAは、危険信号として機能することによって免疫系を活性化することができます。正常な健康な条件下では、DNAの核位置は免疫系への暴露からの保護を提供する。病原性プロセスまたは自己免疫の間に細胞外に放出される自己DNAは、免疫系によって、分子自己タンパク質(DAMP)3に関連する強力な炎症障害として見られる。細胞外DNA(ecDNA)は、アポトーシス、ネクロトーシス好中球外細胞トラップ形成(NETs)、壊死またはピロプトーシス4,4、5、6、7、8などの異なる生化学的経路によって支配されるいくつかの異なるメカニズムを介して死細胞から放出される。5,6,7,8
我々は、MPO-AAV99,1010の患者からの実験的抗MPO GNおよび腎臓生検からホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)腎臓のセクションで死細胞から放出されるecDNAを染色および測定する方法をここに記載する。血清および尿の両方から、およびインビトロアッセイ11,12から循環二本鎖DNA(dsDNA)およびDNA複合体を検出するための複数の方法が12存在する。これらの方法は、ecDNAの量を決定する際に正確であるが、ecDNAが解剖学的に放出される場所を決定しない。アポトーシスのためのチューンルや細胞デブリの測定などのecDNAの特異的測定を記述する方法があります13,,14.病的損傷が起こるFFPE腎臓におけるあらゆる形態の細胞死から最高潮に達したecDNAの測定を記述する方法はない。これは、実験的治療が実際の標的器官の病的傷害部位からecDNAをクリアしているかどうかを判断するために重要である。
腎臓サンプルから複数の画像を取得すると、1人のユーザーによって一般的に分析される大量のデータが作成されます。これは、労力がかかり、時間がかかり、ユーザーの偏見のために、他のユーザーが信頼性の低い再現性を受ける可能性があります。トレーニング可能な Weka セグメンテーションは、機械学習アルゴリズム15,,16を使用してピクセルを分類するために最先端のバイオインフォマティクスツールを使用する ImageJ 用のオープンソースソフトウェアプラグインです。この方法は、ユーザーのピクセルのセグメントの分類から学習し、新しい学習した分類を他の画像に適用する「トレーニング可能」です。この方法は、特定の「クラス」に属するものとしてセグメント内の各ピクセルを「分類」するために使用される ImageJ プログラム内の一般的な分析ツールに依存します。プログラムが「分類子」を学習すると、同じ画像内の他の類似した分類セグメントを識別するために使用できます。このモデルは、同じ実験内の他の画像セットに保存され、適用されます。
腎臓切片におけるその場でのecDNAの決定に対する現在の障害は、ホルマリンにおける固定からの内因性自己蛍光と画像の労働集約的な分析である。ここでは、この自己蛍光を消し止め、ecDNAを検出し、ecDNAの高スループット測定のための教師付き機械学習を使用する方法について説明します。我々は、以前に、ImageJのマクロを用いてNETおよび細胞外MPO(ecMPO)の測定を公表し、今では、教師付き機械学習1を用いてこれらの方法の半自動化を実証する。同じ画像内でNETとecMPOの代替染色を分類するために、機械学習ツールの適応性を実証します。ecDNA、NETおよびecMPOを検出するためにここで説明するこれらの染色法は、ecDNA、NETSおよびecMPOが関節リウマチおよびルプス17,18,18などの永続的疾患において役割を果たす他の固体器官および疾患に翻訳することができる。
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Protocol
この方法は、細胞死のすべての形態からの汎ecDNAの検出を可能にする。同じ方法と抗体がヒト腎臓生検組織に使用される(ステップ4から)。すべての動物と人間の被験者は、モナッシュ大学、モナッシュヘルス、クレイトン、ビクトリア、オーストラリアからの倫理承認を受けました。
1. DAPIとβアクチンを用いたecDNAの染色
- 抗骨髄ペルオキシダーゼ糸球体腎炎(抗MPO-GN)の20日間モデルを8-10週齢のC57/Bl6マウスで誘導し、コントロール9を用いた。
- CO2チャンバーを用いてマウスを人道的2に安楽死させる。
- はさみで皮膚を通して前正中線切開を行うことによって腎臓を除去し、その後慎重に腹筋を切断し、解剖板にピンバックします。鉗子を使用して、前腎筋膜と頭頂腹を脇に押し出し、腎盂の尿管および血管(腎動脈および静脈)を切断することによって腎臓を自由に切断する。鉗子で取り出し、サイズ22メスで半分(矢状面)に腎臓を切断します。
- 腎臓を固定液(4%緩衝ホルマリン)に室温(RT)で16時間置く。処理前に24時間、固定腎臓を30%エタノールに取り除き、浸します。
- 標準的な6時間サイクルを使用して腎臓を処理する:
70%エタノール15分間
90%エタノール15分間
100%エタノール15分間
100%エタノール20分間
25分間のエタノール100%
30分間のエタノール100%
キシレン 20分間
キシレン 30分間
キシレン 40分間
ワックス 30分間
ワックス 35分
ワックス 40分間
注:腎臓は、目的の抗原を破壊することができるので、ワックスの熱に長時間暴露されるべきではないので、これは重要です。 - マイクロトーム上で3μmのセクションをカットし、プラス電荷でコーティングされた市販のガラス顕微鏡スライドに取り付けます。一晩乾燥させます。
- スライドラックにガラススライドを60°Cのオーブンに入れ、60分間置きます。
注: ステップ 1.3 および 1.4 は、抗原検索ステップ中にセクションが浮かび上がらないようにするために重要です。 - スライドを2回の溶剤(キシレンまたは代替品)にそれぞれ40分間、ヒュームフードに浸します。
- 100%エタノール中のリハイドレートスライド、100%エタノール、70%エタノールをそれぞれ5分間用いた。水道水で5分間洗います。
- ホットプレートをフュームフードに入れ、圧力鍋にプリボイルド抗原検索溶液(10 mM Tris、1 mM EDTA pH 9.0)を入れます。抗原の取り出し液が沸騰し始めたらすぐに、トングのペアを使用してポットにスライドを水平に置き、蓋をロックします。高い(15 psiまたは103 kPaに相当)で10分間沸騰させます。
注:このステップは、抗原エピトープ(ホルマリン固定を介して架橋)を解除して目的の抗原を取り出し、エピトープ抗体特異的結合を可能にするため、その後の染色は、それなしでは機能しません。 - 熱から圧力鍋を取り除き、シンクの蓋の上にコールドタップを実行してすぐに蓋を取り除きます。スライドを離れ、抗原検索液中で20分間平衡させます。
- 軌道シェーカー上で0.01 Mリン酸緩衝生理食塩分(PH 7.4)で5分間スライドを2回洗浄します。
- この時間に組織を乾燥させないように注意して腎臓組織の周りに円を描くために疎水性ペンを使用してください。
- 5%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBS(pH 7.4,0.01 M)の10%ニワトリセラで30分間、60μLのブロック組織。このステップの後に洗わないが、慎重に60 μLピペットを使用してブロッキング溶液を除去し、セクションを乾燥させないでください。
- 1%BSA/PBS(pH 7.4,0.01 M)で1/1000希釈したβ-アクチン用の一次抗体カクテルを適用し、1セクションあたり60μL、4°Cの湿度チャンバーで一晩インキュベートします。
- 軌道シェーカー上のPBS(pH 7.4,0.01 M)でスライドを5分間2回洗浄します。
- 二次抗体、鶏抗ウサギ488(1/200)、1%BSA/PBS(pH 7.4、0.01 M)に希釈した1セクションあたり60μLをRTで40分間塗布します。
- スライドを軌道シェーカーでPBS(pH 7.4,0.01 M)で5分間2回洗浄します。
- スライドを0.3%スーダンブラックに70%エタノールで30分間コプリン瓶に浸します。
注:このステップは、ホルマリン固定によって引き起こされる自己蛍光を消すために重要です。 - スライドを水道水で洗浄して沈殿物を除去し、PBS(pH 7.4,0.01 M)に10分間浸して、さらにスーダンブラック沈殿が形成されるのを防ぎます。
- DAPIを使用して3つの60 μLの取り付け溶液を使用して、共焦点ガラスカバーリップにスライドを取り付け、カバースリップの周囲に塗布することでマニキュアでカバーリップを密封します。
- スライドがRTで24時間硬化し(DAPIが浸透するように)、光から保護された4°Cで保存することができます。
注:蛍光プローブの退色を防ぐために暗闇の中に保管することが重要です。 - 顕微鏡に取り付けられた共焦点レーザー走査ヘッドを用いて画像スライド。DAPI用405レーザーとベータアクチン用488レーザーでエキサイトスライド。ecDNAの検出に不可欠なラインシーケンシャルキャプチャと4ライン平均を使用して、単一平面1024 x1024ピクセル画像をキャプチャします。40x 1.0 NA油の目的が使用されます。
- サンプルあたり最低20個の糸球体を画像化します。ND2ファイルとして画像を保存します。
2. DAPIおよびβアクチン分析
- イメージJをインストールします: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
- [プラグイン] の下で、トレーニング可能な Weka セグメンテーションが利用可能であることを確認する |セグメンテーション |訓練可能なWekaセグメンテーション.
- ImageJ ツールバーにイメージをドロップします。[イメージ |色 |チャネルの分割:青い染色でDAPIを持つ1つの画像が表示され、緑色のβ-アクチンを持つ1つの画像が現れ、糸球体を示す。
- 単一の画像のマージされたファイルを作成し、色をクリックして、糸球体の関心領域(ROI)を描画します。チャネルの結合:ポップアップ ボックスは、各チャネルに色を割り当てるように求めます。各チャネルに色を割り当てた後、[合成の作成] ボックスと [ソース イメージの保持] ボックスにチェックマークを付けて[OK]をクリックします。合成画像が合成されます。
- βアクチン染色をガイドとして使用し、糸球体の房の周りにROIを描きます。このプロトコルの最後で ROI を使用するには、このイメージを脇に置いてください。
- 単一の青色の DAPI イメージにガウス ブラーを実行します。[プロセス] をクリックして 、フィルタ |ガウスブラー、1-2.00に入れて。イメージは少しぼやけて見えますが、核は滑らかで背景が柔らかくなります。
注: この手順は、ノイズを除去して、関連するイメージ属性の検出を妨げる可能性のあるアーティファクトからイメージをクリーンアップするために事前に作成されています。 - プラグインをクリックしてください |セグメンテーション |訓練可能なWekaセグメンテーション.
- ImageJ のツールバーのライン ツールを使用して、まずフリーハンドツール(選択可能なライン、円形、四角ツールオプション)を使用して、無傷の核の周りをトレースし、[クラス 1の追加]ボックスに追加します。
- ImageJ のツールバーのライン ツールを使用すると、バックグラウンドの領域が[クラス 2]ボックスに表示されます。
- Weka セグメンテーションウィンドウの「新規クラスを作成」ボタンのラベルをクリックし、「ecDNA」というラベルを付けます。DAPI によって染色された核外 DNA を線分にする場合は、(ImageJ ツール バーから)ライン ツールを使用します。
- トレーニング可能な Weka セグメンテーション ウィンドウのトレーニング メニューの [トレーニング分類子] ボタンをクリックします。
注意:[STOP]ボタンは[列車の分類器]ボタンの代わりに表示され、トレーニングが終了するまで残ります。プロセスが中断されるので、トレーニング中にこのボタンをクリックしないでください。 - [結果を作成]ボタンをクリックすると、すべての分類済みコンポーネント(無傷の核、背景、特定されたecDNA)を含む画像が作成されます。
- [確率の取得] ボタンをクリックします。マウスを切り替えて、選択オブジェクトを白で強調表示して、すべてのクラスの白黒画像を表示します。
- 画像をクリックしてこの画像を複製する |複製.
- ecDNAを含むマウスボタンを使用して画面に切り替えます。しきい値を適用して、ecDNAとして識別されたものだけを取得します。しきい値が十分な場合は、[適用] をクリックします。
- しきい値を設定した後、ecDNAではないDNAの領域が増えた場合は、トレーニングされた元の画像に戻り、分類器を追加し、手順2.1~2.13を繰り返します。
- [イメージ |画像調整 |バイナリを作成します。ステップ 2.3 で作成した糸球体 ROI をコピーし、Ctrl + Shift + Eをクリックします。[編集] で Weka ウィンドウをアクティブにする |選択 |復元: 選択範囲を復元します。[パーティクルを解析] をクリックすると、糸球体内の ecDNA パーティクルのみが測定されます。
注: 結果シートは、パーティクルの数、面積、平均ピクセル、ecDNA を含む糸球体の割合で計算されます。これらの結果は、スプレッドシートにエクスポートして保存し、後で統計分析を行うことができます。 - デスクトップの ImageJ アプリにオプション メニューから[分類子を保存] をクリックして、分類子を ecDNA.classifier として保存します。次に、オプションメニューから「データを保存」をクリックし、ecDNA.arffとして ImageJ フォルダに保存します。ROIは、糸球体の大きさと形状が変化するので、毎回手動で追加する必要がありますが、プログラムはecDNAが何であるかを学びました。
- モデルを後続のイメージに再適用するには、新しいイメージを使用して手順 2.1 ~ 2.5 を繰り返します。オプションメニューから「分類器を読み込む」をクリックし、ステップ 2.16 から ImageJ フォルダーのecDNAmodel.classifierをクリックします。ログメニューがポップアップしてモデルが実行されます。
- モデルを実行したら、オプションメニューのデータのロードをクリックし、ステップ2.16からImageJフォルダに保存されたecDNA.arffファイルを選択します。[結果の作成] をクリックします。結果の画像がすべての核を拾うことができなかった場合、バックグラウンドまたはecDNAは再トレーニング分類子をクリックし、分類子を追加して新しいモデルを保存します。手順 2.9 ~ 2.16 を繰り返して、解析プロセスを完了します。
注: 複数の画像を使用して、ecDNAの検出に使用する最終的なモデルを生成できます。これは、モデルを後続のイメージに適用し、分類子を追加して、新しいモデルとデータを ImageJ フォルダに保存することで実現されます。これは、異なるサンプルの背景が高い場合に特に重要です。Weka セグメンテーション プログラムは、一部の手順を自動化するために、コマンドの多くをマクロ記録可能にする ImageJ マクロ言語とも互換性があります。
3. 好中球細胞外トラップとecMPOの測定
注:この方法は、細胞外DNA、シトルリンヒストンペプチジルアルギネーゼ4(PAD4)およびMPOの共局在化によってNETを識別する。
- 抗骨髄ペルオキシダーゼ糸球体腎炎(抗MPO-GN)の20日間モデルを8-10週齢のC57/Bl6マウスで誘導し、コントロール9を用いた。
- CO2チャンバーを用いてマウスを人道的2に安楽死させる。
- はさみで皮膚を通して前正中線切開を行うことによって腎臓を除去し、その後慎重に腹筋を切断し、解剖板にピンバックします。鉗子を使用して、前腎筋膜と頭頂腹を脇に押し出し、腎盂の尿管および血管(腎動脈および静脈)を切断することによって腎臓を自由に切断する。鉗子で取り出し、サイズ22メスで半分(矢状面)に腎臓を切断します。
- 腎臓を固定液(4%緩衝ホルマリン)に室温(RT)で16時間置く。処理前に24時間、固定腎臓を30%エタノールに取り除き、浸します。
- 標準的な6時間サイクルを使用して腎臓を処理する:
70%エタノール15分間
90%エタノール15分間
100%エタノール15分間
100%エタノール20分間
25分間のエタノール100%
30分間のエタノール100%
キシレン 20分間
キシレン 30分間
キシレン 40分間
ワックス 30分間
ワックス 35分
ワックス 40分間
注:腎臓は、目的の抗原を破壊する可能性がありますので、ワックスの熱に長時間暴露しないでください。 - マイクロトーム上で3μmのセクションをカットし、プラス電荷でコーティングされた市販のガラス顕微鏡スライドに取り付けます。一晩乾燥させる
- スライドラックにガラススライドを60°Cのオーブンに入れ、60分間置きます。
注: ステップ 3.3-3.4 は、抗原検索ステップ中にセクションが浮かび上がらないようにするために重要です。 - スライドを2回の溶剤(キシレンまたは代替品)にそれぞれ40分間、ヒュームフードに浸します。
- 100%エタノール中のリハイドレートスライド、100%エタノール、70%エタノールをそれぞれ5分間用いた。
- 水道水で5分間洗います。
- ホットプレートをフュームフードに入れ、圧力鍋にプリボイルド抗原検索溶液(10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0)を入れます。抗原の検索溶液が沸騰し始めるとすぐにトングのペアを使用して、ポットにスライドを水平に置き、蓋をロックします。高い(15 psiまたは103 kPaに相当)で10分間沸騰させます。
注:このステップは、抗原エピトープ(ホルマリン固定法を介して架橋)を解除して目的の抗原を取り出し、エピトープ抗体特異的結合を可能にし、その後の染色はこのステップなしでは機能しません。 - 圧力鍋を熱から取り出し、シンクの蓋の上に冷たいタップを実行してすぐに蓋を取り除きます。スライドを離れ、抗原検索液中で20分間平衡させます。
- リン酸緩衝生理食塩分(PH 7.4,0.01 M)で5分間スライドを軌道シェーカーで2回洗浄します。
- この時間に組織を乾燥させないように注意して腎臓組織の周りに円を描くために疎水性ペンを使用してください。
- 5%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBS(pH 7.4,0.01 M)の10%ニワトリセラで30分間、60μLのブロック組織。このステップの後は洗わないが、60 μLピペットを使用してブロッキング溶液を慎重に取り除いてください。セクションを乾燥させないでください。
- 1チューブで1%BSA/PBS(pH 7.4,0.01 M)に希釈した一次抗体のカクテルを作ります。腎臓切片ごとに60μLを塗布する。一次抗体の濃度は次の通りである。
ウサギ抗ヒト/マウスH3Cit 1/100
マウス抗ヒト/マウスPAD4 1/50
ヤギ抗人間/マウスMPO 1/200 - 湿度チャンバーで4°Cで一晩インキュベート。
- 軌道シェーカー上のPBS(pH 7.4,0.01 M)でスライドを5分間2回洗浄します。
- 2次抗体のカクテルを1チューブで作ります。二次抗体は、次のように1%BSA/PBS、60μLのセクションに適用されます。
チキンアンチウサギ 488 1/200.
チキンアンチマウス647 1/200。
チキンアンチヤギ594 1/200。 - RTで40分間インキュベートします。
- 軌道シェーカー上のPBS(pH 7.4,0.01 M)でスライドを5分間2回洗浄します。
- 2次抗体1:200を1%BSA/PBS(pH 7.4,0.01 M)に1セクションあたりRT 60 μLで40分間塗布します。
- 軌道シェーカー上のPBS(pH 7.4,0.01 M)でスライドを5分間2回洗浄します。
- 0.3%スーダンブラックにスライドを70%エタノールに30分間浸します。
- 水道水でスライドを洗浄して沈殿物を除去し、PBS(pH 7.4,0.01 M)に10分間浸して、さらにスーダンブラック沈殿が形成されるのを防ぎます。
- DAPIを使用して3つの60 μLの取り付けソリューションを使用して、スライドをコンフォーカルガラスカバーリップにマウントします。カバースリップの周囲に塗布して、カバーリップをマニキュアで密封します。
- スライドがRTで24時間硬化し(DAPIが浸透するように)、光から保護された4°Cで保存することができます。蛍光プローブの退色を防ぐために暗闇の中に保管してください。
- 顕微鏡に取り付けられた共焦点レーザー走査ヘッドを用いて画像スライド。DAPI 用 405 レーザー、H3Cit 用 488 レーザー、MPO 用 561、PAD4 の場合は 647 を使用して、エキサイト スライドします。ecDNAの検出に不可欠なラインシーケンシャルキャプチャと4ライン平均を使用して、単一平面1024x1024ピクセル画像をキャプチャします。40x 1.0 NAのオイルの目的を使用してください。サンプルあたり最低20個の糸球体を画像化します。ND2ファイルとして画像を保存します。
4. 好中球細胞外トラップとecMPO分析
- イメージJをインストールします: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
- [プラグイン] の下で、トレーニング可能な Weka セグメンテーションが利用可能であることを確認する |セグメンテーション |訓練可能なWekaセグメンテーション.
- イメージを ImageJ にドロップします。[イメージ |色 |チャネルの分割:青でDAPIが青い色の1つの画像が表示され、H3Citが緑色に、1つの画像が赤でMPO、PAD4が白で1つの画像が表示されます。
- 色 |チャネルの結合:ポップアップ ボックスは、各チャネルに色を割り当てるように求めます。各チャネルに色を割り当てた後、[合成の作成] ボックスと [ソース イメージの保持] ボックスにチェックマークを付けて[OK]をクリックします。マージされたイメージが表示されます。以前の ecDNA のプロトコルとは異なり、コンポジット イメージを使用して残りの手順を実行します。
- 合成画像にガウスブラーを実行します。これは核の滑らかにすることを可能にする。[プロセス] をクリックして 、フィルタ |ガウスブラー、1.00-2.00に入れて。画像は少しぼやけて見えますが、核は滑らかになり、背景は柔らかくなります。
注: この手順は、ノイズを除去して、関連するイメージ属性の検出を妨げる可能性のあるアーティファクトからイメージをクリーンアップするために事前に作成されています。 - プラグインをクリックしてください |セグメンテーション |訓練可能なWekaセグメンテーション.分析対象の画像と Weka セグメンテーション固有のメニューツールを含む全く新しいウィンドウが表示されます。
- ツールバー(ImageJ)のラインツールを使用して、最初にフリーハンドツールを使用して4つのNETコンポーネント(MPO、PAD4、DAPI、H3Cit)すべてで正の無い無傷の核の周りをトレースし、次にクラス1の追加ボックスに追加します。
- ImageJ ツール バーのライン ツールを使用すると、バックグラウンドの領域が[クラス 2]ボックスに表示されます。
- ラベルメニューの「新規クラスを作成」ボタンのラベルをクリックし、「NETs」というラベルを付けます。ライン ツールを使用して、共局化 DAPI (青)、MPO (赤)、PAD4 (白)、およびシトルリン化ヒストン (緑) として識別される NETS を示します。
- ラベルメニューの「新規クラスを作成」ボタンのラベルをクリックし、「ecMPO」というラベルを付けます。ライン ツールを使用して、セルフリーの MPO (赤) を示します。
- トレーニング可能な Weka セグメンテーション ウィンドウのトレーニング メニューの [トレーニング分類器] ボタンをクリックします。
注意:[STOP]ボタンは[列車の分類器]ボタンの代わりに表示され、トレーニングが終了するまで残ります。トレーニング中にこのボタンをクリックしないでください、プロセスが中断されます。 - トレーニングメニューの[結果を作成]ボタンをクリックすると、すべての分類されたコンポーネント(無傷の核、背景、ecMPOとして識別されたもの)で画像が作成されます。
- トレーニングメニューの[確率を取得]ボタンをクリックします。マウスを切り替えて、選択オブジェクトを白で強調表示して、すべてのクラスの白黒画像を表示します。
- 画像をクリックして、NET確率とecMPO確率画像の両方を複製する |複製.
- NET を含むマウス ボタンを使用して画面に切り替えます。特定された NET の強調表示のみを確認するには、しきい値を適用します。ImageJ メニューツールバーで、画像|調整 |しきい値:スライド式トグルバーを移動して、NET コンポーネントがハイライト表示されるまで移動します。しきい値が満たされたら、[適用] をクリックします。ecMPO についても同じ手順を繰り返します。
- しきい値を設定した後も ecMPO または NET の検出領域がある場合は、トレーニング済みの元のイメージに戻り、分類子を追加して手順 4.1 ~ 4.14 を再適用します。
- [イメージ |画像調整 |バイナリを作成します。ステップ 4.3 で作成した糸球体 ROI をコピーし、Ctrl+ Shift + Eをクリックします。編集で Weka ウィンドウをアクティブにする |選択 |復元: 選択範囲を復元します。[パーティクルを解析]をクリックして、糸球体内の NET パーティクルのみを測定します。
- ecMPO を含むマウスボタンを使用して画面に切り替えます。指定された ecMPO のみが取得されるようにしきい値を適用します。しきい値が満たされたら、[適用] をクリックします。上記のステップ 4.16 を繰り返します。
注: 結果シートは、粒子の数、面積、平均ピクセル、および NET と ecMPO の両方を含む糸球体の割合で計算されます。これらの結果は、スプレッドシートに入れて保存し、後で統計分析を行うことができます。 - オプションメニューから「分類子を保存」をクリックし、デスクトップ上の ImageJ アプリケーション (ImageJ フォルダー) にファイルを保存して、分類子を NETs.classifier として保存します。次に、オプションメニューから「データを保存」をクリックし、NETs.arffファイルとして保存します。糸球体ROIは、糸球体の大きさと形状が変化するので、毎回手動で追加する必要がありますが、プログラムはNETとecMPOの両方が何であるかを学びました。
- モデルを後続のイメージに再適用するには、新しいイメージを使用して手順 4.1 ~ 4.5 を繰り返します。オプション メニューから[分類子を読み込み]をクリックします。ImageJ フォルダでNets.classifierをクリックします。モデルが実行されると、モデルがポップアップして実行され、モデルが起動し、オプションメニューのデータのロードをクリックしてNETs.arffファイルを選択します。
- [結果の作成] をクリックします。結果の画像がすべての核を拾うことができなかった場合、バックグラウンドまたはecDNAは再トレーニング分類子をクリックし、分類子を追加して新しいモデルを保存します。手順 4.11 ~ 4.19 を繰り返して、解析プロセスを完了します。
注: ecDNA、ecMPO、および NET の検出に使用される最終的なモデルを生成するために、いくつかの画像を使用できます。これは、モデルを後続のイメージに適用し、分類子を追加して、新しいモデルとデータを ImageJ フォルダに保存することで実現されます。これは、異なるサンプルの背景が高い場合に特に重要です。Weka セグメンテーション プログラムは、多くのコマンドをマクロ記録可能にして一部の手順を自動化できる ImageJ マクロ言語と互換性があります。
- [結果の作成] をクリックします。結果の画像がすべての核を拾うことができなかった場合、バックグラウンドまたはecDNAは再トレーニング分類子をクリックし、分類子を追加して新しいモデルを保存します。手順 4.11 ~ 4.19 を繰り返して、解析プロセスを完了します。
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Representative Results
これらの画像は、誘導抗MPO GNを有するマウスから蛍光染色されたFFPE腎臓組織におけるecDNAの労力集約的な手動測定を最小限に抑えるために、トレーニング可能なWekaセグメンテーションを正常に使用するために必要な複数のステップを表しています。これらの手順は、図1と図 2に、Weka セグメンテーション プログラムから直接撮影された画像と共に、分析プロセスのすべてのステップを概説したものです。この分析からの測定値は、プログラムが糸球体に堆積する異なる量のecDNAを、対照組織において、誘導抗MPO GNなしで決定する能力を示す図3に示される。図4は、ecDNAのモデルが、コントロール患者(最小変化疾患患者は組織学的レベルで明らかな最小限の糸球体損傷を有する)から腎臓生検検中のecDNAを同定するために適応し、MPO-AAV患者からの腎臓生検と比較することを示している。図5は、腎臓組織内の他の汚れに対するこのプログラムの翻訳能力を示す。我々は、NETおよびecMPOの染色に誘発された実験的抗MPO GNを有するマウス腎臓からの代表的なサンプルを使用した。その後、トレーニング可能な Weka セグメンテーション プログラムを使用して、同じイメージ内で NETS と ecMPO の両方を識別します。図6は、2人の独立したユーザーが分析した同じデータセットでのecDNA定量の量に有意な差がないことを示しています。
図1:トレーニング可能なWekaセグメンテーションを用いた実験MPO-ANCA GNからのマウス腎臓糸球体内の核、背景および細胞外DNAの分類を示す画像。(A)DNAを染色するDAPI(青)、βアクチン(緑色)を染色する単一チャネル画像、および、測定する糸球体領域を示す目的領域(ROI)を有する複合ファイルを示す。(B) モデル(ピンク)と未分類の核(青色)を開発するためのインタクト核の分類。(C) 背景と見なされるものの分類 (緑)。(D) ecDNAと見なされるものの分類 (紫色)(E) 赤で核、緑の背景、紫のecDNA領域を示す訓練可能なWekaセグメンテーションによって生成されたモデル。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 不正確さを減らすためにモデルの監視対象コンポーネントを示す画像。Weka モデルは、未分類のコンポーネントで各分類子を認識する確率を生成します。(A) モデル生成した、無傷の核とは何かの分類。(B) 背景と見なされるもののモデル生成分類。(C) ecDNAが考慮されるモデルの生成。(D) 閾値のない分類済み ecDNA の画像を示す。(E) e ) e で示された ecDNA で識別されたエラーを除外するしきい値の調整を示します。(F)しきい値は画像に適用され、粒子分析のためにバイナリイメージにします。(G)糸球体ROIは画像に重ね合わされるので、球状のecDNAのみが解析される。(H) 解析から生成された結果の概要を表示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:トレーニング可能なWekaセグメンテーションを用いた実験的MPO-ANCA GNを誘発することなく、コントロールマウスからマウス腎臓糸球体リ内の核、背景および細胞外DNAの分類を示す画像。(A) 解析対象の糸球体領域、トレーニング、トレーニングされたモデル結果(背景緑、赤、ecDNA)を紫色で識別した元のマージされた画像を示します。(B)同定、核、背景およびecDNAのモデル確率を示す。(C) モデルが ecDNA として分類および識別したものの結果を、任意の単位で表示する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:検査可能なWekaセグメンテーションを示す画像は、最小変化疾患を有する患者およびMPO-ANCA血管炎患者からのヒト腎臓生検におけるecDNAの分析に適応可能である。(A) 最小 ecDNA が、トレーニング可能な Weka セグメンテーション インタクト核 (赤)、背景(緑)、ecDNA (紫) を使用して検出されることを示しています。(B)MPO-ANCA血管炎無傷核(赤)、背景(緑色)およびecDNA紫の患者からの患者腎臓生検におけるかなりの量のecDNAを示す。B結果は、活動性MPO ANCA血管炎(180粒子)を有する患者と比較して、MCD患者の糸球体領域内で8個のecDNA粒子が見つかったことを示している。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:トレーニング可能なWekaセグメンテーションは、実験MPO-ANCA GNからマウス腎臓組織で、同じ画像およびモデル分析内のNETSおよびecMPOを同定するために使用することができる。(A)NETs(緑(シトルリネートヒストン3)、赤(MPO)DAPI(核)およびPAD4(白)の共局在化を伴う糸球体を示す。AecMPO はセルフリーであると考えられます。(B)分類器の同定のためのトレーニング,赤(無傷核),緑(背景),紫(NET)および黄色(ecDNA))。(C) 列車化可能な Weka セグメンテーションは、NET と ecMPO、赤 (インタクト核)、緑 (背景)、紫 (NET) および黄色 (ecDNA) を分類するために使用します。(D) モデルが NETs と判断した内容の粒子分析。(E)モデルが ecMPO と判断したものの粒子分析。(F) NET と ecDNA の両方の粒子分析の結果シート。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ecDNA検出モデルの設計における2人の独立ユーザーの比較(A) 分析対象のDAPI、ベータアクチン、マージされた画像を示すオリジナル画像。(B) 2人の独立したユーザー間のトレーニングモデル、分類子、閾値および糸球体ROIの比較。黄色の矢印は、ユーザー 2 が背景を削除するためにモデルを再トレーニングする必要があることを示します。(C) 生成された結果は、ecDNAの数、総面積、面積の割合、および境界の比較を示し、2ユーザー間で行います。(D) 2人の独立した研究者から、糸球体の中で検出されたecDNAの数と% 面積との間に有意な差を示さない結果のグラフ。<0.05 に設定された有意性を持つマン・ホイットニー U 検定を使用して実行される統計分析。サンプルサイズはn=6です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
糸球体腎炎の患者およびマウスモデルの血清および尿中の炎症促進マーカーを測定する複数のプロトコルが存在する。この記述されたプロトコルは糸球体の中の細胞死の産物(ecDNA、NETおよびecMPO)を直接分析することを可能にする。このプロトコルの最も重要なステップは、組織の準備とイメージングです。蛍光染色法を用いて分析する主な制限要素は、組織自家蛍光です。ホルマリン固定パラフィン組織は、特定の蛍光染色を覆い隠すことができる自己蛍光の対象となります。スライドがスーダンブラックに浸漬される染色法の最終工程では、組織の自己蛍光を減衰させ、信号対雑音比19の低減を通じて抗体特異的染色の照明を可能にする。この組織のイメージングは、ecDNAおよびMPOの小さな断片を検出できるように、少なくとも40倍の油倍率で行う必要があります。イメージングを取得する場合、あるマーカーから別のマーカーへの蛍光の出血を防ぐために、連続したラインで行うことは重要です。
分析用のプロトコルの利点は、誰でも16にアクセスするために、ImageJを通じてオープンアクセスで利用できることです。我々は、この方法が腎臓組織内の異なる蛍光マーカーを測定するために容易に適応できることを本明細書で実証した。トレーニング可能な Weka セグメンテーションのモデルが決定されると、バイアスなしで、各画像が分析されたのとまったく同じ方法で、後続の画像に適用できます。分析の教師ありの性質により、セグメンテーションのエラーを、「訓練された」画像をしきい値にするか、プログラムを再トレーニングして分類器を追加する追加の手順を通じて調整することができます。このプログラムの利点は、2 人の異なるユーザーが同じモデルを使用して同様の結果を得ることです。2人の異なるエンドユーザーによる再現性の最大の不正確さは、人々が糸球体の房の周りをトレースする異なる方法によって作成されます。たとえば、ある人が糸球体の房の周りに大まかな円を描き、別のユーザーが最も外側の毛細管ループの周りに慎重に描くと、検査される領域は異なります(結果に示されているように)。したがって、両方のユーザーが同じ方法で糸球体の房を識別するように訓練することが不可欠です。このプログラムの実際の応用は、2人のユーザーが複数の画像上でモデルを一緒に設計し、さらにデータセットに適用される堅牢なモデルを構築することです。分類子のトレーニングに使用される画像が多いほど、モデルはより正確になります。
このプロトコルの制限は、共焦点顕微鏡が検出できるものよりも小さいecDNAの断片の測定であろう。これは、超解像度の顕微鏡法を使用して画像をキャプチャし、それらの画像にトレーニング可能なWekaセグメンテーションを適用することで克服することができます。機械学習の教師付きコンポーネントは、余分な手順を追加し、大量の画像セットをバッチ処理する機能を減らします。しかし、結果の中で示したように、教師なしモデルは精度を低下させ、監督されたコンポーネントを導入すると不正確さが大幅に減少しました。
我々は以前、細胞外トラップを産生する好中球に加えて、単球/マクロファージがヒトANCA血管炎において細胞外トラップ(METと呼ぶ)を産生することも観察されたが、より小さな割合で1であると発表した。本明細書に記載されている現在の方法は、好中球または単球/マクロファージによって産生される細胞外トラップを区別しない。ほとんどの共焦点顕微鏡はレーザーの数によって制限されるため、これを達成することは困難です。NETsの同定には4つの異なるレーザーが必要なため、標準的な共焦点イメージングで処理できるセルマーカーの数を制限します。原産地のMPO陽性細胞が必要な場合は、第2のシリアルセクションを好中球またはマクロファージ/単球マーカーのいずれかで染色することができ、細胞外トラップを産生する細胞タイプを同定する。
MPO-ANCA血管炎の病理学的特徴は、腎臓20の糸球体内のecDNA、NETSおよびecMPOの堆積を含む。NETsおよびecMPO内のDNAを治療的に標的化し、疾患のマーカーとしてヒト生検で測定することは、最近の研究11、20、21、2220,21,22の対象となっている。この分野におけるこれらの方法の重要性は、標的臓器内のecDNA、NETおよびecMPOの相対的な割合を正確に決定し、再現性が低く、時間のかかる方法で行う。結論として、ecDNA、NET、ecMPO用の取得画像の大規模なデータセットの分析を半自動化する、監視機械学習ツールのトレーニング可能なWekaセグメンテーションを実証しました。このツールを使用すると、画像解析時間が大幅に短縮され、他の臓器の他の汚れに簡単に適応することができます。
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Disclosures
開示するものは何もありません。
Acknowledgments
我々は、ニコンC1直立共焦点レーザー走査顕微鏡と腎臓組織の処理のためのモナッシュ組織学プラットフォームの使用のためのモナッシュマイクロイメージングを認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
References
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