Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

कीड़ों में क्रिटिकल थर्मल लिमिट्स के उच्च थ्रूपुट परख

Published: June 15, 2020 doi: 10.3791/61186
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Kentucky

Summary

थर्मल सीमा वातावरण जीवों बर्दाश्त है, जो तेजी से जलवायु परिवर्तन के चेहरे में मूल्यवान जानकारी है भविष्यवाणी कर सकते हैं । यहां वर्णित कीड़ों में महत्वपूर्ण थर्मल मिनीमा और गर्मी नॉकडाउन समय का आकलन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल हैं। दोनों प्रोटोकॉल थ्रूपुट को अधिकतम करते हैं और परख की लागत को कम करते हैं।

Abstract

पौधों और जानवरों की ऊपरी और निचली थर्मल सीमाएं उनके प्रदर्शन, अस्तित्व और भौगोलिक वितरण के महत्वपूर्ण भविष्यवक्ता हैं, और जलवायु परिवर्तन के लिए प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी के लिए आवश्यक हैं। यह काम कीट थर्मल सीमा को मापने के लिए दो उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल का वर्णन करता है: एक क्रिटिकल थर्मल मिनिमा (सीटीमिन)का आकलन करने के लिए, और दूसरा स्थिर गर्मी तनाव के जवाब में गर्मी के दस्तक समय (केडीटी) का आकलन करने के लिए। सीटीमिन परख में, व्यक्तियों को एक ऐक्रेलिक-जैकेट कॉलम में रखा जाता है, जो कम तापमान रैंप के अधीन होता है, और एक अवरक्त सेंसर का उपयोग करके उनके पर्चों से गिरने के रूप में गिना जाता है। गर्मी केडीटी परख में, व्यक्तियों को 96 अच्छी तरह से प्लेट में रखा जाता है, जो एक तनावपूर्ण, गर्म तापमान के लिए एक इनक्यूबेटर सेट में रखा जाता है, और उस समय को निर्धारित करने के लिए रिकॉर्ड किया गया वीडियो जिस पर वे अब ईमानदार नहीं रह सकते हैं और आगे बढ़ सकते हैं। ये प्रोटोकॉल आमतौर पर उपयोग की जाने वाली तकनीकों पर लाभ प्रदान करते हैं। दोनों परख कम लागत रहे है और अपेक्षाकृत जल्दी (~ 2 घंटे) पूरा किया जा सकता है । सीटीमिन परख प्रयोगकर्ता त्रुटि को कम करती है और एक बार में बड़ी संख्या में व्यक्तियों को माप सकती है। हीट केडीटी प्रोटोकॉल प्रत्येक परख का एक वीडियो रिकॉर्ड उत्पन्न करता है और इस प्रकार प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह और वास्तविक समय में व्यक्तियों की लगातार निगरानी करने की आवश्यकता को हटा देता है।

Introduction

कीड़ों की थर्मल सीमाएं
तापमान सहित पर्यावरणीय स्थितियों में भिन्नता, जीवों के प्रदर्शन, फिटनेस, अस्तित्व और भौगोलिक वितरण को प्रभावित करने वाला एक प्रमुख कारकहै 1,,2। ऊपरी और निचली थर्मल सीमाएं एक जीव को बर्दाश्त कर सकने वाले वातावरण की सैद्धांतिक श्रृंखला निर्धारित करती हैं, और इसलिए, ये सीमाएं पौधे और पशु वितरण के महत्वपूर्ण भविष्यवक्ता हैं, विशेष रूप से जलवायु परिवर्तन3,,4के चेहरे पर। इस प्रकार, थर्मल सीमा को सही ढंग से मापने के लिए प्रोटोकॉल पारिस्थितिकीविदों, फिजियोलॉजिस्ट, विकासवादी जीवविज्ञानियों और संरक्षण जीवविज्ञानियों के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं।

सबसे प्रचुर मात्रा में और विविध स्थलीय जानवरों के रूप में, कीड़ों का उपयोग अक्सर थर्मल सीमाओं के माप के लिए किया जाता है। क्रिटिकल थर्मल मैक्सिमा (सीटीमैक्स)और क्रिटिकल थर्मल मिनिमा (सीटीमिन)का उपयोग आमतौर पर थर्मल सहिष्णुता5, 6, 7,में अंतर-अंतर और अंतरविशिष्ट भिन्नता का आकलन करने के लिए किया,जाताहै।6 जबकि सीटीमैक्स और सीटीमिन को कई फेनोटाइप के लिए मापा जा सकता है, जिसमें विकास, प्रजनन उत्पादन और व्यवहार शामिल हैं, वे सबसे अधिक लोकोमोटर फ़ंक्शन5,6,,7पर लागू होते हैं।, इस प्रकार,,सीटीमैक्स (जिसे हीट नॉकडाउन तापमान भी कहा जाता है) और सीटीमिन को अक्सर उच्च और निम्न तापमान के रूप में परिभाषित किया जाता है जिस पर कीड़े मोटर कार्य खो देते हैं और 5 ,6, 75,8,,9,7,10, 11तक ईमानदार नहीं रह पाते हैं।,, सीटीमिन ठंडा कोमा की शुरुआत के साथ मेल खाता है, एक प्रतिवर्ती पक्षाघात ठंडे तापमान6द्वारा लाया गया है । जबकि थर्मल सीमा पर पक्षाघात अक्सर उलटा होता है, इन तापमानों के निरंतर संपर्क में पारिस्थितिक मृत्यु 5 की ओरजाताहै।

थर्मल सीमा को मापने के लिए सामान्य तरीके
थर्मल सीमा को मापने के लिए विभिन्न प्रकार के उपकरणों का उपयोग किया गया है (सिंक्लेयर एट अल में संक्षेप में। 6. संक्षेप में, कीड़ों को इनक्यूबेटर12, 13,तरल पदार्थ स्नान में डूबे कंटेनरों में गर्म या ठंडा किया,जाताहै11,,14,,15,,16,एल्यूमीनियम ब्लॉक10,,17,या जैकेट कंटेनर18,और लोकोमोशन समाप्त होने तक निगरानी की जाती है। परख के दौरान कीड़ों की निगरानी करने के लिए, सबसे आम विधि प्रत्यक्ष अवलोकन,11,है, जिसमें व्यक्तियों को रिकॉर्ड किए गए वीडियो,6, 9,10,11, 15, 17के साथ वास्तविक समय या भूतलक्षी प्रभाव से लगातार निगरानी की जाती है।,,1517 जबकि प्रत्यक्ष अवलोकन विधियों में न्यूनतम उपकरण आवश्यकताएं होती हैं, वे श्रम-प्रधान होते हैं और थ्रूपुट को सीमित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, कीड़ों को अप्रत्यक्ष रूप से असतत समय पर व्यक्तियों को इकट्ठा करके देखा जा सकता है क्योंकि वेपर्चों 6,19,20,,21 से गिरते हैं या गतिविधि का उपयोग करके13पर नजर रखता है।

थर्मल सीमाओं को मापने के लिए अप्रत्यक्ष तरीके आम तौर पर उच्च-थ्रूपुट होते हैं और प्रत्यक्ष अवलोकन विधियों की तुलना में संभावित रूप से कम त्रुटि प्रवण होती है। अप्रत्यक्ष निगरानी के लिए सबसे आम तरीका एक जैकेट तापमान नियंत्रित कॉलम 6 ,8,,19,6,20, 21का उपयोग करता है।,,21 कीड़े पर्चों के साथ एक कॉलम के अंदर रखा जाता है, और आंतरिक कक्ष का तापमान कॉलम की जैकेट अस्तर के माध्यम से तापमान नियंत्रित तरल पदार्थ स्नान से तरल पदार्थ पंप करके नियंत्रित होता है। ऐसे व्यक्ति जो अपनी थर्मल सीमा तक पहुंचते हैं, वे अपने पर्च से गिरते हैं और असतत तापमान या समय अंतराल पर एकत्र किए जाते हैं। हालांकि यह विधि सीटीमिनके लिए अच्छी तरह से काम करती है, यह सीटीमैक्सके लिए अनुपयुक्त पाई गई है, क्योंकि तापमान बढ़ने पर मक्खियां स्वेच्छा से कॉलम के नीचे से बाहर निकल जाती हैं। यहां वर्णित नई विधि स्वचालित माप के दौरान व्यक्तिगत रूप से युक्त मक्खियों द्वारा इस मुद्दे को दरकिनार करती है।

अवलोकन की विधि के अलावा, दो प्रकार की तापमान व्यवस्थाओं का उपयोग आमतौर पर ऊपरी थर्मल सीमाओं का आकलन करने के लिए किया जाता है। जब तक मोटर फ़ंक्शन खो नहीं जाता है तब तक गतिशील परख में धीरे-धीरे बढ़ता तापमान होता है; वह तापमान डायनेमिक सीटीमैक्स7, 8,9,,13है .9 इसके विपरीत, स्थिर परख में मोटर फ़ंक्शन खो जाने तक लगातार तनावपूर्ण तापमान होता है; वह समय बिंदु हीट नॉकडाउन समय (हीट केडीटी) है, जिसे हाल ही में एक पेपर में स्टेटिक सीटीमैक्स (एससीटी,8,9,16,22मैक्स)भी कहाजाताहै। यद्यपि सीटीमैक्स और हीट नॉकडाउन परख (हीट केडी परख) विभिन्न इकाइयों के साथ मैट्रिक्स का उत्पादन करते हैं, दो लक्षणों की गणितीय मॉडलिंग इंगित करती है कि वे गर्मी सहिष्णुता के बारे में तुलनीय जानकारी देते हैं और पारिस्थितिक रूप से प्रासंगिक8,,9दोनों हैं। गतिशील परख एक तापमान है कि पर्यावरण की स्थिति की तुलना में किया जा सकता है उपज, और वे बेहतर कर रहे है जब वहां गर्मी सहिष्णुता में बड़े अंतर हैं, जैसे व्यापक रूप से अलग थर्मल niches के साथ प्रजातियों के बीच तुलना के रूप में । हालांकि, गर्मी की चोट संचय के लिए उच्च Q10 के कारण, एक स्थिर परख छोटे प्रभाव आकार का पता लगाने के लिए बेहतर हो सकता है, जैसे गर्मी सहिष्णुता9में अंतरविशिष्ट भिन्नता। इसके अलावा, व्यावहारिक रूप से बोल रहा हूं, एक स्थिर परख एक गतिशील परख की तुलना में कम परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता है ।

उद्देश्य
इस पेपर का उद्देश्य सीटीमिन और हीट केडी परख के लिए तरीकों को औपचारिक रूप देना है जिसका उपयोग भविष्य के शोध में मोटिवल कीड़ों की थर्मल सीमाओं का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल पहले से स्थापित तरीकों से अनुकूलित किए जाते हैं और उच्च-थ्रूपुट, स्वचालित और लागत प्रभावी होने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। दोनों परखें कम समय (~ 2 एच) में पूरी की जा सकती हैं, जिसका अर्थ है कि एक ही दिन में कई प्रयोग किए जा सकते हैं, जिससे दोहराने की क्षमता या सटीकता का त्याग किए बिना बड़ी मात्रा में डेटा का उत्पादन होता है। इस सेटअप के साथ, 96 मक्खियों की गर्मी सहिष्णुता को एक साथ मापा जा सकता है, जबकि सीटीमिन के लिए कॉलम 100 से अधिक मक्खियों को पकड़ सकता है, बशर्ते कि पर्चिंग के लिए पर्याप्त सतह क्षेत्र हो।

सीटीमिन को देखने के लिए उच्च-थ्रूपुट विधि स्वचालित रूप से मक्खियों को गिनने के लिए एक अवरक्त सेंसर के अलावा आम जैकेट कॉलम पद्धति को संशोधित करती है। मतगणना के लिए एक अवरक्त सेंसर का उपयोग पहले १९९६२३ में शुमन एट अल द्वारा प्रस्तावित किया गया था लेकिन इसे व्यापक रूप से नहीं अपनाया गया है । अवरक्त सेंसर के अलावा असतत अंतराल पर डेटा एकत्र करने के बजाय निरंतर डेटा की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है । यह प्रोटोकॉल मैन्युअल डेटा प्रविष्टि को नष्ट करके प्रयोगकर्ता त्रुटि को भी कम करता है और असतत समय बिंदुओं पर लानत कॉलम के नीचे संग्रह ट्यूबों को मैन्युअल रूप से स्विच करने की आवश्यकता है।

गर्मी रिकॉर्ड करने के लिए उच्च थ्रूपुट विधि केडीटी को कीड़ों में गर्मी सहनशीलता के दो पिछले अध्ययनों से संशोधित किया जाता है10,,12। व्यक्तिगत मक्खियों को तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में 96 अच्छी प्लेट में संग्रहीत किया जाता है और वीडियो रिकॉर्ड किया जाता है। यह प्रोटोकॉल हीट केडीटी का निर्धारण करने में प्रयोगकर्ता पूर्वाग्रह को कम करता है क्योंकि रिकॉर्डिंग को वापस खेलकर प्रयोगों की समीक्षा और सत्यापन किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल कस्टम पायथन स्क्रिप्ट का एक सेट भी प्रदान करता है जिसका उपयोग वीडियो विश्लेषण को गति देने के लिए किया जा सकता है। व्यक्तिगत कुओं का उपयोग हस्तक्षेप को समाप्त करता है जो अन्य व्यक्तियों के चारों ओर घूमते हैं या गिर जाते हैं, जो एक समस्या हो सकती है जब व्यक्तियों के समूहों को एक ही क्षेत्रमें 10,,17में मनाया जाता है। इसके अलावा, तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर सभी ९६ कुओं में एक स्थिर तापमान प्रदान करता है, तापमान ढाल के विपरीत कई बार एक तापमान नियंत्रित एल्यूमीनियम ब्लॉक10भर में मनाया । यह भी ध्यान दें कि 96 अच्छी तरह से रिकॉर्डिंग विधि गतिशील सीटीअधिकतम और संभावित सीटीमिनट को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (चर्चा देखें)।

प्रत्येक प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए, ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर जेनेटिक रेफरेंस पैनल (डीजीआरपी) की चुनिंदा पंक्तियों से वयस्क ड्रोसोफिला मेलनोगेस्टर महिलाओं की थर्मल सीमाओं की तुलना24की गई थी। इन पंक्तियों का चयन इसलिए किया गया क्योंकि प्रारंभिक प्रयोगों ने थर्मल सहिष्णुता में महत्वपूर्ण अंतर का संकेत दिया । ये परख थर्मल सहिष्णुता में मतभेदों को भेदभाव करने के लिए मजबूत तरीके साबित हुए । निम्नलिखित दो प्रोटोकॉल, उच्च-थ्रूपुट सीटीमिन परख (धारा 1) और उच्च-थ्रूपुट हीट केडी परख (धारा 2), वयस्क ड्रोसोफिलाजैसे उपकरणों में फिटिंग करने में सक्षम किसी भी मोती कीट जीवन चरण के लिए सीटीमिन और हीट केडीटी डेटा का उत्पादन करने के लिए आवश्यक कार्यों का वर्णन करते हैं। सीटीमिन के लिए यह भी आवश्यक है कि कीट पर्च करने में सक्षम हो। यहां, प्रत्येक परख वयस्क ड्रोसोफिला मेलनोगास्टरमें प्रदर्शित किया जाता है। हालांकि, अन्य टैक्सा या जीवन चरणों6के लिए संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है। मामूली परिवर्तनों में सीटीमिन परख में बड़े नमूनों को समायोजित करने के लिए बड़े उद्घाटन के साथ पर्चिंग सामग्री का उपयोग करना या गर्मी केडी परख में धीमी गति से चलती कीट या जीवन चरण के सूक्ष्म केडीटी को समझने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कैमरे का उपयोग करना शामिल हो सकता है। यह प्रोटोकॉल मक्खियों को तैयार करने के तरीकों का वर्णन नहीं करता है, लेकिन रिपीटेबिलिटी25 सुनिश्चित करने के लिए पालन प्रोटोकॉल का मानकीकरण करना महत्वपूर्ण है (गार्सिया और टीट्स26 और Teets और Hahn27देखें)। प्रदान किए गए प्रोटोकॉल में उपकरणों का निर्माण और स्थापना करने के तरीके, माप रिकॉर्ड करने के तरीके और डेटा विश्लेषण का संक्षिप्त विवरण शामिल है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. हाई-थ्रूपुट सीटीमिन परख

  1. जैकेट कॉलम कोडांतरण(चित्रा 1ए, चित्रा 2)
    1. एक हैकसॉ(चित्रा 2ए)के साथ सबसे व्यापक (7 सेमी x 6.35 सेमी x 0.3 सेमी) और संकीर्ण (5.7 सेमी x 5.1 सेमी x 0.3 सेमी) ऐक्रेलिक ट्यूबों को बराबर लंबाई (31.5 सेमी) में काटें। ये दोनों ट्यूब जैकेट कॉलम की बाहरी और अंतरतम दीवारें होंगी।
    2. मिडसाइज (6.35 सेमी x 5.7 सेमी x 0.3 सेमी) एक्रेलिक ट्यूब से दो छल्ले (2 सेमी चौड़ा) काटें, जो हैकसॉ(चित्रा 2ए)के साथ है। ये दोनों छल्ले आंतरिक और सबसे बाहरी ट्यूबों के बीच स्पेसर होंगे, जो तरल पदार्थ के प्रवाह के लिए दो लंबी ऐक्रेलिक ट्यूबों के बीच एक जगह बनाते हैं।
    3. ध्यान से बाहरी (व्यापक) ऐक्रेलिक ट्यूब में दो छेद ड्रिल, शीर्ष पर एक छेद और नीचे एक। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक छेद ट्यूब के अंत से 3.5 सेमी है। ट्यूब के विपरीत किनारों पर छेद ड्रिल(चित्रा 2बी)।
    4. खुर को कम करने के लिए, भविष्य के छेद के स्थान पर ट्यूब पर टेप रखें और ड्रिल की सबसे कम टॉर्क सेटिंग पर बहुत धीरे-धीरे ड्रिल करें।
    5. थ्रेडिंग टैप का उपयोग करके, दोनों छेदों को थ्रेड करें ताकि नली एडाप्टर को बाहरी ट्यूब के दो छेदों में खराब किया जा सके। क्रैकिंग को कम करने के लिए, स्नेहक का उपयोग करें, और हाथ से धीरे-धीरे थ्रेड करें।
    6. दो स्पेसर्स को आंतरिक जैकेट पर स्लाइड करें, प्रत्येक छोर पर एक (नीचे और ऊपर)। स्पेसर और इनर जैकेट (चित्रा 2बी)के अंत के बीच एक छोटी सी जगह(0.5सेमी) छोड़ दें।
    7. एक्रेलिक सीमेंट का उपयोग करके स्पेसर्स को जगह में वेल्ड करें।
    8. आंतरिक ट्यूब और स्पेसर्स सेट पर सीमेंट के बाद, इस छेद के साथ बड़े बाहरी ट्यूब में निर्माण स्लाइड करें। सुनिश्चित करें कि बाहरी और भीतरी ट्यूब दोनों सिरों पर फ्लश कर रहे हैं। स्पेसर्स अंत से 0.5 सेमी होंगे, जो कॉलम(चित्रा 2सी)के दोनों सिरों पर छोटी खाइयां बनाते हैं।
    9. एक्स्रेलिक सीमेंट का उपयोग करके बाहरी ट्यूब को एक्स्रेलिक सीमेंट का उपयोग करके, उपकरण को एक साथ पकड़ने के लिए समायोज्य स्टील क्लैंप का उपयोग करके, बाहरी ट्यूब को वेल्ड करें। सीमेंट सेट होने का इंतजार करें।
    10. अब स्पेसर्स और इनर ट्यूब के लिए सुरक्षित बाहरी ट्यूब के छेद में नली एडाप्टर धागा।
      नोट: एडाप्टर केवल बाहरी ट्यूब में धागा और भीतरी और सबसे बाहरी ट्यूबों के बीच खुली जगह में नहीं होना चाहिए । यदि नली एडाप्टर बहुत दूर है, तो उन्हें हैकसॉ के साथ उचित लंबाई तक छोटा करें।
    11. नली एडाप्टर को सिलिकॉन सीलेंट के साथ बाहरी ट्यूब पर अपने धागे में सील करें।
    12. सिलिकॉन सीलेंट के साथ जैकेट कॉलम के दोनों सिरों पर भीतरी और सबसे बाहरी ट्यूबों के बीच दो खाइयों को भरें।
    13. कॉलम का परीक्षण करने के लिए, नली एडाप्टर के लिए 0.6 सेमी व्यास टयूबिंग संलग्न करें। कॉलम के नीचे एडाप्टर को ट्यूबिंग के साथ एक जल स्रोत से कनेक्ट करें, और कॉलम के शीर्ष पर एडाप्टर को टयूबिंग के एक अलग टुकड़े के साथ एक नाली में जोड़ें।
    14. नीचे से ऊपर तक उपकरण के माध्यम से पानी चलाएं और लीक की जांच करें। अगर लीक हैं तो पहचानें कि वे कहां से आ रहे हैं और सिलिकॉन के साथ सील करें ।
  2. जैकेट कॉलम और ड्रोसोफिला कीप मॉनिटर (डीएफएम) की स्थापना
    1. जैकेट कॉलम को थ्री-शूल रिटॉर्ट क्लैंप के साथ रिटॉर्ट स्टैंड पर सुरक्षित करें। कॉलम को छत के लिए खुला एक छोर के साथ खड़ी करें और दूसरा लैब बेंच(चित्रा 1बी)के लिए खुला।
    2. 0.6 सेमी व्यास प्लास्टिक ट्यूबिंग(चित्रा 1बी)के साथ कॉलम के एडाप्टर नोज़ल के लिए तापमान नियंत्रित रेफ्रिजरेटेड बाथ से तरल पदार्थ इनपुट और आउटपुट को कनेक्ट करें। द्रव इनपुट को कॉलम के नीचे नोजल और द्रव आउटपुट को कॉलम के शीर्ष पर नोजल से कनेक्ट करें।
    3. दो 3 सेमी मोटी परिपत्र फोम इन्सुलेट प्लग (कॉलम के अंतरतम डिब्बे के उद्घाटन के रूप में एक ही परिधि) काटें। सुनिश्चित करें कि प्लग को चुस्त रूप से फिट करें और दोनों सिरों(चित्रा 1बी)पर डाले जाने पर अंतरतम कॉलम को सील करें।
    4. प्लग में से एक के केंद्र के माध्यम से एक छेद छेद और 5 सेमी के बारे में छेद के माध्यम से एक थर्मोकपल के नंगे अंत धागा और टेप के साथ सुरक्षित । थर्मोकपल के दूसरे छोर को थर्मोकपल डेटा लॉगर में प्लग करें।
    5. थर्मोकपल डाटा लॉगर को कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
    6. परचेजिंग सामग्री के रूप में कार्य करने के लिए कॉलम के अंदर प्लास्टिक गटर गार्ड (5 सेमी x 7 सेमी, ~ 0.5 सेमी व्यास के उद्घाटन के साथ) के दो टुकड़े कील। कॉलम के ऊपर से गार्ड 2/3rds का एक टुकड़ा रखें औरदूसरा 1/3 rds कॉलम के ऊपर से(चित्रा 1B)।
    7. नीचे प्लग (थर्मोकपल के बिना) और शीर्ष प्लग (थर्मोकपल के साथ) सुरक्षित करें। जब प्लग कॉलम के शीर्ष पर डाला जाता है, तो सुनिश्चित करें कि थर्मोकपल कॉलम के किनारों को नहीं छूता है।
    8. रिटॉर्ट स्टैंड पर कॉलम की ऊंचाई को एडजस्ट करें इसलिए कॉलम के नीचे और बेंच टॉप के बीच 25 सेमी की दूरी है।
    9. कॉलम के नीचे 5 सेमी नीचे रिटॉर्ट स्टैंड के लिए एक रिटॉर्ट रिंग (5 सेमी व्यास) सुरक्षित करें और रिंग को कॉलम के किनारे पर घुमाएं।
    10. डीएफएम को सीधे रिटॉर्ट रिंग(चित्रा 1बी)पर सेट करें। सभी इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों को कनेक्ट करें: निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार बिजली की आपूर्ति, बिजली आपूर्ति इंटरफेस और कंप्यूटर।
    11. एक बार घटकों से जुड़ जाने के बाद, डीएफएम और डीएफएम सॉफ्टवेयर के सेटअप को खत्म करने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें।
  3. सीटीमिनट जाँच
    1. द्रव स्नान के इनपुट और आउटपुट वाल्व को खुली स्थिति में बदल दें।
    2. तापमान नियंत्रित तरल पदार्थ स्नान चालू करने के लिए पावर बटन पुश करें और फिर स्नान के तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाने और बनाए रखने के लिए एक कार्यक्रम चलाने के लिए प्ले बटन दबाएं। 25 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने और बनाए रखने के लिए तरल पदार्थ स्नान और कॉलम 5-10 मिनट दें।
    3. कॉलम के शीर्ष पर प्लग निकालें और इसे एक कीप (5.08 सेमी व्यास; चित्रा 1सीदेखें) के साथ बदलें।
    4. उनके भोजन की शीशी से स्तंभ में मक्खियों को टैप करें।
    5. फ़नल निकालें और इसे शीर्ष प्लग के साथ जल्दी से बदलें, सावधान मक्खियों को भागने न दें। मक्खियों को बसने के लिए 5 मिनट दें, कभी-कभी मक्खियों को चढ़ने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए नीचे प्लग का दोहन करें।
    6. द्रव स्नान पर स्टार्ट बटन दबाएं और सीटीमिन रैम्पिंग प्रोग्राम (5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस; 25 डिग्री सेल्सियस से 10 डिग्री सेल्सियस 0.5 डिग्री सेल्सियस/मिनट पर; 2 मिनट के लिए 10 डिग्री सेल्सियस; फिर 10 डिग्री सेल्सियस से -10 डिग्री सेल्सियस 0.25 सेल्सियस/मिनट पर) शुरू करें।
      नोट: इस सीटीमिन रैंपिंग प्रोटोकॉल के अन्य रूपों का उपयोग अनुसंधान प्रश्न के आधार पर किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, सीटीन्यूनतम28पर विभिन्न रैंपिंग दरों के प्रभावों की तुलना)।
    7. कंप्यूटर पर थर्मोकपल रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर खोलने पर क्लिक करें और फिर परख की अवधि के लिए हर सेकंड कॉलम के अंदर तापमान रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए रिकॉर्ड आइकन पर क्लिक करें । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक तापमान रिकॉर्डिंग में दूसरे के लिए विशिष्ट एक समय स्टांप शामिल है, ताकि तापमान डेटा को बाद में डीएफएम के डेटा के साथ मर्ज किया जा सके।
    8. 15 एमएल शंकुकेंद्रित्र ट्यूब में 90% इथेनॉल की 5 एमएल जोड़ें और इसे कॉलम के नीचे एक रैक में रखें।
    9. कभी-कभी, चढ़ाई करने के लिए नीचे की ओर किसी भी मक्खियों को लुभाने के लिए कॉलम के नीचे प्लग पर टैप करें। अधिकांश मक्खियां एक पर्च पर या कॉलम के शीर्ष के पास 15 डिग्री सेल्सियस तक होंगी।
    10. 15 डिग्री सेल्सियस पर, नीचे प्लग को हटा दें और इथेनॉल में नीचे प्लग पर अभी भी किसी भी मक्खियों को इकट्ठा करें। गिनती और ध्यान दें कि इन मक्खियों को 15 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र किया गया था लेकिन उनका सीटीमिन अज्ञात है।
      नोट: जिस तापमान पर नीचे प्लग हटा दिया जाता है परख से पहले और परीक्षण प्रजातियों या उपचार की भविष्यवाणी की सीटीमिनट के आधार पर तय किया जाना चाहिए । इस परख के लिए प्रारंभिक परख में पाई जाने वाली इन विशेष डीजीआरपी लाइनों के सीटीमिन के आधार पर 15 डिग्री सेल्सियस चुना गया।
    11. डीएफएम में 75 मिमी बाहरी व्यास ग्लास कीप रखें। रिटॉर्ट रिंग, डीएफएम और कीप को एडजस्ट करें ताकि वे कॉलम के नीचे हों। सुनिश्चित करें कि कीप का होंठ कॉलम(चित्रा 1डी) के नीचे पूरी तरह से सील कर देताहै।
    12. 15 एमएल कलेक्शन ट्यूब(चित्रा1डी)में कीप के नीचे डालें ।
    13. सॉफ्टवेयर आइकन पर क्लिक कर कंप्यूटर पर डीएफएम सॉफ्टवेयर खोलें। सॉफ्टवेयर तुरंत उस समय/तारीख को रिकॉर्ड करना शुरू कर देगा जिस पर मक्खियां अपने सीटी मिन तक पहुंचतीहैं। मक्खियां जो अपने सीटीमिन तक पहुंचती हैं, न्यूरोमस्कुलर फ़ंक्शन खो देते हैं और उनके पर्चों से गिरते हैं, और उसके बाद डीएफएम के माध्यम से।
    14. निगरानी करें कि क्या सभी मक्खियां अपने सीटीमिनट तक पहुंच गई हैं क्योंकि तापमान शीर्ष प्लग और पर्चों की जांच करके कम हो जाता है ताकि यह देखा जा सके कि क्या कोई मक्खियां अभी भी बैठे हैं (यानी, अभी भी न्यूरोमस्कुलर फ़ंक्शन को बनाए रखना)। परीक्षण तब समाप्त होता है जब सभी मक्खियां अपने सीटी मिन तक पहुंच जातीहैं।
    15. परीक्षण के अंत में, डीएफएम को समायोजित करें और कॉलम खोलने से दूर कीप करें। कुछ मक्खियां अपने सीटीमिन तक पहुंच सकती हैं लेकिन कॉलम में फंसी रहती हैं (यानी एक पर्च में अंकित या एक ही टार्सल हुक द्वारा झूलने)। शीर्ष प्लग खोलें और इन मक्खियों को हटा दें। इन मक्खियों का सीटीमिन अज्ञात है।
    16. RStudio में मर्ज कमांड का उपयोग करके थर्मोकपल रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर (यानी तापमान, तिथि और समय) और डीएफएम सॉफ्टवेयर (यानी, कीप, तारीख और समय के माध्यम से मक्खियों की संख्या) से .txt आउटपुट फ़ाइलों को मिलाएं। साझा तिथि/समय परिवर्तनीय के आधार पर दो फाइलों को मर्ज करें ।

2. उच्च थ्रूपुट हीट केडी परख

  1. उपकरण विधानसभा और तैयारी
    1. एक चिपकने वाला के साथ, स्टील बुने हुए तार जाल (~ 1.5 मिमी एपर्चर) को 96 अच्छी तरह से नो-बॉटम प्लेट के नीचे ठीक करें।
    2. एक गर्म गोंद बंदूक और गर्म गोंद(चित्रा 3)के साथ एक ९६ अच्छी तरह से नहीं नीचे की थाली के नीचे के विपरीत पक्षों के लिए मैग्नेट देते हैं ।
    3. ९६ अच्छी तरह से प्लेटों के लिए डिजाइन चिपकने वाली फिल्म के साथ एक कस्टम पट ढक्कन शिल्प करने के लिए, दो फिल्मों चिपचिपा पक्षों को एक साथ छड़ी के लिए एक ridged प्लास्टिक की चादर बनाने के लिए ।
    4. 96 अच्छी तरह से प्लेट पर प्लास्टिक की चादरें रखें और प्लेट के सभी चार पक्षों का पालन करने के लिए टेप का उपयोग करें। प्लेट पर प्रत्येक अच्छी तरह से खोलने पर, एक बॉक्स कटर (यानी, 96 कुल एक्स) के साथ प्लास्टिक शीट में एक 'एक्स' काटें।) ।
    5. एनेस्थेटाइज सीओ2 के साथ मक्खियों और उन्हें व्यक्तिगत रूप से संशोधित 96 अच्छी तरह से एक एस्पिरेटर और पट ढक्कन के साथ नहीं नीचे प्लेट के प्रत्येक कुएं में लोड करें। 96 अच्छी प्लेट से पट ढक्कन निकालें जबकि मक्खियों को सीओ 2 के साथ एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और इसे एक तंग फिटिंग वाले स्पष्ट ढक्कन से बदल दियाजाता है।
    6. मक्खियों से भरी हुई 96 अच्छी तरह से नो-बॉटम प्लेट रखें और भोजन पर एक स्पष्ट तंग-फिटिंग ढक्कन के साथ। सुनिश्चित करें कि मक्खियों में सीओ2 एनेस्थेटाइजेशन और परख की शुरुआत (चरण 2.2.1-2.2.5) के बीच कम से कम 48 घंटे हैं।
      नोट: संशोधित ९६ अच्छी तरह से नहीं नीचे प्लेटों के नीचे जाल से बना है, तो सीओ2 के साथ एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों लोड किया जा सकता है और एक परीक्षण शुरू होने से पहले कम से ४८ घंटे के लिए भोजन पर छोड़ दिया । किसी भी प्लास्टिक कंटेनर और gt;8.5 सेमी चौड़ा x 13 सेमी लंबा है कि भोजन की एक 1 सेमी गहरी परत को समायोजित करने के लिए कम से कम 2 सेमी गहरी है इस्तेमाल किया जा सकता है।
    7. टेप के साथ तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर के अंदर के नीचे एक वेबकैम को ठीक करें। कैमरे को सीधे ऊपरइंगित करें (चित्रा 4)। कैमरे के ऊपर 10 सेमी के बारे में एक इनक्यूबेटर शेल्फ सुरक्षित करें।
      नोट: वेब कैमरा ऊपर अंक और नीचे से ९६ अच्छी तरह से थाली रिकॉर्ड के रूप में अच्छी तरह से सतह के रूप में ज्यादा सुनिश्चित करने के लिए संभव के रूप में देखने में है (उदाहरण के लिए, थाली की अच्छी तरह से दीवारों से देखने से बाहर अवरुद्ध नहीं) । जब मक्खियां अपने केडीटी तक पहुंचती हैं तो वे कुएं के नीचे गिर जाती हैं; इस मामले में, वेब कैमरा के निकटतम पक्ष, और इसलिए देखने में हैं कि उनकी अच्छी तरह से देखने के केंद्र से कितनी दूर है।
    8. वेबकैम को कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
    9. टेप के साथ, कागज की एक सफेद चादर (८.५ सेमी x 13 सेमी; ९६ अच्छी प्लेट के नीचे का सटीक क्षेत्र) शेल्फ(चित्र 4)के नीचे संलग्न करें । सुनिश्चित करें कि वेबकैम के माध्यम से देखे जाने पर पेपर पूरे फ्रेम को भरता है।
    10. इनक्यूबेटर में एक हल्का स्रोत रखें। प्रकाश व्यवस्था को गीला करने और चकाचौंध को कम करने के लिए कागज या अन्य सामग्रियों का उपयोग करें।
      नोट चरण 2.1.10 प्रत्येक इनक्यूबेटर के लिए विशिष्ट है क्योंकि प्रकाश और प्रतिबिंब इनक्यूबेटर के बीच भिन्न होते हैं। लक्ष्य के लिए इनक्यूबेटर में पर्याप्त प्रकाश व्यवस्था के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से मक्खियों और थाली के पीछे कागज की सफेद चादर जब वेब कैमरा के साथ देखा के बीच एक अच्छा विपरीत प्रदान करने के लिए है ।
  2. गर्मी केडी परख प्रदर्शन
    1. इनक्यूबेटर को 37.5 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और वांछित तापमान तक पहुंचने और बनाए रखने के लिए इनक्यूबेटर को समय देने के लिए लगभग 30 मिनट इंतजार करें। सटीक तापमान कीट का मूल्यांकन किया जा रहा है और किसी भी अन्य समय विचार पर निर्भर करेगा।
    2. 96 अच्छी तरह से थाली इनक्यूबेटर में उलटा रखें, इस तरह कि थाली के नीचे (जाल पक्ष) ट्रे के तल पर सफेद कागज के खिलाफ है(चित्रा 4)। ट्रे पर और वेबकैम के फ्रेम में कुओं (कॉलम और पंक्ति के नाम) के अभिविन्यास पर ध्यान दें। 96 अच्छी तरह से प्लेट और कागज के सफेद टुकड़े के किनारों के साथ रंगीन टेप अभिविन्यास(चित्र 4)सत्यापित कर सकते हैं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि इनक्यूबेटर तापमान गर्मी केडी परख के परीक्षण के दौरान एक थर्मोकपल के साथ थाली के अंदर तापमान रिकॉर्ड करके ९६ अच्छी तरह से थाली के अंदर तापमान के अनुरूप है । यह जांचना भी समझदारी है कि गर्मी केडी परख के संचालन से पहले कई थर्मोकपल के साथ ९६ अच्छी तरह से प्लेट के कुओं के बीच तापमान में नगण्य भिन्नता है ।
    3. इनक्यूबेटर का दरवाजा बंद कर दें।
    4. वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर पर रिकॉर्ड पर क्लिक करें।
    5. 2 घंटे के बाद, रिकॉर्डिंग की जांच करें ताकि यह देखा जा सके कि सभी मक्खियां अपने अंतिम विश्राम स्थल पर पहुंच गई हैं और आगे बढ़ना बंद कर दिया है। एक बार जब सभी मक्खियों ने आगे बढ़ना बंद कर दिया है, तो वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर पर स्टॉप पर क्लिक करें। यहां परीक्षण किए गए जीनोटाइप के लिए, 25 डिग्री सेल्सियस पर पाला जाता है, अधिकांश मक्खियां 37.5 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट तक अपने केडीटी तक पहुंचती हैं (जोर्गेनसेन एट अल9भी देखें)।
    6. मक्खियों का निपटान करें।
    7. कस्टम पायथन स्क्रिप्ट(अनुपूरक कोडिंग फ़ाइलें 1-3)का उपयोग वीडियो में लगभग समय के लिए जब मक्खियों अपनी गर्मी KDT तक पहुंचने के लिए ।
      नोट: चरण 2.2.7 वैकल्पिक है। वीडियो विश्लेषण को गति देने के लिए, प्रत्येक कुएं में समय के साथ पिक्सेल घनत्व में परिवर्तन को मापने के लिए कस्टम पायथन स्क्रिप्ट का एक सेट विकसित किया गया था (पूरक कोडिंग फ़ाइलदेखें)। जब मक्खियां आगे बढ़ना बंद कर देती हैं, तो पिक्सेल घनत्व स्थिर होता है, और इन डेटा के एक भूखंड का उपयोग वीडियो में अनुमानित समय का पता लगाने के लिए किया जा सकता है जब मक्खियों को नीचे गिरा दिया जाता है। हालांकि डेटा विश्लेषण को स्वचालित करने के लिए इस स्क्रिप्ट का उपयोग करना संभव हो सकता है, वर्तमान में वीडियो में मामूली खामियों से पिक्सेल घनत्व में परिवर्तन और सच्चे केडी समय के बीच मामूली विसंगतियां पैदा होती हैं।
    8. वीडियो फ़ाइल खोलने पर क्लिक करें और प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक फ्लाई के KDT रिकॉर्ड करें। परीक्षणों और पर्यवेक्षकों के बीच गर्मी केडीटी का सबसे सुसंगत उपाय उस समय की रिकॉर्डिंग कर रहा है जिस पर एक मक्खी अपने अंतिम विश्राम स्थल तक पहुंचती है ।
    9. वीडियो को रिवर्स में ट्रैक करें, एक अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित करें, और उस समय को ध्यान में रखते हुए जिस पर फ्लाई पहले अपने अंतिम विश्राम स्थल से चलती है। प्रत्येक अच्छी तरह से इस प्रक्रिया को दोहराएं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर जेनेटिक रेफरेंस पैनल (डीजीआरपी) से महिलाओं की थर्मल लिमिट (यानी सीटीमिन और हीट केडीटी) को दो वर्णित प्रोटोकॉल से उत्पन्न उच्च थ्रूपुट डेटा को प्रदर्शित करने के लिए मापा गया था। सीटीमिन डीजीआरपी लाइनों 714 (एन = 37) और 913 (एन = 45) का उपयोग करके परख लिया गया था। हीट केडीटी को डीजीआरपी लाइनों 189 (एन = 42) और 461 (एन = 42) के साथ तुलना में असाया गया था और वीडियो फ़ाइलों का मैन्युअल रूप से विश्लेषण किया गया था। वीडियो देखने सहित प्रयोगों का कुल समय, प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए <2 h लिया गया ।

डीजीआरपी लाइन 913 की महिलाओं में डीजीआरपी लाइन 714(चित्रा 5ए)की महिलाओं की तुलना में सीटीमिन तापमान काफी कम था। विलकॉक्सन रैंक योग परीक्षण, डब्ल्यू = 1585, पी एंड एलटी; 0.001)। दो लाइनों में सीटीमिनका स्पष्ट वितरण था लाइन 913 में 5.00 ± 1.35 डिग्री सेल्सियस (मीन ± एसडी) कासीटी मिन था और लाइन 714 में 9.60 ± 1.53 सेल्सियस का सीटीमिन था।

37.5 डिग्री सेल्सियस पर हीट केडीटी डीजीआरपी लाइन 73 और 461(चित्रा 5बी)से महिलाओं के बीच काफी मतभेद था। विलकॉक्सन रैंक योग परीक्षण, डब्ल्यू = 1658.5, पी एंड एलटी; 0.001)। हालांकि दोनों लाइनों के केडीटी में भिन्नता थी, लेकिन लाइनों के बीच गर्मी केडीटी में अंतर आसानी से पता चला। लाइन 73 में लाइन 461 (लाइन 73 मतलब केडीटी, 55.58 ± 6.92 मिनट) की तुलना में 14.8 मिनट लंबा मतलब केडीटी था; लाइन 461 मतलब केडीटी, 40.78 ± 6.64 मिनट)।

Figure 1
चित्रा 1: सीटीमिन परख के लिए जैकेट कॉलम की स्थापना । (A)इकट्ठे जैकेट कॉलम । (ख)ऊपर और नीचे भीतरी कक्ष सील प्लग के साथ जैकेट कॉलम । थर्मोकपल को शीर्ष प्लग में एक छेद के माध्यम से पिरोया जाता है। DFM कॉलम के नीचे एक रिटॉर्ट अंगूठी के लिए मुहिम शुरू की है और पक्ष में चले गए । (ग)सीटीमिन परख की शुरुआत । शीर्ष प्लग हटा दिया गया था और मक्खियों को कॉलम के शीर्ष उद्घाटन पर एक फ़नल के माध्यम से भीतरी कक्ष में डाला गया था। (घ)सीटीमिन परख के दौरान जैकेट कॉलम और डीएफएम । नीचे प्लग कॉलम से हटा दिया गया था और DFM और कीप कॉलम के नीचे तैनात थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जैकेट कॉलम का तकनीकी चित्रण। (A)एक्रेलिक ट्यूबिंग के प्रत्येक टुकड़े की लंबाई में कटौती: i) दो स्पेसर के छल्ले लंबाई में ३.५ सेमी (चरण 1.1.2): ii) में कटौती करते हैं । 31.5 सेमी (चरण 1.1.1) में सबसे व्यापक एक्रेलिक ट्यूबिंग कट गई; और iii सबसे संकीर्ण एक्रेलिक ट्यूबिंग 31.5 सेमी (चरण 1.1.1) में कटौती करता है। (ख)दो छेद (ग्रे में) ऐक्रेलिक ट्यूबिंग के व्यापक टुकड़े में ड्रिल, प्रत्येक छोर से ३.५ सेमी और विपरीत पक्षों पर (i; कदम १.१.२) । दो स्पेसर छल्ले (ii; चरण 1.1.6 और 1.1.7) के साथ एक्रेलिक ट्यूबिंग के सबसे संकीर्ण टुकड़े की असेंबली। (ग)चरण 1.1.8-1.1.12 के बाद पूरा जैकेट कॉलम। नली एडाप्टर ग्रे में इंगित कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: नीचे (बाएं) और ऊपर (दाएं) ९६ अच्छी तरह से नहीं नीचे थाली के दृश्य । स्टील बुना जाल एक संशोधित 96 अच्छी तरह से नहीं नीचे प्लेट के नीचे से जुड़ा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक गर्मी केडी परख के लिए इनक्यूबेटर सेटअप। (A)वेबकैम और स्टेज एक दूरी पर स्थापित किया गया । (ख)एक परीक्षण शुरू होने से पहले इनक्यूबेटर में वेबकैम और स्टेज सेटअप। वेबकैम इनक्यूबेटर के फर्श पर तय किया गया है और ट्रे वेबकैम से ~ 10 सेमी ऊपर है। (ग)एक गर्मी केडी परख के दौरान वेब कैमरा के ऊपर सफेद मंच पर ९६ अच्छी तरह से थाली का अभिविन्यास । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: ड्रोसोफिला जेनेटिक रेफरेंस पैनल (डीजीआरपी) से चुनिंदा लाइनों की निचली और ऊपरी थर्मल सीमाएं। (A)दो डीजीआरपी लाइनों के सीटीमिन मूल्य । (B)दो डीजीआरपी लाइनों की हीट केडीटी 37.5 डिग्री सेल्सियस पर। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

चित्र 6: टेस्ट डेटासेट की वीडियो विश्लेषण स्क्रिप्ट से गतिविधि आउटपुट। प्रत्येक भूखंड एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के एक अच्छी तरह से गतिविधि डेटा का प्रतिनिधित्व करता है। कुल 84 नमूनों की जांच कर उन्हें दिखाया गया है। अच्छी तरह से आईडी प्रत्येक हिस्टोग्राम के दाईं ओर लेबल है।  कृपया इस आंकड़े को देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक कोडिंग फाइल 1. इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक कोडिंग फाइल 2. इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

सप्लीमेंट्री कोडिंग फाइल 3. इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion


ऊपर विस्तृत दो तरीके ऊपरी और निचले थर्मल सीमाओं के लिए पारिस्थितिक रूप से प्रासंगिक मैट्रिक्स के उच्च-थ्रूपुट डेटा उत्पन्न करते हैं। ये प्रोटोकॉल कीट थर्मल सीमाओं पर शोध करने के लिए पहले से स्थापित पद्धतियों पर निर्माण करते हैं (सिंक्लेयर एट अल में संक्षेप में) 6.दोनों प्रोटोकॉल को कम समय (~ 2 एच प्रत्येक) में पूरा किया जा सकता है, बड़े नमूना आकार के साथ डेटा सेट का उत्पादन कर सकते हैं, दोहराव या सटीकता का त्याग नहीं करते हैं, और मैनुअल डेटा रिकॉर्डिंग और प्रविष्टि (सीटीमिन परख) को नष्ट करके प्रयोगकर्ता त्रुटि को कम करते हैं, या प्रत्येक परख (हीट केडी परख) की बैकअप वीडियो रिकॉर्डिंग बनाकर।

डीजीआरपी24की चुनिंदा पंक्तियों से वयस्क महिलाओं की थर्मल सीमाओं की तुलना करके प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न किए गए थे । दोनों परख लाइनों के बीच थर्मल सहिष्णुता में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया । इनमें से प्रत्येक परख में लाइनों के बीच प्रभाव का आकार अपेक्षाकृत बड़ा था, जिसने बदले में दृश्य और सांख्यिकीय तुलनाओं वाले समूहों के विश्वसनीय भेदभाव की अनुमति दी। दो डीजीआरपी लाइनों के बीच केडीटी में बड़ा अंतर एक गतिशील रैंपिंग परख पर एक स्थिर परख के संभावित लाभ पर प्रकाश डाला गया; स्थिर परख बेहतर गतिशील परख9से समूहों के बीच छोटे मतभेदों का पता लगाने में सक्षम हो सकता है . दो डीजीआरपी लाइनों गर्मी के अधीन केडी परख मतलब केडीटी में १४.८ मिनट से मतभेद । संदर्भ के लिए, एक गतिशील रैंपिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, रोलांडी एट अल13 ने दिखाया कि 34 डीजीआरपी लाइनों के उच्चतम और निम्नतम सीटीअधिकतम मूल्यों का अंतर केवल 1.42 डिग्री सेल्सियस, या 0.25 डिग्री सेल्सियस/न्यूनतम रैंप के साथ <6 मिनट था।

अन्य तरीकों के सापेक्ष, यहां वर्णित सीटीमिन परख और गर्मी केडी परख दोनों के कई फायदे हैं। सीटीमिन परख में स्वचालित गिनती समय की मात्रा कम कर देता है एक प्रयोगकर्ता उपकरण पर खर्च करता है, इस प्रकार समय की मात्रा है कि अंय कार्यों पर खर्च किया जा सकता है बढ़ रही है । एक्रेलिक-जैकेट कॉलम बनाने की लागत ~ $ 50 है, अनुमानित $ 400 की तुलना में कस्टम-निर्मित ग्लास-जैकेट कॉलम खरीदने के लिए। गर्मी केडी परख के लिए, वीडियो रिकॉर्डिंग वास्तविक समय में प्रत्यक्ष टिप्पणियों की आवश्यकता को समाप्त करती है और प्रति नमूने भौतिक स्थान की एक छोटी राशि पर कब्जा कर देती है। अन्य प्रोटोकॉल, जैसे जोर्गेनसेन एट अल 9 द्वारा उपयोग किए जाने वाले, अलग-अलग शीशियों में डूबे व्यक्तियों को देखने के लिए एक बड़े मछलीघर का उपयोग करते हैं, लेकिन इस विधि के लिए अच्छीतरहसे प्रशिक्षित जांचकर्ताओं को आंदोलन के लिए शीशियों और उपकरण के लिए बड़ी मात्रा में स्थान की जांच करने की आवश्यकता होती है। रोलांडी एट अल13 ने 96 अच्छी प्लेटों में सीटीमैक्स पर आंदोलन या आंदोलन की कमी का पता लगाने के लिए अवरक्त सेंसर का उपयोग किया, जबकि इस गर्मी केडी परख गति का पता लगाने के लिए एक सस्ती वेबकैम (~ $ 70) का उपयोग करता है। यह कैमरा सूक्ष्म आंदोलनों का पता लगा सकता है जिन्हें अवरक्त गतिविधि मॉनिटर द्वारा याद किया जा सकता है।

इसके अलावा, गर्मी केडी परख में केडीटी का अनुमान लगाने के लिए अनुकूलन योग्य लिपियों का एक सेट विकसित किया गया था(पूरक कोडिंग फ़ाइल 1-3)। इन लिपियों का उपयोग वीडियो देखने से पहले प्रत्येक कुएं में गर्मी केडीटी का एक मोटा सन्निकटन प्राप्त करके समय बचाने के लिए किया जा सकता है, और उच्च वीडियो गुणवत्ता के साथ ये स्क्रिप्ट संभावित रूप से डेटा रिकॉर्डिंग को स्वचालित कर सकती हैं। वीडियो को प्रोसेस करने के लिए तीन स्क्रिप्ट प्रदान की गई हैं: FirstFrame.py(पूरक कोडिंग फ़ाइल 1),जो वीडियो के पहले छवि फ्रेम को परिभाषित करता है; WellDefine.py(अनुपूरक कोडिंग फ़ाइल 2),जो पहली छवि फ्रेम में 96 अच्छी प्लेट के प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से परिभाषित करता है; और MotionDetect.py(सप्लीमेंट्री कोडिंग फाइल 3),जो अनुक्रमिक फ्रेम के बीच पिक्सेल घनत्व में बदलाव की गणना करके वीडियो फ़ाइल को एक गतिविधि संकेत में बदल देता है। कार्यक्रम के लिए एकमात्र इनपुट वीडियो फ़ाइल है, और आउटपुट में सारांश आंकड़े और प्रति अच्छी तरह से गतिविधि का एक समय श्रृंखला डेटासेट(चित्र 6)शामिल है। वीडियो फ्रेम के बीच पिक्सेल घनत्व में अंतर छवि आयामों को कम करने के लिए ग्रेस्केल फ़िल्टर का उपयोग करके बदल दिया जाता है, छवि शोर को कम करने के लिए एक गॉसियन कम पास फ़िल्टर, और चलती वस्तुओं की सीमाओं को बढ़ाने के लिए एक फैलाव रूपात्मक ऑपरेशन। इस मामले में, गतिविधि को अनुक्रमिक फ्रेम के बीच पिक्सेल मूल्यों के पूर्ण अंतर के रूप में परिभाषित किया गया है। गर्मी केडीटी तो एक गतिविधि मूल्य शून्य से अधिक युक्त पिछले फ्रेम के सूचकांक के रूप में अनुमान लगाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, जिस फ्रेम में गतिविधि पिछली बार एक नमूना डेटासेट(चित्रा 6)के अच्छी तरह से g12 में दर्ज की गई थी, वह 2,000 एस (33.33 मिनट) के बाद था, जैसा कि एक फ्लैट लाइन द्वारा इंगित किया गया था। एक पर्यवेक्षक तो वापस डिजिटल वीडियो खेल सकते है और जल्दी से इस समय स्टांप के साथ अच्छी तरह से g12 की गर्मी KDT मिल ।

मामूली संशोधनों और समस्या निवारण के साथ दोनों परख के लिए अतिरिक्त आवेदन हैं, सबसे विशेष रूप से गर्मी केडी परख के साथ। वीडियो रिकॉर्डिंग सेटअप स्थिर ठंड नॉकडाउन समय, ठंडा कोमा वसूली समय, या संभावित गतिशील सीटी अधिकतम और सीटीमिन मूल्यों को रिकॉर्ड करनेके लिए संशोधित किया जा सकता है । ठंडा कोमा वसूली का समय ठंडे तनाव के बाद एक व्यक्ति को आंदोलन फिर से शुरू करने में लगने वाला समयहै। इसलिए, ठंडा कोमा वसूली समय ९६ अच्छी तरह से थाली में ठंडा कोमा उत्प्रेरण द्वारा इस सेटअप के साथ मापा जा सकता है, तो वीडियो सेटअप का उपयोग करने के लिए इनक्यूबेटर में वसूली समय रिकॉर्ड । अंत में, सावधान ठीक ट्यूनिंग के साथ, गतिशील सीटीअधिकतम या सीटीमिन एक प्रोग्रामिंग रैंप इनक्यूबेटर में दर्ज किया जा सकता है । ९६ कुओं में से प्रत्येक के अंदर तापमान पर सावधानीपूर्वक ध्यान देना एक चिंता का विषय होगा, क्योंकि इनक्यूबेटर में तापमान में मामूली भिन्नता को कुओं के बीच बढ़ाया जा सकता है क्योंकि तापमान में परिवर्तन होता है ।

सीटीमिन या हीट केडी परख का प्रदर्शन करते समय कई बातों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले और सबसे महत्वपूर्ण, गुणवत्ता, आयु, लिंग, जीवन चरण, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, और एक कीट का पिछला अनुभव थर्मल सीमा6,13,,,30, 31,31को प्रभावित कर सकता है। दोनों परख के लिए, परीक्षण विषयों को मोती होना चाहिए। दूसरा, प्रत्येक सीटीमिन उपकरण के लिए एक समय में केवल एक समूह को परखाया जा सकता है । इसलिए, उपचार की तुलना करते समय थर्मल सहिष्णुता32,,33 में दैनिक भिन्नता जैसे चरों पर विचार करने की आवश्यकता है। इस समस्या का एक समाधान एक ही समय में कई उपकरणों के साथ कई उपचार स्थितियों के सीटीमिन परख का संचालन करना है। तीसरा, कुछ प्रजातियां एक या दोनों परख के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, कुछ प्रजातियां सीटीमिन परख में पर्चों पर आसानी से चढ़ने या उड़ने वाली नहीं हो सकती हैं या उनकी गर्मी केडीटी तक पहुंचने से पहले उच्च तापमान पर गतिविधि बंद कर सकती हैं, जिससे नॉकडाउन समय को समझना मुश्किल हो जाएगा। अंत में, गर्मी केडी परख में सटीक तुलना सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि केडीटी (चरण 2.2.8) के लिए मानदंड प्रतिकृति, पर्यवेक्षकों, परीक्षणों आदि के बीच संगत है। विभिन्न कीट प्रजातियों को समायोजित करने के लिए, परीक्षण उपकरणों में से किसी में संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। संभावित संशोधनों में सीटीमिन परख के लिए विभिन्न प्रकार के पर्चों का उपयोग करना, बड़ी कीड़ों को समायोजित करने के लिए 96 अच्छी प्लेट के बजाय कम कुओं और अधिक स्थान (48, 24, 12, या 6 कुओं) के साथ सेल संस्कृति प्लेटों का उपयोग करना, या गर्मी केडी परख के लिए उपयोग किए जाने वाले तापमान को समायोजित करना शामिल है जो बहुत तेज या बहुत धीमा नहीं है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम मक्खी पालन के साथ सहायता के लिए ऐली McCabe शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग द्वारा समर्थित किया जाता है राष्ट्रीय खाद्य और कृषि हैच परियोजना संस्थान अनुदान १०१०९९६ और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान OIA-१८२६६८९ N.M.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) Thermo Scientific; Waltham, MA 153-5401
C922 Pro Stream Webcam Logitech; Newark, CA 960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm Any Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44041
Clear silicone sealant Any Any
Collection tube (15 ml) Any Any
Cordless Drill Any Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM) TriKinetics; Waltham, MA DFM Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software TriKinetics; Waltham, MA Records data input from the DFM
Fly Storage Lid FlySorter; Seatle, WA FS-96LID-5PK Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate FlySorter; Seatle, WA FS-96PLATE-5PK Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray FlySorter; Seatle, WA FS-TRAY-5PK Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel Kimax 28950-75 75mm
Gutter guard Any Any ~0.5 cm diameter openings
Hacksaw Any Any
Heratherm Thermo Scientific incubator Thermo Scientific; Waltham, MA OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 United States Plastic Corp., OH 61135
Hot glue gun and glue Any Any
Light Source Any Any
Magnets Any Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T) OMEGA; Norwalk, CT 5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel Any Any 2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter United States Plastic Corp., OH 62852
Retort ring Any Any 2" diameter
Retort stand Any Any
Retort three-prong clamp Any Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9) TriKinetics; Waltham, MA PSIU9 Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick) Any Any
Tape Any Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1) TriKinetics; Waltham, MA PS9-1 Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement United States Plastic Corp., OH 45737

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. Angilletta, M. J. Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , New York, NY. (2009).
  3. Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
  4. Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
  5. MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
  6. Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
  7. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  8. Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
  9. Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
  10. Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
  11. Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
  12. Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
  13. Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
  14. Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
  15. Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
  16. Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
  17. Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
  18. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
  19. Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
  20. Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
  21. Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
  22. Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
  23. Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
  24. MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  25. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
  26. Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
  27. Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
  28. Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
  29. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
  30. Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
  31. Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
  32. Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
  33. Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).

Tags

जीव विज्ञान अंक 160 थर्मल सीमा क्रिटिकल थर्मल मिनिमा सीटीमिन,क्रिटिकल थर्मल अधिकतम सीटीमैक्स,गर्मी दस्तक समय केडीटी कीड़े ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर
कीड़ों में क्रिटिकल थर्मल लिमिट्स के उच्च थ्रूपुट परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Awde, D. N., Fowler, T. E.,… More

Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter