Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

High-Throughput Assays af kritiske termiske grænser i insekter

doi: 10.3791/61186 Published: June 15, 2020

Summary

Termiske grænser kan forudsige de miljøer organismer tolerere, hvilket er værdifuld information i lyset af de hurtige klimaændringer. Beskrevet her er high-throughput protokoller til at vurdere kritiske termiske minima og varme knockdown tid hos insekter. Begge protokoller maksimerer gennemløbet og minimerer omkostningerne ved analyserne.

Abstract

Øvre og lavere termiske grænser for planter og dyr er vigtige prædiktorer for deres ydeevne, overlevelse og geografiske fordelinger, og er afgørende for at forudsige reaktioner på klimaændringer. Dette arbejde beskriver to high-throughput protokoller til måling af insekt termiske grænser: en til vurdering af kritiske termiske minima (CTmin), og den anden til vurdering af varme knock down tid (KDT) som reaktion på en statisk varme stressor. I CTmin assay, enkeltpersoner er placeret i en akryl-jacketed kolonne, udsat for en faldende temperatur rampe, og tælles som de falder fra deres siddepinde ved hjælp af en infrarød sensor. I varmen KDT assay, enkeltpersoner er indeholdt i en 96 brøndplade, placeret i en inkubator indstillet til en stressende, varm temperatur, og video optaget til at bestemme det tidspunkt, hvor de ikke længere kan forblive oprejst og flytte. Disse protokoller giver fordele i forhold til almindeligt anvendte teknikker. Begge analyser er lave omkostninger og kan afsluttes relativt hurtigt (~ 2 h). CTmin assay reducerer eksperimentator fejl og kan måle et stort antal personer på én gang. Varmen KDT-protokollen genererer en videooptagelse af hver analyse og fjerner dermed eksperimentatorbias og behovet for løbende at overvåge enkeltpersoner i realtid.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Termiske grænser for insekter
Variation i miljøforhold, herunder temperatur, er en væsentlig faktor, der påvirker organismer1,2'sydeevne, kondition, overlevelse oggeografiske fordeling. Øvre og nedre termiske grænser bestemmer det teoretiske område af miljøer en organisme kan tåle, og derfor er disse grænser vigtige prædiktorer for plante- og dyredistributioner, især i lyset afklimaændringerne 3,4. Således protokoller til præcist at måle termiske grænser er vigtige værktøjer for økologer, fysiologer, evolutionære biologer, og bevarelse biologer, blandt andre.

Som de mest udbredte og forskelligartede landdyr anvendes insekter ofte til målinger af termiske grænser. Kritisk termisk maksime (CTmax) og kritiske termiske minima (CTmin) er almindeligt anvendt til at vurdere intra- og interspecifik variation i termisk tolerance5,6,7. Mens CTmax og CTmin kan måles for flere fænotyper, herunder vækst, reproduktiv output, og adfærd, de er mest almindeligt anvendt til bevægelsesfunktion5,,6,7. Ct-max (også kaldet varme knockdown temperatur) og CTmin er således ofte defineret som de høje og lave temperaturer, hvor insekter mister motorisk funktion og ikke er i stand til at forblive oprejst5,6,77,8,9,10,11. CTmin falder sammen med debut af chill koma, en reversibel lammelse anlagt den ved kolde temperaturer6. Mens lammelse ved de termiske grænser ofte er reversibel, fortsat eksponering for disse temperaturer fører til økologisk død5.

Almindelige metoder til måling af termiske grænser
En række apparater er blevet brugt til at måle termiske grænser (sammenfattet i Sinclair et al.) 6.Kort, insekter opvarmes eller afkøles i væksthuse12,,13, beholdere nedsænket i flydende bade11,,14,,15, 16,16, aluminium blokke10,17, eller kappescontainere 18, og overvåges, indtil bevægelse ophører. For at overvåge insekter under analysen er den mest almindelige metode direkte observation, hvor enkeltpersoner løbende overvåges i realtid eller med tilbagevirkende kraft med optaget video6,9,10,11,15,17.9 Mens direkte observationsmetoder har minimale krav til udstyr, er de arbejdskrævende og begrænser gennemløb. Alternativt kan insekter observeres indirekte ved at indsamle individer på diskrete tidspunkter, når de falder frasiddepinde 6,19,20,21 ellerved hjælp af aktivitetsmonitorer13.

Indirekte metoder til måling af termiske grænseværdier er generelt højere gennemløb og potentielt mindre fejlbehæftede end direkte observationsmetoder. Den mest almindelige metode til indirekte overvågning anvender en temperaturstyret kolonne 6,8,19,20,21.8 Insekter er placeret inde i en kolonne med siddepinde, og temperaturen i det indre kammer styres ved at pumpe væske fra en temperatur-kontrolleret væske bad gennem jacketed foring af kolonnen. Personer, der når deres termiske grænse falder fra deres aborre og indsamles ved diskrete temperaturer eller tidsintervaller. Mens denne metode fungerer godt for CTmin, er det blevet fundet uegnet til CTmax,fordi fluer frivilligt gå ud af bunden af kolonnen, når temperaturen stiger. Den nye metode, der er beskrevet her, omgår dette problem ved individuelt at indeholde fluer under automatiserede målinger.

Ud over observationsmetoden anvendes to typer temperaturregimer almindeligvis til at vurdere øvre termiske grænser. Dynamiske analyser består af gradvist stigende temperatur, indtil motorfunktionen går tabt; denne temperatur er den dynamiske CTmax7,8,9,13. I modsætning hertil består statiske analyser af en konstant stressende temperatur, indtil motorfunktionen går tabt; dette tidspunkt er varmen knockdown tid (varme KDT), også kaldet den statiske CTmax (sCTmax)i en nylig papir af Jørgensen et al.7,8,,9,16,22. Selvom CTmax og varme knockdown assays (varme KD-analyser) producere målinger med forskellige enheder, matematisk modellering af de to træk viser, at de giver sammenlignelige oplysninger om varmetolerance og er begge økologisk relevante8,9. Dynamiske analyser giver en temperatur, der kan sammenlignes med miljøforhold, og de er at foretrække, når der er store forskelle i varmetolerance, såsom sammenligninger mellem arter med vidt forskellige termiske nicher. På grund af det høje Q10 for akkumulering af varmeskader kan en statisk analyse dog være at foretrække til påvisning af små effektstørrelser, såsom intraspecifik variation i varmetolerance9. Også, praktisk talt, en statisk analyse kræver mindre sofistikeret udstyr end en dynamisk analyse.

Mål
Formålet med dette papir er at formalisere metoder til CTmin og varme KD assays, der kan bruges i fremtidig forskning til at vurdere de termiske grænser for motile insekter. Protokollerne er tilpasset fra tidligere etablerede metoder og er designet til at være høj-gennemløb, automatiseret, og omkostningseffektiv. Begge analyser kan afsluttes på kort tid (~ 2 h), hvilket betyder, at flere eksperimenter kan udføres på en enkelt dag, producerer store mængder data uden at ofre repeterbarhed eller nøjagtighed. Med denne opsætning kan varmetolerancen på 96 fluer måles samtidigt, mens kolonnen for CTmin kan rumme mere end 100 fluer, forudsat at der er tilstrækkeligt overfladeareal til æder.

Den høje gennemløbsmetode til observation af CTmin ændrer den fælles jacketed kolonne metode med tilføjelse af en infrarød sensor til automatisk at tælle fluer. Brugen af en infrarød sensor til optælling blev først foreslået af Shuman et al. i 199623, men er ikke blevet bredt vedtaget. Tilføjelsen af den infrarøde sensor giver mulighed for generering af kontinuerlige data i stedet for at indsamle data med diskrete intervaller. Denne protokol minimerer også eksperimentatorfejl ved at fjerne manuel dataindtastning og behovet for manuelt at skifte indsamlingsrør under den jacked kolonne på diskrete tidspunkter.

Den høje gennemløbsmetode til registrering af varme KDT ændres fra to tidligere undersøgelser af varmetolerance hos insekter10,12. Individuelle fluer opbevares i en 96 brøndplade i en temperaturstyret inkubator, og video optages. Denne protokol minimerer eksperimentatorbias ved bestemmelse af varme-KDT, fordi eksperimenter kan gennemgås og verificeres ved at afspille optagelsen. Denne protokol indeholder også et sæt brugerdefinerede Python-scripts, der kan bruges til at fremskynde videoanalyse. Brugen af individuelle brønde eliminerer interferens, der kan opstå, når andre personer bevæger sig rundt eller falder over, hvilket kan være et problem, når grupper af personer er observeret i samme arena10,17. Desuden giver den temperaturstyrede inkubator en stabil temperatur på tværs af alle 96 brønde, i modsætning til temperaturgradienten, der undertiden observeres på tværs af en temperaturstyret aluminiumsblok10. Bemærk også, at 96 brøndoptagelsesmetoden kan tilpasses til at måle dynamisk CTmax og potentielt CTmin (se Diskussion).

For at demonstrere hver protokol blev de termiske grænser for voksne Drosophila melanogaster-hunner fra udvalgte linjer i Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP)sammenlignet med 24. Disse linjer blev valgt, fordi indledende forsøg indikerede signifikante forskelle i termisk tolerance. Disse analyser viste sig at være robuste metoder til at diskriminere forskelle i termisk tolerance. De følgende to protokoller, ct min-analyse medhøj overførselshastighed (punkt 1) og højflowvarme KD-analyse (afsnit 2), beskriver de nødvendige foranstaltninger til fremstilling af KDT-data for CTmin og varme for enhver motile insektlevetid, der kan monteres i apparaterne, såsom voksen Drosophila. For CTmin er det også vigtigt, at insektet være i stand til aborre. Her, hver analyse er påvist i voksne Drosophila melanogaster. Der kan dog være behov for ændringer i andre taxa- eller livsfaser6. Mindre ændringer kan omfatte brug af perching materiale med større åbninger til at rumme større prøver i CTmin assay eller ved hjælp af en højere kvalitet kamera til at skelne den subtile KDT af en langsom bevægelse insekt eller livsstadiet i varmen KD assay. Denne protokol beskriver ikke metoder til fremstilling af fluer, men det er vigtigt at standardisere opdrætsprotokollerne for at sikre repeterbarhed25 (se Garcia og Teets26 og Teets og Hahn27). Protokollerne indeholder oplysninger om, hvordan apparaterne opbygges og opsættes, hvordan man registrerer målinger, og en kort beskrivelse af dataanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Ct min-analysemed høj gennemløb

  1. Samling af kolonnen med kappe (Figur 1A, Figur 2)
    1. Skær den bredeste (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) og smalleste (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) akrylrør til lige længder (31,5 cm) med en nedstryger (Figur 2A). Disse to rør vil være de ydre og inderste vægge af jacketed kolonne.
    2. Skær to ringe (2 cm brede) fra den mellemstore (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) akrylrør med en nedstryger (Figur 2A). Disse to ringe vil være afstandsanerne mellem de indre og yderste rør, hvilket skaber et mellemrum mellem de to lange akrylrør for væske til at flyde.
    3. Bor forsigtigt to huller i det ydre (bredeste) akrylrør, et hul i toppen og et i bunden. Sørg for, at hvert hul er 3,5 cm fra enden af røret. Hullerne bores på de modsatte sider af røret (Figur 2B).
    4. For at reducere revner, placere tape på røret over stedet af det fremtidige hul og bore meget langsomt på den laveste drejningsmoment indstilling af boret.
    5. Ved hjælp af gevindhanen skal du tråde begge huller, så slangeadapterne kan skrues ind i de to huller i det ydre rør. For at reducere revner, skal du bruge smøremiddel, og tråd langsomt i hånden.
    6. Skub de to afstandsfraen på den indre jakke, en i hver ende (bund og top). Der skal være et lille mellemrum (0,5 cm) mellem afstands- og enden af inderjakken (Figur 2B).
    7. Svejse afstandsuder på plads ved hjælp af akryl cement.
    8. Efter cement på slangen og afstandssæt, skub denne konstruktion ind i større ydre rør med hullerne. Sørg for, at de ydre og indre rør flugter i begge ender. Afstandsrene vil være 0,5 cm fra enden, danner små skyttegrave i begge ender af kolonnen (Figur 2C).
    9. Svejse det ydre rør til afstandsholderne ved hjælp af akryl cement, ved hjælp af justerbare stål klemmer til at holde apparatet sammen. Vent på, at cementen sætter den.
    10. Før slangeadapterne ind i hullerne i det ydre rør, der nu er fastgjort til afstandserne og slangen.
      BEMÆRK: Adapterne må kun gevind ind i det ydre rør og ikke ind i det åbne rum mellem de inderste og yderste rør. Hvis slangen adaptere tråd for langt ind, forkorte dem til den rette længde med en nedstryger.
    11. Slangeadapterne forsegles i trådene på det ydre rør med silikonefugemasse.
    12. Fyld de to skyttegrave mellem de indre og yderste rør i begge ender af den kappede kolonne med silikone fugemasse.
    13. For at teste kolonnen fastgøres slangen med en diameter på 0,6 cm på slangeadapterne. Tilslut adapteren i bunden af kolonnen til en vandkilde med slanger, og adapteren øverst i kolonnen til et afløb med et andet stykke slange.
    14. Kør vand gennem apparatet fra bunden til toppen og kontroller for utætheder. Hvis der er lækager, identificere, hvor de kommer fra og forsegle med silikone.
  2. Opsætning af jacketed kolonne og Drosophila Tragt Monitor (DFM)
    1. Fastgør den kappeede søjle til en retort stander med en tre-bens retort klemme. Juster kolonnen lodret med den ene ende åben mod loftet og den anden åben for laboratoriebænken (Figur 1B).
    2. Tilslut væsketilførslen og outputtet fra et temperaturstyret kølebad til kolonnens adapterdyser med plastslanger med en diameter på 0,6 cm (Figur 1B). Tilslut væskeindgangen til dysen i bunden af kolonnen og væskeudgangen til dysen øverst i kolonnen.
    3. Skær to 3 cm tykke cirkulære skum isolerende stik (samme omkreds som åbningen af den inderste rum i kolonnen). Sørg for, at propperne sidder tæt, og forsegle den inderste kolonne, når de indsættes i begge ender (Figur 1B).
    4. Pierce et hul gennem midten af en af stikkene og tråd den nøgne ende af et termoelement gennem hullet omkring 5 cm og fastgør med tape. Sæt den anden ende af termoelementet i en termoelementdatalogger.
    5. Tilslut termoelementdatalogen til computeren.
    6. Kile to stykker plast tagrende vagt (5 cm x 7 cm, med ~ 0,5 cm diameter åbninger) inde i kolonnen til at fungere som aborre materiale. Anbring det ene stykke vagt 2/3rds fra toppen af kolonnen og den anden 1/3rd fra toppen af kolonnen (Figur 1B).
    7. Fastgør bundproppen (uden termoelement) og det øverste stik (med et termoelement). Når stikket er sat i toppen af kolonnen, skal du sørge for, at termoelementet ikke rører siderne af kolonnen.
    8. Juster højden af kolonnen på retortstanden, så der er en afstand på 25 cm mellem bunden af kolonnen og bordpladen.
    9. Fastgør en retortring (5 cm diameter) til retortstanden 5 cm under bunden af kolonnen, og drej ringen ud til siden af kolonnen.
    10. Indstil DFM direkte på retortringen (Figur 1B). Tilslut alle de elektroniske komponenter: strømforsyningen, strømforsyningen interface, og computeren i henhold til producentens protokol.
    11. Når komponenterne er tilsluttet, skal du følge producentens protokol for at afslutte opsætningen af DFM- og DFM-softwaren.
  3. CtMin Undersøgelse
    1. Drej ind- og udgangsventilerne i væskebadet til de åbne positioner.
    2. Tryk på tænd/sluk-knappen for at tænde for det temperaturstyrede væskebad, og tryk derefter på afspilningsknappen for at køre et program, der hæver og vedligeholder badetemperaturen til 25 °C. Giv væskebad og kolonne 5-10 min at nå og vedligeholde 25 °C.
    3. Tag stikket øverst i kolonnen ud og udskift det med en tragt (5,08 cm diameter; se figur 1C).
    4. Tap flyver fra deres mad hætteglas i kolonnen.
    5. Fjern tragten og erstatte det med den øverste prop hurtigt, passe på ikke at lade fluer undslippe. Giv fluerne 5 min til at bosætte sig, lejlighedsvis trykke på det nederste stik for at tilskynde fluerne til at klatre.
    6. Tryk på startknappen på væskebadet og begyndCT-rampingprogrammet (25 °C i 5 min; 25 °C til 10 °C ved 0,5 °C/min; 10 °C i 2 min. og derefter 10 °C til -10 °C ved 0,25 °C/min.).
      BEMÆRK: Andre variationer af denne CTmin ramping protokol kan anvendes afhængigt af forskning spørgsmål (f.eks sammenligninger af virkningerne af forskellige ramping satser på CTmin28).
    7. Klik på åbn termoelementoptagelsessoftwaren på computeren, og klik derefter på ikonet Optag for at begynde at registrere temperaturen i kolonnen hvert sekund i hele analysens varighed. Sørg for, at hver temperaturregistrering indeholder et tidsstempel, der er specifikt for det andet, så temperaturdata senere kan flettes med data fra DFM.
    8. Der tilsættes 5 ml 90 % ethanol til et 15 ml konisk centrifugerør, og det anbringes i et stativ under søjlen.
    9. Af og til skal du trykke på kolonnens nederste stik for at lokke fluer i bunden for at klatre. De fleste fluer vil være på en aborre eller nær toppen af kolonnen med 15 °C.
    10. Ved 15 °C fjernes bundproppen, og fluerne opsaml stadig på bundproppen i ethanolen. Tæl og bemærk, at disse fluer blev indsamlet ved 15 °C, men deres CTmin er ukendt.
      BEMÆRK: Den temperatur, ved hvilken bundproppen fjernes, skal besluttes før analysen og baseres på den forventedeCT-min af testarten eller behandlingen. Til denne analyse blev der valgt 15 °C på grundlag af CTmin af disse særlige DGRP-linjer, der blev fundet i foreløbige analyser.
    11. Anvis en glastragt med en 75 mm ydre diameter i DFM. Juster retortringen, DFM og tragten, så de er under kolonnen. Sørg for, at tragtens læbe forsegler bunden af kolonnen (Figur 1D).
    12. Sæt tragtens bund ind i opsamlingsrøret på 15 ml (Figur 1D).
    13. Åbn DFM-softwaren på computeren ved at klikke på ikonet Software. Softwaren vil straks begynde at registrere det tidspunkt / dato, hvor fluer nå deres CTmin. Fluer, der når deres CTmin miste neuromuskulære funktion og falde fra deres siddepinde, og derefter gennem DFM.
    14. Overvåge, om alle fluerne har nået deres CTmin som temperaturen falder ved at kontrollere den øverste stik og siddepinde for at se, om nogen fluer er stadig oppe (dvs. stadig opretholde neuromuskulære funktion). Forsøget slutter, når alle fluerne har nået deres CTmin.
    15. I slutningen af forsøget skal du justere DFM og tragten væk fra kolonneåbningen. Nogle fluer kan nå deres CTmin, men forbliver fast i kolonnen (dvs. kilet i en aborre eller dinglende af en enkelt tarsal krog). Åbn det øverste stik, og fjern fluerne. CTmin af disse fluer er ukendt.
    16. Kombiner .txt-outputfilerne fra termoelementoptagelsessoftwaren (dvs. temperatur, dato og klokkeslæt) og DFM-softwaren (dvs. antal fluer gennem tragten, dato og klokkeslæt) ved hjælp af kommandoen Flet i RStudio. Flet de to filer ud fra den delte dato-/klokkeslætsvariabel.

2. Høj-throughput varme KD analyse

  1. Montering og klargøring af apparater
    1. Med et klæbemiddel fastgør stålvævet trådnet (~1,5 mm blænde) til bunden af en 96 brønds-bundplade.
    2. Fastgør magneter til den modsatte side af bunden af en 96 brønd no-bund plade med en varm lim pistol og varm lim (Figur 3).
    3. At håndværk en brugerdefineret septum låg med selvklæbende film designet til 96 godt plader, holde to film klæbrige sider sammen til en ridged plastfolie.
    4. Placer plastplader over 96 godt plade og bruge tape til at holde det til alle fire sider af pladen. Over åbningen til hver brønd på pladen, skæres et 'x' i plastfolie med en kasseskærer (dvs. 96 i alt x's).
    5. Bedøve fluer med CO2 og læg dem individuelt i hver brønd af den modificerede 96 godt no-bund plade med en aspirator og septum låg. Fjern septum låget fra 96 brøndpladen, mens fluerne er bedøvet med CO2 og erstatte det med en tætsiddende klart låg.
    6. Placer 96 godt no-bottom plade fyldt med fluer og med en klar tætsiddende låg på fødevarer. Sørg for, at fluerne har mindst 48 timer mellem CO2-bedøvelsen og starten af analysen (trin 2.2.1-2.2.5).
      BEMÆRK: Bunden af de modificerede 96 brønde no-bottom plader er lavet af mesh, så fluer bedøvet med CO2 kan indlæses og efterlades på mad i mindst 48 timer, før en retssag begynder. Enhver plastbeholder >8,5 cm bred x 13 cm lang, der er mindst 2 cm dyb for at rumme et 1 cm dybt lag mad, kan bruges.
    7. Fastgør et webcam til bunden af indersiden af en temperaturstyret inkubator med tape. Peg kameraet direkte op(Figur 4). Fastgør en inkubatorhylde ca. 10 cm over kameraet.
      BEMÆRK: Webcamet peger op og registrerer 96 brøndpladen nedefra for at sikre, at så meget af brøndoverfladen er i betragtning som muligt (f.eks. ikke blokeret ud af pladens brøndvægge). Når fluerne når deres KDT de falder til bunden af brønden; i dette tilfælde den side tættest på webcam, og er derfor i betragtning, uanset hvor langt deres godt er fra centrum af visningen.
    8. webcam'et til en computer.
    9. Med tape fastgøres et hvidt ark papir (8,5 cm x 13 cm; det nøjagtige område af bunden af 96 brøndpladen) til bunden af hylden (Figur 4). Sørg for, at papiret fylder hele rammen, når det ses gennem webkameraet.
    10. Anbring en lyskilde i kuvøsen. Brug papir eller andre materialer til at dæmpe belysningen og minimere blænding.
      BEMÆRK Trin 2.1.10 er specifikt for hver inkubator, fordi belysning og refleksioner varierer mellem væksthuse. Målet er at have tilstrækkelig belysning i inkubatoren til at give en god kontrast mellem fluerne i hver brønd og det hvide ark papir bag pladen, når det ses med webcam.
  2. Udførelse af varme KD-analysen
    1. Inkubatoren indstilles til 37,5 °C, og vent ca. 30 minutter for at give inkubatoren tid til at nå og opretholde den ønskede temperatur. Den nøjagtige temperatur vil afhænge af insektet bliver vurderet, og enhver anden tid overvejelser.
    2. Anbring den 96 brøndplade, der er omvendt i inkubatoren, således at bunden af pladen (maskesiden) er mod hvidt papir i bunden af bakken (Figur 4). Vær opmærksom på retningen af brøndene (kolonne og række navne) på bakken og i rammen af webcam. Farvet tape langs siderne af 96 brøndpladen og kanterne af det hvide stykke papir kan kontrollere retningen (Figur 4).
      BEMÆRK: Sørg for, at inkubatortemperaturen er i overensstemmelse med temperaturen inde i 96 brøndpladen ved at registrere temperaturen inde i pladen med et termoelement under en testtest af varme KD-analysen. Det er også klogt at kontrollere, at der er ubetydelig variation i temperaturen mellem brønde af 96 brøndpladen med flere termoelementer, før varme KD-analysen udføres.
    3. Luk inkubatordøren.
    4. Klik på Optag på videooptagelsessoftwaren.
    5. Efter 2 timer skal du kontrollere optagelsen for at se, at alle fluer har nået deres sidste hvilested og er holdt op med at bevæge sig. Når alle fluer er holdt op med at bevæge sig, skal du klikke på Stop på videooptagelsessoftwaren. For de genotyper, der testes her, opdrættet ved 25 °C, når de fleste fluer deres KDT med 60 min ved 37,5 °C (se også Jørgensen et al.9).
    6. Bortskaf fluerne.
    7. Brug de brugerdefinerede Python scripts(Supplerende Coding Files 1-3) til at tilnærme den tid i videoen, når fluer nå deres varme KDT.
      BEMÆRK: Trin 2.2.7 er valgfrit. For at fremskynde videoanalyse blev der udviklet et sæt brugerdefinerede Python-scripts til at måle ændringer i pixeltæthed over tid i hver brønd (se Supplerende kodningsfil). Når fluerne holder op med at bevæge sig, er pixeltætheden konstant, og et plot af disse data kan bruges til at finde den omtrentlige tid i videoen, når fluer er slået ned. Selvom det kan være muligt at bruge dette script til at automatisere dataanalyse, fører små mangler i videoen i øjeblikket til mindre uoverensstemmelser mellem ændringer i pixeltæthed og den sande KD-tid.
    8. Klik på åbn videofilen, og optag KDT for hver flue i hver brønd. Den mest konsekvente mål for varme KDT mellem forsøg og observatører er registrering af det tidspunkt, hvor en flue når sin endelige hvilested.
    9. Spor videoen i bakgear, med fokus på en enkelt brønd, og notere det tidspunkt, hvor fluen først bevæger sig væk fra sin endelige hvilested. Gentag denne proces for hver brønd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De termiske grænser (dvs. CTmin og varme KDT) for kvinder fra Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) blev målt for at påvise de data med høj kapacitet, der genereres fra de to beskrevne protokoller. CTmin blev analyseret ved hjælp af DGRP-linjerne 714 (n = 37) og 913 (n = 45). Heat KDT blev analyseret og sammenlignet med DGRP-linjerne 189 (n = 42) og 461 (n = 42), og videofiler blev analyseret manuelt. Den samlede tid for eksperimenterne, herunder at se videoen, tog <2 timer for hver protokol.

Kvinder fra DGRP-linjen 913 havde betydeligt lavere gennemsnitligeCT-min-temperaturer end kvinder fra DGRP Line 714 (figur 5A; Wilcoxon rang sum test, W = 1585, P < 0,001). De to linjer havde klart forskellige fordelinger af CTmin:linje 913 havde en CTmin på 5,00 ± 1,35 °C (gennemsnitlig ± SD) og linje 714 havde en CTmin på 9,60 ± 1,53 °C.

Varme KDT ved 37,5 °C varierede betydeligt mellem hunnerne fra DGRP-linjerne 73 og 461 (figur 5B; Wilcoxon rang sum test, W = 1658,5, P < 0,001). Selv om der var variation i KDT for begge linjer, blev forskelle i varme-KDT'er mellem linjerne let opdaget. Linje 73 havde en 14,8 min længere gennemsnitligE KDT end linje 461 (Linje 73 gennemsnit KDT, 55,58 ± 6,92 min; Linje 461 betyder KDT, 40,78 ± 6,64 min).

Figure 1
Figur 1: Opsætning af kolonnen med kappe tilCT-min-analysen. aA) Samlet kolonne med kappe. (B) Jacketed kolonne med top og bund stik forsegling det indre kammer. Termoelementet er gevind gennem et hul i det øverste stik. DFM er monteret på en retortring under kolonnen og flyttes ud til siden. (C) Start af en CTmin assay. Den øverste prop blev fjernet og fluer blev hældt ind i det indre kammer via en tragt ved den øverste åbning af kolonnen. dD) Jacketed kolonne og DFM under en CTmin assay. Det nederste stik blev fjernet fra kolonnen, og DFM og tragten blev placeret under kolonnen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Teknisk illustration af kolonnen med kappe. a) Hvert stykke akrylslang skåret i længden: i) to afstandsringe skåret til 3,5 cm i længden (trin 1.1.2):ii). den bredeste akrylslange skåret til 31,5 cm (trin 1.1.1) og iii den smalleste akrylslange skåret til 31,5 cm (trin 1.1.1). B) To huller (i gråt) boret i det bredeste stykke akrylslanger, 3,5 cm fra hver ende og på modsatte sider (i; trin 1.1.2). Samling af det smalleste stykke akrylslanger med de to afstandsringe (ii; trin 1.1.6 og 1.1.7). cC) Den udfyldte kolonne med kappe efter trin 1.1.8-1.1.12. Slangeadaptere er angivet med grå. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Nederst (venstre) og øverste (højre) visning af 96 brønden no-bottom plade. Stålvævet mesh er fastgjort til bunden af en modificeret 96 brønd no-bund plade. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Rugemaskine setup for en varme KD assay. (A)Webcam og scene oprettet på afstand. (B)Webcam og fase setup i kuvøse, før en retssag begynder. Webcam er fastgjort til gulvet i rugemaskinen og bakken er ~ 10 cm over webcam. (C)Orientering af 96 godt plade på den hvide scene over webcam under en varme KD assay. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Lavere og øvre termiske grænser for udvalgte linjer fra Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP). aA) CTmin-værdier for to DGRP-linjer. (B) Heat KDT af to DGRP linjer ved 37,5 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Aktivitetsoutput fra videoanalysescripts i et testdatasæt. Hvert plot repræsenterer aktivitetsdata fra en brønd af en 96 brøndplade. I alt 84 prøver blev testet og er vist. Nå ID er mærket til højre for hver histogram.  Klik her for at se dette tal.

Supplerende kodningsfil 1. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 2. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 3. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here


De to metoder, der er beskrevet ovenfor, genererer data med højt gennemløb af økologisk relevante målinger for øvre og nedre termiske grænser. Disse protokoller bygger på tidligere etablerede metoder, der er fælles for forskning i insekt termiske grænser (sammenfattet i Sinclair et al.) 6.Begge protokoller kan udfyldes på kort tid (~ 2 h hver), producere datasæt med store stikprøvestørrelser, ikke ofrer repeterbarhed eller nøjagtighed, og minimerer eksperimentatorfejl ved at fjerne manuel dataoptagelse og -indtastning (CTmin assay) eller ved at oprette backup videooptagelser af hver analyse (varme KD-analyse).

Der blev genereret repræsentative resultater ved at sammenligne de termiske grænser for voksne hunner fra udvalgte linjer i DGRP24. Begge analyser viste betydelige forskelle i termisk tolerance mellem linjer. Effektstørrelsen mellem linjerne i hver af disse analyser var forholdsvis stor, hvilket igen gjorde det muligt at skelne på pålidelig vis og statistisk. Den store forskel i KDT mellem de to DGRP linjer fremhæver en potentiel fordel ved en statisk analyse over en dynamisk ramping analyse; statiske analyser kan være bedre i stand til at opdage mindre forskelle mellem grupper end dynamiske analyser9. De to DGRP linjer udsat for varmen KD assay afveg i gennemsnit KDT med 14,8 min. For reference, ved hjælp af en dynamisk ramping protokol, Rolandi et al.13 viste, at forskellen mellem de højeste og laveste CTmax værdier på 34 DGRP linjer var kun 1,42 °C, eller <6 min med en 0,25 °C / min rampe.

I forhold til andre metoder, der er flere fordele ved både CTmin assay og varme KD assay beskrevet her. Automatiseret optælling i CTmin assay reducerer den tid, en eksperimentator tilbringer på apparatet, hvilket øger mængden af tid, der kan bruges på andre opgaver. Omkostningerne til at bygge akryl-jacketed kolonne er ~ $ 50, i forhold til den anslåede $ 400 til at købe en skræddersyet glas-jacketed kolonne. Til varme KD-analysen eliminerer videooptagelse behovet for direkte observationer i realtid og optager en lille mængde fysisk plads pr. prøve. Andre protokoller, såsom dem, der anvendes af Jørgensen et al.9, bruger et stort akvarium til at se personer nedsænket i separate hætteglas, men denne metode kræver veluddannede efterforskere til hurtigt at kontrollere hætteglas for bevægelse og en stor mængde plads til apparatet. Rolandi et al.13 brugte infrarøde sensorer til at detektere bevægelse eller manglende bevægelse ved CTmax i 96 brøndplader, mens denne varme KD-analyse bruger en billig webcam (~ $ 70) til at detektere bevægelse. Dette kamera kan registrere subtile bevægelser, der kan blive overset af en infrarød aktivitetsskærm.

Desuden blev et sæt af tilpasselige scripts til hurtigt at vurdere KDT i varmen KD assay blev udviklet(Supplerende Coding File 1-3). Disse scripts kan bruges til at spare tid ved at opnå en grov tilnærmelse af varme KDT i hver godt før du ser videoen, og med højere videokvalitet disse scripts potentielt kunne automatisere dataoptagelse. Der er leveret tre scripts til at behandle videoen: FirstFrame.py (Supplerende kodningsfil 1), som definerer videoens første billedramme. WellDefine.py (Supplerende Kodning Fil 2), som definerer hver enkelt brønd af de 96 godt plade i det første billede ramme; og MotionDetect.py (supplerende kodningsfil 3), som transformerer videofilen til et aktivitetssignal ved at beregne ændringen i pixeltætheden mellem sekventielle rammer. Det eneste input til programmet er videofilen, og outputtet indeholder sammenfattende statistikker og et tidsseriedatasæt af aktivitet pr. brønd (Figur 6). Forskelle i pixeltæthed mellem videorammer omdannes ved hjælp af et gråtonefilter for at reducere billeddimensioner, et gaussisk lavpasfilter for at reducere billedstøj og en udvidelsesmorfologisk handling for at øge kanterne på objekter i bevægelse. I dette tilfælde defineres aktivitet som den absolutte forskel i pixelværdier mellem sekventielle rammer. Varme-KDT kan derefter estimeres som indekset for den sidste ramme, der indeholder en aktivitetsværdi, der er større end nul. F.eks. var den ramme, hvor aktiviteten sidst blev registreret i godt g12 i et prøvedatasæt (figur 6), lige efter 2.000 s (33,33 min), som angivet med en flad linje. En observatør kan derefter afspille den digitale video og hurtigt finde Heat KDT af godt G12 med dette tidsstempel.

Med mindre ændringer og fejlfinding er der yderligere applikationer til begge analyser, især med varmen KD-analysen. Opsætningen af videooptagelsen kan ændres for at optage statiske kolde knockdown-tider, chillkomagenoprettelsestid eller potentielt dynamiskeCT-max- ogCT-min-værdier. Chill koma restitutionstid er den tid, det tager en person til at genoptage bevægelse efter kold stress29. Derfor kan chill coma restitutionstid måles med denne opsætning ved at fremkalde chill koma i 96 brøndpladen, derefter bruge videoopsætningen til at registrere restitutionstiden i kuvøsen. Endelig, med omhyggelig finjustering, dynamisk CTmax eller CTmin kunne registreres i en programmerbar ramping inkubator. Omhyggelig opmærksomhed på temperaturen inde i hver af de 96 brønde ville være en bekymring, fordi små variationer i temperaturen i inkubatoren kunne forstørres mellem brønde som temperaturen ændrer sig.

Der bør tages hensyn til flere overvejelser, når der udføres enten CTmin eller varme KD-analysen. Først og fremmest, kvalitet, alder, køn, livsstadiet, genetiske baggrund, og tidligere erfaringer med et insekt kan påvirketermiske grænser 6,,13,30,31. For begge analyser skal forsøgspersonerne være motile. For det andet kan kun én gruppe analyseres ad gangen for hvert CTmin-apparat. Derfor, variabler såsom døgnvariation i termisk tolerance32,33 skal overvejes, når man sammenligner behandlinger. En løsning på dette problem er at gennemføre CTmin analyser af flere behandlingsbetingelser med flere apparater på samme tid. For det tredje er nogle arter måske ikke egnede til den ene eller begge analyser. For eksempel kan nogle arter ikke let klatre eller flyve til siddepinde i CTmin assay eller kan ophøre med aktivitet ved høje temperaturer, før deres varme KDT er nået, hvilket ville gøre det vanskeligt at skelne en knockdown tid. Endelig er det for at sikre nøjagtige sammenligninger i varme-KD-analysen afgørende, at kriterierne for KDT (trin 2.2.8) er konsistente mellem replikater, observatører, forsøg osv. For at imødekomme forskellige insektarter kan det være nødvendigt at foretage ændringer af et af testapparaterne. Potentielle ændringer omfatter brug af forskellige typer af siddepinde til CTmin assay, ved hjælp af cellekultur plader med færre brønde og mere plads (48, 24, 12, eller 6 brønde) i stedet for 96 godt plade til at rumme større insekter, eller justere den temperatur, der anvendes til varmen KD analyse for at sikre en knockdown tid, der ikke er for hurtigt eller for langsomt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Ellie McCabe for hjælp med flyveopdræt. Dette arbejde er støttet af United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project tilskud 1010996 og National Science Foundation tilskud OIA-1826689 til N.M.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) Thermo Scientific; Waltham, MA 153-5401
C922 Pro Stream Webcam Logitech; Newark, CA 960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm Any Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44041
Clear silicone sealant Any Any
Collection tube (15 ml) Any Any
Cordless Drill Any Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM) TriKinetics; Waltham, MA DFM Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software TriKinetics; Waltham, MA Records data input from the DFM
Fly Storage Lid FlySorter; Seatle, WA FS-96LID-5PK Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate FlySorter; Seatle, WA FS-96PLATE-5PK Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray FlySorter; Seatle, WA FS-TRAY-5PK Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel Kimax 28950-75 75mm
Gutter guard Any Any ~0.5 cm diameter openings
Hacksaw Any Any
Heratherm Thermo Scientific incubator Thermo Scientific; Waltham, MA OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 United States Plastic Corp., OH 61135
Hot glue gun and glue Any Any
Light Source Any Any
Magnets Any Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T) OMEGA; Norwalk, CT 5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel Any Any 2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter United States Plastic Corp., OH 62852
Retort ring Any Any 2" diameter
Retort stand Any Any
Retort three-prong clamp Any Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9) TriKinetics; Waltham, MA PSIU9 Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick) Any Any
Tape Any Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1) TriKinetics; Waltham, MA PS9-1 Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement United States Plastic Corp., OH 45737

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218, (12), 1956-1967 (2015).
  2. Angilletta, M. J. Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. New York, NY. (2009).
  3. Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2, (7), 491-496 (2012).
  4. Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4, (11), 988-992 (2014).
  5. MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222, (4), 191593 (2019).
  6. Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
  7. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75, (10), 1561-1574 (1997).
  8. Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33, (6), 320-323 (2008).
  9. Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33, (4), 629-642 (2019).
  10. Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33, (4), 389-394 (2008).
  11. Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29, (1), 55-65 (2015).
  12. Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33, (2), 197-205 (2004).
  13. Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8, (21), 10374-10383 (2018).
  14. Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7, (3), 1-7 (2012).
  15. Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
  16. Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118, (September), 103946 (2019).
  17. Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59, (10), 1057-1064 (2013).
  18. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214, (5), 726-734 (2011).
  19. Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6, (4), 489-494 (1992).
  20. Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137, (3), 783-789 (1994).
  21. Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84, (6), 553-559 (2011).
  22. Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15, (10), (2019).
  23. Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39, (5), 1773-1780 (1996).
  24. MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, (7384), 173-178 (2012).
  25. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A laboratory handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
  26. Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331, (3), 192-200 (2019).
  27. Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31, (4), 543-555 (2018).
  28. Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45, (8), 719-726 (1999).
  29. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57, (1), 12-20 (2011).
  30. Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220, (23), 4471-4478 (2017).
  31. Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18, (4), 804-810 (2005).
  32. Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204, (9), 1659-1666 (2001).
  33. Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18, (5), 257-262 (2003).
High-Throughput Assays af kritiske termiske grænser i insekter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).More

Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter