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Biology

Ensaios de alta taxa de limite térmico em insetos

doi: 10.3791/61186 Published: June 15, 2020

Summary

Os limites térmicos podem prever os ambientes que os organismos toleram, que são informações valiosas diante das rápidas mudanças climáticas. Descritos aqui estão protocolos de alta produtividade para avaliar minima térmico crítico e tempo de knockdown de calor em insetos. Ambos os protocolos maximizam o rendimento e minimizam o custo dos ensaios.

Abstract

Limites térmicos superiores e inferiores de plantas e animais são importantes preditores de seu desempenho, sobrevivência e distribuições geográficas, e são essenciais para prever respostas às mudanças climáticas. Este trabalho descreve dois protocolos de alta produtividade para medir limites térmicos de insetos: um para avaliar minima térmica crítica (CTmin),e outro para avaliar o tempo de queda de calor (KDT) em resposta a um estressor de calor estático. No ensaiomin ct, os indivíduos são colocados em uma coluna com jaqueta acrílica, submetidos a uma rampa de temperatura decrescente, e contados à medida que caem de suas poltronas usando um sensor infravermelho. No ensaio de calor KDT, os indivíduos estão contidos em uma placa de 96 poços, colocados em uma incubadora definida a uma temperatura estressante, quente e vídeo gravado para determinar o tempo em que eles não podem mais permanecer eretos e se mover. Esses protocolos oferecem vantagens em relação às técnicas comumente utilizadas. Ambos os ensaios são de baixo custo e podem ser concluídos relativamente rapidamente (~2 h). O ensaiomin ct reduz o erro do experimentador e pode medir um grande número de indivíduos ao mesmo tempo. O protocolo de calor KDT gera um registro de vídeo de cada ensaio e, portanto, remove o viés do experimentador e a necessidade de monitorar continuamente os indivíduos em tempo real.

Introduction

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Limites térmicos de insetos
A variação das condições ambientais, incluindo a temperatura, é um fator importante que influencia o desempenho, a aptidão, a sobrevivência e a distribuição geográfica dos organismos1,,2. Limites térmicos superiores e inferiores determinam a gama teórica de ambientes que um organismo pode tolerar e, portanto, esses limites são importantes preditores de distribuições vegetais e animais, especialmente diante das mudanças climáticas3,,4. Assim, os protocolos para medir com precisão os limites térmicos são importantes ferramentas para ecologistas, fisiologistas, biólogos evolucionários e biólogos de conservação, entre outros.

Como os animais terrestres mais abundantes e diversos, os insetos são frequentemente usados para medições de limites térmicos. Máxima térmica crítica (CTmax) e minima térmica crítica (CTmin) são comumente utilizadas para avaliar a variação intra e interespecífica na tolerância térmica5,,6,7. Enquanto a tomografiamáxima e aTC min podem ser medidas para fenótipos múltiplos, incluindo crescimento, produção reprodutiva e comportamento, eles são mais comumente aplicados à função locomotor5,,6,,7. Assim, a tomografiamáxima (também chamada de temperatura de knockdown de calor) e CTmin são muitas vezes definidas como as altas e baixas temperaturas em que os insetos perdem a função motora e são incapazes de permanecer em pé5,6,,7,,8,9,,10,11. Ctmin coincide com o início do coma frio, uma paralisia reversível provocada pelas temperaturas frias6. Embora a paralisia nos limites térmicos seja muitas vezes reversível, a exposição contínua a essas temperaturas leva à morte ecológica5.

Métodos comuns para medir limites térmicos
Uma variedade de aparelhos têm sido usados para medir limites térmicos (resumidos em Sinclair et al.) 6. Brevemente, os insetos são aquecidos ou resfriados em incubadoras12,13, recipientes submersos em banhos fluidos11,,14,15,,16, blocos dealumínio 10,,17ou recipientes cobertos18, e monitorados até que a locomoção cesse. Para monitorar insetos durante o ensaio, o método mais comum é a observação direta, na qual os indivíduos são continuamente monitorados em tempo real ou retrospectivamente com vídeo gravado6,,9,10,,11,,15,,17. Embora os métodos de observação direta tenham requisitos mínimos de equipamento, eles são intensivos em mão-de-obra e limitam o rendimento. Alternativamente, os insetos podem ser observados indiretamente coletando indivíduos em horários discretos à medida que caem dos poleiros6,,19,,20,,21 ou utilizando monitores de atividade13.

Os métodos indiretos para medir limites térmicos são geralmente mais elevados e potencialmente menos propensos a erros do que os métodos de observação direta. O método mais comum para monitoramento indireto utiliza uma coluna controlada pela temperatura6,,8,,19,20,21. Os insetos são colocados dentro de uma coluna com poltronas, e a temperatura da câmara interna é controlada pelo bombeamento do fluido de um banho de fluido controlado pela temperatura através do revestimento revestido da coluna. Indivíduos que atingem seu limite térmico caem de seu poleiro e são coletados a temperaturas discretas ou intervalos de tempo. Embora este método funcione bem para ctmin, foi encontrado inadequado para ctmax, porque moscas voluntariamente saem da parte inferior da coluna quando a temperatura aumenta. O novo método descrito aqui contorna esse problema contendo individualmente moscas durante medições automatizadas.

Além do método de observação, dois tipos de regimes de temperatura são comumente utilizados para avaliar limites térmicos superiores. Os ensaios dinâmicos consistem em aumentar gradualmente a temperatura até que a função motora seja perdida; que a temperatura é a ct dinâmicamáx7,,8,9,13. Em contraste, os ensaios estáticos consistem em uma temperatura estressante constante até que a função motora seja perdida; esse ponto de tempo é o tempo de knockdown de calor (calor KDT), também chamado de CT estáticomax (sCTmax) em um artigo recente por Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Embora os ensaiosde nocaute de TC max e heat knockdown (ensaios de KD de calor) produzam métricas com diferentes unidades, a modelagem matemática dos dois traços indica que eles dão informações comparáveis sobre tolerância ao calor e são ambos ecologicamente relevantes8,,9. Ensaios dinâmicos produzem uma temperatura que pode ser comparada às condições ambientais, e são preferíveis quando há grandes diferenças na tolerância ao calor, como comparações entre espécies com nichos térmicos amplamente diferentes. No entanto, devido ao alto Q10 para acúmulo de lesões térmicas, um ensaio estático pode ser preferível para detectar tamanhos de pequenos efeitos, como variação intraespecífica na tolerância ao calor9. Além disso, praticamente falando, um ensaio estático requer equipamentos menos sofisticados do que um ensaio dinâmico.

Objetivo
O objetivo deste artigo é formalizar métodos para ensaios de DCmin e heat KD que podem ser utilizados em pesquisas futuras para avaliar os limites térmicos dos insetos motile. Os protocolos são adaptados de metodologias previamente estabelecidas e são projetados para serem de alto rendimento, automatizados e econômicos. Ambos os ensaios podem ser concluídos em um curto espaço de tempo (~2 h), o que significa que vários experimentos podem ser realizados em um único dia, produzindo grandes quantidades de dados sem sacrificar a repetibilidade ou a precisão. Com esta configuração, a tolerância ao calor de 96 moscas pode ser medida simultaneamente, enquanto a coluna para CTmin pode conter mais de 100 moscas, desde que haja área de superfície adequada para empinamento.

O método de alta produtividade para observação dect min modifica a metodologia comum da coluna com a adição de um sensor infravermelho para contar automaticamente moscas. O uso de um sensor infravermelho para contagem foi proposto pela primeira vez por Shuman et al. em 199623, mas não foi amplamente adotado. A adição do sensor infravermelho permite a geração de dados contínuos em vez de coletar dados em intervalos discretos. Este protocolo também minimiza o erro do experimentador, eliminando a entrada manual de dados e a necessidade de alternar manualmente os tubos de coleta abaixo da coluna tomada em pontos de tempo discretos.

O método de alta produtividade para registro de KDT térmico é modificado a partir de dois estudos anteriores de tolerância ao calor em insetos10,12. Moscas individuais são armazenadas em uma placa de 96 poços em uma incubadora controlada pela temperatura e o vídeo é gravado. Este protocolo minimiza o viés do experimentador na determinação do KDT de calor porque os experimentos podem ser revisados e verificados reproduzindo a gravação. Este protocolo também fornece um conjunto de scripts Python personalizados que podem ser usados para acelerar a análise de vídeo. O uso de poços individuais elimina a interferência que pode ocorrer quando outros indivíduos se movem ou caem, o que pode ser um problema quando grupos de indivíduos são observados na mesma arena10,17. Além disso, a incubadora controlada pela temperatura fornece uma temperatura estável em todos os 96 poços, ao contrário do gradiente de temperatura às vezes observado em um bloco de alumínio controlado pela temperatura10. Observe também que o método de gravação do poço 96 pode ser adaptado para medir a tomografiadinâmica máxima e potencialmente CTmin (ver Discussão).

Para demonstrar cada protocolo, foram comparados os limites térmicos de fêmeas adultas de melanogaster Drosophila de linhas selecionadas do Painel de Referência Genética de Melanogaster Drosophila (DGRP) foram comparados24. Estas linhas foram selecionadas porque experimentos preliminares indicaram diferenças significativas na tolerância térmica. Estes ensaios provaram ser métodos robustos para discriminar diferenças na tolerância térmica. Os seguintes protocolos, ensaioct min de alta produtividade (seção 1) e ensaio de calor de alto rendimento KD (seção 2), descrevem as ações necessárias para produzir dados de CTmin e Heat KDT para qualquer estágio de vida de insetos motile capazes de se encaixar nos aparelhos, como drosophilaadulto . Para ctmin também é essencial que o inseto seja capaz de poleiro. Aqui, cada ensaio é demonstrado em Drosophila melanogasteradulto. No entanto, podem ser necessárias modificações para outras etapas tributárias ou de vida6. Pequenas alterações podem incluir o uso de material de empinamento com aberturas maiores para acomodar espécimes maiores no ensaiomin ct ou usar uma câmera de maior qualidade para discernir o KDT sutil de um inseto em movimento lento ou estágio de vida no ensaio de calor KD. Este protocolo não descreve métodos para preparar moscas, mas é importante padronizar protocolos de criação para garantir a repetibilidade25 (ver Garcia e Teets26 e Teets e Hahn27). Os protocolos fornecidos incluem informações sobre como construir e configurar os aparelhos, como registrar medições e uma breve descrição da análise de dados.

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Protocol

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1. Ensaio minde alto rendimento ct min

  1. Montagem da coluna jaqueta(Figura 1A, Figura 2)
    1. Corte os tubos acrílicos mais largos (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) e os mais estreitos (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) de tubos acrílicos iguais (31,5 cm) com uma serra(Figura 2A). Estes dois tubos serão as paredes externas e mais internas da coluna jaquetada.
    2. Corte dois anéis (2 cm de largura) do tubo acrílico de 6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm com uma serra de corte(Figura 2A). Estes dois anéis serão os espaçadores entre os tubos mais íntimos e externos, criando um espaço entre os dois longos tubos de acrílico para o fluido fluir.
    3. Faça cuidadosamente dois furos no tubo de acrílico externo (mais largo), um orifício na parte superior e um na parte inferior. Certifique-se de que cada orifício está a 3,5 cm da extremidade do tubo. Faça os furos em lados opostos do tubo(Figura 2B).
    4. Para reduzir as rachaduras, coloque fita adesiva no tubo sobre o ponto do orifício futuro e faça uma broca muito lentamente na configuração de torque mais baixa da broca.
    5. Usando a torneira de rosca, rosque ambos os orifícios para que os adaptadores da mangueira possam ser aparafusados nos dois orifícios do tubo externo. Para reduzir a rachadura, use lubrificante e rosque lentamente à mão.
    6. Deslize os dois espaçadores para a jaqueta interna, um em cada extremidade (inferior e superior). Deixe um espaço pequeno (0,5 cm) entre o espaçador e a extremidade da jaqueta interna(Figura 2B).
    7. Soldar os espaçadores no lugar usando cimento acrílico.
    8. Após o cimento no tubo interno e os espaçadores se definirem, deslize esta construção para o tubo externo maior com os orifícios. Certifique-se de que os tubos externos e internos estão alinhados em ambas as extremidades. Os espaçadores estarão a 0,5 cm do final, formando pequenas trincheiras nas duas extremidades da coluna(Figura 2C).
    9. Solde o tubo externo aos espaçadores usando cimento acrílico, usando grampos de aço ajustáveis para manter o aparelho unido. Espere o cimento definir.
    10. Enfie os adaptadores da mangueira nos orifícios do tubo externo agora fixados aos espaçadores e ao tubo interno.
      NOTA: Os adaptadores devem apenas roscar no tubo externo e não no espaço aberto entre os tubos mais internos e externos. Se os adaptadores da mangueira passarem muito longe, encurte-os até o comprimento apropriado com uma serra de corte.
    11. Sele os adaptadores da mangueira em seus fios no tubo externo com selante de silicone.
    12. Encha as duas trincheiras entre os tubos mais íntimos e externos em ambas as extremidades da coluna jaqueta com selante de silicone.
    13. Para testar a coluna, conecte tubos de 0,6 cm de diâmetro aos adaptadores da mangueira. Conecte o adaptador na parte inferior da coluna a uma fonte de água com tubulação, e o adaptador na parte superior da coluna a um ralo com um pedaço diferente de tubulação.
    14. Passe a água pelo aparelho de baixo para cima e verifique se há vazamentos. Se houver vazamentos, identifique de onde eles estão vindo e se lacre com silicone.
  2. Configuração da coluna jaqueta e monitor de funil Drosophila (DFM)
    1. Fixar a coluna revessa em uma bancada de réplica com um grampo de réplica de três pinos. Alinhe a coluna verticalmente com uma extremidade aberta ao teto e a outra aberta ao banco do laboratório(Figura 1B).
    2. Conecte a entrada e a saída do fluido de um banho refrigerado controlado pela temperatura aos bicos adaptadores da coluna com tubos plásticos de 0,6 cm de diâmetro(Figura 1B). Conecte a entrada de fluido ao bocal na parte inferior da coluna e a saída de fluido ao bocal na parte superior da coluna.
    3. Corte dois plugues isolantes de espuma circular de 3 cm de espessura (a mesma circunferência da abertura do compartimento mais interno da coluna). Certifique-se de que os plugues se encaixam perfeitamente e sele a coluna mais interna quando inserida em ambas as extremidades(Figura 1B).
    4. Furar um buraco no centro de um dos plugues e rosqueiar a extremidade nua de um termopar através do orifício de cerca de 5 cm e fixe com fita adesiva. Conecte a outra extremidade do termopar em um data-logger termopar.
    5. Conecte o data-logger termopar ao computador.
    6. Cunhar dois pedaços de protetor de sarjeta de plástico (5 cm x 7 cm, com aberturas de ~0,5 cm de diâmetro) dentro da coluna para funcionar como material de empinamento. Coloque um pedaço de guarda 2/3rds do topo da coluna e o outro 1/3do topo da coluna(Figura 1B).
    7. Fixar o plugue inferior (sem um termopar) e o plugue superior (com um termopar). Quando o plugue estiver inserido na parte superior da coluna, certifique-se de que o termopar não toque nas laterais da coluna.
    8. Ajuste a altura da coluna no suporte de réplica para que haja uma distância de 25 cm entre a parte inferior da coluna e a parte superior do banco.
    9. Fixar um anel de réplica (5 cm de diâmetro) ao suporte de réplica 5 cm abaixo da parte inferior da coluna e gire o anel para o lado da coluna.
    10. Coloque o DFM diretamente no anel de réplica(Figura 1B). Conecte todos os componentes eletrônicos: a fonte de alimentação, a interface de alimentação e o computador de acordo com o protocolo do fabricante.
    11. Uma vez que os componentes estejam conectados, siga o protocolo do fabricante para concluir a configuração do software DFM e DFM.
  3. CtMin Análise
    1. Gire as válvulas de entrada e saída do banho de fluido para as posições abertas.
    2. Pressione o botão de alimentação para ligar o banho de fluido controlado pela temperatura e, em seguida, pressione o botão de reprodução para executar um programa de elevação e manutenção da temperatura do banho para 25 °C. Dê o banho de fluido e a coluna 5-10 min para alcançar e manter 25 °C.
    3. Remova o plugue na parte superior da coluna e substitua-o por um funil (5,08 cm de diâmetro; veja Figura 1C).
    4. Toque moscas de seu frasco de comida para a coluna.
    5. Remova o funil e substitua-o pelo plugue superior rapidamente, cuidado para não deixar as moscas escaparem. Dê às moscas 5 minutos para se estabelecerem, ocasionalmente tocando o plugue inferior para encorajar as moscas a subir.
    6. Pressione o botão de partida no banho de fluido e inicie o programa ctmin de rampa (25 °C por 5 min; 25 °C a 10 °C a 0,5 °C/min; 10 °C por 2 min; depois 10 °C a -10 °C a 0,25 °C/min).
      NOTA: Outras variações deste protocolo de rampade min ct podem ser utilizadas dependendo da questão da pesquisa (por exemplo, comparações dos efeitos de diferentes taxas de rampa na CTmin28).
    7. Clique em abrir o software de gravação termopar no computador e clique no ícone Gravar para começar a gravar a temperatura dentro da coluna a cada segundo durante a duração do ensaio. Certifique-se de que cada registro de temperatura inclui um carimbo de tempo específico para o segundo, para que os dados de temperatura possam ser posteriormente mesclados com dados do DFM.
    8. Adicione 5 mL de 90% de etanol a um tubo de centrífuga cônica de 15 mL e coloque-o em um rack abaixo da coluna.
    9. Ocasionalmente, toque no plug inferior da coluna para atrair qualquer mosca na parte inferior para subir. A maioria das moscas estará em um poleiro ou perto do topo da coluna por 15 °C.
    10. A 15 °C, retire o plugue inferior e colete todas as moscas ainda na parte inferior do etanol. Conte e note que essas moscas foram coletadas a 15 °C, mas seuminuto ct é desconhecido.
      NOTA: A temperatura em que o plugue inferior é removido deve ser decidida antes do ensaio e com base nomin de tomografia previsto da espécie de ensaio ou tratamento. Para este ensaio, foi escolhida 15 °C com base noct min destas linhas DGRP específicas encontradas em ensaios preliminares.
    11. Coloque um funil de vidro de 75 mm de diâmetro externo no DFM. Ajuste o anel de réplica, DFM e funil para que estejam sob a coluna. Certifique-se de que o lábio do funil sela completamente a parte inferior da coluna(Figura 1D).
    12. Insira a parte inferior do funil no tubo de coleta de 15 mL(Figura 1D).
    13. Abra o software DFM no computador clicando no ícone Software. O software começará imediatamente a registrar a hora/data em que as moscas atingem seu CTmin. Moscas que atingem seuminuto de tomografia perdem função neuromuscular e caem de seus poleiros, e depois através do DFM.
    14. Monitore se todas as moscas atingiram seuminuto ct à medida que a temperatura diminui verificando o plugue superior e os poleiros para ver se alguma mosca ainda está empoleirada (ou seja, ainda mantendo a função neuromuscular). O julgamento termina quando todas as moscas atingiram seu CTmin.
    15. No final do ensaio, ajuste o DFM e afunile longe da abertura da coluna. Algumas moscas podem chegar aoseu minuto ct, mas permanecem presas na coluna (ou seja, presas em um poleiro ou penduradas por um único gancho tarso). Abra a tampa superior e remova essas moscas. Ominuto da tomografia dessas moscas é desconhecido.
    16. Combine os arquivos de saída .txt do software de gravação termopar (ou seja, temperatura, data e hora) e o software DFM (ou seja, número de moscas através do funil, data e hora) usando o comando Merge no RStudio. Mescle os dois arquivos com base na variável data/hora compartilhada.

2. Ensaio de calor de alta produtividade KD

  1. Montagem e preparação do aparelho
    1. Com um adesivo, fixar a malha de arame tecido de aço (~1,5 mm de abertura) na parte inferior de uma placa 96 bem sem fundo.
    2. Conecte ímãs aos lados opostos da parte inferior de uma placa 96 bem sem fundo com uma pistola de cola quente e cola quente(Figura 3).
    3. Para criar uma tampa de septo personalizada com filme adesivo projetado para 96 placas de poço, coloque dois filmes lados pegajosos juntos para formar uma folha de plástico cume.
    4. Coloque as folhas de plástico sobre a placa de poço 96 e use fita adesiva para aderir a todos os quatro lados da placa. Sobre a abertura para cada poço na placa, corte um 'x' na folha de plástico com um cortador de caixa (ou seja, 96 x's totais).
    5. Anesthetize voa com CO2 e carregá-los individualmente em cada poço da placa 96 bem sem fundo modificada com uma tampa aspiradora e septum. Retire a tampa do septo da placa de 96 poços enquanto as moscas são anestesiadas com CO2 e substitua-a por uma tampa clara apertada.
    6. Coloque o 96 bem sem fundo carregado com moscas e com uma tampa clara e apertada sobre os alimentos. Certifique-se de que as moscas tenham pelo menos 48h entre a anestesia de CO2 e o início do ensaio (etapas 2.2.1-2.2.5).
      NOTA: A parte inferior das placas 96 bem modificadas não-inferiores é feita de malha, de modo que moscas anestesiadas com CO2 podem ser carregadas e deixadas em alimentos por pelo menos 48 horas antes de um teste começar. Qualquer recipiente plástico >8,5 cm de largura x 13 cm de comprimento que tenha pelo menos 2 cm de profundidade para acomodar uma camada de 1 cm de profundidade de alimentos pode ser usado.
    7. Fixar uma webcam no fundo do interior de uma incubadora controlada pela temperatura com fita. Aponte a câmera diretamente para cima(Figura 4). Fixar uma prateleira de incubadora cerca de 10 cm acima da câmera.
      NOTA: A webcam aponta para cima e registra a placa de 96 poços de baixo para garantir que o máximo possível da superfície do poço (por exemplo, não bloqueada da vista pelas paredes do poço da placa). Quando as moscas atingem seu KDT eles caem para o fundo do poço; neste caso, o lado mais próximo da webcam, e, portanto, estão em vista, independentemente de quão longe seu poço está do centro de vista.
    8. Conecte a webcam a um computador.
    9. Com fita adesiva, conecte uma folha branca de papel (8,5 cm x 13 cm; a área exata da parte inferior da placa de 96 poços) ao fundo da prateleira(Figura 4). Certifique-se de que o papel preenche todo o quadro quando visualizado através da webcam.
    10. Coloque uma fonte de luz na incubadora. Use papel ou outros materiais para amortecer a iluminação e minimizar o brilho.
      NOTA A etapa 2.1.10 é específica para cada incubadora porque a iluminação e as reflexões variam entre as incubadoras. O objetivo é ter iluminação suficiente na incubadora para proporcionar um bom contraste entre as moscas em cada poço e a folha branca de papel atrás da placa quando vista com a webcam.
  2. Executando o ensaio de calor KD
    1. Coloque a incubadora em 37,5 °C e espere cerca de 30 minutos para dar tempo à incubadora para alcançar e manter a temperatura desejada. A temperatura exata dependerá do inseto ser avaliado e de qualquer outra consideração temporal.
    2. Coloque a placa 96 bem invertida na incubadora, de tal forma que a parte inferior da placa (lado da malha) seja contra o papel branco na parte inferior da bandeja(Figura 4). Tome nota da orientação dos poços (nomes de coluna e linha) na bandeja e no quadro da webcam. Fita colorida ao longo das laterais da placa 96 e bordas do pedaço de papel branco pode verificar a orientação (Figura 4).
      NOTA: Certifique-se de que a temperatura da incubadora é consistente com a temperatura dentro da placa de poço 96, registrando a temperatura dentro da placa com um termopar durante um teste do ensaio de calor KD. Também é prudente verificar se há uma variação insignificante na temperatura entre os poços da placa do poço 96 com múltiplos termopares antes de conduzir o ensaio de calor KD.
    3. Feche a porta da incubadora.
    4. Clique em Gravar no software de gravação de vídeo.
    5. Depois de 2h, verifique a gravação para ver se todas as moscas chegaram ao seu ponto de descanso final e parou de se mover. Uma vez que todas as moscas tenham parado de se mover, clique em Parar no software de gravação de vídeo. Para os genótipos testados aqui, criados a 25 °C, a maioria das moscas atinge seu KDT por 60 min a 37,5 °C (veja também Jørgensen et al.9).
    6. Descarte as moscas.
    7. Use os scripts Python personalizados(Arquivos de Codificação Suplementar 1-3) para aproximar o tempo no vídeo quando as moscas atingirem seu KDT de calor.
      NOTA: A etapa 2.2.7 é opcional. Para acelerar a análise de vídeo, um conjunto de scripts Python personalizados foram desenvolvidos para medir mudanças na densidade de pixels ao longo do tempo em cada poço (ver Arquivo de Codificação Suplementar). Quando as moscas param de se mover, a densidade de pixels é constante, e um gráfico desses dados pode ser usado para localizar o tempo aproximado no vídeo quando as moscas são derrubadas. Embora possa ser possível usar este script para automatizar a análise de dados, atualmente pequenas imperfeições no vídeo levam a pequenas discrepâncias entre mudanças na densidade de pixels e o tempo de KD real.
    8. Clique em abrir o arquivo de vídeo e gravar o KDT de cada mosca em cada poço. A medida mais consistente de calor KDT entre ensaios e observadores é registrar o tempo em que uma mosca atinge seu ponto de descanso final.
    9. Acompanhe o vídeo ao contrário, focando em um único poço, e observando o tempo em que a mosca primeiro se move para fora de seu ponto de descanso final. Repita este processo para cada poço.

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Representative Results

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Os limites térmicos (ou seja, CTmin e KDT de calor) das fêmeas do Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) foram medidos para demonstrar os dados de alta produtividade gerados a partir dos dois protocolos descritos. Omin ct foi avaliado utilizando as linhas DGRP 714 (n = 37) e 913 (n = 45). O Heat KDT foi avaliado e comparado com as linhas DGRP 189 (n = 42) e 461 (n = 42), e os arquivos de vídeo foram analisados manualmente. O tempo total dos experimentos, incluindo assistir ao vídeo, levou <2 h para cada protocolo.

As fêmeas da Linha DGRP 913 apresentaram temperaturasmédias médias de tomografias significativamente mais baixas do que as fêmeas da Linha DGRP 714 (Figura 5A; Teste de soma de classificação Wilcoxon, W = 1585, P < 0,001). As duas linhas tinham distribuições claramente distintas de CTmin: a linha 913 tinha umct min de 5,00 ± 1,35 °C (média ± SD) e a linha 714 tinha um ctmin de 9,60 ± 1,53 °C.

O calor KDT a 37,5 °C difere significativamente entre as fêmeas das linhas DGRP 73 e 461 (Figura 5B; Teste de soma de classificação Wilcoxon, W = 1658,5, P < 0,001). Embora tenha havido variação no KDT de ambas as linhas, as diferenças nos KDTs de calor entre as linhas foram prontamente detectadas. A linha 73 teve um KDT médio de 14,8 min maior que a linha 461 (Linha 73 média KDT, 55,58 ± 6,92 min; Linha 461 média KDT, 40,78 ± 6,64 min).

Figure 1
Figura 1: Configuração da coluna jaqueta para o ensaioct min. (A) Coluna com jaqueta montada. (B) Coluna revesida com tampões superiores e inferiores selando a câmara interna. O termopar é roscado através de um orifício na tomada superior. O DFM é montado em um anel de réplica abaixo da coluna e movido para o lado. (C) Início de um ensaiomin CT. O plugue superior foi removido e moscas foram despejadas na câmara interna através de um funil na abertura superior da coluna. (D) Coluna e DFM em paleto durante um ensaiomin ct. O plugue inferior foi removido da coluna e o DFM e o funil foram posicionados abaixo da coluna. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Ilustração técnica da coluna jaqueta. (A) Cada pedaço de tubo acrílico cortado ao comprimento: i) dois anéis espaçador cortados para 3,5 cm de comprimento (passo 1.1.2):ii). o tubo de acrílico mais largo cortou para 31,5 cm (passo 1.1.1); e iii o tubo de acrílico mais estreito cortou para 31,5 cm (passo 1.1.1). (B) Dois furos (em cinza) perfurados na peça mais larga do tubo acrílico, 3,5 cm de cada extremidade e em lados opostos (i; passo 1.1.2). Montagem da peça mais estreita de tubo acrílico com os dois anéis espaçador (ii; passos 1.1.6 e 1.1.7). (C) A coluna coberta jaqueta após as etapas 1.1.8-1.1.12. Os adaptadores de mangueira são indicados em cinza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Vista inferior (esquerda) e superior (direita) da placa 96 bem sem fundo. A malha tecida de aço é anexada ao fundo de uma placa modificada de 96 bem sem fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Configuração da incubadora para um ensaio de calor KD. (A) Webcam e palco configurado à distância. (B) Webcam e configuração de estágio na incubadora antes do início de um teste. A webcam é fixada no chão da incubadora e a bandeja está ~10 cm acima da webcam. (C) Orientação da placa de 96 poços no palco branco acima da webcam durante um ensaio de KD de calor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Limites térmicos inferiores e superiores de linhas selecionadas do Painel de Referência Genética Drosophila (DGRP). (A) Valoresmin ct de duas linhas DGRP. (B) Aqueça KDT de duas linhas DGRP a 37,5 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Saída de atividade dos scripts de análise de vídeo de um conjunto de dados de teste. Cada parcela representa os dados de atividade de um poço de uma placa de 96 poços. Um total de 84 amostras foram testadas e são mostradas. Bem, a ID é rotulada à direita de cada histograma.  Clique aqui para ver esta figura.

Arquivo de codificação suplementar 1. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 3. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Os dois métodos detalhados acima geram dados de alto rendimento de métricas ecologicamente relevantes para limites térmicos superiores e inferiores. Esses protocolos baseiam-se em metodologias previamente estabelecidas comuns à pesquisa sobre limites térmicos de insetos (resumidas em Sinclair et al.) 6. Ambos os protocolos podem ser concluídos em um curto espaço de tempo (~2 h cada), produzir conjuntos de dados com grandes tamanhos de amostra, não sacrificar a repetibilidade ou a precisão e minimizar o erro do experimentador eliminando a gravação e a entrada de dados manuais (ensaiomin CT) ou criando gravações de vídeo de backup de cada ensaio (ensaio de KD de calor).

Os resultados representativos foram gerados comparando os limites térmicos das fêmeas adultas a partir de linhas selecionadas do DGRP24. Ambos os ensaios mostraram diferenças significativas na tolerância térmica entre as linhas. O tamanho do efeito entre as linhas em cada um desses ensaios foi relativamente grande, o que, por sua vez, permitiu diferenciação confiável de grupos com comparações visuais e estatísticas. A grande diferença no KDT entre as duas linhas DGRP destaca uma vantagem potencial de um ensaio estático sobre um ensaio dinâmico de rampa; ensaios estáticos podem ser mais capazes de detectar diferenças menores entre grupos do que ensaios dinâmicos9. As duas linhas DGRP submetidas ao ensaio de calor KD diferem em KDT médio por 14,8 min. Para referência, utilizando um protocolo dinâmico de rampa, Rolandi et al.13 mostraram que a diferença dos maiores e menores valoresmáximos de CT de 34 linhas DGRP foi de apenas 1,42 °C, ou <6 min com uma rampa de 0,25 °C/min.

Em relação a outros métodos, existem várias vantagens tanto para o ensaiomin CT e para o ensaio de KD de calor descrito aqui. A contagem automatizada no ensaiomin ct reduz a quantidade de tempo que um experimentador passa no aparelho, aumentando assim o tempo que pode ser gasto em outras tarefas. O custo para construir a coluna com jaqueta acrílica é de ~$50, em comparação com os US$ 400 estimados para comprar uma coluna feita sob medida com jaqueta de vidro. Para o ensaio de KD de calor, a gravação de vídeo elimina a necessidade de observações diretas em tempo real e ocupa uma pequena quantidade de espaço físico por amostra. Outros protocolos, como os usados por Jørgensen et al.9,usam um grande aquário para visualizar indivíduos submersos em frascos separados, mas este método requer investigadores bem treinados para verificar rapidamente frascos para movimentação e uma grande quantidade de espaço para o aparelho. Rolandi et al.13 usaram sensores infravermelhos para detectar movimento ou falta de movimento no CTmax em 96 placas de poço, enquanto este ensaio de calor KD usa uma webcam barata (~US$ 70) para detectar movimento. Esta câmera pode detectar movimentos sutis que podem ser perdidos por um monitor de atividade infravermelha.

Além disso, um conjunto de scripts personalizáveis para estimar rapidamente o KDT no ensaio de calor KD foi desenvolvido(Arquivo de Codificação Suplementar 1-3). Esses scripts podem ser usados para economizar tempo obtendo uma aproximação aproximada do KDT de calor em cada poço antes de assistir ao vídeo, e com maior qualidade de vídeo esses scripts poderiam potencialmente automatizar a gravação de dados. Três scripts para processar o vídeo foram fornecidos: FirstFrame.py (Arquivo de Codificação Suplementar 1), que define o primeiro quadro de imagem do vídeo; WellDefine.py (Arquivo de Codificação Suplementar 2), que define cada poço individual da placa de 96 poços no primeiro quadro de imagem; e MotionDetect.py (Arquivo de Codificação Suplementar 3), que transforma o arquivo de vídeo em um sinal de atividade calculando a alteração na densidade de pixels entre quadros sequenciais. A única entrada para o programa é o arquivo de vídeo, e a saída inclui estatísticas sumárias e um conjunto de dados de séries temporais de atividade por poço(Figura 6). As diferenças na densidade de pixels entre os quadros de vídeo são transformadas usando um filtro em escala de cinza para reduzir as dimensões da imagem, um filtro de passagem baixa gaussiano para reduzir o ruído da imagem e uma operação morfológica de dilatação para aumentar as bordas dos objetos em movimento. Neste caso, a atividade é definida como a diferença absoluta dos valores dos pixels entre quadros sequenciais. O KDT de calor pode então ser estimado como o índice do último quadro contendo um valor de atividade superior a zero. Por exemplo, o quadro em que a atividade foi registrada pela última vez em bem g12 de um conjunto de dados amostral (Figura 6) foi logo após 2.000 s (33,33 min), conforme indicado por uma linha plana. Um observador pode então reproduzir o vídeo digital e encontrar rapidamente o Heat KDT do bem g12 com este carimbo de tempo.

Com pequenas modificações e solução de problemas, existem aplicações adicionais para ambos os ensaios, mais notavelmente com o ensaio de calor KD. A configuração de gravação de vídeo pode ser modificada para registrar tempos estáticos de knockdown frio, tempo de recuperação do coma frio ou valores de ctmax ect min potencialmente dinâmicos. O tempo de recuperação do coma frio é a quantidade de tempo que um indivíduo leva para retomar o movimento após o estresse frio29. Portanto, o tempo de recuperação do coma frio poderia ser medido com esta configuração induzindo o coma frio na placa de 96 poços, em seguida, usando a configuração de vídeo para registrar o tempo de recuperação na incubadora. Finalmente, com ajuste fino cuidadoso, ctdinâmico max ouct min poderia ser registrado em uma incubadora de rampa programável. Uma atenção cuidadosa à temperatura dentro de cada um dos 96 poços seria uma preocupação, pois pequenas variações de temperatura na incubadora poderiam ser ampliadas entre os poços à medida que a temperatura muda.

Várias considerações devem ser levadas em conta ao realizar o ensaio ctmin ou heat KD. Em primeiro lugar, a qualidade, idade, sexo, fase de vida, fundo genético e experiência prévia de um inseto podem influenciar os limites térmicos6,13,30,31. Para ambos os ensaios, as cobaias devem ser motile. Em segundo lugar, apenas um grupo pode ser avaliado de cada vez para cada aparelhomin ct. Portanto, variáveis como a variação diurna na tolerância térmica32,33 precisam ser consideradas na comparação dos tratamentos. Uma solução para este problema é realizar ensaiosmin ct de múltiplas condições de tratamento com múltiplos aparelhos ao mesmo tempo. Em terceiro lugar, algumas espécies podem não ser adequadas para um ou ambos os ensaios. Por exemplo, algumas espécies podem não subir ou voar facilmente para poleiros no ensaiomin ct ou pode cessar a atividade a altas temperaturas antes de seu calor KDT é atingido, o que tornaria difícil discernir um tempo de knockdown. Finalmente, para garantir comparações precisas no ensaio de KD de calor, é fundamental que os critérios para KDT (etapa 2.2.8) sejam consistentes entre réplicas, observadores, ensaios, etc. Para acomodar diferentes espécies de insetos, podem ser necessárias modificações em qualquer um dos aparelhos de teste. As modificações potenciais incluem o uso de diferentes tipos de poltronas para o ensaiomin ct, usando placas de cultura celular com menos poços e mais espaço (48, 24, 12 ou 6 poços) em vez da placa de 96 poços para acomodar insetos maiores, ou ajustar a temperatura usada para o ensaio de calor KD para garantir um tempo de knockdown que não seja muito rápido ou muito lento.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Ellie McCabe pela ajuda na criação de moscas. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de Agricultura dos Estados Unidos do Projeto Hatch de Alimentos e Agricultura 1010996 e a National Science Foundation concede OIA-1826689 à N.M.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) Thermo Scientific; Waltham, MA 153-5401
C922 Pro Stream Webcam Logitech; Newark, CA 960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm Any Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44041
Clear silicone sealant Any Any
Collection tube (15 ml) Any Any
Cordless Drill Any Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM) TriKinetics; Waltham, MA DFM Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software TriKinetics; Waltham, MA Records data input from the DFM
Fly Storage Lid FlySorter; Seatle, WA FS-96LID-5PK Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate FlySorter; Seatle, WA FS-96PLATE-5PK Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray FlySorter; Seatle, WA FS-TRAY-5PK Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel Kimax 28950-75 75mm
Gutter guard Any Any ~0.5 cm diameter openings
Hacksaw Any Any
Heratherm Thermo Scientific incubator Thermo Scientific; Waltham, MA OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 United States Plastic Corp., OH 61135
Hot glue gun and glue Any Any
Light Source Any Any
Magnets Any Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T) OMEGA; Norwalk, CT 5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel Any Any 2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter United States Plastic Corp., OH 62852
Retort ring Any Any 2" diameter
Retort stand Any Any
Retort three-prong clamp Any Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9) TriKinetics; Waltham, MA PSIU9 Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick) Any Any
Tape Any Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1) TriKinetics; Waltham, MA PS9-1 Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement United States Plastic Corp., OH 45737

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References

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Ensaios de alta taxa de limite térmico em insetos
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Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).More

Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).

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