Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyser med høy gjennomstrømning av kritiske termiske grenser i insekter

Published: June 15, 2020 doi: 10.3791/61186
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Kentucky

Summary

Termiske grenser kan forutsi miljøene organismene tolererer, noe som er verdifull informasjon i møte med raske klimaendringer. Beskrevet her er høy gjennomstrømningsprotokoller for å vurdere kritisk termisk minima og varme knockdown tid i insekter. Begge protokollene maksimerer gjennomstrømningen og minimerer kostnadene for analysene.

Abstract

Øvre og nedre termiske grenser for planter og dyr er viktige prediktorer for deres prestasjoner, overlevelse og geografiske fordelinger, og er avgjørende for å forutsi tiltak mot klimaendringer. Dette arbeidet beskriver to høygjennomstrømningsprotokoller for måling av insekts termiske grenser: en for å vurdere kritisk termisk minima (CT min ), ogdenandre for å vurdere varme slå ned tid (KDT) som svar på en statisk varmestressor. I CTmin-analysen plasseres individer i en akryljakket kolonne, utsatt for en avtagende temperaturrampe, og telles når de faller fra perches ved hjelp av en infrarød sensor. I varmen KDT analyse, enkeltpersoner er inneholdt i en 96 brønnplate, plassert i en inkubator satt til en stressende, varm temperatur, og video registrert for å bestemme tidspunktet da de ikke lenger kan forbli oppreist og flytte. Disse protokollene gir fordeler fremfor vanlige teknikker. Begge analysene er lave kostnader og kan fullføres relativt raskt (~ 2 h). CTmin analysen reduserer experimenter feil og kan måle et stort antall individer på en gang. Varme-KDT-protokollen genererer en videoopptak av hver analyse og fjerner dermed eksperimentererbias og behovet for å kontinuerlig overvåke enkeltpersoner i sanntid.

Introduction

Termiske grenser for insekter
Variasjon i miljøforhold, inkludert temperatur, er en viktig faktor som påvirker ytelsen, kondisjonen, overlevelsen og den geografiskefordelingen av organismer 1,,2. Øvre og nedre termiske grenser bestemmer det teoretiske spekteret av miljøer en organisme kan tolerere, og derfor er disse grensene viktige prediktorer for plante- og dyrefordelinger, spesielt i møte medklimaendringer 3,4. Dermed er protokoller for å måle termiske grenser nøyaktig viktige verktøy for økologer, fysiologer, evolusjonære biologer og bevaringsbiologer, blant andre.

Som de mest tallrike og mangfoldige terrestriske dyrene brukes insekter ofte til målinger av termiske grenser. Kritisk termisk maxima (CTmax) og kritisk termisk minima (CTmin) brukes vanligvis til å vurdere intra- og interspesifikk variasjon i termisktoleranse 5,,6,,7. Mens CTmax og CTmin kan måles for flere fenotyper, inkludert vekst, reproduktiv produksjon og atferd, brukes de oftest på lokomotoriskfunksjon 5,,6,,7. Dermed er CTmax (også kalt varme knockdown temperatur) og CTmin ofte definert som de høye og lave temperaturene der insekter mister motorfunksjonen og ikke kan forbli oppreist5,,6,,7,,8,,9,,10,,11. CTmin sammenfaller med utbruddet av chill koma, en reversibel lammelse forårsaket av kalde temperaturer6. Mens lammelse ved de termiske grensene ofte er reversibel, fører fortsatt eksponering for disse temperaturene til økologisk død5.

Vanlige metoder for måling av termiske grenser
En rekke apparater har blitt brukt til å måle termiske grenser (oppsummert i Sinclair et al.) 6. Kort, insekter er oppvarmet eller avkjølt i inkubatorer12,13, beholdere nedsenket i flytende bad11,14,15,16, aluminiumblokker 10,17, eller jakkede beholdere18, og overvåket til bevegelse opphører. For å overvåke insekter under analysen er den vanligste metoden direkte observasjon, der enkeltpersoner overvåkes kontinuerlig i sanntid eller retrospektivt med innspilt video6,9,10,11,15,17. Mens direkte observasjonsmetoder har minimale utstyrskrav, er de arbeidskrevende og begrenser gjennomstrømningen. Alternativt kan insekter observeres indirekte ved å samle individer til diskrete tider når de faller fra perches6,19,20,21 eller ved hjelp av aktivitetsmonitorer13.

Indirekte metoder for måling av termiske grenser er generelt høyere gjennomstrømming og potensielt mindre feil utsatt enn direkte observasjonsmetoder. Den vanligste metoden for indirekte overvåking bruker en jakket temperaturkontrollert kolonne6,8,19,20,21. Insekter plasseres inne i en kolonne med perches, og temperaturen i det indre kammeret styres ved å pumpe væske fra et temperaturkontrollert væskebad gjennom den jakkede foringen av kolonnen. Personer som når sin termiske grense faller fra abbor og samles ved diskrete temperaturer eller tidsintervaller. Mens denne metoden fungerer bra for CTmin, har den blitt funnet uegnet for CTmax, fordi fluer frivillig går ut av bunnen av kolonnen når temperaturen øker. Den nye metoden som er beskrevet her omgår dette problemet ved å individuelt inneholde fluer under automatiserte målinger.

I tillegg til observasjonsmetoden brukes to typer temperaturregimer ofte til å vurdere øvre termiske grenser. Dynamiske analyser består av gradvis økende temperatur til motorfunksjonen går tapt; at temperaturen er den dynamiske CTmax7,8,9,13. I motsetning består statiske analyser av en konstant stressende temperatur til motorfunksjonen går tapt; det tidspunktet er varme knockdown tid (varme KDT), også kalt statisk CTmax (sCTmax) i en nylig papir av Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Selv om CTmax og varme knockdown analyser (varme KD-analyser) produserer beregninger med forskjellige enheter, indikerer matematisk modellering av de to egenskapene at de gir sammenlignbar informasjon om varmetoleranse og er begge økologisk relevante8,9. Dynamiske analyser gir en temperatur som kan sammenlignes med miljøforhold, og de er å foretrekke når det er store forskjeller i varmetoleranse, for eksempel sammenligninger mellom arter med vidt forskjellige termiske nisjer. På grunn av den høye Q10 for opphopning av varmeskader kan imidlertid en statisk analyse være å foretrekke for å oppdage små effektstørrelser, for eksempel intraspesifikk variasjon ivarmetoleranse 9. Også praktisk talt krever en statisk analyse mindre sofistikert utstyr enn en dynamisk analyse.

Målet
Målet med dette papiret er å formalisere metoder for CTmin og varme KD-analyser som kan brukes i fremtidig forskning for å vurdere de termiske grensene for motile insekter. Protokollene er tilpasset fra tidligere etablerte metoder og er utformet for å være høy gjennomstrømning, automatisert og kostnadseffektiv. Begge analysene kan fullføres på kort tid (~ 2 timer), noe som betyr at flere eksperimenter kan utføres på en enkelt dag, og produserer store mengder data uten å ofre repeterbarhet eller nøyaktighet. Med dette oppsettet kan varmetoleransen til 96 fluer måles samtidig, mens kolonnen for CTmin kan holde mer enn 100 fluer, forutsatt at det er tilstrekkelig overflateareal for perching.

Metoden for høy gjennomstrømming for å observere CTmin endrer den vanlige jakkede kolonnemetodikken med tillegg av en infrarød sensor for automatisk å telle fluer. Bruken av en infrarød sensor for telling ble først foreslått av Shuman et al. i 199623, men har ikke blitt allment vedtatt. Tilsetningen av den infrarøde sensoren gjør det mulig å samle kontinuerlige data i stedet for å samle inn data med diskrete intervaller. Denne protokollen minimerer også eksperimentererfeil ved å eliminere manuell dataregistrering og behovet for å manuelt bytte innsamlingsrør under den jekkede kolonnen på diskrete tidspunkter.

Høy gjennomstrømningsmetoden for registrering av varme KDT er modifisert fra to tidligere studier av varmetoleranse hosinsekter 10,12. Individuelle fluer lagres i en 96 brønnplate i en temperaturkontrollert inkubator og video blir tatt opp. Denne protokollen minimerer eksperimentererbias ved å bestemme varme-KDT fordi eksperimenter kan gjennomgås og verifiseres ved å spille av opptaket. Denne protokollen gir også et sett med tilpassede Python-skript som kan brukes til å øke hastigheten på videoanalyse. Bruk av individuelle brønner eliminerer forstyrrelser som kan oppstå når andre individer beveger seg rundt eller faller over, noe som kan være et problem når grupper av individer observeres i samme arena10,17. Videre gir den temperaturkontrollerte inkubatoren en stabil temperatur på tvers av alle 96 brønner, i motsetning til temperaturgradienten som noen ganger observeres over en temperaturkontrollert aluminiumsblokk10. Vær også oppmerksom på at 96-brønnopptaksmetoden kan tilpasses for å måle dynamisk CTmax og potensielt CTmin (se Diskusjon).

For å demonstrere hver protokoll ble de termiske grensene for voksne Drosophila melanogaster kvinner fra utvalgte linjer av Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP)sammenlignet 24. Disse linjene ble valgt fordi foreløpige eksperimenter indikerte betydelige forskjeller i termisk toleranse. Disse analysene viste seg å være robuste metoder for diskriminering av forskjeller i termisk toleranse. Følgende to protokoller,CT min-analyse med høy gjennomstrømning (avsnitt 1) og høy gjennomstrømningsvarme KD-analyse (avsnitt 2), beskriver de nødvendige tiltakene for å produsere CTmin og varme KDT-data for ethvert motilt insektlivsstadium som er i stand til å passe inn i apparatene, for eksempel voksne Drosophila. For CTmin er det også viktig at insektet kan abbor. Her er hver analyse demonstrert hos voksne Drosophila melanogaster. Endringer kan imidlertid være nødvendig for andre taxa eller livsstadier6. Mindre endringer kan omfatte bruk av perching materiale med større åpninger for å imøtekomme større prøver i CTmin analyse eller bruke en høyere kvalitet kamera for å skjelne den subtile KDT av en langsom bevegelig insekt eller livsstadium i varmen KD analyse. Denne protokollen beskriver ikke metoder for å forberede fluer, men det er viktig å standardisere oppdrettsprotokoller for å sikre repeterbarhet25 (se Garcia og Teets26 og Teets og Hahn27). Protokollene som er gitt inkluderer informasjon om hvordan du bygger og setter opp apparater, hvordan du registrerer målinger, og en kort beskrivelse av dataanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ct minmin analyse med høy gjennomstrømming

  1. Montering av den jakkede søylen (figur 1A, figur 2)
    1. Klipp den bredeste (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) og smaleste (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) akrylrør til like lengder (31,5 cm) med en baufil (figur 2A). Disse to rørene vil være de ytre og innerste veggene i den jakkede kolonnen.
    2. Klipp to ringer (2 cm brede) fra mellomstore (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) akrylrør med en baufil (figur 2A). Disse to ringene vil være avstandsslangene mellom de indre og ytterste rørene, noe som skaper et mellomrom mellom de to lange akrylrørene for væske å strømme.
    3. Bor forsiktig to hull i det ytre (bredeste) akrylrøret, ett hull øverst og ett nederst. Pass på at hvert hull er 3,5 cm fra enden av røret. Bor hullene på motsatte sider av røret (figur 2B).
    4. For å redusere sprekkdannelse, plasser tape på røret over stedet for det fremtidige hullet og bor veldig sakte på den laveste momentinnstillingen av boret.
    5. Bruk gjengekranen til å gjenge begge hullene slik at slangeadapterne kan skrus inn i de to hullene på det ytre røret. For å redusere sprekkdannelse, bruk smøremiddel og tre sakte for hånd.
    6. Skyv de to avstandsslene på den indre jakken, en i hver ende (bunn og topp). La det være en liten plass (0,5 cm) mellom avstandssdet og enden av den indre jakken (figur 2B).
    7. Sveis avstandsstakerne på plass ved hjelp av akrylmalingssement.
    8. Etter sementen på det indre røret og avstandsseedlene, skyv denne konstruksjonen inn i det større ytre røret med hullene. Pass på at de ytre og indre rørene er i flukt i begge ender. Avstandsslene vil være 0,5 cm fra enden, danner små grøfter på begge ender av kolonnen (Figur 2C).
    9. Sveis det ytre røret til avstandsstangene ved hjelp av akrylsement, ved hjelp av justerbare stålklemmer for å holde apparatet sammen. Vent til sementen skal settes.
    10. Tre slangeadapterne inn i hullene på det ytre røret som nå er festet til avstandsslangene og det indre røret.
      MERK: Adapterne skal bare tre inn i det ytre røret og ikke inn i det åpne rommet mellom de indre og ytterste rørene. Hvis slangeadapterne trer for langt inn, forkort dem til riktig lengde med en baufil.
    11. Forsegle slangeadapterne i gjengene på det ytre røret med silikontetningsmasse.
    12. Fyll de to skyttergravene mellom de indre og ytterste rørene i begge ender av den jakkede søylen med silikontetningsmasse.
    13. For å teste kolonnen, fest 0,6 cm diameter rør til slangeadapterne. Koble adapteren nederst i kolonnen til en vannkilde med rør, og adapteren øverst i kolonnen til et avløp med et annet stykke rør.
    14. Kjør vann gjennom apparatet fra bunnen til toppen og se etter lekkasjer. Hvis det er lekkasjer, identifisere hvor de kommer fra og forsegle med silikon.
  2. Sette opp jakkesøylen og Drosophila Traktmonitor (DFM)
    1. Fest den jakkede søylen til et retortstativ med en tredelt retortklemme. Juster kolonnen vertikalt med den ene enden åpen til taket og den andre åpen for laboratoriebenken (figur 1B).
    2. Koble væskeinngangen og utgangen fra et temperaturkontrollert nedkjølt bad til søylens adapterdyser med plastrør med diameter på 0,6 cm (figur 1B). Koble væskeinngangen til dysen nederst i kolonnen og væskeutgangen til dysen øverst i kolonnen.
    3. Klipp to 3 cm tykke sirkulære skumisolerende plugger (samme omkrets som åpningen av det innerste rommet i kolonnen). Pass på at pluggene sitter godt og forsegler den innerste kolonnen når de settes inn i begge ender (figur 1B).
    4. Pierce et hull gjennom midten av en av pluggene og tre den nakne enden av en termoelement gjennom hullet ca 5 cm og fest med tape. Koble den andre enden av termoelementet til en termoelement datalogger.
    5. Koble termoelementdataloggeren til datamaskinen.
    6. Kil to stykker plast takrenne vakt (5 cm x 7 cm, med ~ 0,5 cm diameter åpninger) inne i kolonnen for å fungere som perching materiale. Plasser ett vernestykke 2/3rds fra toppen av kolonnen og den andre 1/3rd fra toppen av kolonnen (figur 1B).
    7. Fest bunnpluggen (uten termoelement) og topppluggen (med termoelement). Når pluggen er satt inn øverst i kolonnen, må du kontrollere at termoelementet ikke berører sidene av kolonnen.
    8. Juster høyden på søylen på retortstativet slik at det er en 25 cm avstand mellom bunnen av kolonnen og benketoppen.
    9. Fest en retortring (5 cm diameter) til retortstativet 5 cm under bunnen av kolonnen og roter ringen av til siden av kolonnen.
    10. Sett DFM direkte på retortringen (figur 1B). Koble til alle elektroniske komponenter: strømforsyningen, strømforsyningsgrensesnittet og datamaskinen i henhold til produsentens protokoll.
    11. Når komponentene er koblet til, følger du produsentens protokoll for å fullføre oppsettet av DFM- og DFM-programvaren.
  3. CtMin Analyse
    1. Vri inngangs- og utgangsventilene til væskebadet til de åpne posisjonene.
    2. Trykk på av/på-knappen for å slå på det temperaturkontrollerte væskebadet, og trykk deretter på avspillingsknappen for å kjøre et program som hever og opprettholder temperaturen på badet til 25 °C. Gi væskebadet og søylen 5-10 min for å nå og vedlikeholde 25 °C.
    3. Fjern pluggen øverst i kolonnen og bytt den ut med en trakt (5,08 cm diameter, se figur 1C).
    4. Trykk fluer fra deres mat hetteglass inn i kolonnen.
    5. Fjern trakten og bytt den ut med topppluggen raskt, forsiktig så du ikke lar fluene unnslippe. Gi fluene 5 min å bosette seg, av og til trykke på bunnpluggen for å oppmuntre fluene til å klatre.
    6. Trykk på startknappen på væskebadet og start CTmin ramping program (25 °C i 5 min; 25 °C til 10 °C ved 0,5 °C/min; 10 °C i 2 min; deretter 10 °C til -10 °C ved 0,25 °C/min).
      MERK: Andre varianter av denne CTmin ramping protokollen kan brukes avhengig av forskningsspørsmålet (f.eks sammenligninger av effekten av ulike ramping priser på CTmin28).
    7. Klikk åpne termoelementopptaksprogramvaren på datamaskinen, og klikk deretter på Record-ikonet for å begynne å registrere temperaturen inne i kolonnen hvert sekund i analysens varighet. Kontroller at hvert temperaturopptak inneholder et tidsstempel som er spesifikt for det andre, slik at temperaturdata senere kan slås sammen med data fra DFM.
    8. Tilsett 5 ml 90% etanol til et konisk sentrifugrør på 15 ml og legg det i et stativ under kolonnen.
    9. Av og til trykker du på den nederste pluggen på kolonnen for å lokke eventuelle fluer på bunnen for å klatre. De fleste fluer vil være på en abbor eller nær toppen av kolonnen med 15 ° C.
    10. Ved 15 °C, fjern bunnpluggen og samle eventuelle fluer som fortsatt er på bunnpluggen i etanol. Count og merk at disse fluene ble samlet ved 15 ° C, men deres CTmin er ukjent.
      MERK: Temperaturen som bunnpluggen fjernes på, bør avgjøres før analysen og basert på den forventedeCT-minen til testartene eller behandlingen. For denne analysen ble 15 °C valgt basert på CTmin av disse spesielle DGRP-linjene som finnes i foreløpige analyser.
    11. Plasser en glasstrakt med 75 mm ytre diameter i DFM. Juster retortringen, DFM og trakten slik at de er under kolonnen. Kontroller at leppen på trakten helt forsegler bunnen av kolonnen (figur 1D).
    12. Sett bunnen av trakten inn i 15 ml oppsamlingsrør (figur 1D).
    13. Åpne DFM-programvaren på datamaskinen ved å klikke på Programvare-ikonet. Programvaren vil umiddelbart begynne å registrere tid / dato der fluer når sin CTmin. Fluer som når deres CTmin mister nevromuskulær funksjon og faller fra deres perches, og deretter gjennom DFM.
    14. Overvåk om alle fluene har nådd ctmin når temperaturen minker ved å sjekke topppluggen og perches for å se om noen fluer fortsatt er plassert (det vil si fortsatt opprettholde nevromuskulær funksjon). Rettssaken avsluttes når alle fluene har nådd sin CTmin.
    15. På slutten av studien justerer du DFM og trakter bort fra kolonneåpningen. Noen fluer kan nå sin CTmin, men forbli fast i kolonnen (det vil vil at kilt i en abbor eller dingler av en enkelt tarsal krok). Åpne den øverste pluggen og fjern disse fluene. CTmin av disse fluene er ukjent.
    16. Kombiner TXT-utdatafilene fra termoelementopptaksprogramvaren (det vil vil vil at temperatur, dato og klokkeslett) og DFM-programvaren (det vil vil vil at antall fluer gjennom trakten, datoen og klokkeslettet) ved hjelp av kommandoen Merge i RStudio. Slå sammen de to filene basert på variabelen for delt dato/klokkeslett.

2. Høy gjennomstrømningsvarme KD-analyse

  1. Montering og forberedelse av apparater
    1. Med et klebemiddel, fest stålvevd netting (~ 1,5 mm blenderåpning) til bunnen av en 96 godt no-bottom plate.
    2. Fest magneter på motsatt side av bunnen av en 96 godt no-bottom plate med en varm limpistol og varmt lim (figur 3).
    3. For å lage et tilpasset septumlokk med selvklebende film designet for 96 brønnplater, stikker du to filmer klissete sider sammen for å danne et rillet plastark.
    4. Plasser plastplatene over 96-brønnplaten og bruk tape til å feste det til alle fire sidene av platen. Over åpningen til hver brønn på platen, kutt en "x" i plastarket med en bokskutter (det vil si 96 totalt x's).
    5. Bedøve fluer med CO2 og last dem individuelt inn i hver brønn av den modifiserte 96 godt no-bottom plate med en aspirator og septum lokk. Fjern septumlokket fra 96-brønnplaten mens fluene bedøves med CO2 og sett det ut med et tettsittende klart lokk.
    6. Plasser 96 godt no-bottom plate lastet med fluer og med et klart tettsittende lokk på mat. Sørg for at fluene har minst 48 timer mellom CO2-bedøvelse og starten av analysen (trinn 2.2.1-2.2.5).
      MERK: Bunnen av de modifiserte 96 godt ikke-bunnplater er laget av mesh, så fluer bedøvet med CO2 kan lastes og stå på mat i minst 48 timer før en studie begynner. Enhver plastbeholder > 8,5 cm bred x 13 cm lang som er minst 2 cm dyp for å imøtekomme et 1 cm dypt lag med mat kan brukes.
    7. Fest et webkamera til bunnen av innsiden av en temperaturkontrollert inkubator med tape. Rett kameraet direkte opp (figur 4). Fest en inkubatorhylle ca. 10 cm over kameraet.
      MERK: Webkameraet peker opp og registrerer 96-brønnplaten nedenfra for å sikre at så mye av brønnoverflaten er i sikte som mulig (f.eks. ikke blokkert fra visningen av brønnveggene på platen). Når fluene når sin KDT faller de til bunnen av brønnen; i dette tilfellet, siden nærmest webkameraet, og er derfor i sikte uansett hvor langt deres brønn er fra sentrum av visningen.
    8. Koble webkameraet til en datamaskin.
    9. Med tape fester du et hvitt ark (8,5 cm x 13 cm; det nøyaktige området på bunnen av 96-brønnplaten) til bunnen av hyllen (figur 4). Kontroller at papiret fyller hele rammen når det vises gjennom webkameraet.
    10. Plasser en lyskilde i inkubatoren. Bruk papir eller andre materialer til å dempe belysningen og minimere gjenskinn.
      MERK Trinn 2.1.10 er spesifikk for hver inkubator fordi belysning og refleksjoner varierer mellom inkubatorer. Målet er å ha tilstrekkelig belysning i inkubatoren for å gi en god kontrast mellom fluene i hver brønn og det hvite arket bak platen sett med webkameraet.
  2. Utføre varme KD-analysen
    1. Sett inkubatoren til 37,5 °C og vent ca. 30 min for å gi inkubatoren tid til å nå og opprettholde ønsket temperatur. Den nøyaktige temperaturen vil avhenge av at insektet blir vurdert og andre tidshensyn.
    2. Plasser 96-brønnplaten invertert i inkubatoren, slik at bunnen av platen (nettingsiden) er mot det hvite papiret på undersiden av skuffen (figur 4). Legg merke til retningen på brønnene (kolonne- og radnavn) på skuffen og i rammen av webkameraet. Farget tape langs sidene av 96 brønnplaten og kantene på det hvite papiret kan bekrefte retningen (figur 4).
      MERK: Kontroller at inkubatortemperaturen er i samsvar med temperaturen inne i 96-brønnplaten ved å registrere temperaturen inne i platen med et termoelement under en testprøve på varme-KD-analysen. Det er også forsvarlig å kontrollere at det er ubetydelig variasjon i temperatur mellom brønnene på 96-brønnplaten med flere termoelement før du utfører varme-KD-analysen.
    3. Lukk inkubatordøren.
    4. Klikk ta opp på videoopptaksprogramvaren.
    5. Etter 2 timer, sjekk opptaket for å se at alle fluer har nådd sitt siste hvilested og sluttet å bevege seg. Når alle fluene har sluttet å bevege seg, klikker du Stopp på videoopptaksprogramvaren. For genotypene som er testet her, oppdratt ved 25 °C, når de fleste fluer sin KDT med 60 min ved 37,5 °C (se også Jørgensen et al.9).
    6. Kast fluene.
    7. Bruk de vanlige Python-skriptene (Supplerende kodefiler 1-3) til omtrentlig tid i videoen når fluer når sin varme KDT.
      MERK: Trinn 2.2.7 er valgfritt. For å øke hastigheten på videoanalyse ble det utviklet et sett med vanlige Python-skript for å måle endringer i pikseltetthet over tid i hver brønn (se Supplerende kodefil). Når fluene slutter å bevege seg, er pikseltettheten konstant, og et plott av disse dataene kan brukes til å finne omtrentlig tid i videoen når fluer slås ned. Selv om det kan være mulig å bruke dette skriptet til å automatisere dataanalyse, fører for tiden små feil i videoen til mindre avvik mellom endringer i pikseltetthet og den sanne KD-tiden.
    8. Klikk åpne videofilen og ta opp KDT for hver fly i hver brønn. Det mest konsistente målet på varme KDT mellom forsøk og observatører registrerer tiden da en flue når sitt siste hvilested.
    9. Spor videoen i revers, fokuser på en enkelt brønn, og noterer tiden da flyet først beveger seg av sitt siste hvilested. Gjenta denne prosessen for hver brønn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De termiske grensene (det vil si CTmin og varme KDT) av kvinner fra Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) ble målt for å demonstrere de høye gjennomstrømmingsdataene generert fra de to beskrevne protokollene. CTmin ble analysert ved hjelp av DGRP-linjene 714 (n = 37) og 913 (n = 45). Heat KDT ble analysert og sammenlignet med DGRP-linjene 189 (n = 42) og 461 (n = 42), og videofiler ble analysert manuelt. Den totale tiden for eksperimentene, inkludert å se videoen, tok <2 h for hver protokoll.

Kvinner fra DGRP Line 913 hadde betydelig lavere gjennomsnittlig CTmin temperaturer enn kvinner fra DGRP Line 714 (Figur 5A; Wilcoxon rang sum test, W = 1585, P < 0,001). De to linjene hadde klart distinkte fordelinger av CTmin:linje 913 hadde en CTmin på 5,00 ± 1,35 °C (gjennomsnitt ± SD) og linje 714 hadde en CTmin på 9,60 ± 1,53 °C.

Varme KDT ved 37,5 °C var signifikant forskjellig mellom kvinner fra DGRP-linjene 73 og 461 (figur 5B; Wilcoxon rang sum test, W = 1658,5, P < 0,001). Selv om det var variasjon i KDT på begge linjene, ble forskjeller i varme-KDTs mellom linjene lett oppdaget. Linje 73 hadde en 14,8 min lengre gjennomsnittlig KDT enn linje 461 (linje 73 gjennomsnittlig KDT, 55,58 ± 6,92 min; Linje 461 gjennomsnittlig KDT, 40,78 ± 6,64 min).

Figure 1
Figur 1: Sette opp den jakkede kolonnen for CTmin analysen. (A) Montert jakkesøyøylen. (B) Jacketed kolonne med topp og bunn plugger tetting det indre kammeret. Termoelementet er gjenget gjennom et hull i topppluggen. DFM er montert på en retort ring under kolonnen og flyttet av til siden. (C) Start av en CTmin analyse. Den øverste pluggen ble fjernet og fluer ble strømmet inn i det indre kammeret via en trakt på den øverste åpningen av kolonnen. (D) Jacketed kolonne og DFM under en CTmin analyse. Den nederste pluggen ble fjernet fra kolonnen og DFM og trakten ble plassert under kolonnen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Teknisk illustrasjon av den jakkede søylen. (A)Hver del av akrylrør kuttet til lengde: i) to avstandssringer kuttet til 3,5 cm i lengde (trinn 1.1.2):ii). den bredeste akrylrør kuttet til 31,5 cm (trinn 1.1.1); og iii den smaleste akrylrør kuttet til 31,5 cm (trinn 1.1.1). (B)To hull (i grått) boret inn i det bredeste akrylslangen, 3,5 cm fra hver ende og på motsatte sider (i; trinn 1.1.2). Montering av det smaleste stykke akrylrør med de to avstandsslangene (ii; trinn 1.1.6 og 1.1.7). (C) Den ferdige jakkesøylen etter trinn 1.1.8-1.1.12. Slangeadaptere er angitt i grått. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Nederst (venstre) og øverst (høyre) på 96 godt no-bottom plate. Stålvevd nett er festet til bunnen av en modifisert 96 godt no-bottom plate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Inkubatoroppsett for en KD-analyse med varme. (A) Webkamera og scene satt opp på avstand. (B) Webkamera og sceneoppsett i inkubatoren før en prøvestart begynner. Webkameraet er festet til gulvet i inkubatoren og skuffen er ~ 10 cm over webkameraet. (C) Orientering av 96 brønnplaten på den hvite scenen over webkameraet under en varme KD-analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Nedre og øvre termiske grenser for utvalgte linjer fra Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP). (A) CTmin verdier av to DGRP linjer. (B) Varm KDT av to DGRP linjer ved 37,5 °C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Aktivitetsutdata fra videoanalyseskriptene i et testdatasett. Hvert plott representerer aktivitetsdataene fra en brønn av en 96 brønnplate. Totalt 84 prøver ble testet og vist. Vel ID er merket til høyre for hvert histogrammet.  Vennligst klikk her for å se dette tallet.

Supplerende kodefil 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 2. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 3. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion


De to metodene som er beskrevet ovenfor, genererer data med høy gjennomstrømning av økologisk relevante beregninger for øvre og nedre termiske grenser. Disse protokollene bygger på tidligere etablerte metoder som er felles for forskning på insektsmiske grenser (oppsummert i Sinclair et al.) 6. Begge protokollene kan fullføres på kort tid (~ 2 timer hver), produsere datasett med store prøvestørrelser, ikke ofre repeterbarhet eller nøyaktighet, og minimere eksperimentererfeil ved å eliminere manuell dataopptak og oppføring (CTmin analyse), eller ved å lage backup videoopptak av hver analyse (varme KD analyse).

Representative resultater ble generert ved å sammenligne de termiske grensene for voksne kvinner fra utvalgte linjer i DGRP24. Begge analysene viste betydelige forskjeller i termisk toleranse mellom linjer. Effektstørrelsen mellom linjene i hver av disse analysene var relativt stor, noe som igjen tillot pålitelig differensiering av grupper med visuelle og statistiske sammenligninger. Den store forskjellen i KDT mellom de to DGRP-linjene fremhever en potensiell fordel med en statisk analyse over en dynamisk rampeanalyse; statiske analyser kan være bedre i stand til å oppdage mindre forskjeller mellom grupper enn dynamiske analyser9. De to DGRP-linjene som ble utsatt for varme-KD-analysen, var forskjellige i gjennomsnittlig KDT med 14,8 min. For referanse, ved hjelp av en dynamisk rampeprotokoll, viste Rolandi et al.13 at forskjellen på de høyeste og laveste CTmaksverdiene på 34 DGRP-linjer var bare 1,42 °C, eller <6 min med en 0,25 °C/min rampe.

I forhold til andre metoder er det flere fordeler med både CTmin analyse og varme KD analyse beskrevet her. Automatisert telling i CTmin analysen reduserer tiden en eksperimenterer bruker på apparatet, og øker dermed tiden som kan brukes på andre oppgaver. Kostnaden for å bygge akryl-jacketed kolonnen er ~ $ 50, sammenlignet med den estimerte $ 400 for å kjøpe en skreddersydd glass-jacketed kolonne. For varme-KD-analysen eliminerer videoopptak behovet for direkte observasjoner i sanntid og opptar en liten mengde fysisk plass per prøve. Andre protokoller, som de som brukes av Jørgensen et al.9,bruker et stort akvarium for å se individer nedsenket i separate hetteglass, men denne metoden krever godt trente etterforskere å raskt sjekke hetteglass for bevegelse og en stor mengde plass til apparatet. Rolandi et al.13 brukte infrarøde sensorer for å oppdage bevegelse eller mangel på bevegelse ved CTmax i 96 brønnplater, mens denne varme KD-analysen bruker et billig webkamera (~ $ 70) for å oppdage bevegelse. Dette kameraet kan oppdage subtile bevegelser som kan gå glipp av en infrarød aktivitetsmåler.

Videre ble et sett med tilpassbare skript for raskt å estimere KDT i varmen KD-analysen utviklet (Supplerende Kodingsfil 1-3). Disse skriptene kan brukes til å spare tid ved å få en grov tilnærming av varme KDT i hver brønn før du ser på videoen, og med høyere videokvalitet kan disse skriptene potensielt automatisere dataopptak. Tre skript for å behandle videoen er gitt: FirstFrame.py (Supplerende koding fil 1), som definerer den første bilderammen av videoen; WellDefine.py (Supplerende Koding Fil 2), som definerer hver enkelt brønn av 96 brønnplate i den første bilderammen; og MotionDetect.py (Supplerende kodefil 3), som forvandler videofilen til et aktivitetssignal ved å beregne endringen i pikseltetthet mellom sekvensielle rammer. Den eneste inngangen til programmet er videofilen, og utdataene inneholder sammendragsstatistikk og et tidsseriedatasett av aktivitet per brønn (figur 6). Forskjeller i pikseltetthet mellom videorammer forvandles ved hjelp av et gråtonefilter for å redusere bildedimensjoner, et gaussisk lavpassfilter for å redusere bildestøy og en dilatasjonsmorfologisk operasjon for å øke grensene for bevegelige objekter. I dette tilfellet defineres aktiviteten som den absolutte forskjellen mellom pikselverdier mellom sekvensielle rammer. Varme-KDT kan deretter anslås som indeksen for den siste rammen som inneholder en aktivitetsverdi som er større enn null. For eksempel var rammen der aktiviteten sist ble registrert i brønn g12 av et eksempeldatasett (figur 6) like etter 2000 s (33,33 min), som angitt med en flat linje. En observatør kan deretter spille av den digitale videoen og raskt finne Heat KDT av godt G12 med dette tidsstempelet.

Med mindre modifikasjoner og feilsøking er det flere bruksområder for begge analysene, spesielt med varme-KD-analysen. Videoopptaksoppsettet kan endres for å ta opp statiske kalde knockdown-tider, chill komagjenopprettingstid eller potensielt dynamiske CTmax- ogCT-minverdier. Chill koma utvinning tid er hvor lang tid det tar en person å gjenoppta bevegelse etter kaldt stress29. Derfor kan chill koma utvinning tid måles med dette oppsettet ved å indusere chill koma i 96 brønnplaten, og deretter bruke videooppsettet til å registrere gjenopprettingstiden i inkubatoren. Til slutt, med forsiktig finjustering, kan dynamisk CTmax eller CTmin registreres i en programmerbar rampeinkubator. Nøye oppmerksomhet til temperaturen inne i hver av de 96 brønnene ville være en bekymring, fordi små temperaturvariasjoner i inkubatoren kunne forstørres mellom brønnene etter hvert som temperaturen endres.

Flere hensyn bør tas i betraktning når du utfører enten CTmin eller varme KD analyse. Først og fremst kan kvaliteten, alderen, kjønn, livsstadiet, genetisk bakgrunn og tidligere erfaring med et insekt påvirke termiskegrenser 6,,13,,30,,31. For begge analysene må testpersoner være motile. For det andre kan bare en gruppe analyseres om gangen for hvert CTmin apparat. Derfor må variabler som dagsvariasjon i termisktoleranse 32,33 vurderes ved sammenligning av behandlinger. En løsning på dette problemet er å gjennomføre CTmin-analyser av flere behandlingsforhold med flere apparater samtidig. For det tredje kan noen arter ikke være egnet for en eller begge analysene. For eksempel kan noen arter ikke lett klatre eller fly til perches i CTmin analysen eller kan opphøre aktivitet ved høye temperaturer før deres varme KDT er nådd, noe som ville gjøre det vanskelig å skjelne en knockdown tid. Til slutt, for å sikre nøyaktige sammenligninger i varmen KD analyse, er det avgjørende at kriteriene for KDT (trinn 2.2.8) er konsistent mellom repliker, observatører, studier, etc. For å imøtekomme forskjellige insektarter kan det være nødvendig med modifikasjoner på et av testapparatene. Potensielle modifikasjoner inkluderer bruk av ulike typer perches for CTmin analysen, ved hjelp av cellekulturplater med færre brønner og mer plass (48, 24, 12 eller 6 brønner) i stedet for 96-brønnplaten for å imøtekomme større insekter, eller justere temperaturen som brukes til varme-KD-analysen for å sikre en nedslagstid som ikke er for rask eller for treg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Ellie McCabe for hjelp med flyoppdragelse. Dette arbeidet støttes av United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project grant 1010996 og National Science Foundation gi OIA-1826689 til N.M.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) Thermo Scientific; Waltham, MA 153-5401
C922 Pro Stream Webcam Logitech; Newark, CA 960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm Any Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44041
Clear silicone sealant Any Any
Collection tube (15 ml) Any Any
Cordless Drill Any Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM) TriKinetics; Waltham, MA DFM Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software TriKinetics; Waltham, MA Records data input from the DFM
Fly Storage Lid FlySorter; Seatle, WA FS-96LID-5PK Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate FlySorter; Seatle, WA FS-96PLATE-5PK Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray FlySorter; Seatle, WA FS-TRAY-5PK Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel Kimax 28950-75 75mm
Gutter guard Any Any ~0.5 cm diameter openings
Hacksaw Any Any
Heratherm Thermo Scientific incubator Thermo Scientific; Waltham, MA OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 United States Plastic Corp., OH 61135
Hot glue gun and glue Any Any
Light Source Any Any
Magnets Any Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T) OMEGA; Norwalk, CT 5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel Any Any 2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter United States Plastic Corp., OH 62852
Retort ring Any Any 2" diameter
Retort stand Any Any
Retort three-prong clamp Any Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9) TriKinetics; Waltham, MA PSIU9 Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick) Any Any
Tape Any Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1) TriKinetics; Waltham, MA PS9-1 Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement United States Plastic Corp., OH 45737

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. Angilletta, M. J. Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , New York, NY. (2009).
  3. Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
  4. Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
  5. MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
  6. Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
  7. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  8. Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
  9. Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
  10. Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
  11. Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
  12. Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
  13. Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
  14. Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
  15. Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
  16. Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
  17. Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
  18. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
  19. Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
  20. Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
  21. Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
  22. Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
  23. Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
  24. MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  25. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
  26. Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
  27. Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
  28. Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
  29. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
  30. Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
  31. Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
  32. Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
  33. Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).

Tags

Biologi termiske grenser kritisk termisk minima CTmin,kritisk termisk maksimum CTmax varme slå ned tid KDT insekter Drosophila melanogaster
Analyser med høy gjennomstrømning av kritiske termiske grenser i insekter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Awde, D. N., Fowler, T. E.,… More

Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter