Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عالية الإنتاجية المقايسة من الحدود الحرارية الحرجة في الحشرات

Published: June 15, 2020 doi: 10.3791/61186
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Kentucky

Summary

الحدود الحرارية يمكن التنبؤ البيئات التي تتسامح مع الكائنات الحية، وهي معلومات قيمة في مواجهة التغير المناخي السريع. يتم وصفها هنا بروتوكولات عالية الإنتاجية لتقييم الحد الأدنى الحراري الحرج ووقت الضربة القاضية للحرارة في الحشرات. البروتوكولين تكبير الإنتاجية وتقليل تكلفة المقايسات.

Abstract

والحدود الحرارية العليا والدنيا للنباتات والحيوانات هي مؤشرات هامة لأدائها وبقائها وتوزيعاتها الجغرافية، وهي ضرورية للتنبؤ بالاستجابات لتغير المناخ. يصف هذا العمل بروتوكولين عاليي الإنتاجية لقياس الحدود الحرارية للحشرات: أحدهما لتقييم الحد الأدنى الحراري الحرج (CTmin)والآخر لتقييم الحرارة يهدم الوقت (KDT) استجابةً لجهد حراري ثابت. فيالمقايسة الدقيقة CT، يتم وضع الأفراد في عمود أكريليك سترة، تخضع لتراجع درجة الحرارة المنحدر، وتحسب لأنها تقع من قعقعتهم باستخدام جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء. في اختبار KDT الحرارة ، يتم احتواء الأفراد في لوحة 96 بئرًا ، توضع في حاضنة تم تعيينها إلى درجة حرارة ساخنة ومجهدة ، والفيديو المسجل لتحديد الوقت الذي لم يعد بإمكانهم البقاء فيه منتصبين والتحرك. توفر هذه البروتوكولات مزايا على التقنيات الشائعة الاستخدام. كل من المقايسات هي منخفضة التكلفة ويمكن أن تكتمل بسرعة نسبيا (~ 2 ح). المقايسة الدقيقة CT يقلل من خطأ المجرب ويمكن قياس عدد كبير من الأفراد في وقت واحد. يولد بروتوكول KDT الحرارة سجل فيديو لكل مقايسة وبالتالي يزيل التحيز المجرب والحاجة إلى مراقبة الأفراد باستمرار في الوقت الحقيقي.

Introduction

الحدود الحرارية للحشرات
الاختلاف في الظروف البيئية، بما في ذلك درجة الحرارة، هو عامل رئيسي يؤثر على الأداء واللياقة البدنية والبقاء على قيد الحياة والتوزيع الجغرافي للكائنات الحية1،2. تحدد الحدود الحرارية العليا والدنيا النطاق النظري للبيئات التي يمكن أن يتسامح معها الكائن الحي ، وبالتالي ، فإن هذه الحدود هي تنبؤات مهمة لتوزيع النباتات والحيوانات ، خاصة في مواجهة تغير المناخ3،4. وهكذا، فإن البروتوكولات لقياس الحدود الحرارية بدقة هي أدوات مهمة لعلماء البيئة، وعلم وظائف الأعضاء، وعلماء الأحياء التطورية، وعلماء الأحياء المحافظة، من بين آخرين.

كما الحيوانات البرية الأكثر وفرة وتنوعا، وغالبا ما تستخدم الحشرات لقياس الحدود الحرارية. ويشيع استخدام الحد الأقصى الحراري الحرج (CTmax)وصغر حجم الحرارة الحرجة (CTmin)لتقييم الاختلاف داخل وفيما بين القطاعات في التسامح الحراري5،6،7. في حينيمكن قياس الحدالأقصى للأشعة المقطعية و المقطعية للنوعات الظاهرية متعددة، بما في ذلك النمو، والإخراج الإنجابي، والسلوك، يتم تطبيقها الأكثر شيوعاً على وظيفة الحركي5،6،7. وهكذا ، فإن الحد الأقصى للتصويرالمقطعي (يسمى أيضا الحرارة المنهزة) وMasctmin غالبا ما يتم تعريفه على أنه درجات الحرارة العالية والمنخفضة التي تفقد فيها الحشرات الوظيفة الحركية وغير قادرة على البقاء منتصبة5،6،7،8،9،10،11. CTmin يتزامن مع بداية الغيبوبة الباردة، وهو شلل عكسي الناجمة عن درجات الحرارة الباردة6. في حين أن الشلل عند الحدود الحرارية غالبا ما يكون عكسها، استمرار التعرض لهذه درجات الحرارة يؤدي إلى الموت الإيكولوجي5.

طرق مشتركة لقياس الحدود الحرارية
وقد استخدمت مجموعة متنوعة من الأجهزة لقياس الحدود الحرارية (ملخصة في Sinclair et al.) 6.لفترة وجيزة، يتم تسخين الحشرات أو تبريدها في الحاضنات12،13، حاويات مغمورة في حمامات السوائل11،14،15،16، كتل الألومنيوم10،17، أو حاويات مغطاة18، ومراقبتها حتى تتوقف الحركة. لرصد الحشرات أثناء الفحص ، فإن الطريقة الأكثر شيوعًا هي المراقبة المباشرة ، حيث يتم مراقبة الأفراد بشكل مستمر في الوقت الفعلي أو بأثر رجعي مع الفيديو المسجل6،9،10،11،15،17. وفي حين أن أساليب المراقبة المباشرة لديها الحد الأدنى من متطلبات المعدات، إلا أنها تتطلب كثافة في العمالة والحد من الإنتاجية. بدلا من ذلك ، يمكن ملاحظة الحشرات بشكل غير مباشر عن طريق جمع الأفراد في أوقات منفصلة لأنها تقع من جثم6،19،20،21 أو استخدام رصد النشاط13.

11- إن الطرق غير المباشرة لقياس الحدود الحرارية هي عموماً أعلى إنتاجية وربما تكون أقل عرضة للخطأ من طرق المراقبة المباشرة. الأسلوب الأكثر شيوعاً للرصد غير المباشر يستخدم العمود سترة درجة الحرارة التي تسيطر عليها6،8،19،20،21. يتم وضع الحشرات داخل عمود مع الجثم ، ويتم التحكم في درجة حرارة الغرفة الداخلية عن طريق ضخ السوائل من حمام السوائل التي يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة من خلال البطانة المبسترة للعمود. الأفراد الذين يصلون إلى حد الحرارة يسقطون من جثمهم ويتم جمعهم في درجات حرارة منفصلة أو فترات زمنية. في حين أن هذه الطريقة تعمل بشكل جيد للتصويرالمقطعي دقيقة، فقد وجد غير مناسبللأشعة المقطعية ماكس، لأن الذباب يمشي طوعا من الجزء السفلي من العمود عندما تزيد درجة الحرارة. والطريقة الجديدة الموصوفة هنا تتحايل على هذه المسألة من خلال احتواء الذباب بشكل فردي أثناء القياسات الآلية.

وبالإضافة إلى طريقة المراقبة، يشيع استخدام نوعين من نظم الحرارة لتقييم الحدود الحرارية العليا. تتكون الأقوال الديناميكية من زيادة درجة الحرارة تدريجياً حتى يتم فقدان وظيفة المحرك. أن درجة الحرارة هي دينامية CTماكس7،8،9،13. في المقابل، تتكون المقايسات الثابتة من درجة حرارة مرهقة ثابتة حتى يتم فقدان الوظيفة الحركية. أن نقطة الوقت هي الحرارة ضربة قاضية الوقت (KDT الحرارة)، وتسمى أيضاماكس CT ثابت(sCT ماكس)في ورقة حديثة من قبل يورغنسن وآخرون7،,8،,9،,16،,22. على الرغم من أنCT ماكس والحرارة المقايسات الضربة القاضية (الحرارة KD المقايسات) تنتج المقاييس مع وحدات مختلفة، النمذجة الرياضية من الصفات اثنين يشير إلى أنها تعطي معلومات قابلة للمقارنة على التسامح الحرارة وكلاهما ذات الصلة بيئيا8،9. تؤدي المقايسات الديناميكية إلى درجة حرارة يمكن مقارنتها بالظروف البيئية ، وهي أفضل عندما تكون هناك اختلافات كبيرة في تحمل الحرارة ، مثل المقارنات بين الأنواع ذات المنافذ الحرارية المختلفة على نطاق واسع. ومع ذلك ، بسبب Q10 عالية لتراكم إصابات الحرارة ، قد يكون من الأفضل إجراء فحص ثابت للكشف عن أحجام التأثير الصغيرة ، مثل الاختلاف داخل معينة في تحمل الحرارة9. أيضا ، من الناحية العملية ، يتطلب الفحص الثابت معدات أقل تطورا من الفحص الديناميكي.

الهدف
الهدف من هذه الورقة هو إضفاء الطابع الرسمي على أساليب المقايساتالمقطعية الدقيقة والحرارة KD التي يمكن استخدامها في البحوث المستقبلية لتقييم الحدود الحرارية للحشرات المتحركة. ويتم تكييف البروتوكولات من منهجيات سبق وضعها، وهي مصممة بحيث تكون عالية الإنتاجية، وآلية، وفعالة من حيث التكلفة. يمكن إتمام كل من الأقوال في فترة زمنية قصيرة (~2 ساعة)، مما يعني أنه يمكن إجراء تجارب متعددة في يوم واحد، مما ينتج كميات كبيرة من البيانات دون التضحية بالتكرار أو الدقة. مع هذا الإعداد، يمكن قياس تحمل الحرارة من 96 الذباب في وقت واحد، في حينأن العمود ل دقيقة CT يمكن أن تعقد أكثر من 100 الذباب، شريطة أن يكون هناك مساحة سطحية كافية لتجثم.

طريقة عالية الإنتاجية لمراقبة CTmin بتعديل منهجية العمود المبستر المشترك مع إضافة مستشعر الأشعة تحت الحمراء لحساب الذباب تلقائيًا. وقد اقترح شومان وآخرون استخدام جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء للعد لأول مرة في عام 199623 ولكن لم يتم اعتماده على نطاق واسع. إضافة جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء يسمح لتوليد البيانات المستمرة بدلا من جمع البيانات على فترات منفصلة. كما يقلل هذا البروتوكول من خطأ المجرب عن طريق التخلص من إدخال البيانات اليدوي والحاجة إلى تبديل أنابيب التجميع يدويًا أسفل العمود المُقَدَّد عند نقاط زمنية منفصلة.

يتم تعديل طريقة عالية الإنتاجية لتسجيل KDT الحرارة من دراستين سابقتين من التسامح الحراري في الحشرات10،12. يتم تخزين الذباب الفردي في لوحة 96 بئر في حاضنة درجة الحرارة يتم تسجيل الفيديو. يقلل هذا البروتوكول من تحيز المجرب في تحديد KDT الحرارة لأنه يمكن مراجعة التجارب والتحقق من ذلك عن طريق تشغيل التسجيل مرة أخرى. كما يوفر هذا البروتوكول مجموعة من البرامج النصية Python المخصصة التي يمكن استخدامها لتسريع تحليل الفيديو. استخدام الآبار الفردية يزيل التداخل الذي يمكن أن يحدث عندما يتحرك الأفراد الآخرين أو يسقطون ، والتي يمكن أن تكون مشكلة عندما يتم ملاحظة مجموعات من الأفراد في نفس الساحة10،17. وعلاوة على ذلك، فإن الحاضنة التي يتم التحكم فيها بدرجة حرارة توفر درجة حرارة مستقرة عبر جميع الآبار الـ 96، على عكس تدرج درجة الحرارة الذي لوحظ أحيانًا عبر كتلة ألمنيوم يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة10. لاحظ أيضاً أنه يمكن تكييف طريقة تسجيل 96 جيداً لقياسالحد الأقصى الديناميكي للتصوير المقطعي المحوسب ويحتمل أن يكون CTmin (انظر المناقشة).

لإثبات كل بروتوكول، تم مقارنة الحدود الحرارية للإناث الزميل Drosophila الكبار من خطوط مختارة من الفريق المرجعي الوراثي Drosophila melanogaster (DGRP)24. وقد تم اختيار هذه الخطوط لأن التجارب الأولية أشارت إلى اختلافات كبيرة في التسامح الحراري. وقد أثبتت هذه الأقوال أنها أساليب قوية للتمييز بين الاختلافات في التسامح الحراري. البروتوكولين التاليين ، عالية الإنتاجية CTmin المقايسة (القسم 1) وعالية الإنتاجية الحرارة KD مقايسة (القسم 2) ، ووصف الإجراءات اللازمة لإنتاج CTmin والحرارة KDT البيانات عن أي مرحلة حياة الحشرات motile قادرة على تركيب في الأجهزة ، مثل Drosophilaالكبار . للتصويرالمقطعي دقيقة من الضروري أيضا أن تكون الحشرة قادرة على جثم. هنا, كل مقايسة هو موضح في الكبار Drosophila melanogaster. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات لـ "تصنيف" آخر أو مراحل الحياة6. قد تشمل التغييرات الطفيفة استخدام مواد جثم مع فتحات أكبر لاستيعاب عينات أكبر فيمقايسة دقيقة CT أو استخدام كاميرا ذات جودة أعلى لتمييز KDT خفية من حشرة بطيئة الحركة أو مرحلة الحياة في اختبار KD الحرارة. هذا البروتوكول لا يصف أساليب إعداد الذباب ، ولكن من المهم توحيد بروتوكولات تربية لضمان تكرار25 (انظر غارسيا وتيتس26 وتيتس وهان27). وتشمل البروتوكولات المقدمة معلومات عن كيفية بناء الأجهزة وإعدادها، وكيفية تسجيل القياسات، ووصف موجز لتحليل البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. عالية الإنتاجية CTدقيقة المقايسة

  1. تجميع العمود المعطف (الشكل 1أ، الشكل 2)
    1. قطع أوسع (7 سم × 6.35 سم × 0.3 سم) وأضيق (5.7 سم × 5.1 سم × 0.3 سم) أنابيب الاكريليك إلى أطوال متساوية (31.5 سم) مع المنشار (الشكل 2أ). هذه الأنابيب اثنين سيكون الخارجي والأعمق الجدران من العمود سترة.
    2. قطع حلقتين (2 سم واسعة) من متوسطة الized (6.35 سم × 5.7 سم × 0.3 سم) أنبوب الاكريليك مع المنشار (الشكل 2أ). وسوف يكون هذان الحلقتان الفواصل بين الأنابيب الداخلية والخارجية، مما يخلق مساحة بين أنبوبي الأكريليك الطويلين لتدفق السوائل.
    3. حفر بعناية اثنين من الثقوب في الخارجي (أوسع) أنبوب الاكريليك، ثقب واحد في الجزء العلوي وواحد في الجزء السفلي. تأكد من أن كل ثقب هو 3.5 سم من نهاية الأنبوب. حفر الثقوب على طرفي نقيض من الأنبوب (الشكل 2B).
    4. للحد من تكسير, وضع الشريط على أنبوب على بقعة من ثقب المستقبل وحفر ببطء شديد على أدنى وضع عزم الدوران من الحفر.
    5. باستخدام الصنبور خيوط، الخيط على حد سواء الثقوب بحيث يمكن أن يكون مشدود محولات خرطوم في اثنين من الثقوب من أنبوب الخارجي. للحد من تكسير، واستخدام مواد التشحيم، والخيط ببطء باليد.
    6. الشريحة اثنين من الفواصل على سترة الداخلية، واحد في كل نهاية (أسفل وأعلى). اترك مساحة صغيرة (0.5 سم) بين المسافة ونهاية السترة الداخلية (الشكل 2ب).
    7. قم بحام الفواصل في مكانها باستخدام أسمنت الأكريليك.
    8. بعد الاسمنت على أنبوب الداخلية ومجموعات الفواصل، الشريحة هذا البناء في أنبوب الخارجي أكبر مع الثقوب. تأكد من أن الأنابيب الخارجية والداخلية هي دافق على كلا الطرفين. وسوف تكون الفواصل 0.5 سم من نهاية, تشكيل خنادق صغيرة على طرفي العمود (الشكل 2ج).
    9. قم بحام الأنبوب الخارجي إلى الفواصل باستخدام الأسمنت الأكريليك، وذلك باستخدام المشابك الفولاذية القابلة للتعديل لعقد الجهاز معا. انتظر حتى ينضبط الإسمنت.
    10. خيط محولات خرطوم في ثقوب الأنبوب الخارجي المضمون الآن إلى الفواصل والانبوب الداخلي.
      ملاحظة: يجب أن يكون مؤشر المحولات في الأنبوب الخارجي فقط وليس في المساحة المفتوحة بين الأنابيب الداخلية والأُمَرِية. إذا كان مؤشر ترابط محولات الخرطوم بعيداً جداً في, تقصير لهم إلى طول المناسبة مع المنشار.
    11. ختم محولات خرطوم في المواضيع الخاصة بهم على أنبوب الخارجي مع تسرب السيليكون.
    12. ملء الخنادق اثنين بين الأنابيب الداخلية والأعدى في كلا طرفي العمود سترة مع تسرب السيليكون.
    13. لاختبار العمود، قم بتوصيل أنابيب قطرها 0.6 سم بمحولات الخرطوم. قم بتوصيل المحول الموجود في أسفل العمود بمصدر مياه مع أنابيب، والمحول الموجود أعلى العمود إلى هجرة مع قطعة أنابيب مختلفة.
    14. تشغيل المياه من خلال الجهاز من أسفل إلى أعلى والتحقق من تسرب. إذا كان هناك تسرب، وتحديد من أين هم قادمون وختم مع السيليكون.
  2. إعداد العمود المُغلف وشاشة قمع Drosophila (DFM)
    1. تأمين العمود سترة إلى موقف معوج مع مشبك معوجة من ثلاثة محاور. محاذاة العمود عموديا مع نهاية واحدة مفتوحة على السقف والأخرى مفتوحة على مقاعد البدلاء مختبر (الشكل 1B).
    2. قم بتوصيل مدخلات السوائل والإخراج من حمام مبرد يتم التحكم فيه بدرجة حرارة إلى فوهات المحول للعمود بقطر 0.6 سم من الأنابيب البلاستيكية (الشكل 1B). قم بتوصيل مدخل السوائل بالزهة الموجودة في أسفل العمود وإخراج السائل بالوزية الموجودة أعلى العمود.
    3. قطع اثنين من المقابس العازلة دائرية رغوة 3 سم سميكة (نفس محيط كما افتتاح المقصورة الأعمق من العمود). تأكد من أن المقابس تناسب بشكل مريح وختم العمود الأعمق عند إدراجها في كلا الطرفين(الشكل 1B).
    4. ثقب ثقب من خلال مركز واحد من المقابس والخيط نهاية عارية من ثيرموكوبل من خلال ثقب حوالي 5 سم وآمنة مع الشريط. قم بتوصيل الطرف الآخر من الثيرموكوببل في مسجل بيانات ثيرموبل.
    5. قم بتوصيل مسجل بيانات ثيرموبل بالكمبيوتر.
    6. إسفين قطعتين من البلاستيك مزراب حارس (5 سم × 7 سم، مع فتحات قطرها 0.5 سم) داخل العمود لتعمل كمادة جثم. ضع قطعة واحدة من الحرس 2/3rds من أعلى العمود و 1/3الثالثة الأخرى من أعلى العمود (الشكل 1B).
    7. تأمين المكونات السفلية (دون thermocouple) والمكونات العلوية (مع thermocouple). عندما يتم إدراج المكونات في أعلى العمود، تأكد من أن ثيرموكوببل لا تلمس جوانب العمود.
    8. ضبط ارتفاع العمود على موقف معوجة بحيث يكون هناك مسافة 25 سم بين أسفل العمود وأعلى مقاعد البدلاء.
    9. تأمين حلقة معوجة (5 سم قطر) إلى موقف معوج 5 سم تحت الجزء السفلي من العمود وتدوير الحلقة قبالة إلى جانب العمود.
    10. تعيين سوق دبي المالي مباشرة على حلقة معوجة (الشكل 1B). قم بتوصيل كافة المكونات الإلكترونية: مصدر الطاقة، واجهة مصدر الطاقة، والكمبيوتر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    11. بمجرد توصيل المكونات، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لإنهاء إعداد برنامج سوق دبي المالي وDFM.
  3. Ctدقيقه تحليل
    1. بدوره صمامات المدخلات والمخرجات من حمام السوائل إلى مواقف مفتوحة.
    2. اضغط على زر الطاقة لتشغيل حمام السوائل التي يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة ثم اضغط على زر التشغيل لتشغيل برنامج رفع والحفاظ على درجة حرارة الحمام إلى 25 درجة مئوية. إعطاء حمام السائل والعمود 5-10 دقيقة للوصول والحفاظ على 25 درجة مئوية.
    3. قم بإزالة المكونات في أعلى العمود واستبدله بعمود (قطر 5.08 سم؛ انظر الشكل 1ج).
    4. انقر على الذباب من قارورة الطعام الخاصة بهم في العمود.
    5. إزالة القمع واستبداله مع المكونات العلوي بسرعة، والحرص على عدم السماح للذباب الهروب. إعطاء الذباب 5 دقيقة لتسوية، التنصت أحيانا على المكونات السفلية لتشجيع الذباب على الصعود.
    6. اضغط على زر البدء على حمام السوائل وابدأ برنامج التدّهّدبالدقيقة CT (25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 25 درجة مئوية إلى 10 درجات مئوية عند 0.5 درجة مئوية/دقيقة؛ 10 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ ثم 10 درجات مئوية إلى -10 درجة مئوية عند 0.25 درجة مئوية/دقيقة).
      ملاحظة: يمكن استخدام اختلافات أخرى من هذا البروتوكول CTmin المنحدرة اعتمادا على مسألة البحث (على سبيل المثال، مقارنات آثار معدلات المنحدرات المختلفة على CTدقيقة28).
    7. انقر فوق فتح برنامج تسجيل ثيرموكوب على الكمبيوتر ثم انقر فوق رمز التسجيل لبدء تسجيل درجة الحرارة داخل العمود كل ثانية لمدة الفحص. تأكد من أن كل تسجيل درجة حرارة يتضمن طابعًا زمنيًا خاصًا بالثاني، بحيث يمكن دمج بيانات درجة الحرارة لاحقًا مع بيانات من سوق دبي المالي.
    8. إضافة 5 مل من 90٪ الإيثانول إلى أنبوب أجهزة الطرد المركزي المخروطية 15 مل ووضعها في رف تحت العمود.
    9. في بعض الأحيان، انقر فوق المكونات السفلية من العمود لإغراء أي الذباب في الجزء السفلي لتسلق. معظم الذباب سيكون على جثم أو بالقرب من أعلى العمود بنسبة 15 درجة مئوية.
    10. عند 15 درجة مئوية، قم بإزالة المكونات السفلية وجمع أي ذباب لا يزال على المكونات السفلية في الإيثانول. عد ولاحظ أن هذه الذباب تم جمعها في 15 درجة مئوية ولكن الأشعةالمقطعية min غير معروفة.
      ملاحظة: ينبغي أن تقرر درجة الحرارة التي تتم إزالة المكونات السفلية قبل الفحص واستنادا إلىدقيقة CT المتوقعة من الأنواع اختبار أو العلاج. لهذا الفحص، تم اختيار 15 درجة مئوية على أساسدقيقة CT من هذه الخطوط DGRP خاصة وجدت في المقايسات الأولية.
    11. ضع قمعًا زجاجيًا قطره 75 مم في سوق دبي المالي. اضبط حلقة المُعوَّد، وDFM، و القمع بحيث تكون تحت العمود. تأكد من أن الشفة من القمع الأختام تماما أسفل العمود (الشكل 1D).
    12. أدخل الجزء السفلي من القمع في أنبوب جمع 15 مل (الشكل 1D).
    13. افتح برنامج سوق دبي المالي على الكمبيوتر بالنقر على رمز البرنامج. البرنامج سيبدأ على الفور تسجيل الوقت / التاريخ الذي الذباب تصل إلى دقيقة الأشعةالمقطعيةالخاصة بهم . الذباب الذي يصل إلىدقيقة الأشعة المقطعية يفقد وظيفته العصبية العضلية ويسقط من جثم، وبعد ذلك من خلال سوق دبي المالي.
    14. رصد ما إذا كان قد وصلت جميع الذباب بهم الأشعةالمقطعية دقيقة كما تنخفض درجة الحرارة عن طريق التحقق من المكونات العليا والجثم لمعرفة ما إذا كان أي الذباب لا تزال جاثمة (أي لا تزال تحافظ على وظيفة عصبية عضلية). تنتهي المحاكمة عندما وصلت جميع الذباب بهم CTدقيقة.
    15. في نهاية التجربة، قم بضبط سوق دبي المالي وإبعاد فتحة العمود. بعض الذباب قد تصل إلىدقيقة الأشعة المقطعية الخاصة بهم ولكن لا تزال عالقة في العمود (أي إسفين في جثم أو تتدلى من قبل خطاف واحد tarsal). افتح المكونات العلوية وأزل هذه الذبابات. دقيقة CT من هذه الذباب غير معروف.
    16. الجمع بين ملفات إخراج .txt من برنامج تسجيل الثيرموكوب (أي درجة الحرارة والتاريخ والوقت) وبرنامج DFM (أي عدد الذباب خلال القمع والتاريخ والوقت) باستخدام أمر دمج في RStudio. دمج الملفين استناداً إلى متغير التاريخ/الوقت المشترك.

2. عالية الإنتاجية الحرارة KD مقايسة

  1. جهاز التجميع والإعداد
    1. مع لاصقة، وإصلاح شبكة سلكية المنسوجة الصلب (~ 1.5 mm الفتحة) إلى الجزء السفلي من 96 جيدا لا أسفل لوحة.
    2. نعلق المغناطيس إلى الجانبين المعاكس من الجزء السفلي من 96 جيدا لا أسفل لوحة مع بندقية الغراء الساخن والغراء الساخن(الشكل 3).
    3. لصياغة غطاء septum مخصص مع فيلم لاصق مصمم للوحات 96 بئر ، عصا اثنين من الأفلام الجانبين لزجة معا لتشكيل ورقة بلاستيكية المتطاولة.
    4. ضع الصفائح البلاستيكية على لوحة 96 جيدا واستخدام الشريط للتمسك بها إلى جميع الجوانب الأربعة من لوحة. على الفتحة إلى كلّ بئر على اللوحة, يقطع 'x' في الورقة بلاستيكيّة مع صندوق قطع ([إي.], 96 إجماليّة [إكس]).
    5. تخدير الذباب مع CO2 وتحميلها بشكل فردي في كل بئر من 96 تعديل جيدا لا أسفل لوحة مع التعرق وغطاء الحاجز. إزالة غطاء الحاجز من لوحة 96 جيدا في حين يتم تخدير الذباب مع CO2 واستبداله مع غطاء واضح ضيق المناسب.
    6. وضع 96 جيدا لا أسفل لوحة محملة الذباب ومع غطاء واضح ضيق المناسب على الغذاء. ضمان الذباب لديها على الأقل 48 ح بين CO2 تخدير وبداية المقايسة (الخطوات 2.2.1-2.2.5).
      ملاحظة: الجزء السفلي من 96 جيدا تعديل لوحات لا القاع مصنوع من شبكة، حتى الذباب مخدر مع CO2 يمكن تحميلها وتركها على المواد الغذائية لمدة 48 ساعة على الأقل قبل أن تبدأ المحاكمة. يمكن استخدام أي حاوية بلاستيكية > 8.5 سم عرض × 13 سم طويلة التي لا يقل عن 2 سم عميق لاستيعاب طبقة عميقة 1 سم من المواد الغذائية.
    7. إصلاح كاميرا ويب إلى الجزء السفلي من داخل حاضنة درجة الحرارة التي تسيطر عليها مع الشريط. نقطة الكاميرا مباشرة إلى أعلى (الشكل 4). تأمين رف حاضنة حوالي 10 سم فوق الكاميرا.
      ملاحظة: الكاميرا تشير إلى أعلى ويسجل لوحة 96 جيدا من أسفل لضمان أكبر قدر من سطح البئر هو في طريقة العرض ممكن (على سبيل المثال، لم يتم حظر الخروج من عرض من قبل الجدران بئر من لوحة). عندما يصل الذباب إلى KDT يسقطون إلى قاع البئر؛ في هذه الحالة، فإن الجانب الأقرب إلى كاميرا ويب، وبالتالي فهي في طريقة العرض بغض النظر عن مدى ابتعادها عن مركز الرؤية.
    8. قم بتوصيل كاميرا ويب بالكمبيوتر.
    9. مع الشريط، نعلق ورقة بيضاء من الورق (8.5 سم × 13 سم؛ المساحة الدقيقة من الجزء السفلي من لوحة 96 بئر) إلى أسفل الجرف (الشكل 4). تأكد من أن الورقة تملأ الإطار بأكمله عند عرضها من خلال كاميرا الويب.
    10. وضع مصدر الضوء في الحاضنة. استخدم الورق أو المواد الأخرى لتخمين الإضاءة وتقليل الوهج.
      ملاحظة الخطوة 2.1.10 هي خاصة لكل حاضنة لأن الإضاءة والتأملات تختلف بين الحاضنات. والهدف هو الحصول على إضاءة كافية في الحاضنة لتوفير تباين جيد بين الذباب في كل بئر وورقة بيضاء من الورق خلف اللوحة عند مشاهدتها مع كاميرا الويب.
  2. أداء فحص KD الحرارة
    1. تعيين الحاضنة إلى 37.5 درجة مئوية وانتظر حوالي 30 دقيقة لإعطاء الحاضنة الوقت للوصول والحفاظ على درجة الحرارة المطلوبة. تعتمد درجة الحرارة الدقيقة على تقييم الحشرة وأي اعتبارات أخرى في الوقت.
    2. ضع 96 لوحة مقلوب جيدا في الحاضنة، بحيث الجزء السفلي من لوحة (الجانب شبكة) هو ضد ورقة بيضاء على الجزء السفلي من علبة (الشكل 4). يحيط علما باتجاه الآبار (أسماء الأعمدة والصفوف) على الدرج وفي إطار كاميرا ويب. الشريط الملون على طول جانبي لوحة 96 جيدا وحواف قطعة بيضاء من الورق يمكن التحقق من التوجه (الشكل 4).
      ملاحظة: تأكد من أن درجة حرارة الحاضنة تتسق مع درجة الحرارة داخل لوحة البئر 96 عن طريق تسجيل درجة الحرارة داخل اللوحة مع ثركوسوب أثناء اختبار اختبار اختبار KD الحرارة. ومن الحكمة أيضا أن تحقق من أن هناك تباينا ضئيلا في درجة الحرارة بين آبار 96 بئر مع ثيرموكوبل متعددة قبل إجراء اختبار KD الحرارة.
    3. أغلق باب الحاضنة.
    4. انقر فوق تسجيل على برنامج تسجيل الفيديو.
    5. بعد 2 ساعة، تحقق من التسجيل لمعرفة أن جميع الذباب قد وصلت إلى نقطة الراحة النهائية وتوقفت عن الحركة. بمجرد توقف جميع الذباب عن الحركة ، انقر فوق إيقاف على برنامج تسجيل الفيديو. بالنسبة للنمط الجيني الذي تم اختباره هنا، الذي تم تربيته عند 25 درجة مئوية، يصل معظم الذباب إلى KDT بمقدار 60 دقيقة عند 37.5 درجة مئوية (انظر أيضاً يورغنسن وآخرون9).
    6. تخلص من الذباب
    7. استخدام البرامج النصية بيثون مخصصة(تكميلية الترميز الملفات 1-3) لتقريب الوقت في الفيديو عندما يصل الذباب KDT الحرارة الخاصة بهم.
      ملاحظة: الخطوة 2.2.7 اختيارية. لتسريع تحليل الفيديو، تم تطوير مجموعة من البرامج النصية Python المخصصة لقياس التغيرات في كثافة البكسل مع مرور الوقت في كل بئر (انظر ملف الترميز التكميلي). عندما يتوقف الذباب عن الحركة، تكون كثافة البكسل ثابتة، ويمكن استخدام مخطط لهذه البيانات لتحديد الوقت التقريبي في الفيديو عندما يتم إسقاط الذباب. في حين أنه قد يكون من الممكن استخدام هذا البرنامج النصي لأتمتة تحليل البيانات ، عيوب طفيفة حاليا في الفيديو يؤدي إلى اختلافات طفيفة بين التغيرات في كثافة بكسل والوقت KD الحقيقي.
    8. انقر فوق فتح ملف الفيديو وتسجيل KDT من كل ذبابة في كل بئر. المقياس الأكثر اتساقا من KDT الحرارة بين التجارب والمراقبين هو تسجيل الوقت الذي تصل ذبابة بقعة الراحة النهائية.
    9. تتبع الفيديو في الاتجاه المعاكس، مع التركيز على بئر واحد، و مشيرا إلى الوقت الذي تتحرك فيه الذبابة لأول مرة قبالة بقعة الراحة النهائية. كرر هذه العملية لكل بئر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم قياس الحدود الحرارية(أي، دقيقة CT وKDT الحرارية) للإناث من الفريق المرجعي الوراثي Drosophila melanogaster (DGRP) لإثبات البيانات عالية الإنتاجية المتولدة من البروتوكولين الموصوفين. تم فحصالمقطع المقطعي باستخدام خطوط DGRP 714 (ن = 37) و913 (ن = 45). تم فحص KDT الحرارة ومقارنتها مع خطوط DGRP 189 (ن = 42) و 461 (ن = 42)، وتم تحليل ملفات الفيديو يدويا. استغرق الوقت الإجمالي للتجارب، بما في ذلك مشاهدة الفيديو، <2 ح لكل بروتوكول.

وكان متوسط درجات حرارة درجة حرارةالاناث من خط DGRP 913 أقل بكثير من الإناث من خط DGRP 714(الشكل 5A; ويلكوكسيون رتبة مجموع اختبار، W = 1585، P < 0.001). وكان خطين توزيعات متميزة بوضوح من الـ CTmin:كان الخط 913 دقيقة من الأشعةالمقطعية 5.00 ± 1.35 درجة مئوية (متوسط ± SD) وكان خط 714دقيقة من الأشعة المقطعية من 9.60 ± 1.53 درجة مئوية.

الحرارة KDT في 37.5 درجة مئوية تختلف اختلافا كبيرا بين الإناث من خطوط DGRP 73 و 461(الشكل 5باء; ويلكاكسون رتبة مجموع اختبار، W = 1658.5، P < 0.001). على الرغم من وجود اختلاف في KDT لكلا الخطين، تم اكتشاف الاختلافات في درجة الحرارة KDTs بين الخطوط بسهولة. خط 73 كان 14.8 دقيقة يعني KDT أطول من الخط 461 (الخط 73 يعني KDT، 55.58 ± 6.92 دقيقة؛ يعني الخط 461 KDT، 40.78 ± 6.64 دقيقة).

Figure 1
الشكل 1: إعداد العمود سترة لمحسبدقيقة CT. (أ) تجميعها سترت عمود. (B) عمود مبستر مع سدادات علوية وسفلى تختم الغرفة الداخلية. يتم خيط الثرموكوببل من خلال ثقب في المكونات العلوية. يتم تركيب DFM على حلقة معوجة أسفل العمود وانتقل إلى الجانب. (C) بدء إجراءدقيقة CT. تمت إزالة المكونات العلوية وسكب الذباب في الغرفة الداخلية عن طريق قمع في الفتح العلوي للعمود. (D) العمود سترة وDFM خلالالمقايسة دقيقة CT. تمت إزالة المكونات السفلية من العمود وتم وضع DFM و القمع أسفل العمود. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التوضيح التقني للعمود المُغلف. (A) كل قطعة من الاكريليك أنابيب قطع إلى طول: ط) قطعت اثنين من حلقات المسافة إلى 3.5 سم في الطول (الخطوة 1.1.2): ii). قطع أنابيب الاكريليك على أوسع نطاق إلى 31.5 سم (الخطوة 1.1.1); و ثالثا أضيق قطع أنابيب الاكريليك إلى 31.5 سم (الخطوة 1.1.1). (ب)ثقبين (باللون الرمادي) محفورين في أوسع قطعة من أنابيب الأكريليك، 3.5 سم من كل طرف وعلى طرفي نقيض (i؛ الخطوة 1.1.2). تجميع أضيق قطعة من أنابيب الاكريليك مع حلقتي المسافة (ii; الخطوتين 1.1.6 و 1.1.7). (C) العمود المُكتمل بعد الخطوات 1.1.8-1.1.12. يشار إلى محولات خرطوم باللون الرمادي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: أسفل (يسار) وأعلى (يمين) عرض من 96 جيدا لا أسفل لوحة. يتم إرفاق شبكة الصلب المنسوجة إلى الجزء السفلي من لوحة معدلة 96 جيدا لا القاع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: إعداد حاضنة لـ KD فحص حراري. (A) كاميرا ويب والمرحلة اقامة على مسافة. (ب) كاميرا ويب وإعداد المرحلة في الحاضنة قبل بدء التجربة. يتم إصلاح كاميرا ويب على أرضية الحاضنة والصينة هي ~ 10 سم فوق كاميرا ويب. (C) التوجه من لوحة 96 جيدا على خشبة المسرح الأبيض فوق كاميرا ويب أثناء فحص KD الحرارة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الحدود الحرارية السفلى والعليا لخطوط مختارة من لوحة دروسفيلا المرجعية الجينية (DGRP). (A) قيمدقيقة من خطوط DGRP. (ب)سخنات KDT من خطين DGRP عند 37.5 درجة مئوية.

الشكل 6: إخراج النشاط من البرامج النصية لتحليل الفيديو لمجموعة بيانات الاختبار. كل قطعة أرض تمثل بيانات النشاط من بئر واحد من 96 بئرا. وتم اختبار ما مجموعه 84 عينة من العينات التي تم عرضها. حسنا معرف هو المسمى على يمين كل المدرج التكراري.  الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الرقم.

ملف الترميز التكميلي 1. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 2. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 3. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion


الطريقتان المفصلتان أعلاه تولدان بيانات عالية الإنتاجية للمقاييس ذات الصلة من الناحية الإيكولوجية للحدود الحرارية العليا والدنيا. وتستند هذه البروتوكولات إلى منهجيات سبق وضعها في البحوث المتعلقة بالقيود الحرارية للحشرات (ملخصة في Sinclair et al.) 6.يمكن الانتهاء من كل من البروتوكولات في فترة قصيرة من الوقت (~ 2 ح لكل منهما)، وإنتاج مجموعات البيانات مع أحجام عينة كبيرة، لا تضحي التكرار أو الدقة، والحد من خطأ المجرب عن طريق القضاء على تسجيل البيانات اليدوية والدخول (CTmin المقايسة)، أو عن طريق إنشاء تسجيلات الفيديو الاحتياطية لكل مقايسة (اختبار KD الحرارة).

تم توليد النتائج التمثيلية من خلال مقارنة الحدود الحرارية للإناث البالغات من خطوط مختارة من DGRP24. وأظهرت كل من المقايسات اختلافات كبيرة في التسامح الحراري بين الخطوط. كان حجم التأثير بين الخطوط في كل من هذه الأقوال كبيرًا نسبيًا ، مما سمح بدوره بتمايز موثوق للمجموعات ذات المقارنات البصرية الإحصائية. الفرق الكبير في KDT بين خطين DGRP يسلط الضوء على ميزة محتملة من مقايسة ثابتة على مقايسة منحدر ديناميكي; قد تكون عمليات الفحص الثابتة أكثر قدرة على اكتشاف الاختلافات الأصغر بين المجموعات من المعايرات الديناميكية9. تباينت خطوط DGRP التي خضعت لـ KD heat في متوسط KDT بمقدار 14.8 دقيقة. للرجوع إليها، باستخدام بروتوكول التهريج الديناميكي، أظهر Rolandi et al.13 أن الفرق بين قيمالحد الأقصى لـ CT أعلى وأدنى من 34 خطوط DGRP كان فقط 1.42 درجة مئوية، أو <6 دقيقة مع منحدر 0.25 درجة مئوية/ دقيقة.

نسبة إلى أساليب أخرى، وهناك العديدmin من المزايا لكل من المقايسة دقيقة CT و درجة الحرارة KD مقايسة الموصوفة هنا. العد الآلي فيالمقايسة الدقيقة CT يقلل من مقدار الوقت الذي يقضيه المجرب في الجهاز ، وبالتالي زيادة مقدار الوقت الذي يمكن إنفاقه على مهام أخرى. تكلفة بناء العمود الاكريليك سترة هو ~ 50 دولارا ، مقارنة مع ما يقدر بمبلغ 400 دولار لشراء عمود من صنع مخصص الزجاج سترة. بالنسبة لمقايسة KD الحرارية ، فإن تسجيل الفيديو يلغي الحاجة إلى الملاحظات المباشرة في الوقت الحقيقي ويحتل مساحة صغيرة لكل عينة. بروتوكولات أخرى، مثل تلك التي يستخدمها Jørgensen وآخرون9، واستخدام حوض السمك كبيرة لمشاهدة الأفراد المغمورين في قارورة منفصلة، ولكن هذه الطريقة تتطلب محققين مدربين تدريبا جيدا لفحص بسرعة قارورة للحركة وكمية كبيرة من الفضاء للجهاز. استخدم Rolandi etal. 13 أجهزة استشعار الأشعة تحت الحمراء للكشف عن الحركة أو عدم الحركة فيالحد الأقصى للتصوير المقطعي في 96 لوحة بئر ، في حين أن هذا المقايسة KD الحرارية يستخدم كاميرا ويب غير مكلفة (~ 70 دولار) للكشف عن الحركة. يمكن لهذه الكاميرا الكشف عن الحركات الدقيقة التي قد تكون غاب عن شاشة نشاط الأشعة تحت الحمراء.

وعلاوة على ذلك، وضعت مجموعة من البرامج النصية للتخصيص لتقدير سرعة KDT في الحرارة KD مقايسة(تكميلية الترميز ملف 1-3). يمكن استخدام هذه البرامج النصية لتوفير الوقت من خلال الحصول على تقريب تقريبي تقريبي من KDT الحرارة في كل بئر قبل مشاهدة الفيديو ، ومع جودة الفيديو أعلى هذه البرامج النصية يمكن أن تكون أتمتة تسجيل البيانات. وقد تم توفير ثلاثة نصوص لمعالجة الفيديو: FirstFrame.py (ملف الترميز التكميلي 1) ، الذي يحدد إطار الصورة الأول من الفيديو ؛ WellDefine.py (ملف التشفير التكميلي 2) ، الذي يحدد كل بئر فردي من 96 بئر في إطار الصورة الأولى؛ و MotionDetect.py (ملف الترميز التكميلي 3) ، الذي يحول ملف الفيديو إلى إشارة نشاط عن طريق حساب التغير في كثافة البكسل بين الإطارات المتتابعة. المدخلات الوحيدة للبرنامج هو ملف الفيديو، والإخراج يتضمن إحصاءات موجزة ومجموعة بيانات سلسلة زمنية من النشاط في بئر(الشكل 6). يتم تحويل الاختلافات في كثافة البكسل بين إطارات الفيديو باستخدام فلتر تدرج الرمادي لتقليل أبعاد الصورة، ومرشح تمريرة غاوسية منخفضة لتقليل ضوضاء الصورة، وعملية مورفولوجية تمدد لزيادة حدود الأجسام المتحركة. في هذه الحالة، يتم تعريف النشاط على أنه الفرق المطلق لقيم البيكسل بين الإطارات المتتابعة. ويمكن عندئذ تقدير درجة الحرارة KDT على أنها مؤشر الإطار الأخير الذي يحتوي على قيمة نشاط أكبر من الصفر. على سبيل المثال، كان الإطار الذي تم فيه تسجيل النشاط في آخر عام في g12 من مجموعة بيانات عينة(الشكل 6)بعد 2000 s (33.33 دقيقة)، كما هو مبين بخط مسطح. An observer can then play back the digital video and quickly find the Heat KDT of well g12 with this time stamp.

مع تعديلات طفيفة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها هناك تطبيقات إضافية لكل من المقايسات، وأبرزها مع مقايسة KD الحرارة. يمكن تعديل إعداد تسجيل الفيديو لتسجيل أوقات الضربة القاضية الباردة الثابتة ، أو وقت استرداد الغيبوبة ، أو قيمالحد الأدنى CT و CT التي يحتمل أن تكون ديناميكية. البرد غيبوبة الانتعاش الوقت هو مقدار الوقت الذي يستغرقه الفرد لاستئناف الحركة بعد الإجهاد البارد29. لذلك، يمكن قياس وقت الانتعاش غيبوبة البرد مع هذا الإعداد عن طريق تحفيز غيبوبة البرد في لوحة 96 جيدا، ثم استخدام إعداد الفيديو لتسجيل وقت الانتعاش في الحاضنة. وأخيرا، مع صقل دقيق دقيق دقيق، يمكن تسجيلماكس CT الديناميكية أو CTدقيقة في حاضنة المنحدر قابلة للبرمجة. وسيكون الاهتمام الدقيق بدرجة الحرارة داخل كل بئر من الآبار الـ 96 مصدر قلق، لأن الاختلافات الطفيفة في درجة الحرارة في الحاضنة يمكن تضخيمها بين الآبار مع تغير درجة الحرارة.

وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عدة اعتبارات عند تنفيذ إمادقيقة CT أو المقايسة KD الحرارة. أولا وقبل كل شيء ، يمكن أن تؤثر الجودة والعمر والجنس ومرحلة الحياة والخلفية الوراثية والخبرة السابقة من حشرة على الحدود الحرارية6،13،30،31. بالنسبة لكل من المقايسات، يجب أن تكون مواضيع الاختبار منسوخة. ثانياً، يمكن أن يتم حساب مجموعة واحدة فقط في وقت واحد لكل جهاز من أجهزة الـ CTدقيقة. لذلك، المتغيرات مثل الاختلاف النهاري في التسامح الحراري32،33 تحتاج إلى النظر عند مقارنة العلاجات. أحد الحلول لهذه المشكلة هو إجراء المقايساتالمقطعية الدقيقة من حالات العلاج المتعددة مع أجهزة متعددة في نفس الوقت. ثالثاً، قد لا تكون بعض الأنواع مناسبة لواحد أو لكليهما. على سبيل المثال، قد لا تصعد بعض الأنواع بسهولة أو تطير إلى الجثم فيمقايسة الدقيقة CT أو قد تتوقف عن النشاط في درجات حرارة عالية قبل الوصول إلى KDT الحرارة الخاصة بها، مما يجعل من الصعب تمييز وقت الضربة القاضية. وأخيراً، لضمان المقارنات الدقيقة في مقايسة KD الحرارة، من المهم أن تكون معايير KDT (الخطوة 2.2.8) متسقة بين التكرارات والمراقبين والتجارب، إلخ. لاستيعاب أنواع الحشرات المختلفة ، قد تكون هناك حاجة إلى إدخال تعديلات على أي من أجهزة الاختبار. وتشمل التعديلات المحتملة استخدام أنواع مختلفة من القعقع لمقايسة المقطعالمقطعي، واستخدام لوحات ثقافة الخلايا مع عدد أقل من الآبار ومساحة أكبر (48، 24، 12، أو 6 آبار) بدلا من لوحة 96 بئر لاستيعاب الحشرات أكبر، أو ضبط درجة الحرارة المستخدمة لمقايسة KD الحرارة لضمان وقت الضربة القاضية التي ليست سريعة جدا أو بطيئة جدا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر (إيلي مكابي) على مساعدتها في تربية الذبابة ويدعم هذا العمل من قبل وزارة الزراعة الأمريكية المعهد الوطني للأغذية والزراعة مشروع منحة 1010996 والمؤسسة الوطنية للعلوم منحة OIA -1826689 لN.M.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) Thermo Scientific; Waltham, MA 153-5401
C922 Pro Stream Webcam Logitech; Newark, CA 960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm Any Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44041
Clear silicone sealant Any Any
Collection tube (15 ml) Any Any
Cordless Drill Any Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM) TriKinetics; Waltham, MA DFM Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software TriKinetics; Waltham, MA Records data input from the DFM
Fly Storage Lid FlySorter; Seatle, WA FS-96LID-5PK Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate FlySorter; Seatle, WA FS-96PLATE-5PK Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray FlySorter; Seatle, WA FS-TRAY-5PK Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel Kimax 28950-75 75mm
Gutter guard Any Any ~0.5 cm diameter openings
Hacksaw Any Any
Heratherm Thermo Scientific incubator Thermo Scientific; Waltham, MA OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 United States Plastic Corp., OH 61135
Hot glue gun and glue Any Any
Light Source Any Any
Magnets Any Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T) OMEGA; Norwalk, CT 5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel Any Any 2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter United States Plastic Corp., OH 62852
Retort ring Any Any 2" diameter
Retort stand Any Any
Retort three-prong clamp Any Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9) TriKinetics; Waltham, MA PSIU9 Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick) Any Any
Tape Any Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1) TriKinetics; Waltham, MA PS9-1 Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement United States Plastic Corp., OH 45737

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. Angilletta, M. J. Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , New York, NY. (2009).
  3. Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
  4. Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
  5. MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
  6. Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
  7. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  8. Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
  9. Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
  10. Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
  11. Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
  12. Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
  13. Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
  14. Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
  15. Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
  16. Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
  17. Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
  18. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
  19. Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
  20. Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
  21. Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
  22. Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
  23. Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
  24. MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  25. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
  26. Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
  27. Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
  28. Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
  29. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
  30. Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
  31. Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
  32. Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
  33. Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).

Tags

علم الأحياء، العدد 160، الحدود الحرارية، الحد الأدنى الحراري الحرج، CTدقيقة،الحد الأقصى الحراري الحرج، الأشعةالمقطعية ماكس،الحرارة تدق أسفل الوقت، KDT، والحشرات، Drosophila melanogaster
عالية الإنتاجية المقايسة من الحدود الحرارية الحرجة في الحشرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Awde, D. N., Fowler, T. E.,… More

Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter