Summary
I limiti termici possono prevedere gli ambienti che gli organismi tollerano, che sono informazioni preziose di fronte al rapido cambiamento climatico. Qui descritti sono protocolli ad alto rendimento per valutare il minimo termico critico e il tempo di abbattimento del calore negli insetti. Entrambi i protocolli massimizzano la velocità effettiva e riducono al minimo il costo dei test.
Abstract
I limiti termici superiori e inferiori di piante e animali sono importanti predittori delle loro prestazioni, sopravvivenza e distribuzioni geografiche e sono essenziali per prevedere le risposte ai cambiamenti climatici. Questo lavoro descrive due protocolli ad alto rendimento per misurare i limiti termici degli insetti: uno per la valutazione della minima termica critica (CTmin)e l'altro per la valutazione del tempo di down del calore (KDT) in risposta a uno stress termico statico. Nelsaggio min CT, gli individui sono collocati in una colonna acrilica-jacketed, sottoposti a una rampa di temperatura decrescente, e contati come cadono dai loro posatoi utilizzando un sensore a infrarossi. Nel saggio termico KDT, gli individui sono contenuti in una piastra di 96 porri, collocata in un'incubatrice impostata su una temperatura stressante e calda e video registrato per determinare il momento in cui non possono più rimanere in posizione verticale e muoversi. Questi protocolli offrono vantaggi rispetto alle tecniche di uso comune. Entrambi i test sono a basso costo e possono essere completati relativamente rapidamente (2 h). Il saggioCT min riduce l'errore dello sperimentatore e può misurare un gran numero di individui contemporaneamente. Il protocollo termo-KDT genera una registrazione video di ogni saggio e quindi rimuove la distorsione dello sperimentatore e la necessità di monitorare continuamente gli individui in tempo reale.
Introduction
Limiti termici degli insetti
La variazione delle condizioni ambientali, compresa la temperatura, è un fattore importante che influenza le prestazioni, la forma fisica, la sopravvivenza e la distribuzione geografica degliorganismi 1,2. I limiti termici superiori e inferiori determinano la gamma teorica di ambienti che un organismo può tollerare e, pertanto, questi limiti sono importanti predittori delle distribuzioni vegetali e animali, soprattutto di fronte ai cambiamenticlimatici 3,4. Pertanto, i protocolli per misurare con precisione i limiti termici sono strumenti importanti per ecologisti, fisiologi, biologi evoluzionisti e biologi della conservazione, tra gli altri.
Come gli animali terrestri più abbondanti e diversi, gli insetti sono spesso utilizzati per misurazioni dei limiti termici. Le maxima termiche critiche (CTmax) e la minima termica critica (CTmin)sono comunemente utilizzate per valutare le variazioni intra e interspecifiche nella tolleranzatermica 5,6,7. Mentre CTmax e CTmin possono essere misurati per più fenotipi, tra cui la crescita, la produzione riproduttiva e il comportamento, sono più comunemente applicati alla funzione locomotore5,6,7. Così, CTmax (chiamato anche temperatura di knockdown di calore) e CTmin sono spesso definiti come le alte e basse temperature a cui gli insetti perdono la funzione motoria e non sono in grado di rimanere in posizioneverticale 5,6,7,8,9,10,11. CTmin coincide con l'insorgenza del coma freddo, una paralisi reversibile causata da temperature fredde6. Mentre la paralisi ai limiti termici è spesso reversibile, l'esposizione continua a queste temperature porta alla morte ecologica5.
Metodi comuni per misurare i limiti termici
Una varietà di apparati sono stati utilizzati per misurare i limiti termici (riepilogo in Sinclair et al.) 6. Brevemente, gli insetti vengono riscaldati o raffreddati in incubatrici12,13, contenitori sommersi in bagni fluidi11,14,15,16, blocchi di alluminio10,17, o contenitori con giubbotto18, e monitorati fino a quando la locomozione cessa. Per monitorare gli insetti durante il test, il metodo più comune è l'osservazione diretta, in cui gli individui sono continuamente monitorati in tempo reale o retrospettivamente con videoregistrati 6,9,10,11,15,17. Mentre i metodi di osservazione diretta hanno requisiti minimi di equipaggiamento, sono ad alta intensità di manodopera e limitano la produttività. In alternativa, gli insetti possono essere osservati indirettamente raccogliendo individui in momenti discreti quando cadono dai posatoi6,19,20,21 o utilizzando monitor di attività13.
I metodi indiretti per la misurazione dei limiti termici sono generalmente più elevati e potenzialmente meno soggetti a errori rispetto ai metodi di osservazione diretta. Il metodo più comune per il monitoraggio indiretto utilizza una colonna con temperaturacontrollata 6,8,19,20,21. Gli insetti sono posizionati all'interno di una colonna con posatoi, e la temperatura della camera interna è controllata da pompaggio di liquido da un bagno fluido a temperatura controllata attraverso il rivestimento con la giacca della colonna. Gli individui che raggiungono il loro limite termico cadono dal loro tresico e vengono raccolti a temperature discrete o intervalli di tempo. Mentre questo metodo funziona bene per CTmin, è stato trovato inadatto per CTmax, perché le mosche camminano volontariamente fuori dal fondo della colonna quando la temperatura aumenta. Il nuovo metodo qui descritto elude questo problema mediante la condilenza individuale dei mosche durante le misurazioni automatizzate.
