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Biology

Tests à haut débit des limites thermiques critiques chez les insectes

doi: 10.3791/61186 Published: June 15, 2020

Summary

Les limites thermiques peuvent prédire les environnements que les organismes tolèrent, ce qui est une information précieuse face au changement climatique rapide. Décrits ici sont des protocoles à haut débit pour évaluer les minima thermiques critiques et le temps de choc thermique chez les insectes. Les deux protocoles maximisent le débit et minimisent le coût des tests.

Abstract

Les limites thermiques supérieures et inférieures des plantes et des animaux sont d’importants prédicteurs de leur performance, de leur survie et de leur répartition géographique, et sont essentielles pour prédire les réponses au changement climatique. Ce travail décrit deux protocoles à haut débit pour mesurer les limites thermiques des insectes : l’un pour l’évaluation des minima thermiques critiques (CTmin),et l’autre pour évaluer le temps d’arrêt de la chaleur (KDT) en réponse à un facteur de stress thermique statique. Dans le test ctmin, les individus sont placés dans une colonne à veste acrylique, soumis à une rampe de température décroissante, et comptés comme ils tombent de leurs perchoirs à l’aide d’un capteur infrarouge. Dans le test de chaleur KDT, les individus sont contenus dans une plaque de puits 96, placé dans un incubateur réglé à une température stressante et chaude, et vidéo enregistrée pour déterminer l’heure à laquelle ils ne peuvent plus rester debout et se déplacer. Ces protocoles offrent des avantages par rapport aux techniques couramment utilisées. Les deux essais sont peu coûteux et peuvent être effectués relativement rapidement (~2 h). Le test CTmin réduit l’erreur de l’expérimentateur et peut mesurer un grand nombre d’individus à la fois. Le protocole KDT de chaleur génère un enregistrement vidéo de chaque essai et supprime ainsi le biais d’expérimentateur et la nécessité de surveiller en permanence les individus en temps réel.

Introduction

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Limites thermiques des insectes
La variation des conditions environnementales, y compris la température, est un facteur important influençant la performance, la condition physique, la survie et la répartition géographique des organismes1,2. Les limites thermiques supérieures et inférieures déterminent l’éventail théorique des environnements qu’un organisme peut tolérer et, par conséquent, ces limites sont d’importants prédicteurs des distributions végétales et animales, en particulier face au changement climatique3,4. Ainsi, les protocoles de mesure des limites thermiques sont des outils importants pour les écologistes, les physiologistes, les biologistes évolutionnistes et les biologistes de la conservation, entre autres.

En tant qu’animaux terrestres les plus abondants et les plus diversifiés, les insectes sont fréquemment utilisés pour mesurer les limites thermiques. Les maxima thermiques critiques (CTmax)et les minima thermiques critiques (CTmin)sont couramment utilisés pour évaluer les variations intra- et interspécifiques de la tolérance thermique5,,6,7. Bien que CTmax et CTmin puissent être mesurés pour plusieurs phénotypes, y compris la croissance, la production reproductrice et le comportement, ils sont le plus souvent appliqués à la fonction locomotrice5,,6,7. Ainsi, CTmax (également appelé température de la chaleur knockdown) et CTmin sont souvent définis comme les températures élevées et basses à laquelle les insectes perdent la fonction motrice et sont incapables de rester debout5,6,7,8,9,10,11. CTmin coïncide avec le début du coma froid, une paralysie réversible provoquée par des températures froides6. Alors que la paralysie aux limites thermiques est souvent réversible, l’exposition continue à ces températures conduit à la mort écologique5.

Méthodes courantes de mesure des limites thermiques
Une variété d’appareils ont été utilisés pour mesurer les limites thermiques (résumé dans Sinclair et al.) 6. En bref, les insectes sont chauffés ou refroidis dans des incubateurs12,13, conteneurs immergés dans des bains fluides11,14,15,16, blocs d’aluminium10,17, ou conteneurs à veste18, et surveillés jusqu’à ce que la locomotion cesse. Pour surveiller les insectes pendant l’essai, la méthode la plus courante est l’observation directe, dans laquelle les individus sont surveillés en permanence en temps réel ou rétrospectivement avec la vidéo enregistrée6,9,10,11,15,17. Bien que les méthodes d’observation directe aient des exigences minimales en matière d’équipement, elles exigent beaucoup de main-d’œuvre et limitent le débit. Alternativement, les insectes peuvent être observés indirectement en recueillant des individus à des moments discrets comme ils tombent de perchoirs6,19,20,21 ou en utilisant des moniteurs d’activité13.

Les méthodes indirectes de mesure des limites thermiques sont généralement plus élevées et potentiellement moins sujettes aux erreurs que les méthodes d’observation directe. La méthode la plus courante de surveillance indirecte utilise une colonne à température contrôléeveste 6,,8,19,20,21. Les insectes sont placés à l’intérieur d’une colonne avec des perchoirs, et la température de la chambre intérieure est contrôlée par le pompage du liquide d’un bain fluide à température contrôlée à travers la doublure veste de la colonne. Les individus qui atteignent leur limite thermique tombent de leur perchoir et sont recueillis à des températures discrètes ou à des intervalles de temps. Bien que cette méthode fonctionne bien pour CTmin, il a été jugé inapproprié pour CTmax, parce que les mouches volontairement sortir du fond de la colonne lorsque la température augmente. La nouvelle méthode décrite ici contourne ce problème en contenant individuellement des mouches lors de mesures automatisées.

En plus de la méthode d’observation, deux types de régimes de température sont couramment utilisés pour évaluer les limites thermiques supérieures. Les essais dynamiques consistent à augmenter progressivement la température jusqu’à ce que la fonction motrice soit perdue; cette température est la dynamique CTmax7,8,9,13. En revanche, les tests statiques se composent d’une température stressante constante jusqu’à ce que la fonction motrice soit perdue; ce point de temps est le temps de la chaleur knockdown (chaleur KDT), également appelé le statique CTmax (sCTmax) dans un article récent par Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Bien que les tests de CTmax et de knockdown thermique (essais de chaleur KD) produisent des métriques avec des unités différentes, la modélisation mathématique des deux traits indique qu’ils donnent des informations comparables sur la tolérance à la chaleur et sont tous deux écologiquement pertinents8,9. Les essais dynamiques donnent une température qui peut être comparée aux conditions environnementales, et ils sont préférables lorsqu’il y a de grandes différences dans la tolérance à la chaleur, comme les comparaisons entre les espèces ayant des niches thermiques très différentes. Toutefois, en raison du Q10 élevé pour l’accumulation de blessures par la chaleur, un test statique peut être préférable pour détecter de petites tailles d’effet, telles que la variation intraspécifique de la tolérance thermique9. En outre, pratiquement parlant, un test statique nécessite un équipement moins sophistiqué qu’un test dynamique.

Objectif
L’objectif de cet article est de formaliser les méthodes de ctmin et de tests de chaleur KD qui peuvent être utilisés dans des recherches futures pour évaluer les limites thermiques des insectes motiles. Les protocoles sont adaptés à partir de méthodologies établies précédemment et sont conçus pour être à haut débit, automatisés et rentables. Les deux essais peuvent être effectués en peu de temps (~2 h), ce qui signifie que plusieurs expériences peuvent être menées en une seule journée, produisant de grandes quantités de données sans sacrifier la répétabilité ou la précision. Avec cette configuration, la tolérance thermique de 96 mouches peut être mesurée simultanément, tandis que la colonne de CTmin peut contenir plus de 100 mouches, à condition qu’il y ait une surface adéquate pour se percher.

La méthode de haut débit pour observer CTmin modifie la méthodologie commune de colonne de veste avec l’ajout d’un capteur infrarouge pour compter automatiquement les mouches. L’utilisation d’un capteur infrarouge pour le comptage a été proposée pour la première fois par Shuman et coll. en 199623, mais n’a pas été largement adoptée. L’ajout du capteur infrarouge permet la production de données continues plutôt que de recueillir des données à intervalles distincts. Ce protocole minimise également l’erreur de l’expérimentateur en éliminant la saisie manuelle des données et la nécessité de commuter manuellement les tubes de collecte sous la colonne jacked à des points de temps discrets.

La méthode à haut débit pour l’enregistrement de la chaleur KDT est modifiée à partir de deux études antérieures de tolérance à la chaleur chez les insectes10,12. Les mouches individuelles sont stockées dans une plaque de puits de 96 dans un incubateur à température contrôlée et la vidéo est enregistrée. Ce protocole minimise le biais de l’expérimentateur dans la détermination de la chaleur KDT parce que les expériences peuvent être examinées et vérifiées en jouant en arrière de l’enregistrement. Ce protocole fournit également un ensemble de scripts Python personnalisés qui peuvent être utilisés pour accélérer l’analyse vidéo. L’utilisation de puits individuels élimine les interférences qui peuvent se produire lorsque d’autres personnes se déplacent ou tombent, ce qui peut être un problème lorsque des groupes d’individus sont observés dans le même aréna10,17. En outre, l’incubateur à température contrôlée fournit une température stable sur les 96 puits, contrairement au gradient de température parfois observé à travers un bloc d’aluminium à température contrôlée10. Notez également que la méthode d’enregistrement 96 puits peut être adaptée pour mesurer la dynamique CTmax et potentiellement CTmin (voir Discussion).

Pour démontrer chaque protocole, les limites thermiques des femelles adultes Drosophila melanogaster de certaines lignes du Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) ont été comparées24. Ces lignes ont été sélectionnées parce que les expériences préliminaires ont indiqué des différences significatives dans la tolérance thermique. Ces essais se sont avérés être des méthodes robustes pour discriminer les différences dans la tolérance thermique. Les deux protocoles suivants, l’essai de CTmin à haut débit (section 1) et l’essai KD à haute chaleur (section 2), décrivent les mesures nécessaires pour produire des données CTmin et thermiques KDT pour tout stade de vie d’insecte motile capable de s’adapter aux appareils, tels que la Drosophilaadulte . Pour CTmin, il est également essentiel que l’insecte soit capable de se percher. Ici, chaque essai est démontré chez drosophila melanogasteradulte . Toutefois, des modifications peuvent être nécessaires pour d’autres taxons ou étapes de la vie6. Les changements mineurs peuvent inclure l’utilisation de matériaux de perchoir avec de plus grandes ouvertures pour accueillir de plus grands spécimens dans le testde CT min ou l’utilisation d’une caméra de meilleure qualité pour discerner le KDT subtil d’un insecte lent ou étape de vie dans le test de la chaleur KD. Ce protocole ne décrit pas les méthodes de préparation des mouches, mais il est important de normaliser les protocoles d’élevage pour assurer la répétabilité25 (voir Garcia et Teets26 et Teets et Hahn27). Les protocoles fournis comprennent des informations sur la façon de construire et de mettre en place les appareils, comment enregistrer les mesures et une brève description de l’analyse des données.

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Protocol

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1. Essai dect min à haut débit

  1. Assemblage de la colonne en veste (Figure 1A, Figure 2)
    1. Couper les tubes acryliques les plus larges (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) et les plus étroits (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) à longueurs égales (31,5 cm) avec des scies à aas (figure 2A). Ces deux tubes seront les murs extérieurs et les plus intimes de la colonne veste.
    2. Couper deux anneaux (2 cm de large) du tube acrylique de taille moyenne (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) à l’aide d’une scie à métaux (figure 2A). Ces deux anneaux seront les espaceurs entre les tubes intérieurs et les tubes les plus externes, créant un espace entre les deux longs tubes acryliques pour que le fluide s’écoule.
    3. Percer soigneusement deux trous dans le tube acrylique extérieur (le plus large), un trou en haut et un en bas. Assurez-vous que chaque trou est à 3,5 cm de l’extrémité du tube. Percer les trous sur les côtés opposés du tube (Figure 2B).
    4. Pour réduire la fissuration, placez du ruban adhésif sur le tube au-dessus de l’endroit du futur trou et percez très lentement sur le réglage de couple le plus bas de la perceuse.
    5. À l’aide du robinet de filetage, enfiler les deux trous de sorte que les adaptateurs de tuyau peuvent être vissés dans les deux trous du tube extérieur. Pour réduire la fissuration, utilisez du lubrifiant et enfilez lentement à la main.
    6. Faites glisser les deux espaceurs sur la veste intérieure, l’une à chaque extrémité (en bas et en haut). Laissez un petit espace (0,5 cm) entre l’espaceur et l’extrémité de la veste intérieure (figure 2B).
    7. Souder les espaceurs en place à l’aide de ciment acrylique.
    8. Après le ciment sur le tube intérieur et les ensembles d’espaceurs, faites glisser cette construction dans le plus grand tube extérieur avec les trous. Assurez-vous que les tubes extérieurs et intérieurs sont rincés aux deux extrémités. Les espaceurs seront à 0,5 cm de l’extrémité, formant de petites tranchées aux deux extrémités de la colonne (figure 2C).
    9. Soudez le tube extérieur aux espaceurs à l’aide de ciment acrylique, à l’aide de pinces en acier réglables pour maintenir l’appareil ensemble. Attendez que le ciment se mette.
    10. Enfiler les adaptateurs du tuyau dans les trous du tube extérieur maintenant fixés aux espaceurs et au tube intérieur.
      REMARQUE : Les adaptateurs ne doivent s’enfiler que dans le tube externe et non dans l’espace ouvert entre les tubes intérieurs et extérieurs. Si les adaptateurs de tuyau s’enfilent trop loin, raccourcissez-les à la longueur appropriée avec une scie à scie.
    11. Sceller les adaptateurs de tuyau dans leurs fils sur le tube extérieur avec scellant en silicone.
    12. Remplissez les deux tranchées entre les tubes intérieurs et extérieurs aux deux extrémités de la colonne de veste avec un scellant en silicone.
    13. Pour tester la colonne, attachez des tubes de 0,6 cm de diamètre aux adaptateurs du tuyau. Connectez l’adaptateur au bas de la colonne à une source d’eau avec des tubes, et l’adaptateur en haut de la colonne à un drain avec un autre morceau de tube.
    14. Faire couler de l’eau à travers l’appareil du bas vers le haut et vérifier les fuites. S’il y a des fuites, identifiez d’où elles viennent et scellez-les avec du silicone.
  2. Mise en place de la colonne veste et du moniteur d’entonnoir Drosophila (DFM)
    1. Fixez la colonne en veste sur un support de riposte à l’aide d’une pince de riposte à trois volets. Aligner la colonne verticalement avec une extrémité ouverte au plafond et l’autre ouverte sur le banc de laboratoire (figure 1B).
    2. Connecter l’entrée et la sortie du liquide d’un bain réfrigéré à température contrôlée aux buses d’adaptateur de la colonne avec des tubes en plastique de 0,6 cm de diamètre (figure 1B). Connectez l’entrée de fluide à la buse au bas de la colonne et la sortie du fluide à la buse en haut de la colonne.
    3. Couper deux bouchons isolants circulaires en mousse de 3 cm d’épaisseur (la même circonférence que l’ouverture du compartiment le plus intime de la colonne). Assurez-vous que les bouchons s’adaptent parfaitement et scellez la colonne la plus intérieure lorsqu’elles sont insérées aux deux extrémités (figure 1B).
    4. Percer un trou à travers le centre de l’un des bouchons et enfiler l’extrémité nue d’un thermocouple à travers le trou d’environ 5 cm et fixer avec du ruban adhésif. Branchez l’autre extrémité du thermocouple dans un enregistreur de données thermocouple.
    5. Connectez l’enregistreur de données thermocouple à l’ordinateur.
    6. Coincer deux morceaux de protection de gouttière en plastique (5 cm x 7 cm, avec des ouvertures de diamètre de ~0,5 cm) à l’intérieur de la colonne pour fonctionner comme matériau de perchoir. Placez un morceau de garde 2/3rds du haut de la colonne et l’autre 1/3rd du haut de la colonne (Figure 1B).
    7. Fixez la prise inférieure (sans thermocouple) et la prise supérieure (avec un thermocouple). Lorsque le bouchon est inséré en haut de la colonne, assurez-vous que le thermocouple ne touche pas les côtés de la colonne.
    8. Réglez la hauteur de la colonne sur le support de riposte afin qu’il y ait une distance de 25 cm entre le bas de la colonne et le dessus du banc.
    9. Fixez un anneau de riposte (5 cm de diamètre) au stand de riposte à 5 cm sous le bas de la colonne et faites pivoter l’anneau sur le côté de la colonne.
    10. Placez le DFM directement sur l’anneau de riposte (Figure 1B). Connectez tous les composants électroniques : l’alimentation, l’interface d’alimentation et l’ordinateur selon le protocole du fabricant.
    11. Une fois les composants connectés, suivez le protocole du fabricant pour terminer la configuration du logiciel DFM et DFM.
  3. CtMin Test
    1. Tournez les valves d’entrée et de sortie du bain fluide vers les positions ouvertes.
    2. Appuyez sur le bouton d’alimentation pour allumer le bain fluide à température contrôlée, puis appuyez sur le bouton de jeu pour exécuter un programme augmentant et maintenant la température du bain à 25 °C. Donnez le bain fluide et la colonne 5-10 min pour atteindre et maintenir 25 °C.
    3. Retirez le bouchon en haut de la colonne et remplacez-le par un entonnoir (5,08 cm de diamètre; voir la figure 1C).
    4. Appuyez sur les mouches de leur flacon alimentaire dans la colonne.
    5. Retirez l’entonnoir et remplacez-le rapidement par la prise supérieure, en prenant soin de ne pas laisser les mouches s’échapper. Donnez aux mouches 5 min pour régler, en tapant de temps en temps la prise inférieure pour encourager les mouches à grimper.
    6. Appuyez sur le bouton de démarrage du bain fluide et commencez le programme de rampement CTmin (25 °C pendant 5 min; 25 °C à 10 °C à 0,5 °C/min; 10 °C pendant 2 min; puis 10 °C à -10 °C à 0,25 °C/min).
      REMARQUE : D’autres variantes de ce protocole de rampement ctmin peuvent être utilisées en fonction de la question de recherche (p. ex., comparaisons des effets des différents taux de montée en puissance sur ctmin28).
    7. Cliquez sur ouvrir le logiciel d’enregistrement thermocouple sur l’ordinateur, puis sur l’icône Enregistrement pour commencer à enregistrer la température à l’intérieur de la colonne chaque seconde pendant la durée de l’essai. Assurez-vous que chaque enregistrement de température inclut un horodatage spécifique à la seconde, afin que les données de température puissent ensuite être fusionnées avec les données du DFM.
    8. Ajouter 5 ml d’éthanol à 90 % à un tube de centrifugeuse conique de 15 m L et le placer dans un rack sous la colonne.
    9. De temps en temps, appuyez sur la prise inférieure de la colonne pour inciter les mouches sur le fond à grimper. La plupart des mouches seront sur une perche ou près du haut de la colonne par 15 °C.
    10. À 15 °C, retirez la prise inférieure et récupérez les mouches encore sur la prise inférieure de l’éthanol. Comptez et notez que ces mouches ont été recueillies à 15 °C, mais leur ctmin est inconnu.
      REMARQUE : La température à laquelle le bouchon inférieur est enlevé doit être décidée avant l’essai et en fonction de lact min prévue de l’espèce d’essai ou du traitement. Pour cet essai, 15 °C ont été choisis en fonction de lact min de ces lignes DGRP particulières trouvées dans les essais préliminaires.
    11. Placez un entonnoir de verre de 75 mm de diamètre extérieur dans le DFM. Réglez l’anneau de riposte, le DFM et l’entonnoir de sorte qu’ils soient sous la colonne. Assurez-vous que la lèvre de l’entonnoir scelle complètement le bas de la colonne (Figure 1D).
    12. Insérez le fond de l’entonnoir dans le tube de collecte de 15 mL (figure 1D).
    13. Ouvrez le logiciel DFM sur l’ordinateur en cliquant sur l’icône Logiciel. Le logiciel commencera immédiatement à enregistrer l’heure/date à laquelle les mouches atteignent leur ctmin. Les mouches qui atteignent leur CTmin perdent la fonction neuromusculaire et tombent de leurs perchoirs, et par la suite par le DFM.
    14. Surveillez si toutes les mouches ont atteint leur ctmin à mesure que la température diminue en vérifiant la prise supérieure et les perchoirs pour voir si des mouches sont encore perchées (c.-à-d. le maintien de la fonction neuromusculaire). L’essai se termine lorsque toutes les mouches ont atteint leur ctmin.
    15. À la fin de l’essai, ajustez le DFM et éloignez-vous de l’ouverture de la colonne. Certaines mouches peuvent atteindre leur ctmin, mais restent coincées dans la colonne (c.-à-d. coincées dans une perche ou suspendues par un seul crochet tarsal). Ouvrez la prise supérieure et retirez ces mouches. Le ctmin de ces mouches est inconnu.
    16. Combinez les fichiers de sortie .txt du logiciel d’enregistrement thermocouple (c.-à-d. température, date et heure) et du logiciel DFM (c.-à-d. le nombre de mouches à travers l’entonnoir, la date et l’heure) à l’aide de la commande Merge dans RStudio. Fusionnez les deux fichiers en fonction de la variable date/heure partagée.

2. Essai KD à haute chaleur

  1. Assemblage et préparation d’appareils
    1. À l’aide d’un adhésif, fixer la maille métallique tissée en acier (~1,5 mm d’ouverture) au fond d’une plaque de 96 puits sans fond.
    2. Attachez des aimants aux côtés opposés du fond d’une plaque de 96 puits sans fond avec un pistolet à colle chaude et de la colle chaude (figure 3).
    3. Pour fabriquer un couvercle de septum personnalisé avec un film adhésif conçu pour 96 plaques de puits, collez deux films collants côtés ensemble pour former une feuille de plastique à crête.
    4. Placez les feuilles de plastique sur la plaque de 96 puits et utilisez du ruban adhésif pour l’adhérer aux quatre côtés de la plaque. Au-dessus de l’ouverture à chaque puits sur la plaque, couper un « » dans la feuille de plastique avec un coupe-boîte (c.-à-d. 96 x au total).
    5. Anesthétiser les mouches avec du CO2 et les charger individuellement dans chaque puits de la plaque modifiée de 96 puits sans fond avec un aspirateur et un couvercle de septum. Retirez le couvercle du septum de la plaque de puits 96 pendant que les mouches sont anesthésiées par du CO2 et remplacez-le par un couvercle transparent bien ajusté.
    6. Placez la plaque 96 bien sans fond chargée de mouches et avec un couvercle étanche clair sur les aliments. Assurez-vous que les mouches ont au moins 48 h entre l’anesthésiation du CO2 et le début de l’essai (étapes 2.2.1-2.2.5).
      REMARQUE : Le fond des plaques modifiées de 96 puits sans fond est fait de maille, de sorte que les mouches anesthésiées avec du CO2 peuvent être chargées et laissées sur les aliments pendant au moins 48 h avant le début d’un essai. Tout récipient en plastique >8,5 cm de large x 13 cm de long qui est d’au moins 2 cm de profondeur pour accueillir une couche profonde de 1 cm de nourriture peut être utilisé.
    7. Fixez une webcam au fond de l’intérieur d’un incubateur à température contrôlée avec du ruban adhésif. Pointez la caméra directement vers le haut (Figure 4). Fixer une étagère d’incubateur à environ 10 cm au-dessus de la caméra.
      REMARQUE : La webcam pointe vers le haut et enregistre la plaque de puits 96 d’en bas pour s’assurer que la plus grande partie de la surface du puits est en vue que possible (par exemple, pas bloqué de la vue par les murs de puits de la plaque). Lorsque les mouches atteignent leur KDT, elles tombent au fond du puits; dans ce cas, le côté le plus proche de la webcam, et sont donc en vue indépendamment de la distance de leur puits est du centre de vue.
    8. Connectez la webcam à un ordinateur.
    9. À l’aide de ruban adhésif, fixer une feuille de papier blanche (8,5 cm x 13 cm; la zone exacte du fond de la plaque de puits 96) au bas de l’étagère (figure 4). Assurez-vous que le papier remplit l’ensemble du cadre lorsqu’il est vu à travers la webcam.
    10. Placez une source de lumière dans l’incubateur. Utilisez du papier ou d’autres matériaux pour amortir l’éclairage et minimiser l’éblouissement.
      NOTE L’étape 2.1.10 est spécifique à chaque incubateur car l’éclairage et les réflexions varient d’un incubateur à l’autre. L’objectif est d’avoir suffisamment d’éclairage dans l’incubateur pour fournir un bon contraste entre les mouches dans chaque puits et la feuille de papier blanche derrière la plaque lorsqu’il est vu avec la webcam.
  2. Exécution de la chaleur KD test
    1. Réglez l’incubateur à 37,5 °C et attendez environ 30 min pour donner à l’incubateur le temps d’atteindre et de maintenir la température désirée. La température exacte dépendra de l’évaluation de l’insecte et de toute autre considération temporelle.
    2. Placez la plaque de puits 96 inversée dans l’incubateur, de sorte que le fond de la plaque (côté maille) est contre le papier blanc sur le fond du plateau (Figure 4). Prenez note de l’orientation des puits (noms de colonne et de ligne) sur le plateau et dans le cadre de la webcam. Le ruban coloré le long des côtés de la plaque de puits 96 et les bords du morceau de papier blanc peuvent vérifier l’orientation (Figure 4).
      REMARQUE : Assurez-vous que la température de l’incubateur est conforme à la température à l’intérieur de la plaque de puits 96 en enregistrant la température à l’intérieur de la plaque avec un thermocouple lors d’un essai de l’essai de chaleur KD. Il est également prudent de vérifier qu’il y a une variation négligeable de la température entre les puits de la plaque de puits 96 avec plusieurs thermocouples avant d’effectuer le test de chaleur KD.
    3. Fermez la porte de l’incubateur.
    4. Cliquez sur Enregistrement sur le logiciel d’enregistrement vidéo.
    5. Après 2 h, vérifiez l’enregistrement pour voir que toutes les mouches ont atteint leur point de repos final et ont cessé de bouger. Une fois que toutes les mouches ont cessé de bouger, cliquez sur Arrêter sur le logiciel d’enregistrement vidéo. Pour les génotypes testés ici, élevés à 25 °C, la plupart des mouches atteignent leur KDT de 60 min à 37,5 °C (voir également Jørgensen et al.9).
    6. Disposez des mouches.
    7. Utilisez les scripts Python personnalisés (Fichiers de codage supplémentaires 1-3) pour se rapprocher de l’heure dans la vidéo lorsque les mouches atteignent leur chaleur KDT.
      REMARQUE : L’étape 2.2.7 est facultative. Pour accélérer l’analyse vidéo, un ensemble de scripts Python personnalisés ont été développés pour mesurer les changements dans la densité des pixels au fil du temps dans chaque puits (voir fichier de codage supplémentaire). Lorsque les mouches cessent de bouger, la densité des pixels est constante et une trace de ces données peut être utilisée pour localiser l’heure approximative dans la vidéo lorsque les mouches sont renversées. Bien qu’il puisse être possible d’utiliser ce script pour automatiser l’analyse des données, actuellement de légères imperfections dans la vidéo conduisent à des écarts mineurs entre les changements dans la densité des pixels et le temps KD réel.
    8. Cliquez sur ouvrir le fichier vidéo et enregistrer le KDT de chaque mouche dans chaque puits. La mesure la plus cohérente de la chaleur KDT entre les essais et les observateurs est l’enregistrement de l’heure à laquelle une mouche atteint son point de repos final.
    9. Suivez la vidéo à l’envers, en mettant l’accent sur un seul puits, et en notant l’heure à laquelle la mouche se déplace d’abord hors de son point de repos final. Répétez ce processus pour chaque puits.

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Representative Results

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Les limites thermiques (c.-à-d. CTmin et KDT thermique) des femelles du Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) ont été mesurées pour démontrer les données à haut débit générées par les deux protocoles décrits. CTmin a été analysé à l’aide des lignes 714 (n = 37) et 913 (n = 45). Le KDT thermique a été analysé et comparé aux lignes 189 (n = 42) et 461 (n = 42), et les fichiers vidéo ont été analysés manuellement. Le temps total des expériences, y compris regarder la vidéo, a pris <2 h pour chaque protocole.

Les femelles de la ligne 913 du DGRP avaient des températures moyennesmoyennes de CT min significativement inférieures à celles des femelles de la ligne 714 du DGRP (figure 5A; Wilcoxon rank sum test, W = 1585, P < 0,001). Les deux lignes avaient des distributions clairement distinctes de CTmin: la ligne 913 avait unect min de 5,00 ± 1,35 °C (moyenne ± SD) et la ligne 714 avait unect min de 9,60 ± 1,53 °C.

La chaleur KDT à 37,5 °C différait significativement entre les femelles des lignes 73 et 461 du DGRP(figure 5B; Wilcoxon rank sum test, W = 1658,5, P < 0,001). Bien qu’il y ait eu des variations dans le KDT des deux lignes, des différences dans les KDT de chaleur entre les lignes ont été facilement détectées. La ligne 73 avait un KDT moyen de 14,8 min de plus que la ligne 461 (ligne moyenne KDT, 55,58 ± 6,92 min; Ligne 461 moyenne KDT, 40,78 ± 6,64 min).

Figure 1
Figure 1 : Configuration de la colonne en veste pour l’essai ctmin. (A) Colonne de vestes assemblées. (B) Colonne en veste avec bouchons supérieurs et inférieurs scellant la chambre intérieure. Le thermocouple est enfilé à travers un trou dans la prise supérieure. Le DFM est monté sur un anneau de riposte sous la colonne et déplacé sur le côté. (C) Début d’un test ctmin. La prise supérieure a été enlevée et les mouches ont été versées dans la chambre intérieure par l’intermédiaire d’un entonnoir à l’ouverture supérieure de la colonne. (D) Colonne en veste et DFM pendant un test ctmin. La prise inférieure a été retirée de la colonne et le DFM et l’entonnoir ont été placés sous la colonne. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Illustration technique de la colonne en veste. (A) Chaque morceau de tube acrylique coupé à la longueur : i) deux anneaux d’espacement coupés à 3,5 cm de longueur (étape 1.1.2):ii). le tube acrylique le plus large coupé à 31,5 cm (étape 1.1.1); et iii les tubes acryliques les plus étroits coupés à 31,5 cm (étape 1.1.1). (B) Deux trous (en gris) percés dans le morceau le plus large de tubes acryliques, à 3,5 cm de chaque extrémité et sur les côtés opposés (i; étape 1.1.2). Assemblage de la pièce la plus étroite de tubes acryliques avec les deux anneaux de l’espace (ii; étapes 1.1.6 et 1.1.7). (C) Colonne de vestes terminée après les étapes 1.1.8-1.1.12. Les adaptateurs de tuyau sont indiqués en gris. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Vue inférieure (à gauche) et supérieure (droite) de la plaque 96 bien sans fond. La maille tissée en acier est fixée au fond d’une plaque modifiée de 96 puits sans fond. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Configuration de l’incubateur pour un essai KD thermique. (A) Webcam et scène installée à distance. (B) Webcam et mise en scène dans l’incubateur avant le début d’un essai. La webcam est fixée au sol de l’incubateur et le plateau est ~10 cm au-dessus de la webcam. (C) Orientation de la plaque de puits 96 sur la scène blanche au-dessus de la webcam lors d’un essai de chaleur KD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Limites thermiques inférieures et supérieures de certaines lignes du Panneau de référence génétique Drosophila (DGRP). (A) Valeurs CTmin de deux lignes DGRP. (B) Chauffe KDT de deux lignes DGRP à 37.5 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Sortie d’activité des scripts d’analyse vidéo d’un jeu de données de test. Chaque parcelle représente les données d’activité d’un puits d’une plaque de puits de 96. Au total, 84 échantillons ont été testés et sont présentés. Eh bien ID est étiqueté sur la droite de chaque histogramme.  Veuillez cliquer ici pour voir ce chiffre.

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Discussion

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Les deux méthodes détaillées ci-dessus génèrent des données à haut débit de mesures écologiquement pertinentes pour les limites thermiques supérieures et inférieures. Ces protocoles s’appuient sur des méthodologies déjà établies communes à la recherche sur les limites thermiques des insectes (résumées dans Sinclair et al.) 6. Les deux protocoles peuvent être complétés en peu de temps (~2 h chacun), produire des ensembles de données avec de grandes tailles d’échantillon, ne pas sacrifier la répétabilité ou la précision, et minimiser les erreurs d’expérimentateur en éliminant l’enregistrement et la saisie manuelles des données (test CTmin), ou en créant des enregistrements vidéo de sauvegarde de chaque essai (essai de chaleur KD).

Des résultats représentatifs ont été obtenus en comparant les limites thermiques des femelles adultes à partir de certaines lignes de la DGRP24. Les deux essais ont montré des différences significatives dans la tolérance thermique entre les lignes. La taille d’effet entre les lignes dans chacun de ces essais était relativement grande, ce qui a permis une différenciation fiable des groupes avec des comparaisons visuelles et statistiques. La grande différence de KDT entre les deux lignes du DGRP met en évidence un avantage potentiel d’un test statique par rapport à un essai de rampement dynamique; les tests statiques peuvent être mieux en mesure de détecter de plus petites différences entre les groupes que les essais dynamiques9. Les deux lignes DGRP soumises à l’essai KD thermique différaient en KDT moyen de 14,8 min. À titre de référence, à l’aide d’un protocole de rampement dynamique, Rolandi et coll.13 ont montré que la différence des valeursmaximales CT les plus élevées et les plus basses de 34 lignes DGRP n’était que de 1,42 °C, ou 6 min avec une rampe de 0,25 °C/min.

Par rapport à d’autres méthodes, il ya plusieurs avantages à la fois le test de CTmin et la chaleur KD assay décrit ici. Le comptage automatisé dans l’essai ctmin réduit le temps qu’un expérimentateur passe à l’appareil, augmentant ainsi le temps qui peut être consacré à d’autres tâches. Le coût de construction de la colonne acrylique-veste est ~ 50 $, comparativement à l’estimation de 400 $ pour l’achat d’une colonne sur mesure en verre veste. Pour l’essai de chaleur KD, l’enregistrement vidéo élimine le besoin d’observations directes en temps réel et occupe une petite quantité d’espace physique par échantillon. D’autres protocoles, tels que ceux utilisés par Jørgensen etal.9, utilisent un grand aquarium pour observer les individus submergés dans des flacons séparés, mais cette méthode nécessite des enquêteurs bien formés pour vérifier rapidement les flacons pour le mouvement et une grande quantité d’espace pour l’appareil. Rolandi et coll.13 ont utilisé des capteurs infrarouges pour détecter le mouvement ou le manque de mouvement à CTmax dans 96 plaques de puits, tandis que ce test de chaleur KD utilise une webcam peu coûteuse (~70 $) pour détecter le mouvement. Cette caméra peut détecter les mouvements subtils qui pourraient être manqués par un moniteur d’activité infrarouge.

En outre, un ensemble de scripts personnalisables pour estimer rapidement KDT dans le test KD de chaleur ont été développés (Fichier de codage supplémentaire 1-3). Ces scripts peuvent être utilisés pour gagner du temps en obtenant une approximation approximative de la chaleur KDT dans chaque puits avant de regarder la vidéo, et avec une meilleure qualité vidéo ces scripts pourraient potentiellement automatiser l’enregistrement des données. Trois scripts pour traiter la vidéo ont été fournis: FirstFrame.py (Fichier de codage supplémentaire 1), qui définit le premier cadre d’image de la vidéo; WellDefine.py (Fichier de codage supplémentaire 2), qui définit chaque puits individuel de la plaque de puits 96 dans le premier cadre d’image; et MotionDetect.py (Fichier de codage supplémentaire 3), qui transforme le fichier vidéo en un signal d’activité en calculant la variation de la densité des pixels entre les images séquentielles. La seule entrée au programme est le fichier vidéo, et la sortie comprend des statistiques sommaires et un jeu de données de séries horaires d’activité par puits (Figure 6). Les différences de densité de pixels entre les images vidéo sont transformées à l’aide d’un filtre à échelle grise pour réduire les dimensions de l’image, d’un filtre gaussien à faible passage pour réduire le bruit de l’image et d’une opération morphologique de dilatation pour augmenter les bordures des objets en mouvement. Dans ce cas, l’activité est définie comme la différence absolue de valeurs de pixels entre les images séquentielles. La chaleur KDT peut alors être estimée comme l’index du dernier cadre contenant une valeur d’activité supérieure à zéro. Par exemple, le cadre dans lequel l’activité a été enregistrée pour la dernière fois dans le puits g12 d’un ensemble de données d’échantillon (figure 6) était juste après 2 000 s (33,33 min), comme indiqué par une ligne plate. Un observateur peut alors lire la vidéo numérique et trouver rapidement le Heat KDT de bien g12 avec ce horodatage.

Avec des modifications mineures et le dépannage il ya des applications supplémentaires pour les deux essais, plus particulièrement avec la chaleur KD test. La configuration de l’enregistrement vidéo peut être modifiée pour enregistrer les temps de chute à froid statiques, le temps de récupération du coma froid ou les valeurs potentiellement dynamiques de CTmax etCT min. Temps de récupération du coma froid est la quantité de temps qu’il faut à une personne pour reprendre le mouvement après le stress froid29. Par conséquent, le temps de récupération du coma froid pourrait être mesuré avec cette configuration en induisant le coma froid dans la plaque de puits 96, puis en utilisant la configuration vidéo pour enregistrer le temps de récupération dans l’incubateur. Enfin, grâce à un réglage minutieux, le CTmax dynamique ou le CTmin pourraient être enregistrés dans un incubateur de rampes programmable. Une attention particulière à la température à l’intérieur de chacun des 96 puits serait préoccupante, car de légères variations de température dans l’incubateur pourraient être amplifiées entre les puits à mesure que la température change.

Plusieurs considérations doivent être prises en compte lors de l’exécution du ctmin ou de la chaleur KD test. D’abord et avant tout, la qualité, l’âge, le sexe, le stade de la vie, les antécédents génétiques et l’expérience antérieure d’un insecte peuvent influencer les limites thermiques6,13,30,31. Pour les deux essais, les sujets d’essai doivent être motiles. Deuxièmement, un seul groupe peut être évalué à la fois pour chaque appareilct min. Par conséquent, des variables telles que la variation diurne de la tolérance thermique32,33 doivent être prises en considération lors de la comparaison des traitements. Une solution à ce problème est d’effectuer des tests ctmin de multiples conditions de traitement avec plusieurs appareils en même temps. Troisièmement, certaines espèces peuvent ne pas convenir à l’un ou aux deux essais. Par exemple, certaines espèces peuvent ne pas grimper facilement ou voler jusqu’aux perchoirs dans le test de CTmin ou cesser d’activité à des températures élevées avant que leur KDT de chaleur ne soit atteint, ce qui rendrait difficile de discerner un temps de chute. Enfin, pour assurer des comparaisons précises dans l’essai KD thermique, il est essentiel que les critères de KDT (étape 2.2.8) soient cohérents entre les répliques, les observateurs, les essais, etc. Pour accueillir différentes espèces d’insectes, des modifications à l’un ou l’autre des appareils d’essai peuvent être nécessaires. Les modifications potentielles comprennent l’utilisation de différents types de perchoirs pour l’essai ctmin, l’utilisation de plaques de culture cellulaire avec moins de puits et plus d’espace (48, 24, 12 ou 6 puits) au lieu de la plaque de 96 puits pour accueillir les insectes plus grands, ou l’ajustement de la température utilisée pour le test de la chaleur KD pour assurer un temps de renversement qui n’est pas trop rapide ou trop lent.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions Ellie McCabe pour son aide à l’élevage des mouches. Ce travail est soutenu par la subvention 1010996 du National Institute of Food and Agriculture De l’Institut national de l’alimentation et de l’agriculture des États-Unis et la National Science Foundation accorde oia-1826689 à N.M.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) Thermo Scientific; Waltham, MA 153-5401
C922 Pro Stream Webcam Logitech; Newark, CA 960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm Any Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44041
Clear silicone sealant Any Any
Collection tube (15 ml) Any Any
Cordless Drill Any Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM) TriKinetics; Waltham, MA DFM Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software TriKinetics; Waltham, MA Records data input from the DFM
Fly Storage Lid FlySorter; Seatle, WA FS-96LID-5PK Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate FlySorter; Seatle, WA FS-96PLATE-5PK Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray FlySorter; Seatle, WA FS-TRAY-5PK Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel Kimax 28950-75 75mm
Gutter guard Any Any ~0.5 cm diameter openings
Hacksaw Any Any
Heratherm Thermo Scientific incubator Thermo Scientific; Waltham, MA OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 United States Plastic Corp., OH 61135
Hot glue gun and glue Any Any
Light Source Any Any
Magnets Any Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T) OMEGA; Norwalk, CT 5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel Any Any 2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter United States Plastic Corp., OH 62852
Retort ring Any Any 2" diameter
Retort stand Any Any
Retort three-prong clamp Any Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9) TriKinetics; Waltham, MA PSIU9 Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick) Any Any
Tape Any Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1) TriKinetics; Waltham, MA PS9-1 Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement United States Plastic Corp., OH 45737

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References

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Tests à haut débit des limites thermiques critiques chez les insectes
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Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).More

Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).

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