Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Veiledet maskinlæring for semikvantifisering av ekstracellulært DNA i Glomerulonefrit

Published: June 18, 2020 doi: 10.3791/61180
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

Summary

Ekstracellulært DNA (ecDNA) utgitt under celledød er proinflammatorisk og bidrar til betennelse. Måling av ecDNA på skadestedet kan bestemme effekten av terapeutisk behandling i målorganet. Denne protokollen beskriver bruken av et maskinlæringsverktøy for å automatisere måling av ecDNA i nyrevev.

Abstract

Glomerulær celledød er et patologisk trekk ved myeloperoxidase anti nøytrofilt cytoplasmatisk antistoff assosiert vaskulitt (MPO-AAV). Ekstracellulær deoksyribonuklesyre (ecDNA) frigjøres under ulike former for celledød, inkludert apoptose, nekrose, nøytrofil ekstracellulære feller (NETs) og pyroptose. Måling av denne celledøden er tidkrevende med flere forskjellige biomarkører som kreves for å identifisere de forskjellige biokjemiske former for celledød. Måling av ecDNA utføres vanligvis i serum og urin som surrogat for nyreskade, ikke i selve målorganet der den patologiske skaden oppstår. Den nåværende vanskeligheten med å undersøke ecDNA i nyrene er mangelen på metoder for formalin fast parafin innebygd vev (FFPE) både eksperimentelt og i arkiverte menneskelige nyrebiopsier. Denne protokollen gir et sammendrag av trinnene som kreves for å flekke for ecDNA i FFPE-vev (både menneskelig og murine), slukke autofluorescens og måle ecDNA i de resulterende bildene ved hjelp av et maskinlæringsverktøy fra den offentlig tilgjengelige åpen kildekode ImageJ plugin trainable Weka segmentering. Trainable Weka segmentering brukes på ecDNA i glomeruli hvor programmet lærer å klassifisere ecDNA. Denne klassifikatoren brukes på etterfølgende ervervede nyrebilder, noe som reduserer behovet for manuelle merknader av hvert enkelt bilde. Tilpasningsevnen til den togbare Weka-segmenteringen er demonstrert videre i nyrevev fra eksperimentell murine anti-MPO glomerulonefritt (GN), for å identifisere NETs og ecMPO, vanlige patologiske bidragsytere til anti-MPO GN. Denne metoden gir objektiv analyse av ecDNA i nyrevev som viser tydelig effekten der det trainable Weka segmenteringsprogrammet kan skille ecDNA mellom sunt normalt nyrevev og sykt nyrevev. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å identifisere ecDNA, NETs og ecMPO i andre organer.

Introduction

Myeloperoxidase anti nøytrofilt cytoplasmatisk antistoff assosiert vaskulitt (MPO-AAV) er en autoimmun sykdom som resulterer i nyresvikt fra patologisk glomerulær skade med betydelig celledød og frigjøring av deoksyribonuklesyre (DNA)1,2. DNA kan aktivere immunsystemet ved å fungere som et faresignal. Under normale sunne forhold gir den kjernefysiske plasseringen av DNA beskyttelse mot eksponering for immunsystemet. Selv-DNA som frigjøres ekstracellulært under enten patogene prosesser eller autoimmunitet er sett av immunsystemet som en potent proinflammatorisk skade assosiert molekylært selvprotein (DAMP)3. Ekstra cellulær DNA (ecDNA) frigjøres fra døende celler gjennom flere forskjellige mekanismer som styres av distinkte biokjemiske veier, som apoptose, nekrotose nøytrofil ekstracellulær felledannelse (NETs), nekrose eller pyroptose4,5,6,7,8.

Vi beskriver heri metoder for å flekke og måle ecDNA utgitt fra døende celler i deler av formalin fast parafin innebygd (FFPE) nyrer fra eksperimentelle anti-MPO GN og nyre biopsier fra pasienter med MPO-AAV9,10. Det finnes flere metoder for påvisning av sirkulerende dobbeltstrandet DNA (dsDNA) og DNA-komplekser fra både serum og urin og fra in vitro-analyser11,,12. Disse metodene, selv om de er nøyaktige for å bestemme mengden ecDNA, bestemmer ikke hvor ecDNA frigjøres anatomisk. Det finnes metoder som beskriver spesifikk måling av ecDNA som tunel for apoptose og måling av cellerester13,14. Det finnes ingen metode som beskriver måling av ecDNA som kulminerte fra alle former for celledød i FFPE-nyrer hvor den patologiske skaden oppstår. Dette er viktig for å avgjøre om eksperimentelle terapeutiske behandlinger fjerner ecDNA fra steder av patologisk skade i selve målorganet.

Oppkjøpet av flere bilder fra nyreprøver skaper et høyt volum data som analyseres ofte av en enkelt bruker. Dette er arbeidskrevende, tidkrevende og kan være underlagt upålitelig reproduserbarhet av andre brukere, på grunn av brukerbias. Trainable Weka segmentering er en åpen kildekode programvare plugin for ImageJ som bruker cutting edge bioinformatikk verktøy for å klassifisere piksler ved hjelp av maskinlæringalgoritmer 15,16. Denne metoden er "trainable" der den lærer av brukerens klassifisering av segmenter av piksler og bruker den nye lært klassifisering til andre bilder. Denne metoden er avhengig av vanlige analyseverktøy i ImageJ-programmet som brukes til å "klassifisere" hver piksel i et segment som tilhører en bestemt "klasse". Når programmet lærer "klassifikatorer", kan de brukes til å identifisere andre lignende klassifiserte segmenter i samme bilde. Denne modellen lagres og brukes deretter på andre sett med bilder i samme eksperiment.

Nåværende hindringer for å bestemme ecDNA in situ i nyreseksjoner er endogene autofluorescens fra fiksering i formalin og den arbeidsintensive analysen av bildene. Vi beskriver her hvordan å slukke denne autofluorescensen, oppdage ecDNA, og bruke overvåket maskinlæring for høy gjennomstrømningsmåling av ecDNA. Vi har tidligere publisert måling av NETs og ekstracellulær MPO (ecMPO) ved hjelp av en makro i ImageJ, vi viser nå semi automatisering av disse metodene ved hjelp av overvåket maskinlæring1. Vi demonstrerer tilpasningsevnen til maskinlæringsverktøyet, for å klassifisere en alternativ flekk for NETs og ecMPO i samme bilde. Disse fargemetodene som er beskrevet her for å oppdage ecDNA, NETs og ecMPO kan oversettes til andre faste organer og sykdommer der ecDNA, NETS og ecMPO spiller en rolle i å opprettholde sykdom som revmatoid artritt og lupus17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne metoden muliggjør deteksjon av pan ecDNA fra alle former for celledød. Den samme metoden og antistoffer brukes til humant nyrebiopsivev (fra trinn 4). Alle dyre- og menneskefag hadde etikkgodkjenning fra Monash University, og Monash Health, Clayton, Victoria, Australia.

1. Farging for ecDNA med DAPI og β-Actin

  1. Indusere en 20 dagers modell av anti-myeloperoxidase glomerulonefritt (anti-MPO-GN) i 8-10 uker gamle C57/Bl6 mus, med kontroller9.
    1. Euthanize mus humant ved hjelp av et CO2-kammer.
    2. Fjern nyrene ved å gjøre et fremre midtlinjesnitt gjennom huden med saks, og kutt deretter bukhinnen forsiktig og pin tilbake på et disseksjonsbord. Ved hjelp av tang skyve til side fremre nyre fascia og parietal peritoneum og kutte nyre fri ved å kutte ureter og blodkar (nyrearterien og venen) på nyrebekkenet. Fjern med tang og kutt nyrene i halvparten (sagittal plan) med en størrelse 22 skalpell.
    3. Plasser nyrene i fikseringsmiddel (4 % bufret formalin) i 16 timer ved romtemperatur (RT). Fjern og suge fast nyre i 30% etanol i 24 timer før behandling.
  2. Behandle nyrer ved hjelp av en standard 6-timers syklus:
    70% etanol i 15 min
    90% etanol i 15 min
    100% etanol i 15 min
    100% etanol i 20 min
    100% etanol i 25 min
    100% etanol i 30 min
    Xylen i 20 min
    Xylen i 30 min
    Xylen i 40 min
    Voks i 30 min
    Voks i 35 min
    Voks i 40 min
    MERK: Dette er viktig da nyrer ikke skal utsettes for langvarig eksponering for varme i voksen, da det kan ødelegge antigener av interesse.
  3. Klipp 3 μm seksjoner på en mikrotom og monter på kommersielt tilgjengelige glassmikroskopsklier belagt med en positiv ladning. La det tørke over natten.
  4. Sett glasssklier i et glidestativ i en 60 °C ovn i 60 min.
    MERK: Trinn 1.3 og 1.4 er avgjørende for å sikre at seksjonene ikke flyter av under antigenhentingstrinnet.
  5. Senk skliene i to endringer i løsemiddel (xylen eller erstatning) i 40 min hver, i en røykhette.
  6. Rehydrere lysbilder i 100% etanol, 100% etanol, 70% etanol i 5 min hver. Vask i 5 min i vann fra springen.
  7. Legg en kokeplate i en røykhette og preboil antigengjenfinnende oppløsning (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) i en trykkoker. Så snart antigengjenfinningsløsningen begynner å koke, plasser lysbildene i potten horisontalt ved hjelp av et par tang og lås lokket. Kok på høy (tilsvarer 15 psi eller 103 kPa) i 10 min.
    MERK: Dette trinnet er avgjørende da det henter antigen av interesse ved å avdekke antigenepitop (kryss koblet via formalin fiksering) for å tillate epitop antistoff spesifikk binding den påfølgende flekker vil ikke fungere uten det.
  8. Fjern trykkokeren fra varme og fjern lokket umiddelbart ved å kjøre kald kran på toppen av lokket i en vask. La lysbildene likevekt i 20 min i antigengjenfinningsoppløsningen.
  9. Vask skliene to ganger i 5 min i 0,01 M fosfatbufret saltvann (PBS) (pH 7.4) på en orbital shaker.
  10. Bruk en hydrofob penn til å tegne sirkler rundt nyrevevet være forsiktig så du ikke lar noe vev tørke ut i denne tiden.
  11. Blokker vev i 10% kylling sera i 5% storfe serum albumin (BSA) / PBS (pH 7,4, 0,01 M) for 30 min, 60 μL per seksjon. Ikke vask etter dette trinnet, men fjern forsiktig blokkeringsløsningen ved hjelp av en 60 μL pipette, ikke la seksjonene tørke ut.
  12. Påfør primær antistoffcocktail for β-actin fortynnet 1/1000 i 1 % BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 μL per snitt og inkuber over natten i et fuktighetskammer ved 4 °C.
  13. Vask skliene to ganger i 5 min i PBS (pH 7.4, 0.01 M) på en orbital shaker.
  14. Påfør sekundært antistoff, kyllingantikanin 488 (1/200), 60 μL per seksjon fortynnet i 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) i 40 min ved RT.
  15. Vask lysbildene to ganger i 5 min i PBS (pH 7.4, 0.01 M) på en orbital shaker.
  16. Fordyp lysbildene i 0,3% Sudan Black i 70% etanol i 30 min i en Coplin krukke.
    MERK: Dette trinnet er viktig da det slukker autofluorescensen forårsaket av formalin fiksering.
  17. Vask lysbildene i vann fra springen for å fjerne bunnfall og deretter nedsenke i PBS (pH 7.4, 0.01 M) i 10 min for å hindre ytterligere Sudan Black utfelling fra forming.
  18. Monter lysbildene på konfuserende glassdeksler ved hjelp av tre 60 μL dråper monteringsløsning med DAPI og forsegle dekkslipsene med neglelakk ved å påføre rundt omkretsen av dekkslip.
  19. La lysbildene kurere i 24 timer ved RT (for å tillate DAPI å trenge inn) og deretter lagre ved 4 °C beskyttet mot lys.
    MERK: Viktig å holde i mørket for å hindre falming av fluorescerende sonder.
  20. Bildelysbilder ved hjelp av et konfikalt laserskanningshode festet til et mikroskop. Opphisse lysbilder med 405 laser for DAPI og 488 Laser for Beta Actin. Ta enkeltplan 1024 x1024 pixel bilder ved hjelp av line-sekvensiell fangst og 4-linje snitt, noe som er viktig for å oppdage ecDNA. 40x 1.0 NA oljemål brukes.
    1. Bilde minst 20 glomeruli per prøve. Lagre bilder som ND2-filer.

2. DAPI- og β-Actin-analyse

  1. Installer ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Kontroller at den lærbare Weka-segmenteringen er tilgjengelig under Programtillegg | Segmentering | Trenbar Weka Segmentering.
  3. Slipp bildet på imagej-verktøylinjen. Klikk på Bilde | Farge | Delte kanaler. Ett bilde med DAPI i blå farging alle kjerner vil vises og 1 bilde med β-actin i grønt vil vises, som avgrense glomeruli.
    1. Opprett en flettet fil av enkeltbildene for å tegne et område av interesse (ROI) for glomerulus ved å klikke på Farge | Slå sammen kanaler. En popup-boks vil be om å tilordne en farge til hver kanal. Når du har tilordnet hver kanal en farge, merker du av for Opprett kompositt og Behold kildebilder-boksen og klikker Ok. Et sammenslått sammensatt bilde vises.
    2. Bruk β-actin farging som en guide, tegne en avkastning rundt glomerulær tuft. Hold dette bildet til side for å bruke avkastningen på slutten av denne protokollen.
  4. Utfør en gaussisk uskarphet på det blå DAPI-bildet. Klikk prosess | Filtre | Gaussian Blur, satt i 1-2.00. Bildet vil nå se litt uskarpt ut, men kjerner er nå glatte og bakgrunnen myknet.
    MERK: Dette trinnet er forhåndsformet for å fjerne støy for å rydde opp i bildet fra artefakter som kan forhindre relevant påvisning av bildeattributter som skal analyseres.
  5. Klikk på Plugins | Segmentering | Trenbar Weka Segmentering.
  6. Ved hjelp av linjeverktøyet på verktøylinjen i ImageJ, må du først spore rundt intakte kjerner ved hjelp av de frie håndverktøyene (det finnes alternativer for linje, sirkulære og firkantede verktøy tilgjengelige å velge mellom) og deretter legge til Legg til klasse 1-boksen.
  7. Bruk linjeverktøyet på verktøylinjen i ImageJ avgrense bakgrunnsområder til klasse 2-boksen.
  8. Klikk på Opprett ny klasse-knappen etiketten i Weka-segmenteringsvinduet og etiketten "ecDNA". Bruk linjeverktøyet (fra ImageJ-verktøylinjen) til å avgrense ekstranukleært DNA farget av DAPI.
  9. Klikk på Togklassifikator-knappen i treningsmenyen i vinduet for treddbar Weka-segmentering.
    MERK: STOP-knappen vises i stedet for Train Classifier-knappen og forblir til treningen er ferdig. Ikke klikk på denne knappen under trening som prosessen vil bli avbrutt.
  10. Klikk på Opprett resultat-knappen for å lage et bilde med alle klassifiserte komponenter, bestående av intakte kjerner, bakgrunnen og identifisert ecDNA.
  11. Klikk på Knappen Få sannsynlighet. Veksle musen for å gi et svart-hvitt bilde av alle klassene med objektet av utvalg uthevet i hvitt.
  12. Dupliser dette bildet ved å klikke på Bilde | Dupliser.
  13. Slå til skjermen ved hjelp av museknappen som inneholder ecDNA. Bruk en terskel for å få bare det som er identifisert som ecDNA. Klikk Påfør når terskelen er tilstrekkelig.
  14. Hvis det etter terskel, er det flere områder av DNA som ikke er ecDNA, gå tilbake til det opprinnelige trente bildet, legg til flere klassifikatorer og gjenta trinn 2.1-2.13.
  15. Klikk på Bilde | Bildejustering | Gjør binær . Kopier den glomerulære avkastningen som er gjort i trinn 2.3, og klikk Ctrl+Skift+E. Aktivere Weka-vinduet ved å redigere | Valg | Gjenopprett, som gjenoppretter valget. Klikk analyser partikler, som bare vil måle ecDNA-partiklene i glomerulus.
    MERK: Et resultatark beregnes med antall partikler, området, gjennomsnittspiksler og prosentandelen av glomerulus som inneholder ecDNA. Disse resultatene kan eksporteres til et regneark og lagres, for senere statistisk analyse.
  16. Lagre klassifikatoren som ecDNA.classifier ved å klikke Lagre klassifikator fra alternativmenyen i ImageJ-appen på skrivebordet. Klikk deretter Lagre data fra alternativmenyen og lagre som ecDNA.arff i ImageJ-mappen. Avkastningen må legges til manuelt hver gang som glomerulus størrelse og form vil endres, men programmet har lært hva ecDNA er.
  17. Hvis du vil bruke modellen på følgende bilder på nytt, gjentar du trinn 2.1-2.5 med et nytt bilde. Klikk Last inn klassifikator fra alternativmenyen og deretter ecDNAmodel.classifier i ImageJ-mappen fra trinn 2.16. Loggmenyen vil dukke opp og kjøre modellen.
  18. Når modellen har kjørt, klikker du på Last inn data i alternativmenyen og velger ecDNA.arff-filen som er lagret i ImageJ-mappen fra trinn 2.16. Klikk på Opprett resultat. Hvis det resulterende bildet ikke har klart å plukke opp alle kjerner, bakgrunn eller ecDNA klikk på re-train klassifikator og legge til flere klassifikatorer og lagre den nye modellen. Fullfør analyseprosessen ved å gjenta trinn 2.9-2.16.
    MERK: Flere bilder kan brukes til å generere den endelige modellen som brukes til å oppdage ecDNA. Dette oppnås ved å bruke modellen på etterfølgende bilder, legge til flere klassifikatorer og lagre den nye modellen og dataene i ImageJ-mappen. Dette kan være spesielt viktig når ulike prøver har høyere bakgrunn. Weka Segmentering programmet er også kompatibelt med ImageJ makrospråk som gjør det mulig for mange av kommandoene å være makro postable å automatisere noen av trinnene.

3. Måling av nøytrofile ekstracellulære feller og ecMPO

MERK: Denne metoden identifiserer NETs ved colocalization av ekstracellulær DNA, Citrullinated Histones peptidyl arginase 4 (PAD4) og MPO.

  1. Indusere en 20 dagers modell av anti-myeloperoxidase glomerulonefritt (anti-MPO-GN) i 8-10 uker gamle C57/Bl6 mus, med kontroller9.
    1. Euthanize mus humant ved hjelp av et CO2-kammer.
    2. Fjern nyrene ved å gjøre et fremre midtlinjesnitt gjennom huden med saks, og kutt deretter bukhinnen forsiktig og pin tilbake på et disseksjonsbord. Ved hjelp av tang skyve til side fremre nyre fascia og parietal peritoneum og kutte nyre fri ved å kutte ureter og blodkar (nyrearterien og venen) på nyrebekkenet. Fjern med tang og kutt nyrene i halvparten (sagittal plan) med en størrelse 22 skalpell.
    3. Plasser nyrene i fikseringsmiddel (4 % bufret formalin) i 16 timer ved romtemperatur (RT). Fjern og suge fast nyre i 30% etanol i 24 timer før behandling.
  2. Behandle nyrer ved hjelp av en standard 6-timers syklus:
    70% etanol i 15 min
    90% etanol i 15 min
    100% etanol i 15 min
    100% etanol i 20 min
    100% etanol i 25 min
    100% etanol i 30 min
    Xylen i 20 min
    Xylen i 30 min
    Xylen i 40 min
    Voks i 30 min
    Voks i 35 min
    Voks i 40 min
    MERK: Nyrene bør ikke utsettes for langvarig eksponering for varme i voksen, da det kan ødelegge antigener av interesse.
  3. Klipp 3 μm seksjoner på en mikrotom og monter på kommersielt tilgjengelige glassmikroskopsklier belagt med en positiv ladning. La det tørke over natten
  4. Sett glasssklier i et glidestativ i en 60 °C ovn i 60 min.
    MERK: Trinn 3.3-3.4 er avgjørende for å sikre at seksjonene ikke flyter av under antigenhentingstrinnet.
  5. Senk skliene i to endringer i løsemiddel (xylen eller erstatning) i 40 min hver, i en røykhette.
  6. Rehydrere lysbilder i 100% etanol, 100% etanol, 70% etanol i 5 min hver.
  7. Vask i 5 min i vann fra springen.
  8. Legg en kokeplate i en røykhette og preboil antigengjenfinnende oppløsning (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) i en trykkoker. Så snart antigengjenfinningsløsningen begynner å koke, plasser lysbildene i potten horisontalt ved hjelp av et par tang og lås lokket. Kok på høy (tilsvarer 15 psi eller 103 kPa) i 10 min.
    MERK: Dette trinnet henter antigenet av interesse ved å avdekke antigenepitopen (krysskoblet via formalin fiksering) for å tillate epitopantistoffspesifikk binding, vil den påfølgende fargingen ikke fungere uten dette trinnet.
  9. Fjern trykkokeren fra varme og fjern lokket umiddelbart ved å kjøre kald kran på toppen av lokket i en vask. La lysbildene likevekt i 20 min i antigengjenfinningsoppløsningen.
  10. Vask skliene to ganger i 5 min i fosfatbufret saltvann (PBS) (pH 7,4, 0,01 M) på en orbital shaker.
  11. Bruk en hydrofob penn til å tegne sirkler rundt nyrevevet være forsiktig så du ikke lar noe vev tørke ut i denne tiden.
  12. Blokker vev i 10% kylling sera i 5% storfe serum albumin (BSA) / PBS (pH 7,4, 0,01 M) for 30 min, 60 μL per seksjon. Ikke vask etter dette trinnet, men fjern forsiktig blokkeringsløsningen ved hjelp av en 60 μL pipette. Ikke la seksjonene tørke ut.
  13. Lag en cocktail av de primære antistoffene fortynnet i 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) i 1 rør. Påfør 60 μL per nyreseksjoner. Konsentrasjonen av de primære antistoffene er som følger:
    Kanin anti menneske/ mus H3Cit 1 / 100
    Mus anti menneske/mus PAD4 1/50
    Geit anti menneske / mus MPO 1 / 200
  14. Inkuber over natten ved 4 °C i et fuktighetskammer.
  15. Vask skliene to ganger i 5 min i PBS (pH 7.4, 0.01 M) på en orbital shaker.
  16. Lag en cocktail av de sekundære antistoffene i 1 rør. Sekundære antistoffer påføres i 1 % BSA/PBS, 60 μL per avsnitt som følger:
    Kylling anti kanin 488 1/200.
    Kylling anti mus 647 1 / 200.
    Kylling anti geit 594 1 / 200.
  17. Inkuber ved RT i 40 min.
  18. Vask skliene to ganger i 5 min i PBS (pH 7.4, 0.01 M) på en orbital shaker.
  19. Påfør sekundært antistoff 1:200 i 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) i 40 min ved RT 60 μL per seksjon.
  20. Vask skliene to ganger i 5 min i PBS (pH 7.4, 0.01 M) på en orbital shaker.
  21. Fordyp deg i 0,3% Sudan Svart i 70% etanol i 30 min.
  22. Vask sklier i vann fra springen for å fjerne bunnfall og deretter nedsenke i PBS (pH 7.4, 0.01 M) i 10 min for å hindre ytterligere Sudan Black utfelling fra forming.
  23. Monter lysbildene på konfikale glassdeksler med tre 60 μL dråper monteringsløsning med DAPI. Forsegle dekkslips med neglelakk ved å påføre rundt omkretsen av dekkslip.
  24. La lysbildene kurere i 24 timer ved RT (for å tillate DAPI å trenge inn) og deretter lagre ved 4 °C beskyttet mot lys. Hold deg i mørket for å hindre falming av fluorescerende sonder.
  25. Bildelysbilder ved hjelp av et konfikalt laserskanningshode festet til et mikroskop. Opphisse lysbilder med 405 laser for DAPI og 488 Laser for H3Cit, 561 for MPO og 647 for PAD4. Ta enkeltplan bilder på 1024 x 1024 piksler ved hjelp av line-sekvensiell opptak og 4-linjers snitt, noe som er viktig for å oppdage ecDNA. Bruk et oljemål på 40 x 1,0 NA. Bilde minst 20 glomeruli per prøve. Lagre bilder som ND2-filer.

4. Nøytrofile ekstracellulære feller og ecMPO-analyse

  1. Installer ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Kontroller at den lærbare Weka-segmenteringen er tilgjengelig under Programtillegg | Segmentering | Trenbar Weka Segmentering.
  3. Slipp bildet i ImageJ. Klikk på Bilde | Farge | Delte kanaler. Ett bilde med DAPI i blå farging alle kjerner vil vises, ett bilde med H3Cit i grønt, ett bilde med MPO i rødt, og ett bilde med PAD4 i hvitt vises.
    1. Lag en sammenslått fil av enkeltbildene for å tegne en avkastning for glomerulus ved å klikke på Farge | Slå sammen kanaler. En popup-boks vil be om å tilordne en farge til hver kanal. Når du har tilordnet hver kanal en farge, merker du av for Opprett kompositt og Behold kildebilder-boksen og klikker Ok. Et flettet bilde vises. I motsetning til protokollen for ecDNA tidligere vil vi bruke det sammensatte bildet til å utføre resten av trinnene.
  4. Utfør en gaussisk uskarphet på det sammensatte bildet. Dette gjør det mulig å glatte ut av kjernene. Klikk prosess | Filtre | Gaussian Blur, satt i 1.00-2.00. Bildet vil nå se litt uskarpt, men kjerner er nå glatt og bakgrunnen myknet.
    MERK: Dette trinnet er forhåndsformet for å fjerne støy for å rydde opp i bildet fra artefakter som kan forhindre relevant påvisning av bildeattributter som skal analyseres.
  5. Klikk på Plugins | Segmentering | Trenbar Weka Segmentering. Et helt nytt vindu vises med bildet som skal analyseres og Weka segmentering spesifikke menyverktøy.
  6. Bruk linjeverktøyet på verktøylinjen (i ImageJ), først spore rundt intakte kjerner ikke positivt for alle 4 NET-komponenter (MPO, PAD4, DAPI og H3Cit) ved hjelp av gratis hånd verktøyet og deretter legge til Legg til klasse 1 eske.
  7. Bruk linjeverktøyet på ImageJ-verktøylinjen avgrense bakgrunnsområdene til klasse 2-boksen.
  8. Klikk på Opprett ny klasse-knappen etiketten i etikettmenyen og etiketten "NETs". Bruk linjeverktøyet til å avgrense NETS identifisert som samlokalisering DAPI (blå), MPO (rød), PAD4 (hvit) og citrullinerte histoner (grønn).
  9. Klikk på Opprett ny klasse-knappen etiketten i etikettmenyen og etiketten "ecMPO". Bruk linjeverktøyet til å avgrense MPO (rød) som er cellefri.
  10. Klikk på Togklassifikator-knappen i treningsmenyen i vinduet Trenbar Weka-segmentering.
    MERK: STOP-knappen vises i stedet for Train Classifier-knappen og forblir til treningen er ferdig. Ikke klikk på denne knappen under trening og prosessen vil bli avbrutt.
  11. Klikk på Opprett resultat-knappen i treningsmenyen og et bilde opprettes med alle klassifiserte komponenter, bestående av intakte kjerner, bakgrunnen og det som ble identifisert som ecMPO.
  12. Klikk på Knappen Få sannsynlighet i treningsmenyen. Veksle musen for å gi et svart-hvitt bilde av alle klassene med objektet av utvalg uthevet i hvitt.
  13. Duplisere både NET-sannsynligheten og ecMPO-sannsynlighetsbildet ved å klikke på Bilde | Dupliser.
  14. Veksle til skjermen ved hjelp av museknappen som inneholder NETs. Bruk en terskel for å sikre bare utheving av identifiserte NETs. Klikk Bilde på verktøylinjen for ImageJ-menyen | Juster | Terskel. Flytt glidebryterne til NET-komponentene er uthevet. Klikk på Bruk når du er fornøyd med terskelen. Gjenta de samme trinnene for ecMPO.
  15. Hvis det etter terskellen fortsatt oppdager områder av ecMPO eller NETs, gå tilbake til det opprinnelige trente bildet og legg til flere klassifikatorer og påfør trinn 4.1-4.14.
  16. Klikk på Bilde | Bildejustering | Gjør binær . Kopier den glomerulære avkastningen som er gjort i trinn 4.3, klikk Ctrl+Skift+E. Aktiver Weka-vinduet etter Rediger | Valg | Gjenopprett, som gjenoppretter valget. Klikk analyser partikler for å måle bare NET-partiklene i glomerulus.
  17. Slå til skjermen ved hjelp av museknappen som inneholder ecMPO. Bruk en terskel for å sikre at bare identifisert ecMPO oppnås. Klikk på Bruk når du er fornøyd med terskelen. Gjenta trinn 4.16 ovenfor.
    MERK: Et resultatark beregnes med antall partikler, området, gjennomsnittspiksler og prosentandelen av glomerulus som inneholder både NETs og ecMPO. Disse resultatene kan deretter legges inn i et regneark og lagres, for senere statistisk analyse.
  18. Lagre klassifikatoren som NETs.classifier ved å klikke Lagre klassifikator fra alternativmenyen og lagre filen i ImageJ-appen på skrivebordet (ImageJ-mappen). Klikk deretter Lagre data fra alternativmenyen og lagre som NETs.arff-fil. Den glomerulære avkastningen må legges til manuelt hver gang som glomerulus størrelse og form vil endres, men programmet har lært hva både NETs og ecMPO er.
  19. Hvis du vil bruke modellen på følgende bilder på nytt, gjentar du trinn 4.1-4.5 med et nytt bilde. Klikk på Last inn klassifikator fra alternativmenyen. Klikk på Nets.classifier i ImageJ-mappen. Loggmenyen vil dukke opp og kjøre modell, når modellen har kjørt klikk på Last inn data i alternativmenyen og velg NETs.arff-filen.
    1. Klikk på Opprett resultat. Hvis det resulterende bildet ikke har klart å plukke opp alle kjerner, bakgrunn eller ecDNA klikk på re-train klassifikator og legge til flere klassifikatorer og lagre den nye modellen. Fullfør analyseprosessen ved å gjenta trinn 4.11-4.19.
      MERK: Flere bilder kan brukes til å generere den endelige modellen som brukes til å oppdage ecDNA, ecMPO og NETs. Dette oppnås ved å bruke modellen på etterfølgende bilder, legge til flere klassifikatorer og lagre den nye modellen og dataene i ImageJ-mappen. Dette kan være spesielt viktig når ulike prøver har høyere bakgrunn. Weka Segmentering programmet er kompatibelt med ImageJ makrospråk som gjør det mulig for mange av kommandoene å være makro skrivbar for å automatisere noen av trinnene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse bildene representerer flere trinn som kreves for å kunne bruke trainable Weka segmentering for å minimere den arbeidsintensive manuelle målingen av ecDNA i fluorescerende farget FFPE nyrevev fra en mus med indusert anti-MPO GN. Disse trinnene er oppsummert i figur 1 og figur 2 med bilder tatt direkte fra Weka segmenteringsprogrammet, som beskriver hvert trinn i analyseprosessen. Målinger fra denne analysen vises deretter i figur 3 som viser programmets evne til å bestemme de ulike mengdene ecDNA deponert i glomerulus, i kontrollvev, uten indusert anti MPO GN. Figur 4 viser at modellen for ecDNA kan tilpasses til å identifisere ecDNA i nyrebiopsiprøver fra en kontrollpasient (Minimal Change Disease pasienter har minimal glomerulær skade tydelig på et histologisk nivå) og sammenlignet med en nyrebiopsi fra en pasient med MPO-AAV. Figur 5 demonstrerer oversettelseskapasiteten til dette programmet til andre flekker i nyrevev. Vi har brukt en representativ prøve fra en mus nyre med indusert eksperimentell anti-MPO GN å flekke for NETs og ecMPO. Det togbare Weka-segmenteringsprogrammet brukes deretter til å identifisere både NETS og ecMPO i samme bilde. Figur 6 viser at det ikke er noen signifikant forskjell i resultatet av resultatene i mengden ecDNA-kvantifisering på samme datasett analysert av to uavhengige brukere som skaper 2 forskjellige modeller designet for å semi-kvantifisere ecDNA.

Figure 1
Figur 1: Bilder som illustrerer klassifisering av kjerner, bakgrunn og ekstracellulært DNA i musnynyglomeruli fra eksperimentell MPO-ANCA GN ved bruk av trebarnssegmentering. (A) Demonstrerer enkeltkanalbilder av DAPI for å flekke DNA (blå), β actin (grønn) for å avgrense glomerulært område, og komposittfilen med en interesseregion (ROI) som indikerer det glomerulære området som skal måles. (B) Klassifisering av intakte kjerner for å utvikle modellen (rosa) og uklassifiserte kjerner (blå). (C) Klassifisering av det som anses å være bakgrunn (grønn). (D) Klassifisering av det som anses å være ecDNA (lilla). (E)Modellen som genereres av tredbar Weka-segmentering som viser kjerner i rødt, bakgrunn i grønt og ecDNA-område i lilla. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Bilder som viser den overvåkede komponenten i modellen for å redusere unøyaktigheten. Weka-modellen genererer sannsynligheten for å gjenkjenne hver klassifikator i uklassifiserte komponenter. (A) Modell generert klassifisering av hva intakt kjerner er. (B) Modell generert klassifisering av hva som anses bakgrunn. (C)Modellgenerering av hva ecDNA vurderes. (D)Illustrerer bildet av klassifisert ecDNA unthresholded. (E) Viser justeringen av terskelen for å utelukke eventuelle feil i det som er identifisert som ecDNA, identifisert ecDNA vist i rødt. (F)Terskelen brukes på bildet og gjøres om til et binært bilde for partikkelanalyse. (G)Den glomerulære avkastningen legges over bildet slik at bare glomerulær ecDNA analyseres. (H) Viser sammendraget av resultatene som genereres fra analysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Bilder som illustrerer klassifisering av kjerner, bakgrunn og ekstracellulært DNA i musnynyglomeruli fra en kontrollmus uten indusert eksperimentell MPO-ANCA GN ved hjelp av tredbar Weka-segmentering. (A) Viser det opprinnelige sammenslåtte bildet med glomerulære regionen som skal analyseres, treningen og det trente modellresultatet (bakgrunn grønn, kjernerød og ecDNA identifisert i lilla. (B) Viser modellsannsynlighetene for å identifisere, kjerner, bakgrunn og ecDNA. (C) Resultater av hva modellen klassifisert og identifisert som ecDNA, vises i vilkårlige enheter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Bilde som illustrerer trainable Weka segmentering er tilpasningsdyktig for analyse av ecDNA i menneskelige nyrebiopsier fra en pasient med minimal endringssykdom og en pasient med MPO-ANCA vaskulitt. (A) Illustrerer at minimal ecDNA oppdages ved hjelp av trainable Weka segmentering intakt kjerner (rød), bakgrunn (grønn) og ecDNA (lilla). (B) Demonstrerer betydelige mengder ecDNA hos en pasient nyrebiopsi fra en pasient med MPO-ANCA vaskulitt intakt kjerner (rød), bakgrunn (grønn) og ecDNA lilla. Resultatene viser at 8 partikler av ecDNA ble funnet i det glomerulære området til en pasient med MCD sammenlignet med en pasient med aktiv MPO ANCA vaskulitt (180 partikler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Trenbar Weka-segmentering kan brukes til å identifisere NETS og ecMPO i samme bilde- og modellanalyse, i musnyrenvev fra eksperimentell MPO-ANCA GN. (A)Demonstrerer en glomerulus med NETs [co-lokalisering av grønt (Citrullinate histone 3), rød (MPO) DAPI (kjerner) og PAD4 (hvit)]. ecMPO anses å være cellefri. (B) Opplæring for identifisering av klassifikatorer, rød (intakt kjerner), grønn (bakgrunn), lilla (nets) og gul (ecDNA)]. (C) Modellen trainable Weka segmentering bruker til å klassifisere NETs og ecMPO, Rød (Intakt kjerner), Grønn (bakgrunn), Lilla (NETs) og gul (ecDNA). (D) Partikkelanalyse av hva modellen bestemte seg for å være NETs. (E) Partikkelanalyse av hva modellen fastslått å være ecMPO. (F) Resultatark fra partikkelanalysen for både NETs og ecDNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Sammenligning av 2 uavhengige brukere i utformingen av en modell for påvisning av ecDNA. (A) Originalbilde som viser DAPI, Beta Actin og Sammenslåtte bilder som skal analyseres. (B) Sammenligning av treningsmodell, klassifikatorer, terskel- og glomerulær avkastning mellom 2 uavhengige brukere. Den gule pilen angir at bruker 2 måtte omskolere modellen for å fjerne bakgrunnen. (C) Resultater generert som viser sammenligningen av ecDNA antall, totalt areal, % område og perimeter, mellom 2 brukere. (D) Graf over resultater som ikke viser noen signifikant forskjell mellom antall ecDNA oppdaget innenfor glomeruli og % område fra to uavhengige etterforskere. Statistisk analyse utført ved hjelp av Mann-Whitney U-test med signifikans satt til <0,05. Eksempelstørrelsen er n=6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finnes flere protokoller som måler proinflammatoriske markører i serum og urin av både pasienter og musemodeller av glomerulonefritt. Denne beskrevne protokollen tillater analyse av produkter av celledød (ecDNA, NETs og ecMPO) i glomerulus direkte. De viktigste trinnene i denne protokollen er vevspreparatet og bildet. Det viktigste begrensende elementet ved å bruke en fluorescerende fargemetode for analyse er vevet autofluorescens. Formalin fast parafinvev er gjenstand for autofluorescens som kan skjule spesifikk fluorescerende farging. Det siste trinnet i fargemetoden der lysbildene er nedsenket i Sudan svart, demper autofluorescens av vevet, og tillater belysning av antistoffet spesifikk farging gjennom reduksjon i signal til støyforhold19. Avbildningen av vevet må utføres med minst 40x oljeforstørrelse for å kunne oppdage mindre fragmenter av ecDNA og MPO. Når bildebehandling er anskaffet, er det avgjørende at det gjøres på en linje sekvensiell måte for å sikre ingen blødning gjennom fluorescens av en markør til en annen.

En fordel med protokollen for analyse er at den er tilgjengelig i åpen tilgang via ImageJ for alle å få tilgang til16. Vi har vist her at metoden lett kan tilpasses for å måle forskjellige fluorescerende markører i nyrevev. Når modellen i trainable Weka segmentering er fastslått det kan brukes på etterfølgende bilder uten bias og på nøyaktig samme måte hvert bilde har blitt analysert. Analysens overvåkede karakter gjør at eventuelle feil i segmenteringen kan justeres gjennom de ekstra trinnene for å begrense de "trente" bildene, eller omskolere programmet og legge til flere klassifikatorer. Fordelen med dette programmet er at to forskjellige brukere vil få lignende resultat ved hjelp av samme modell, forutsatt at de nøyaktig avgrense glomerulær tuft. Den største unøyaktigheten i reproduserbarhet av to forskjellige sluttbrukere er skapt av den forskjellige måten folk sporer rundt glomerulær tuft. For eksempel, hvis en person tegner en grov sirkel rundt glomerulær tuft og en annen bruker nøye trekker rundt de ytterste kapillær løkker området som undersøkes vil variere (som vist i resultatene). Derfor er det viktig at begge brukerne er opplært til å identifisere glomerulær tuft på en identisk måte. Den praktiske anvendelsen av dette programmet ville være for to brukere å designe modellen sammen på flere bilder for å bygge en robust modell som skal brukes på ytterligere datasett. Jo flere bilder som brukes til å trene klassifikatorene, jo mer nøyaktige vil modellen være.

Begrensninger av denne protokollen ville være måling av fragmenter av ecDNA mindre enn hva det konskopet kan oppdage. Dette kan overvinnes med bruk av å fange bilder ved hjelp av superoppløsning mikroskopi metoder og bruke trainable Weka segmentering til disse bildene. Den overvåkede komponenten i maskinlæringen legger til ekstra trinn og reduserer muligheten til å batch behandle store sett med bilder. Men som vi demonstrerte innenfor resultatene uovervåket modeller har redusert nøyaktighet og innføre overvåket komponent redusert unøyaktighet betydelig.

Vi har tidligere publisert at i tillegg til nøytrofiler som produserer ekstracellulære feller, ble monocytter / makrofager også observert for å produsere ekstracellulære feller (kalt METs) i human ANCA vaskulitt, men i mindre proporsjoner1. De nåværende metodene som er beskrevet her, skiller ikke mellom ekstracellulære feller produsert av nøytrofiler eller monocytter/makrofager. Dette er vanskelig å oppnå som de fleste confocal mikroskoper er begrenset av antall lasere. Identifisering av NETs krever 4 forskjellige lasere derfor begrense antall celle markører i stand til å bli behandlet via standard confocal imaging. Hvis MPO-positiv opprinnelsescelle er nødvendig, kan en annen seriell seksjon farges med enten en nøytrofil eller makrofag/monocyttmarkør, for å identifisere celletypen som produserer den ekstracellulære fellen.

Patologiske egenskaper av MPO-ANCA vaskulitt inkluderer avsetning av ecDNA, NETS og ecMPO i glomeruli avnyrene 20. Terapeutisk målretting DNA innen NETs og ecMPO samt måle dem i menneskelige biopsier som markører for sykdom har vært gjenstand for nyere studier1,,20,21,22. Betydningen av disse metodene på dette feltet er nøyaktig å bestemme den relative andelen av ecDNA, NETs og ecMPO innenfor målorganet, på en reproduserbar, mindre tidkrevende måte. Til slutt har vi demonstrert et overvåket maskinlæringsverktøy som kan trenes wekasegmentering for å halvautomatisere analysen av store datasett med oppkjøpte bilder for ecDNA, NETs og ecMPO. Bruken av dette verktøyet vil redusere bildeanalysetiden betydelig, og teknikkene kan lett tilpasses andre flekker i andre organer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi anerkjenner Monash Micro Imaging for bruk av Nikon C1 oppreist konfikal laserskanning mikroskop og Monash Histology Platform for behandling av nyrevev.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin SIGMA A2153 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.
Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-21468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-121468 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-21441 Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken sera SIGMA C5405 Made up in 1%BSA/PBS
Coverslips 24 x60 mm Azerscientific ES0107222 #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy
EDTA 10mM SIGMA E6758 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution
Ethanol 30%, 70% and 100% Chem Supply UN1170 Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water
Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) TRAJAN NBF-500 Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood
Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm TRAJAN J3800AM4 Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step
Goat anti human/mouse MPO antibody R&D AF3667 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Histosol Clini Pure CPL HISTOSOL 08 Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood
Hydrophobic pen VECTOR Labs H-400 Use to draw circle around kidney tissue
Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) ABCAM ab128086 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope Coherent Scientific Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Phosphate Buffered Saline SIGMA P38135 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time
Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless Tefal GSA-P2530738 Purchased at local homeware store
Prolong Gold DAPI Life Technologies P36962 Apply drops directly to coverslip
Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody ABCAM ab8227 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody ABCAM ab5103 Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Staining rack 24 slides ProScitech H4465 Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven
Sudan Black B SIGMA 199664 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature
Tris 10mM SIGMA T4661 Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution
Xylene Trajan XL005/20 Must be use used in a fume hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  2. Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
  3. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
  6. Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
  7. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  8. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  9. Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
  10. Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
  11. Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
  12. Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
  13. Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
  14. Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
  15. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
  18. Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
  19. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  20. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  21. Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
  22. Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 160 Glomerulonefritt Ekstracellulært DNA Nyre Celledød Veiledet maskinlæring
Veiledet maskinlæring for semikvantifisering av ekstracellulært DNA i Glomerulonefrit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Sullivan, K. M., Creed, S., Gan,… More

O'Sullivan, K. M., Creed, S., Gan, P. Y., Holdsworth, S. R. Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis. J. Vis. Exp. (160), e61180, doi:10.3791/61180 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter