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Biology

昆虫の臨界熱限界のハイスループットアッセイ

doi: 10.3791/61186 Published: June 15, 2020

Summary

熱制限は、急速な気候変動に直面した場合に貴重な情報である生物が許容する環境を予測することができます。ここでは、昆虫の重要な熱ミニマと熱ノックダウン時間を評価するためのハイスループットプロトコルを説明します。両方のプロトコルは、スループットを最大化し、アッセイのコストを最小限に抑えます。

Abstract

動植物の上下の熱制限は、その性能、生存、および地理的分布の重要な予測変数であり、気候変動への応答を予測するために不可欠です。この研究は、昆虫の熱限界を測定するための2つのハイスループットプロトコルを説明します:1つは臨界熱ミニマ(CT)を評価し、もう1つは静的熱ストストレスに応じて熱ノックダウン時間(KDT)を評価するためのものです。CT アッセイでは、個人はアクリルジャケットのカラムに入れられ、温度ランプが低下し、赤外線センサーを使用して止まり木から落ちるとカウントされます。熱KDTアッセイでは、個人は96ウェルプレートに含まれ、ストレスの多い高温温度に設定されたインキュベーターに入れられ、ビデオは直立したままで動かなくなった時間を決定します。これらのプロトコルは、一般的に使用される技術よりも優れた利点を提供します。どちらのアッセイも低コストで、比較的迅速に完了できます(〜2時間)。CT アッセイは実験者の誤差を減らし、多数の個体を一度に測定できる。熱KDTプロトコルは、各アッセイのビデオ記録を生成し、実験者のバイアスとリアルタイムで個人を継続的に監視する必要性を除去します。

Introduction

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昆虫の熱制限
温度を含む環境条件の変動は、生物の性能、フィットネス、生存、および地理的分布に影響を与える主要な要因である 1,,2。上下の熱限界は、生物が許容できる環境の理論的範囲を決定し、したがって、これらの限界は、特に気候変動33、44に直面して、植物および動物の分布の重要な予測値である。したがって、熱限界を正確に測定するためのプロトコルは、生態学者、生理学者、進化生物学者、および保全生物学者にとって重要なツールです。

最も豊富で多様な陸上動物として、昆虫は熱限界の測定に頻繁に使用されます。臨界熱最大(CTmax)および臨界熱小量体(CTmin)は、熱,公差5、6、76における内比および間比比変動を評価するために一般的に使用される5CTmaxおよびCT最小は、成長、生殖出力、および挙動を含む複数の現象タイプについて測定することができるが、それらは最も一般的に、locomotor関数55、6、76,7に適用される。,7,8,9,10,11したがって、CTmax(ヒートノックダウン温度とも呼ばれる)とCT最小は、しばしば、昆虫が運動機能を失い6直立状態を保つことができない高温と低温と定義されるCT分は寒冷昏睡の発症と一致し、寒い温度6によってもたらされる可逆性麻痺である。熱限界での麻痺はしばしば可逆的であるが、これらの温度への継続的な暴露は生態学的死に至る5.

熱制限の測定方法の一般的な方法
様々な装置が熱制限を測定するために使用されてきた(Sinclairらで要約されている)。6.簡単に言えば、昆虫は、インキュベーター12、13、液体浴に沈められた容器,1311、14、15、16、アルミニウム1614,15ブロック,1110、17、またはジャケット付き容器18で加熱または冷却され、移動が停止するまで監視される。10,17アッセイ中の昆虫を監視するために、最も一般的な方法は、個人が記録された,ビデオ6、9、10、11、15、179,10,でリアルタイムまたは遡及的に連続的に監視される直接観察15である17611直接観察方法は、最小限の機器要件を持っていますが、それらは労働集約的であり、スループットを制限します。あるいは、昆虫は、止まり木6、19、20、2119,20から落ちる離6散時に個体を収集することによって間接的に観察することができるか21または活動モニター13を使用する。

熱制限を測定する間接的な方法は、一般的に、直接観察方法よりも高いスループットと潜在的にエラーが発生しにくい方法です。間接監視の最も一般的な方法では、ジャケット温度制御カラム686、8、19、20、2119,20,21を使用します。,昆虫は止まり木のある柱の中に置かれ、内室の温度はカラムのジャケット付きの裏地を通って温度制御された流体浴から流体をポンピングすることによって制御される。熱限界に達した個人は止まり木から落ち、離散的な温度または時間間隔で収集されます。この方法はCTminに適していますが、温度が上昇するとハエが自発的にカラムの底から出て行くので、CTmaxには適していません。ここで説明する新しい方法は、自動測定中にハエを個別に含めることによって、この問題を回避します。

観測方法に加えて、2種類の温度レジームが一般的に、温度制限の上限を評価するために使用されます。動的アッセイは、モータ機能が失われるまで徐々に温度を上昇させることから成ります。温度は動的CTの最高77、8、9、138,9,13である。これに対して、静的アッセイは、モータ機能が失われるまで一定のストレス温度で構成されています。その時点は熱ノックダウン時間(熱KDT)であり、ヨルゲンセンら,,,77、8、9、16、22による最近の論文では静的CTマックス(sCTmax)とも呼ばれる。,891622CTの最大および熱ノックダウンアッセイ(熱KDアッセイ)は、異なる単位を持つメトリックを生成するが、2つの形質の数学的モデルは、それらが熱耐性に関する同等の情報を与え、両方とも生態学的に関連する8、99であることを示す。8動的アッセイは、環境条件と比較できる温度を生み出し、熱ニッチが大きく異なる種間の比較など、熱耐性に大きな違いがある場合に好ましい。しかしながら、熱損傷蓄積のためのQ10が高いため、熱耐性9の特異性変化などの小さな効果サイズを検出するために静的アッセイが好ましい場合がある。また、実際には、静的なアッセイは、動的なアッセイよりも洗練された装置を必要としません。

目的
本論文の目的は、今後の研究で使用できるCT および熱KDアッセイの方法を形式化し、運動性昆虫の熱限界を評価することです。プロトコルは、以前に確立された方法論から適応され、高スループット、自動化、およびコスト効率が高いように設計されています。どちらのアッセイも短時間(〜2時間)で完了することができ、反復性や精度を犠牲にすることなく、1日に複数の実験を行い、大量のデータを生成することができます。この設定により、96ハエの熱耐熱度を同時に測定することができ、CT最小 のカラムは、止まり木に十分な表面積があれば、100以上のハエを保持することができます。

CT を観察するためのハイスループット方法は、ハエを自動的にカウントするために赤外線センサーを追加して、共通のジャケットカラム方法論を変更します。計数用赤外線センサの使用は、1996年23 年にShumanらの最初の提案であったが、広く採用されていない。赤外線センサーの追加は、離散間隔でデータを収集するのではなく、連続的なデータを生成することができます。このプロトコルは、手動でのデータ入力を排除し、離散した時点でジャッキ列の下のコレクションチューブを手動で切り替える必要をなくすことで、実験者のエラーを最小限に抑えます。

熱KDTを記録するためのハイスループット方法は、昆虫10,12,12における熱耐性の2つの以前の研究から改変される。個々のハエは温度制御されたインキュベーターの96の井戸の版で貯られ、ビデオは記録される。このプロトコルは、実験を再生して確認できるため、熱KDTを決定する際の実験者のバイアスを最小限に抑えます。このプロトコルは、ビデオ分析を高速化するために使用できるカスタム Python スクリプトのセットも提供します。個々のウェルの使用は、他の個人が移動または転倒したときに発生する可能性のある干渉を排除し、これは、個体群が同じアリーナ10、17,17で観察されたときに問題になる可能性がある。さらに、温度制御インキュベーターは、温度制御されたアルミニウムブロック10にわたって時々観察される温度勾配とは異なり、96のウェル全体にわたって安定した温度を提供する。また、96ウェル記録方式は、動的CTマックスおよびCT最小の測定に適応することができることに注意してください(議論参照)。

各プロトコルを実証するために、ショウジョウバエメラノガスターの一部のラインから成体ショウジョウバエメラノガスターメスの熱限界を遺伝学的参照パネル(DGRP)と比較し、24を比較した。予備的な実験は熱耐性の有意な差を示したので、これらのラインが選択されました。これらのアッセイは、熱耐性の違いを識別するための堅牢な方法であることが判明した。以下の2つのプロトコルは、ハイスループットCT分アッセイ(セクション1)および高スループット熱KDアッセイ(セクション2)、成人よ性ショウジョウバエなどの装置に収まり得る任意のモチル昆虫寿命段階に対してCTおよび加熱KDTデータを生成するために必要な行動を記述する。CTの場合は、昆虫が止まり木にできることも不可欠です。ここでは、各アッセイが成人ショウジョウバエメラノガスターで実証されています。しかし、他の分類またはライフステージ6に変更が必要な場合があります。小さな変更には、CTアッセイでより大きな標本を収容するために大きな開口部を持つ止まり材を使用するか、より高品質のカメラを使用して、ゆっくりと動く昆虫の微妙なKDTまたは熱KDアッセイのライフステージを識別することが含まれる場合があります。このプロトコルでは、ハエを準備する方法は記述されていませんが、反復性25を確保するために、飼育プロトコルを標準化することが重要です (ガルシアとティーツ26とティーツと Hahn27を参照)。提供されるプロトコルには、装置の構築とセットアップ方法、測定を記録する方法、およびデータ分析の簡単な説明が含まれます。

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Protocol

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1. ハイスループットCT アッセイ

  1. ジャケット付きカラムを組み立てる(図1A、図2)
    1. 最も広い(7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm)と最も狭い(5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm)のアクリルチューブをハックソーで等しい長さ(31.5 cm)に切ります(図2A)。これらの2つのチューブは、ジャケット柱の外側と最も内側の壁になります。
    2. 中型(6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm)のアクリルチューブから2つのリング(幅2cm)をハックソーでカットします(図2A)。これら2つのリングは、内側と外側のチューブの間のスペーサーになり、流体が流れる2つの長いアクリルチューブの間にスペースを作成します。
    3. 慎重に外側(最も広い)アクリルチューブに2つの穴を開け、上部に1つの穴と下部に1つを開きます。各穴がチューブの端から3.5cmであることを確認します。チューブの反対側の穴を開けます(図2B)。
    4. クラッキングを減らすには、将来の穴のスポットの上にチューブにテープを置き、ドリルの最も低いトルク設定で非常にゆっくりとドリルします。
    5. スレッディングタップを使用して、ホースアダプタを外側のチューブの2つの穴にねじ込むことができるように、両方の穴をねじ込みます。割れを減らすには、潤滑剤を使用し、手でゆっくりと糸を通します。
    6. 2人のスペーサーを内側のジャケットの上にスライドさせ、両端(下と上)に1つずつ置きます。スペーサーとインナージャケットの端の間に小さなスペース(0.5 cm)を残します(図2B)。
    7. アクリルセメントを使用してスペーサーを所定の位置に溶接します。
    8. 内側のチューブとスペーサーセットのセメントの後、穴が開いている大きな外側のチューブにこのコンストラクトをスライドさせます。外側と内側のチューブが両端にフラッシュされていることを確認します。スペーサーは、列の両端に小さな溝を形成し、端から0.5センチメートルになります(図2C)。
    9. アクリルセメントを使用して外管をスペーサーに溶接し、調整可能なスチールクランプを使用して装置を一緒に保持します。セメントがセットされるのを待ちます。
    10. ホースアダプタを外管の穴に通し、スペーサーとインナーチューブに固定します。
      メモ:アダプタは外側のチューブに入れ、内側と外側のチューブの間の空きスペースには入りません。ホースアダプタが長すぎている場合は、ハックソーで適切な長さに短くします。
    11. ホースアダプタをシリコンシーラントで外側のチューブの糸に密封します。
    12. ジャケットカラムの両端にある内側と外側のチューブの間の2つの溝をシリコーンシーラントで満たします。
    13. 柱をテストするには、直径0.6cmのチューブをホースアダプタに取り付けます。列の下部にあるアダプターをチューブ付きの水源に接続し、列の上部にあるアダプターを別のチューブを使用したドレインに接続します。
    14. 装置を下から上に通して水を流し、漏れを確認します。漏れがある場合は、どこから来ているかを特定し、シリコーンで密封します。
  2. ジャケットカラムと ショウジョウバエ ファネルモニター(DFM)の設定
    1. ジャケット付きの柱を3本のレトルトクランプでレトルトスタンドに固定します。柱を垂直に、一方の端を天井に開き、もう一方の端をラボベンチに開いて配置します(図 1B)。
    2. 温度制御された冷蔵浴からの流体の入出力を、直径0.6cmのプラスチックチューブを備えたカラムのアダプタノズルに接続します(図1B)。流体入力を列の下部のノズルに接続し、流体出力を列の上部のノズルに接続します。
    3. 2つの3 cm厚い円形の泡の断熱プラグ(列の最も内側の区画の開口部と同じ円周)を切る。プラグがぴったりとフィットし、両端に挿入されたときに最も内側の列を密封します(図1B)。
    4. プラグの1つの中央に穴を開け、熱電対の裸の端を約5cmの穴に通し、テープで固定します。熱電対のもう一方の端を熱電対データロガーに差し込みます。
    5. 熱電対データロガーをコンピュータに接続します。
    6. ●2枚のプラスチック側溝ガード(5cm x 7 cm、直径0.5cmの開口部)をコラム内にくさび込み、止まり材として機能させます。1 つのガードを列の上から 2/3rds、もう 1 つのガードを列の上から 1/3rd に配置します (図 1B)。
    7. 底部プラグ(熱電対なし)とトッププラグ(熱電対付き)を固定します。プラグをコラムの上部に挿入する場合は、熱電対がカラムの側面に触れないようにしてください。
    8. レトルトスタンドの柱の高さを調整し、列の下部とベンチトップの間に25cmの距離を置きます。
    9. レトルトリング(直径5cm)をカラムの底下5cm下にレトルトスタンドに固定し、リングを柱の側面に回転させます。
    10. DFM をレトルトリングに直接設定します(図 1B)。すべての電子部品(電源、電源インターフェイス、および製造元のプロトコルに従ったコンピュータ)を接続します。
    11. コンポーネントが接続されたら、製造元のプロトコルに従って、DFM および DFM ソフトウェアのセットアップを完了します。
  3. Ct 試験
    1. 流体浴の入力バルブと出力バルブを開いた位置に回します。
    2. 電源ボタンを押して温度調節された流体浴をオンにし、再生ボタンを押して、お風呂の温度を25°Cに上げて維持するプログラムを実行します。 流動浴と柱を5~10分与え、25°Cに達して維持します。
    3. コラムの上部にあるプラグを取り外し、じょうごに交換します(直径5.08cm、図1CCを参照)。
    4. 彼らの食べ物のバイアルから列にハエをタップします。
    5. 漏斗を取り外し、すぐにトッププラグで交換し、ハエが逃げないように注意してください。ハエに5分を与えて落ち着き、時折下のプラグをタップしてハエを登るようにします。
    6. 流体浴の開始ボタンを押し、CT ランピングプログラム(25°Cは5分、0.5°C/分で25°C〜10°C、2分間は10°C、0.25°C/分で10°C~-10°C)を開始します。
      注:このCTの最小 ランピングプロトコルの他のバリエーションは、研究の質問に応じて使用することができます(例えば、CT28に対する異なるランピング率の影響の比較)。
    7. コンピュータで熱電対記録ソフトウェアを開き、 記録 アイコンをクリックして、アッセイの間、1秒ごとにカラム内の温度の記録を開始します。各温度記録に 2 番目のタイム スタンプが含まれていることを確認し、後で温度データを DFM のデータとマージできるようにします。
    8. 90%エタノール5 mLを15 mLの円錐形遠心分離管に加え、カラムの下のラックに入れる。
    9. 時折、柱の下部プラグをタップして、下のハエを誘惑して登ります。ほとんどのハエは止まり木か15 °Cによってコラムの上部の近くになります。
    10. 15°Cで底栓を取り外し、エタノールの底栓に残ったハエを集めます。カウントと注意してくださいこれらのハエは15 °Cで収集したが、そのCT は不明です。
      注: 底栓を取り外す温度は、検定の前に、試験種または治療の予測されたCT に基づいて決定されるべきです。このアッセイでは、予備アッセイで見つかったこれらの特定のDGRPラインのCT に基づいて15°Cが選択されました。
    11. 75 mm の外径ガラス漏斗をDFMに入れます。レトルト リング、DFM、および漏斗を、カラムの下に表示するように調整します。漏斗のリップが柱の底を完全に密封していることを確認してください(図1D)。
    12. 漏斗の底部を15 mLコレクションチューブに挿入します(1D)。
    13. ソフトウェアアイコンをクリックして、コンピュータ上のDFM ソフトウェア を開きます。ソフトウェアはすぐにハエが彼らのCT分に達する時刻/日付の記録を開始します。彼らのCTミンに達するハエ 神経筋機能を失い、止まり木から落ち、その後DFMを介して落ちる。
    14. 温度が下がるにつれて、すべてのハエがCT に達しているかどうかを監視し、上部プラグと止まり木をチェックして、ハエがまだ止まっているかどうかを確認します(すなわち、神経筋機能を維持しています)。すべてのハエがCT分に達すると裁判は終了します
    15. トライアルの最後に、DFMを調整し、カラムの開口部から離します。一部のハエはCT に達する可能性がありますが、柱に立ち往生したままです(止まり木にくさびを打ったり、単一の歯皮フックでぶら下がったりします)。上部プラグを開き、これらのハエを取り外します。これらのハエのCT は不明です。
    16. RStudio の Merge コマンドを使用して、熱電対記録ソフトウェア (温度、日付、時刻など) と DFM ソフトウェア (漏斗を通過するハエの数、日付、時刻) の .txt 出力ファイルを組み合わせます。共有日付/時刻変数に基づいて 2 つのファイルをマージします。

2. ハイスループット熱KDアッセイ

  1. 装置の組立と準備
    1. 接着剤で、鋼製の織り金網(約1.5mm開口)を96ウェル無底板の底部に固定します。
    2. 熱い接着剤銃と熱い接着剤で96ウェル底板の底の反対側に磁石を取り付けます(図3)。
    3. 96ウェルプレート用に設計された粘着フィルム付きのカスタム中隔蓋を作るために、2つのフィルムを粘着性の側面を貼り付けて、隆起したプラスチックシートを形成します。
    4. プラスチックシートを96ウェルプレートの上に置き、テープを使用してプレートの4つの側面すべてに貼付します。プレート上の各ウェルの開口部に、ボックスカッター(すなわち、合計xの96)でプラスチックシートに「x」をカットします。
    5. CO2 でハエを麻酔し、吸引器と中隔蓋で修正された96ウェル底板の各ウェルに個別にロードします。ハエがCO2 で麻酔されている間に96ウェルプレートから中隔蓋を取り除き、しっかりとしたクリア蓋に置き換えます。
    6. ハエを積んだ96の井戸なし底プレートを置き、食べ物に明確なタイトフィット蓋を付けます。ハエがCO2 麻酔とアッセイの開始までの間に少なくとも48時間を持っていることを確認してください(ステップ2.2.1-2.2.5)。
      注:修正された96ウェルノーボトムプレートの底部はメッシュで作られているので、CO2 で麻酔をかけたハエは、試験が始まる前に少なくとも48時間食品に積み込まれ、残すことができます。1cmの深層の食品を収容するために深さ2cm以上のプラスチック容器>8.5cm幅x13cmの長さも使用できます。
    7. ウェブカメラを温度制御インキュベーターの内側の底にテープで固定します。カメラを上に向けます(図4)。カメラの上約10cmのインキュベーター棚を固定します。
      注:ウェブカメラは、下から96ウェルプレートをポイントして記録し、井戸表面の多くが可能な限り視界に入っていることを確認します(例えば、プレートのウェルウォールによって視界からブロックされません)。ハエがKDTに達すると、彼らは井戸の底に落ちる。この場合、ウェブカメラに最も近い側は、したがって、彼らの井戸がビューの中心からどのくらい離れているかに関係なくビューです。
    8. Web カメラをコンピューターに接続します。
    9. テープで、白い用紙(8.5 cm x 13 cm、96ウェルプレートの底部の正確な部分)を棚の底面に取り付けます(図4)。Web カメラで見たとき、用紙がフレーム全体に表示されるようにします。
    10. インキュベーターに光源を置きます。紙や他の材料を使用して、照明を湿らして、まぶしさを最小限に抑えます。
      注: ステップ 2.1.10 は、照明と反射がインキュベーターによって異なるため、各インキュベーターに固有です。目標は、各井戸のハエと、ウェブカメラで見たときにプレートの後ろの白い紙との間に良好なコントラストを提供するために、インキュベーターに十分な照明を持つ必要があります。
  2. 熱KDアッセイを実行する
    1. インキュベーターを37.5°Cに設定し、約30分待って、インキュベーターが所望の温度に達し、維持する時間を与えます。正確な温度は、評価される昆虫およびその他の時間の考慮事項に依存します。
    2. 96ウェルプレートをインキュベーターに反転し、プレートの底部(メッシュ側)がトレイの底面の白紙に対して置きます(図4)。トレイとウェブカメラのフレームのウェル(列と行の名前)の向きをメモします。96 ウェルプレートの側面に沿って色付きテープ、白い紙の端が向きを確認できます(図4)。
      注: 熱 KD アッセイの試験試験中に熱電対でプレート内部の温度を記録することにより、インキュベーター温度が 96 ウェル プレート内の温度と一致していることを確認します。また、熱KDアッセイを行う前に、複数の熱電対を有する96ウェルプレートのウェル間の温度にごくわずかな変動があることを確認することも賢明です。
    3. インキュベーターのドアを閉めます。
    4. ビデオ 録画 ソフトウェアで[録画]をクリックします。
    5. 2時間後、すべてのハエが最後の休息場所に到達し、動きを停止したことを確認するために記録をチェックしてください。すべてのハエが動かなくなったら、ビデオ録画ソフトウェアの [停止 ]をクリックします。ここで試験した遺伝子型は、25°Cで飼育され、ほとんどのハエは37.5 °Cで60分までにKDTに到達する(ヨルゲンセンら9を参照)。
    6. ハエを処分する。
    7. カスタム Python スクリプト (補足コーディング ファイル 1-3) を使用して、ハエが熱 KDT に達したときのビデオの時間を概算します。
      注: ステップ 2.2.7 はオプションです。ビデオ分析を高速化するために、カスタム Python スクリプトのセットが開発され、各ウェルの時間の経過に伴うピクセル密度の変化を測定します ( 補足コーディング ファイルを参照)。ハエが動かなくなると、ピクセル密度は一定であり、これらのデータのプロットを使用して、ハエが倒されたときにビデオのおおよその時間を見つけることができます。このスクリプトを使用してデータ解析を自動化することは可能ですが、現在ビデオにわずかな欠陥があると、ピクセル密度の変化と実際のKD時間の間にわずかな不一致が生じます。
    8. ビデオファイルを開き、各井戸の各フライのKDTを記録をクリックします。試験と観察者の間の熱KDTの最も一貫した尺度は、ハエが最終的な休息場所に到達する時間を記録しています。
    9. ビデオを逆に追跡し、単一の井戸に焦点を当て、フライが最初に最後の休息場所から移動する時間に注目してください。各ウェルに対してこのプロセスを繰り返します。