Oltre al metodo di osservazione, due tipi di regimi di temperatura sono comunemente utilizzati per valutare i limiti termici superiori. I saggi dinamici consistono nell'aumentare gradualmente la temperatura fino alla perdita della funzione motoria; che la temperatura è la dinamica CTmax7,8,9,13. Al contrario, i saggi statici consistono in una temperatura costante stressante fino alla perdita della funzione motoria; quel punto di tempo è il tempo di knockdown di calore (heat KDT), chiamato anche il CTmax statico (sCTmax) in un recente documento di J'rgensen et al.7,8,9,16,22. Anche sei test di TC max e heat knockdown (analisi di calore KD) producono metriche con unità diverse, la modellazione matematica dei due tratti indica che danno informazioni comparabili sulla tolleranza al calore e sono entrambi ecologicamenterilevanti 8,9. I saggi dinamici producono una temperatura che può essere paragonata alle condizioni ambientali, e sono preferibili quando ci sono grandi differenze nella tolleranza al calore, come i confronti tra specie con nicchie termiche molto diverse. Tuttavia, a causa dell'elevato Q10 per l'accumulo di lesioni termico, un saggio statico può essere preferibile per rilevare piccole dimensioni di effetto, come la variazione intraspecifica nella tolleranza alcalore 9. Inoltre, in pratica, un saggio statico richiede attrezzature meno sofisticate di un saggio dinamico.
Obiettivo
L'obiettivo di questo documento è formalizzare i metodi per i testTC min e heat KD che possono essere utilizzati nella ricerca futura per valutare i limiti termici degli insetti motile. I protocolli sono adattati da metodologie precedentemente stabilite e sono progettati per essere ad alta velocità effettiva, automatizzati e convenienti. Entrambi i test possono essere completati in un breve lasso di tempo (2 h), il che significa che più esperimenti possono essere condotti in un solo giorno, producendo grandi quantità di dati senza sacrificare ripetibilità o precisione. Con questa configurazione, la tolleranza al calore di 96 mosche può essere misurata contemporaneamente, mentre la colonna per CTmin può contenere più di 100 mosche, a condizione che vi sia una superficie adeguata per appollaiare.
Il metodo ad alta velocità effettiva per osservare CTmin modifica la metodologia comune delle colonne con l'aggiunta di un sensore a infrarossi per contare automaticamente le mosche. L'uso di un sensore a infrarossi per il conteggio è stato23 proposto per la prima volta da Shuman et al. L'aggiunta del sensore a infrarossi consente la generazione di dati continui anziché la raccolta di dati a intervalli discreti. Questo protocollo riduce anche al minimo l'errore dello sperimentatore eliminando l'immissione manuale dei dati e la necessità di passare manualmente i tubi di raccolta sotto la colonna jacked in punti di tempo discreti.
Il metodo ad alto rendimento per la registrazione del KDT termico viene modificato da due studi precedenti sulla tolleranza al calore negliinsetti 10,12. Le singole mosche vengono conservate in una piastra di 96 po 'in un'incubatrice a temperatura controllata e viene registrato il video. Questo protocollo riduce al minimo la distorsione dello sperimentatore nel determinare il KDT termico perché gli esperimenti possono essere rivisti e verificati eseguendo la riproduzione della registrazione. Questo protocollo fornisce anche una serie di script Python personalizzati che possono essere utilizzati per velocizzare l'analisi video. L'uso di singoli pozzi elimina le interferenze che possono verificarsi quando altri individui si muovono o cadono, che può essere un problema quando gruppi di individui sono osservati nella stessa arena10,17. Inoltre, l'incubatrice a temperatura controllata fornisce una temperatura stabile in tutti i 96 pozzi, a differenza del gradiente di temperatura talvolta osservato in un blocco di alluminio controllato dallatemperatura 10. Si noti inoltre che il metodo di registrazione dei 96 well può essere adattato per misurare la CTmax dinamica e potenzialmente LA CTmin (vedi Discussione).
Per dimostrare ogni protocollo, i limiti termici delle femmine adulte di Drosophila melanogaster da alcune linee del Pannello di riferimento genetico drosophila melanogaster (DGRP) sono staticonfrontati 24. Queste linee sono state selezionate perché gli esperimenti preliminari hanno indicato differenze significative nella tolleranza termica. Questi saggi si sono rivelati metodi robusti per discriminare le differenze nella tolleranza termica. I seguenti due protocolli, il saggio CTmin ad alta velocità (sezione 1) e il saggio KD termico ad alta velocità (sezione 2), descrivono le azioni necessarie per produrre dati KDT TCmin e heat per qualsiasi fase di vita degli insetti motile in grado di adattarsi agli apparati, come la Drosophilaadulta. Per CTmin è anche essenziale che l'insetto sia in grado di persico. Qui, ogni saggio è dimostrato in adulto Drosophila melanogaster. Tuttavia, possono essere necessarie modifiche per altre fasi di taxa o di vita6. Piccoli cambiamenti potrebbero includere l'utilizzo di materiale appollaiato con aperture più grandi per ospitare campioni piùgrandi nel saggio min CT o l'utilizzo di una fotocamera di qualità superiore per discernere il sottile KDT di un insetto in movimento lento o di una fase di vita nel saggio KD di calore. Questo protocollo non descrive i metodi per la preparazione dei mosche, ma è importante standardizzare i protocolli di allevamento per garantire la ripetibilità25 (vedi Garcia e Teets26 e Teets e Hahn27). I protocolli forniti includono informazioni su come costruire e impostare gli apparati, come registrare le misurazioni e una breve descrizione dell'analisi dei dati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Analisi CT min adalta velocità effettiva
- Assemblaggio della colonna con la giacca(Figura 1A, Figura 2)
- Tagliare i tubi acrilici più larghi (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) e più stretti (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) a lunghezze uguali (31,5 cm) con un seghetto(Figura 2A). Questi due tubi saranno le pareti esterne e più interne della colonna con la giacca.
- Tagliare due anelli (2 cm di larghezza) dal tubo acrilico di medie dimensioni (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) con un seghetto(Figura 2A). Questi due anelli saranno i distanziali tra i tubi interni e più esterni, creando uno spazio tra i due lunghi tubi acrilici per il fluido a fluire.
- Praticare con cura due fori nel tubo acrilico esterno (più largo), un foro in alto e uno in basso. Assicurarsi che ogni foro sia di 3,5 cm dalla fine del tubo. Forare i fori sui lati opposti del tubo (Figura 2B).
- Per ridurre la fessurazione, posizionare il nastro sul tubo sul punto del foro futuro e praticare molto lentamente sull'impostazione della coppia più bassa del trapano.
- Utilizzando il rubinetto di filettatura, infilare entrambi i fori in modo che gli adattatori del tubo tubo possano essere avvitati nei due fori del tubo esterno. Per ridurre la fessurazione, utilizzare il lubrificante e filo lentamente a mano.
- Far scorrere i due distanziatori sulla giacca interna, uno ad ogni estremità (in basso e in alto). Lasciare un piccolo spazio (0,5 cm) tra il distanziale e la fine della giacca interna (Figura 2B).
- Saldare i distanziali in posizione utilizzando cemento acrilico.
- Dopo il cemento sulla tubo d'aria e distanziali set, far scorrere questo costrutto nel tubo esterno più grande con i fori. Assicurarsi che le estremità esterne e interne siano a filo su entrambe le estremità. I distanziatori saranno di 0,5 cm dalla fine, formando piccole trincee su entrambe le estremità della colonna (Figura 2C).
- Saldare il tubo esterno ai distanziali utilizzando cemento acrilico, utilizzando morsetti in acciaio regolabili per tenere insieme l'apparecchio. Attendere che il cemento si set.
- Infilare gli adattatori del tubo tubo nei fori del tubo esterno ora fissati ai distanziali e alla tubo interno.
NOTA: Gli adattatori devono solo infilare nel tubo esterno e non nello spazio aperto tra i tubi interni ed esterni. Se gli adattatori tubo si infilano troppo, accorciarli alla lunghezza appropriata con un seghetto. - Sigillare gli adattatori del tubo in fili sul tubo esterno con sigillante in silicone.
- Riempire le due trincee tra i tubi interni ed esterni ad entrambe le estremità della colonna con la giacca con sigillante in silicone.
- Per testare la colonna, collegare tubi di diametro 0,6 cm agli adattatori del tubo. Collegare l'adattatore nella parte inferiore della colonna a una fonte d'acqua con tubi e l'adattatore nella parte superiore della colonna a uno scarico con un altro pezzo di tubazione.
- Eseguire l'acqua attraverso l'apparato dal basso verso l'alto e verificare la presenza di perdite. Se ci sono perdite, identificare da dove provengono e sigillare con silicone.
- Impostazione della colonna con la giacca e del monitor a imbuto Drosophila (DFM)
- Fissare la colonna con la giacca a un supporto di ristoro con un morsetto a tre prong retort. Allineare la colonna verticalmente con un'estremità aperta al soffitto e l'altra aperta al banco di laboratorio (Figura 1B).
- Collegare l'ingresso fluido e l'uscita da un bagno refrigerato a temperatura controllata agli ugelli dell'adattatore della colonna con tubi di plastica di 0,6 cm di diametro (Figura 1B). Collegare l'input fluido all'ugello nella parte inferiore della colonna e l'uscita del fluido all'ugello nella parte superiore della colonna.
- Tagliare due spine isolanti circolari spesse 3 cm (la stessa circonferenza dell'apertura del compartimento più interno della colonna). Assicurarsi che le spine si adattino perfettamente e sigillare la colonna più interna quando vengono inserite a entrambe le estremità (Figura 1B).
- Forare un foro attraverso il centro di uno dei tappi e infilare l'estremità nuda di un termocoppia attraverso il foro di circa 5 cm e fissare con nastro adesivo. Collegare l'altra estremità del termocopo in un registratore di dati termocoppia.
- Collegare il registratore di dati termocoppia al computer.
- Incuneare due pezzi di protezione di grondaia di plastica (5 cm x 7 cm, con aperture di diametro di 0,5 cm) all'interno della colonna per funzionare come materiale per arrotoglie. Posizionare un pezzo di protezione 2/3rds dalla parte superiore della colonna e l'altro 1/3rd dalla parte superiore della colonna (Figura 1B).
- Fissare la spina inferiore (senza termocoppia) e la spina superiore (con un termocoppia). Quando la spina viene inserita nella parte superiore della colonna, assicurarsi che il termocoppia non tocchi i lati della colonna.
- Regolare l'altezza della colonna sul supporto di ritort in modo che ci sia una distanza di 25 cm tra la parte inferiore della colonna e la parte superiore della panca.
- Fissare un anello di risposta (diametro 5 cm) al supporto di risposta 5 cm sotto la parte inferiore della colonna e ruotare l'anello sul lato della colonna.
- Impostare il DFM direttamente sull'anello di ristoro (Figura 1B). Collegare tutti i componenti elettronici: l'alimentatore, l'interfaccia di alimentazione e il computer in base al protocollo del produttore.
- Una volta collegati i componenti, seguire il protocollo del produttore per completare la configurazione del software DFM e DFM.
- CtMinimo Saggio
- Ruotare le valvole di ingresso e uscita del bagno fluido nelle posizioni aperte.
- Premere il pulsante di alimentazione per accendere il bagno fluido a temperatura controllata e quindi premere il pulsante di riproduzione per eseguire un programma di sollevamento e mantenere la temperatura del bagno a 25 gradi centigradi. Dare il bagno fluido e la colonna 5-10 min per raggiungere e mantenere 25 gradi centigradi.
- Rimuovere la spina nella parte superiore della colonna e sostituirla con un imbuto (diametro 5,08 cm; vedere la figura 1C).
- Tap vola dalla loro fiala alimentare nella colonna.
- Rimuovere l'imbuto e sostituirlo rapidamente con la spina superiore, facendo attenzione a non lasciare che le mosche sfuggise. Dare le mosche 5 minuti per stabilirsi, di tanto in tanto toccando la spina inferiore per incoraggiare le mosche a salire.
- Premere il pulsante di avvio sul bagno fluido e iniziare il programma di rampa CTmin (25 gradi centigradi per 5 minuti; da 25 a 10 gradi centigradi a 0,5 gradi centigradi; 10 gradi centigradi per 2 min; quindi da 10 gradi centigradi a -10 gradi centigradi a 0,25 gradi centigradi/ min).
NOTA: Altre varianti di questo protocollo di rampa CTmin possono essere utilizzate a seconda della domanda di ricerca (ad esempio, confronti degli effetti dei diversi tassi di rampa su CTmin28). - Fare clic su apri il software di registrazione termocoppia sul computer, quindi fare clic sull'icona Registra per iniziare a registrare la temperatura all'interno della colonna ogni secondo per la durata del saggio. Assicurarsi che ogni registrazione della temperatura includa un timestamp specifico per il secondo, in modo che i dati di temperatura possano essere successivamente uniti ai dati del DFM.
- Aggiungere 5 mL del 90% di etanolo a un tubo di centrifuga conica da 15 mL e posizionarlo in un rack sotto la colonna.
- Occasionalmente, tocca la spina inferiore della colonna per invogliare le mosche sul fondo a salire. La maggior parte delle mosche sarà su un tresico o vicino alla parte superiore della colonna di 15 gradi centigradi.
- A 15 gradi centigradi, rimuovere la spina inferiore e raccogliere eventuali mosche ancora sulla spina inferiore nell'etanolo. Contare e notare che queste mosche sono state raccolte a 15 gradi centigradi, ma il loromin CT è sconosciuto.
NOTA: La temperatura alla quale viene rimossa la spina inferiore deve essere decisa prima del saggio e in base al min CTprevisto della specie di prova o del trattamento. Per questo saggio, è stato scelto 15 gradi centigradi in base al CTmin di queste particolari linee DGRP trovate nei saggi preliminari. - Inserire un imbuto di vetro di 75 mm di diametro esterno nel DFM. Regolare l'anello di ristoro, DFM e imbuto in modo che siano sotto la colonna. Assicurarsi che il labbro dell'imbuto sigilli completamente la parte inferiore della colonna (Figura 1D).
- Inserire la parte inferiore dell'imbuto nel tubo di raccolta di 15 mL (Figura 1D).
- Aprire il software DFM sul computer facendo clic sull'icona Software. Il software inizierà immediatamente a registrare l'ora / data in cui i voli raggiungono il loro CTmin. Le mosche che raggiungono laloro TC min perdono la funzione neuromuscolare e cadono dai loro posatoi, e successivamente attraverso il DFM.
- Monitorare se tutte le mosche hanno raggiunto il loroCT min come la temperatura diminuisce controllando la spina superiore e posatoi per vedere se eventuali mosche sono ancora arroccati (cioè, mantenendo ancora la funzione neuromuscolare). La prova termina quando tutte le mosche hanno raggiunto il loro CTmin.
- Al termine della prova, regolare il DFM e allontanarlo dall'apertura della colonna. Alcune mosche possono raggiungere il loro CTmin ma rimangono bloccate nella colonna (cioè incuneate in un tresico o penzolanti da un singolo gancio tarsale). Aprire la spina superiore e rimuovere queste mosche. Il CTmin di queste mosche è sconosciuto.
- Combinare i file di output .txt del software di registrazione termocoppia (ad esempio, temperatura, data e ora) e il software DFM (ad esempio, il numero di mosche attraverso l'imbuto, la data e l'ora) utilizzando il comando Merge in RStudio. Unire i due file in base alla variabile di data/ora condivisa.
2. Analisi KD di calore ad alta velocità
- Assemblaggio e preparazione dell'apparato
- Con un adesivo, fissare la rete metallica intrecciata in acciaio (apertura di 1,5 mm) sul fondo di una piastra 96 ben senza fondo.
- Attaccare i magneti ai lati opposti del fondo di una piastra 96 ben senza fondo con una pistola a colla a caldo e colla a caldo (Figura 3).
- Per creare un coperchio del setto personalizzato con pellicola adesiva progettata per 96 piastre di pozzo, attaccare due pellicole lati appiccicosi insieme per formare un foglio di plastica snodato.
- Posizionare i fogli di plastica sopra la piastra del pozzo 96 e utilizzare il nastro adesivo per aderire a tutti e quattro i lati della piastra. Sopra l'apertura di ogni pozzo sulla piastra, tagliare una 'x' nel foglio di plastica con una taglierina scatola (cioè, 96 x totali).
- L'anestesia vola con CO2 e le carica individualmente in ogni pozzo della piastra 96 ben senza fondo modificata con un coperchio aspiratore e setto. Togliere il coperchio del setto dalla piastra del pozzo 96 mentre le mosche sono anetitezzate con CO2 e sostituirle con un coperchio chiaro aderente.
- Posizionare il piatto 96 ben senza fondo caricato con mosche e con un coperchio aderente chiaro sul cibo. Assicurarsi che le mosche abbiano almeno 48 h tra l'anesthetizzazioneco-2 e l'inizio del saggio (punti 2.2.1-2.2.5).
NOTA: Il fondo delle piastre modificate 96 ben senza fondo è fatto di rete, quindi le mosche anethetized con CO2 possono essere caricate e lasciate sul cibo per almeno 48 h prima dell'inizio di una prova. Qualsiasi contenitore di plastica >8,5 cm di larghezza x 13 cm di lunghezza che è almeno 2 cm di profondità per ospitare uno strato di cibo profondo 1 cm può essere utilizzato. - Fissare una webcam sul fondo dell'interno di un incubatore a temperatura controllata con nastro adesivo. Puntare la fotocamera direttamente verso l'alto (Figura 4). Fissare uno scaffale dell'incubatrice a circa 10 cm sopra la fotocamera.
NOTA: La webcam punta verso l'alto e registra la piastra del pozzo 96 dal basso per garantire che la maggior parte della superficie del pozzo sia in vista possibile (ad esempio, non bloccata dalla vista dalle pareti del pozzo della piastra). Quando le mosche raggiungono il loro KDT cadono in fondo al pozzo; in questo caso, il lato più vicino alla webcam, e sono quindi in vista indipendentemente da quanto il loro bene è dal centro di vista. - Collegare la webcam a un computer.
- Con il nastro, fissare un foglio bianco di carta (8,5 cm x 13 cm; l'area esatta della parte inferiore della piastra del pozzo 96) alla parte inferiore del ripiano (Figura 4). Assicurarsi che la carta riempia l'intero fotogramma quando viene visualizzata tramite la webcam.
- Inserire una fonte di luce nell'incubatrice. Utilizzare carta o altri materiali per smorzare l'illuminazione e ridurre al minimo l'abbagliamento.
NOTA Il punto 2.1.10 è specifico per ogni incubatrice perché l'illuminazione e i riflessi variano tra le incubatrici. L'obiettivo è quello di avere sufficiente illuminazione nell'incubatrice per fornire un buon contrasto tra le mosche in ogni pozzo e il foglio bianco di carta dietro la piastra quando viene visualizzato con la webcam.
- Esecuzione del test di calore KD
- Impostare l'incubatrice a 37,5 gradi centigradi e attendere circa 30 minuti per dare all'incubatrice il tempo di raggiungere e mantenere la temperatura desiderata. La temperatura esatta dipenderà dall'insetto valutato e da eventuali altre considerazioni di tempo.
- Posizionare la piastra del pozzo 96 invertita nell'incubatrice, in modo che il fondo della piastra (lato mesh) sia contro la carta bianca sul fondo del vassoio (Figura 4). Prendere nota dell'orientamento dei pozzetti (nomi di colonne e righe) sul vassoio e nella cornice della webcam. Nastro colorato lungo i lati della piastra del pozzo 96 e bordi del pezzo di carta bianco può verificare l'orientamento (Figura 4).
NOTA: Assicurarsi che la temperatura dell'incubatrice sia coerente con la temperatura all'interno della piastra del pozzo 96 registrando la temperatura all'interno della piastra con una termocoppia durante una prova di prova del saggio di calore KD. È anche prudente verificare che vi sia una variazione trascurabile della temperatura tra i pozzetti della piastra del pozzo 96 con termocoppie multiple prima di condurre il test di calore KD. - Chiudere lo porta dell'incubatrice.
- Fare clic su Registra sul software di registrazione video.
- Dopo 2 h, controllare la registrazione per vedere che tutte le mosche hanno raggiunto il loro punto di riposo finale e smesso di muoversi. Una volta che tutte le mosche hanno smesso di muoversi, fare clic su Interrompi sul software di registrazione video. Per i genotipi qui testati, allevati a 25 gradi centigradi, la maggior parte delle mosche raggiunge il proprio KDT di 60 min a 37,5 gradi centigradi (c'è anche il numero di voli (vedere anche J'rgensen et al.9).
- Smaltire le mosche.
- Utilizzare gli script Python personalizzati (Supplementary Coding Files 1-3) per approssimare il tempo nel video quando i mosche raggiungono il loro KDT di calore.
NOTA: il passaggio 2.2.7 è facoltativo. Per velocizzare l'analisi video, è stato sviluppato un set di script Python personalizzati per misurare le variazioni della densità dei pixel nel tempo in ogni pozzo (vedere File di codifica supplementare). Quando le mosche smettono di muoversi, la densità dei pixel è costante e un grafico di questi dati può essere utilizzato per individuare il tempo approssimativo nel video quando le mosche vengono abbattute. Anche se potrebbe essere possibile utilizzare questo script per automatizzare l'analisi dei dati, attualmente lievi imperfezioni nel video portano a discrepanze minori tra le variazioni nella densità dei pixel e il vero tempo KD. - Fare clic su aprire il file video e registrare il KDT di ogni volo in ogni pozzo. La misura più consistente del KDT di calore tra le prove e gli osservatori è la registrazione del momento in cui una mosca raggiunge il suo punto di riposo finale.
- Traccia il video al contrario, concentrandoti su un singolo pozzo e notando il momento in cui la mosca si sposta per prima dal suo punto di riposo finale. Ripetere questo processo per ogni pozzo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I limiti termici (ad esempio, CTmin e heat KDT) delle femmine del Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) sono stati misurati per dimostrare i dati ad alto rendimento generati dai due protocolli descritti. La CTmin è stata analizzata utilizzando le linee DGRP 714 (n - 37) e 913 (n - 45). Heat KDT è stato analizzato e confrontato con le linee DGRP 189 (n - 42) e 461 (n - 42), e i file video sono stati analizzati manualmente. Il tempo totale degli esperimenti, inclusa la visione del video, ha richiesto <2 h per ogni protocollo.
Le femmine della linea DGRP 913 avevano temperature medieminime medie significativamente inferiori rispetto alle femmine della linea DGRP 714 ( Figura5A; Test di somma del rango Wilcoxon, W - 1585, P < 0.001). Le due linee avevano distribuzioni chiaramente distinte di CTmin: linea 913 aveva un CTmin di 5,00 ± 1,35 gradi centigradi (media ± SD) e la linea 714 aveva un CTmin di 9,60 ± 1,53 gradi centigradi.
Il KDT termico a 37,5 gradi centigradi differiva in modo significativo tra le femmine rispetto alle linee DGRP 73 e 461 (Figura 5B; Test di somma del rango Wilcoxon, W - 1658,5, P < 0.001). Anche se c'era una variazione nel KDT di entrambe le linee, le differenze nei KDT di calore tra le linee sono state facilmente rilevate. La linea 73 aveva un KDT medio di 14,8 minuti più lungo rispetto alla linea 461 (linea 73 media KDT, 55,58 ± 6,92 min; Linea 461 media KDT, 40.78 ± 6.64 min).
Figura 1: Impostazione della colonna con la giacca per iltest TC min. (A) Colonna con cappuccio assemblato. (B) Colonna con tappi superiore e inferiore che sigillano la camera interna. Il termocoppia viene filettato attraverso un foro nella spina superiore. Il DFM è montato su un anello di ristoro sotto la colonna e spostato di lato. (C) Inizio di un testCT min. La spina superiore è stata rimossa e le mosche sono state versate nella camera interna tramite un imbuto all'apertura superiore della colonna. (D) Colonna in giacca e DFM durante un testCT min. La spina inferiore è stata rimossa dalla colonna e il DFM e l'imbuto sono stati posizionati sotto la colonna. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Illustrazione tecnica della colonna con la giacca. (A) Ogni pezzo di tubo acrilico tagliato a lunghezza: i) due anelli distanziali tagliati a 3,5 cm di lunghezza (passo 1.1.2):ii). il tubo acrilico più largo tagliato a 31,5 cm (passo 1.1.1); e iii il tubo acrilico più stretto tagliato a 31,5 cm (passo 1.1.1). (B) Due fori (in grigio) perforati nel più ampio pezzo di tubo acrilico, 3,5 cm da ogni estremità e sui lati opposti (i; passo 1.1.2). Assemblaggio del pezzo più stretto di tubo acrilico con i due anelli distanziali (ii; punti 1.1.6 e 1.1.7). (C) La colonna con la giacca completata dopo i passaggi 1.1.8-1.1.12. Gli adattatori per tubi sono indicati in grigio. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Vista in basso (a sinistra) e in alto (a destra) della piastra 96 well no-bottom. La maglia intrecciata in acciaio è attaccata al fondo di una piastra modificata 96 ben senza fondo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Impostazione dell'incubatore per un test KD termico. (A) Webcam e palco impostato a distanza. (B) Webcam e configurazione dello stage nell'incubatore prima dell'inizio di una prova. La webcam è fissata al pavimento dell'incubatrice e il vassoio si trova a 10 cm sopra la webcam. (C) Orientamento della piastra del pozzo 96 sul palco bianco sopra la webcam durante un test KD di calore. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Limiti termici inferiori e superiori delle linee selezionate del pannello di riferimento genetico della Drosophila (DGRP). (A) valoriTC min di due linee DGRP. (B) Riscaldare il KDT di due linee DGRP a 37,5 gradi centigradi.
Figura 6: output dell'attività dagli script di analisi video di un set di dati di test. Ogni grafico rappresenta i dati di attività da un pozzo di una piastra di 96 po '. Un totale di 84 campioni sono stati testati e sono mostrati. Beh ID è etichettato a destra di ogni istogramma. Si prega di fare clic qui per visualizzare questa figura.
File di codifica supplementare 1. Clicca qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 2. Clicca qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementare 3. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I due metodi descritti in precedenza generano dati ad alta velocità di produzione di metriche ecologicamente rilevanti per i limiti termici superiori e inferiori. Questi protocolli si basano su metodologie precedentemente stabilite comuni alla ricerca sui limiti termici degli insetti (riepilogati in Sinclair et al.) 6. Entrambi i protocolli possono essere completati in un breve lasso di tempo (2 h ciascuno), produrre set di dati con grandi dimensioni del campione, non sacrificare la ripetibilità o l'accuratezza e ridurre al minimo l'errore dello sperimentatore eliminando la registrazione manuale dei dati e l'immissione (CTmin assay), o creando registrazioni video di backup di ogni saggio (analisi termica KD).
I risultati rappresentativi sono stati generati confrontando i limiti termici delle femmine adulte da alcune linee della DGRP24. Entrambi i saggi hanno mostrato differenze significative nella tolleranza termica tra le linee. La dimensione dell'effetto tra le linee in ciascuno di questi saggi era relativamente grande, il che a sua volta ha permesso una differenziazione affidabile dei gruppi con confronti visivi e statistici. La grande differenza di KDT tra le due linee DGRP evidenzia un potenziale vantaggio di un saggio statico rispetto a un saggio dinamico di rampa; i saggi statici possono essere in grado di rilevare differenze più piccole tra i gruppi rispetto ai saggi dinamici9. Le due linee DGRP sottoposte al calore KD assay differivano in KDT medio di 14,8 min. Per riferimento, utilizzando un protocollo di rampa dinamico, Rolandi et al.13 ha mostrato che la differenza dei valori massimi CTpiù alti e più bassi di 34 linee DGRP era di soli 1,42 gradi centigradi o <6 min con una rampa di 0,25 gradi centigradi.
Rispetto ad altri metodi, ci sono diversi vantaggi sia per il saggio CTmin e il test di KD di calore descritto qui. Il conteggio automatico nelsaggio MIN CT riduce la quantità di tempo che uno sperimentatore trascorre presso l'apparato, aumentando così la quantità di tempo che può essere speso per altre attività. Il costo per costruire la colonna in acrilico è di 50 dollari, rispetto ai 400 dollari stimati per l'acquisto di una colonna in vetro su su cui su base. Per il test di calore KD, la registrazione video elimina la necessità di osservazioni dirette in tempo reale e occupa una piccola quantità di spazio fisico per campione. Altri protocolli, come quelli utilizzati da Jàrgensen et al.9, utilizzano un grande acquario per la visualizzazione di individui sommersi in fiale separate, ma questo metodo richiede investigatori ben addestrati per controllare rapidamente le fiale per il movimento e una grande quantità di spazio per l'apparato. Rolandi et al.13 ha utilizzato sensori a infrarossi per rilevare il movimento o la mancanza di movimento a CTmax in 96 piastre di pozzo, mentre questo saggio di calore KD utilizza una webcam poco costosa (70 dollari) per rilevare il movimento. Questa telecamera è in grado di rilevare movimenti sottili che potrebbero essere persi da un monitor di attività a infrarossi.
Inoltre, è stata sviluppata una serie di script personalizzabili per stimare rapidamente il KDT nel test di KD termico (Supplementary Coding File 1-3). Questi script possono essere utilizzati per risparmiare tempo ottenendo un'approssimazione approssimativa del KDT di calore in ogni pozzo prima di guardare il video, e con una qualità video più elevata questi script potrebbero potenzialmente automatizzare la registrazione dei dati. Sono stati forniti tre script per elaborare il video: FirstFrame.py (Supplementary Coding File 1), che definisce il primo fotogramma dell'immagine del video; WellDefine.py (Supplementary Coding File 2), che definisce ogni singolo pozzo della piastra del pozzo 96 nella prima cornice dell'immagine; e MotionDetect.py (Supplementary Coding File 3), che trasforma il file video in un segnale di attività calcolando la variazione della densità dei pixel tra i fotogrammi sequenziali. L'unico input per il programma è il file video e l'output include statistiche di riepilogo e un set di dati di attività di serie a tempo per pozzo (Figura 6). Le differenze nella densità dei pixel tra i fotogrammi video vengono trasformate utilizzando un filtro in scala di grigi per ridurre le dimensioni dell'immagine, un filtro di passaggio basso gaussiano per ridurre il rumore dell'immagine e un'operazione morfologica di dilatazione per aumentare i bordi degli oggetti in movimento. In questo caso, l'attività è definita come la differenza assoluta dei valori dei pixel tra i fotogrammi sequenziali. Il KDT di calore può quindi essere stimato come indice dell'ultimo fotogramma contenente un valore di attività maggiore di zero. Ad esempio, il frame in cui l'attività è stata registrata per l'ultima volta in g12 di un set di dati di esempio (Figura 6) è stato appena dopo 2.000 s (33,33 min), come indicato da una linea piatta. Un osservatore può quindi riprodurre il video digitale e trovare rapidamente il KDT di calore del pozzo g12 con questo timestamp.
Con piccole modifiche e risoluzione dei problemi ci sono applicazioni aggiuntive per entrambi i saggi, in particolare con il calore KD analisi. La configurazione della registrazione video potrebbe essere modificata per registrare i tempi di knockdown a freddo statici, i tempi di recupero del coma freddo o i valori min CTmax e CTpotenzialmente dinamici. Tempo di recupero coma freddo è la quantità di tempo che ci vuole un individuo per riprendere il movimento dopo lo stress freddo29. Pertanto, il tempo di recupero del coma freddo potrebbe essere misurato con questa configurazione inducendo il coma freddo nella piastra del pozzo 96, quindi utilizzando la configurazione video per registrare il tempo di recupero nell'incubatrice. Infine, con un'attenta messa a punto, la CTmax o la CTmin dinamica potrebbe essere registrata in un incubatore di rampa programmabile. Un'attenta attenzione alla temperatura all'interno di ciascuno dei 96 pozzi sarebbe un problema, perché lievi variazioni di temperatura nell'incubatrice potrebbero essere ingrandite tra i pozzi come i cambiamenti di temperatura.
Diverse considerazioni dovrebbero essere prese in considerazione quando si esegue il saggio CTmin o calore KD. In primo luogo, la qualità, l'età, il sesso, lo stadio di vita, il background genetico e la precedente esperienza di un insetto possono influenzare i limititermici 6,13,30,31. Per entrambi i saggi, i soggetti di prova devono essere motile. In secondo luogo, solo un gruppo può essere analizzato alla volta per ogniapparato CT min. Pertanto, variabili come la variazione diurna nella tolleranzatermica 32,33 devono essere considerate quando si confrontano i trattamenti. Una soluzione a questo problema è quella di condurretest TC min di più condizioni di trattamento con più apparati allo stesso tempo. In terzo luogo, alcune specie potrebbero non essere adatte a uno o a entrambi i saggi. Ad esempio, alcune specie non possono facilmente salire o volare per posarsi nel saggio CTmin o possono cessare l'attività ad alte temperature prima che il loro KDT di calore sia raggiunto, il che renderebbe difficile discernere un tempo di knockdown. Infine, per garantire confronti accurati nel saggio di calore KD, è fondamentale che i criteri per KDT (passo 2.2.8) siano coerenti tra repliche, osservatori, prove, ecc. Per ospitare diverse specie di insetti, possono essere necessarie modifiche a uno degli apparati di prova. Le potenziali modifiche includono l'utilizzo di diversi tipi di posatoi per il saggio TCmin, l'utilizzo di piastre di coltura cellulare con meno pozzi e più spazio (48, 24, 12 o 6 pozzetti) invece della piastra 96 well per ospitare insetti più grandi, o regolare la temperatura utilizzata per il saggio di calore KD per garantire un tempo di knockdown che non è troppo veloce o troppo lento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Ellie McCabe per l'assistenza con l'allevamento a mosca. Questo lavoro è sostenuto dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti National Institute of Food and Agriculture Hatch Project grant 1010996 e dalla National Science Foundation grant OIA-1826689 a N.M.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing - 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- Angilletta, M. J. Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , New York, NY. (2009).
- Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
- Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
- MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
- Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
- Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
- Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
- Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
- Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
- Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
- Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
- Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
- Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
- Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
- Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
- Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
- Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
- Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
- MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
- Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
- Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
- MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
- Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
- Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
- Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
- Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).