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Representative Results

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ショウジョウバエメラノガスター遺伝参照パネル(DGRP)からの女性の熱限界(すなわちCTおよび熱KDT)を測定し、2つのプロトコルから生成される高スループットデータを実証した。CTは、DGRP線714(n=37)および913(n=45)を用いてアッセイした。熱KDTをアッセイし、DGRP行189(n=42)および461(n=42)と比較し、ビデオファイルを手動で解析した。ビデオの視聴を含む実験の合計時間は、各プロトコルに対して<2時間かかりました。

DGRPライン913のメスは、DGRPライン714の女性よりも平均CT 温度が有意に低かった(図5A;ウィルコクソンランク合計テスト、W = 1585、P <0.001)。2本の線はCTの明確に異なる分布を有していた:913号線は5.00±1.35°C(平均±SD)のCT を有し、714行目は9.60±1.53°CのCT を有していた。

37.5 °Cの熱KDTは、DGRPライン73と461の女性間で有意に異なっていました(図5B;ウィルコクソンランク合計テスト、W = 1658.5、P <0.001)。両線のKDTにはばらつきがあったが、ライン間の熱KDTの差が容易に検出された。ライン73は、ライン461よりも14.8分長い平均KDTを持っていました(ライン73平均KDT、55.58±6.92分;ライン461はKDT、40.78±6.64分を意味します)。

Figure 1
図1:CT アッセイ用のジャケットカラムの設定 (A) 組み立てられたジャケットコラム。(B)内側の部屋を密封する上部および底部のプラグが付いたジャケットコラム。熱電対は上部プラグの穴を通して通される。DFM はカラムの下のレトルト リングに取り付けられ、側面に移動します。(C)CT アッセイの開始。上部プラグを取り外し、カラムの上部開口部に漏斗を介してハエを内部チャンバーに注いだ。(D) CT アッセイ中のジャケットカラムと DFM。下部プラグはカラムから取り外され、DFMと漏斗はカラムの下に配置されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ジャケットコラムのテクニカルイラスト。(A)アクリルチューブの各部分は長さにカット:i)2つのスペーサーリングは、長さが3.5センチメートルにカット(ステップ1.1.2):ii。31.5 cmにカットされた最も広いアクリルチューブ(ステップ1.1.1);そしてiii最も狭いアクリルチューブは31.5 cmにカット(ステップ1.1.1)。(B)2つの穴(灰色)は、アクリルチューブの最も広い部分に掘削され、両端から3.5cm、反対側に(i; ステップ1.1.2)。2つのスペーサーリング(ii;ステップ1.1.6と1.1.7)とアクリルチューブの最も狭い部分のアセンブリ。(C) ステップ 1.1.8~1.1.1.12 以降の完成したジャケット列。ホースアダプタはグレーで示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:96ウェルなし底板の下(左)と上(右)の図。 鋼鉄織られた網は修正された96ウェルの底の版の底に付す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:熱KDアッセイ用インキュベーターのセットアップ。 (A) ウェブカメラとステージが遠くに設置されている。(B) 試用が始まる前に、インキュベーターでウェブカメラとステージのセットアップ。ウェブカメラはインキュベーターの床に固定され、トレイはウェブカメラの上に〜10cmです。(C)熱KDアッセイ中にウェブカメラの上の白いステージ上の96ウェルプレートの向き。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:ショ ウジョウバエ 遺伝基準パネル(DGRP)からの選択ラインの下側および上層の熱限界。 (A) 2 つの DGRP ラインの CT最小値(B)37.5 °Cの2つのDGRPラインの熱KDT この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 6: テスト データセットのビデオ解析スクリプトからのアクティビティ出力 各プロットは、96ウェルプレートの1つのウェルからの活動データを表します。合計84サンプルが試験され、示されている。さて、IDは各ヒストグラムの右側にラベルが付いています。 この図を見るには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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上記の2つの方法は、温度制限の上限と下限に関する生態学的に関連する指標のハイスループットデータを生成します。これらのプロトコルは、昆虫の熱限界に関する研究に共通する以前に確立された方法論に基づいて構築される(Sinclairらにまとめた)。6.両方のプロトコルは、短時間(〜2時間)で完了し、大きなサンプルサイズのデータセットを生成し、再現性や精度を犠牲にせず、手動データ記録と入力(CT アッセイ)を排除するか、または各アッセイのバックアップビデオ録画(ヒートKDアッセイ)を作成することによって、実験者の誤差を最小限に抑えることができます。

代表結果は、DGRP24の選択ラインから成体女性の熱限界を比較することによって生成された。どちらのアッセイも、ライン間の熱耐熱性に有意な差を示した。これらのアッセイの各線間の効果サイズは比較的大きく、視覚的および統計的比較を用いたグループの信頼できる分化が可能であった。2つのDGRPライン間のKDTの大きな違いは、動的なランピングアッセイに対する静的アッセイの潜在的な利点を強調しています。静的アッセイは、動的アッセイ9よりもグループ間の小さな違いを検出できる可能性があります。熱KDアッセイに供した2つのDGRPラインは平均KDTが14.8分異なった。参照上、動的なランピングプロトコルを用いて、Rolandi etal. 13 は、34のDGRPラインの最高CT最大値と最低CT最大 値の差がわずか1.42°C、または0.25°C/分ランプで<6分であることを示した。

他の方法に対して、CT アッセイと熱KDアッセイの両方に、ここに記載の利点が幾つかある。CTmin アッセイでの自動カウントは、実験者が装置に費やす時間を短縮し、他のタスクに費やすことができる時間を増やします。アクリルジャケットのコラムを構築するためのコストは、カスタムメイドのガラスジャケットの列を購入するために推定$400と比較して、〜$50です。熱KDアッセイの場合、ビデオ録画はリアルタイムで直接観察する必要がなくなり、サンプル当たりの物理的なスペースを少量占有します。ヨルゲンセンら9で使用されるような他のプロトコルは、別々のバイアルに沈んだ個人を見るために大きな水族館を使用しますが、この方法では、バイアルの動きと装置のための大量のスペースをすばやくチェックする十分な訓練を受けた調査官が必要です。Rolandiら13 は赤外線センサーを使用して96のウェルプレートのCTMax で動きや動きの欠如を検出し、この熱KDアッセイは動きを検出するために安価なウェブカメラ(〜$70)を使用します。このカメラは赤外線アクティビティモニタで見逃されるかもしれない微妙な動きを検出できます。

さらに、熱KDアッセイでKDTを迅速に推定するためのカスタマイズ可能なスクリプトのセットが開発されました (補足コーディングファイル1-3)。これらのスクリプトは、ビデオを見る前に各井戸の熱KDTの大まかな近似を得ることによって時間を節約するために使用することができ、より高いビデオ品質では、これらのスクリプトは潜在的にデータ記録を自動化することができます。ビデオを処理する3つのスクリプトが提供されています: FirstFrame.py (補足コーディングファイル 1) ビデオの最初の画像フレームを定義します。WellDefine.py (補足符号化ファイル 2)、最初の画像フレームの 96 ウェルプレートの個々のウェルを定義します。MotionDetect.py (補足コーディング ファイル 3) を指定すると、連続フレーム間のピクセル密度の変化を計算して、ビデオ ファイルをアクティビティ信号に変換します。プログラムへの唯一の入力はビデオファイルであり、出力には、概要統計量と井戸ごとのアクティビティの時系列データセットが含まれています(図6)。ビデオフレーム間のピクセル密度の違いは、画像の寸法を減らすためのグレースケールフィルタ、画像ノイズを低減するためのガウスローパスフィルタ、および移動オブジェクトの境界を増やすために拡張形態学的操作を使用して変換されます。この場合、アクティビティは、連続するフレーム間のピクセル値の絶対差として定義されます。熱 KDT は、ゼロより大きいアクティビティ値を含む最後のフレームのインデックスとして推定できます。たとえば、サンプル データセットの well g12 でアクティビティが最後に記録されたフレーム (図 6) は、フラット ラインで示されているように、2,000 s (33.33 分) の直後でした。オブザーバーは、デジタルビデオを再生し、すぐにこのタイムスタンプとwell g12のヒートKDTを見つけることができます。

わずかな変更とトラブルシューティングを行う場合、熱KDアッセイを用いて、両方のアッセイに追加のアプリケーションがあります。ビデオ録画の設定は、静的なコールドノックダウン時間、昏睡状態の回復時間の冷却、または潜在的に動的なCTの最大値 とCT最小値 を記録するように変更することができます。チル昏睡回復時間は、個人が冷感ストレス29の後に動きを再開するのにかかる時間の量である。したがって、チル昏睡回復時間は、96ウェルプレートにチル昏睡を誘導し、ビデオセットアップを使用してインキュベーター内の回復時間を記録することによって、このセットアップで測定することができます。最後に、慎重な微調整により、動的CT最大 またはCT分を プログラム可能なランピングインキュベーターに記録することができます。インキュベーターの温度のわずかな変動は、温度変化に伴ってウェル間で拡大することができるので、96の井戸の内部の温度に注意が懸念されます。

CTminまたは熱 KD アッセイを実行する場合は、いくつかの考慮事項を考慮する必要があります。まず第一に、昆虫の品質、年齢、性別、ライフステージ、遺伝的背景、および以前の経験は、熱限界66、13、30、3113,30,31に影響を与えることができます。どちらのアッセイでも、被験者は運動性でなければならない。第2に、各CT最小装置について一度に1つのグループのみをアッセイすることができる。したがって、熱許容度32,33,33の日当り等の変数は、治療を比較する際に考慮する必要がある。この問題の1つの解決策は、複数の装置を同時に複数の治療条件のCTアッセイを実施することである。第3に、一部の種は、一方または両方のアッセイに適していない場合がある。例えば、一部の種は、CTのアッセイで止まり木に容易に登ったり飛んだりしたり、熱KDTに達する前に高温で活動を停止したりして、ノックダウン時間を見分けにくくなる可能性があります。最後に、熱KDアッセイの正確な比較を確実にするために、KDT(ステップ2.2.8)の基準が複製、オブザーバー、試験の間で一貫していることが重要です。異なる昆虫種に対応するために、いずれかの試験装置への変更が必要となる場合がある。潜在的な変更には、CTアッセイに異なるタイプの止まり木を使用すること、より大きな昆虫を収容するために96ウェルプレートの代わりに、より少ない井戸とより多くのスペース(48、24、12、または6ウェル)を持つ細胞培養プレートを使用するか、熱KDアッセイに使用される温度を調整して、あまりにも速くまたは遅すぎるノックダウン時間を確保することが含まれます。

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Disclosures

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgments

エリー・マッケイブのフライ飼育に対する支援に感謝します。この研究は、米国農務省食品農業ハッチプロジェクト助成金1010996と国立科学財団がOIA-1826689をN.M.T.に付与することによって支援されています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) Thermo Scientific; Waltham, MA 153-5401
C922 Pro Stream Webcam Logitech; Newark, CA 960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm Any Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44041
Clear silicone sealant Any Any
Collection tube (15 ml) Any Any
Cordless Drill Any Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM) TriKinetics; Waltham, MA DFM Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software TriKinetics; Waltham, MA Records data input from the DFM
Fly Storage Lid FlySorter; Seatle, WA FS-96LID-5PK Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate FlySorter; Seatle, WA FS-96PLATE-5PK Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray FlySorter; Seatle, WA FS-TRAY-5PK Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel Kimax 28950-75 75mm
Gutter guard Any Any ~0.5 cm diameter openings
Hacksaw Any Any
Heratherm Thermo Scientific incubator Thermo Scientific; Waltham, MA OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 United States Plastic Corp., OH 61135
Hot glue gun and glue Any Any
Light Source Any Any
Magnets Any Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T) OMEGA; Norwalk, CT 5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel Any Any 2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter United States Plastic Corp., OH 62852
Retort ring Any Any 2" diameter
Retort stand Any Any
Retort three-prong clamp Any Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9) TriKinetics; Waltham, MA PSIU9 Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick) Any Any
Tape Any Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1) TriKinetics; Waltham, MA PS9-1 Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement United States Plastic Corp., OH 45737

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References

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昆虫の臨界熱限界のハイスループットアッセイ
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Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).More

Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).

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