Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Высокая пропускная способность анализ критических тепловых пределов у насекомых

Published: June 15, 2020 doi: 10.3791/61186
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Kentucky

Summary

Тепловые ограничения могут предсказывать терпимые к окружающей среде организмы, что является ценной информацией перед лицом быстрого изменения климата. Описаны здесь протоколы высокой пропускной способности для оценки критических тепловых минимумов и теплового нокдауна у насекомых. Оба протокола максимизируют пропускную способность и минимизируют стоимость анализов.

Abstract

Верхние и нижние тепловые пределы растений и животных являются важными предикторами их эффективности, выживания и географического распределения и имеют важное значение для прогнозирования реакции на изменение климата. В этой работе описаны два протокола высокой пропускной способности для измерения тепловых пределов насекомых: один для оценки критических тепловых минимумов (CTmin),а другой для оценки времени стука тепла (KDT) в ответ на статический тепловой стрессор. В анализе CTmin, индивидуалы помещены в acrylic-jacketed колонку, подверглись к уменьшая пандусу температуры, и подсчитаны по мере того как они падают от их окуней используя инфракрасный датчик. В жару KDT анализ, лица, содержащиеся в 96 хорошо пластины, помещены в инкубатор установлен на стрессовой, горячей температуры, и видео, записанные, чтобы определить время, в котором они больше не могут оставаться в вертикальном положении и двигаться. Эти протоколы предлагают преимущества по сравнению с широко используемыми методами. Оба анализа являются недорогими и могут быть завершены относительно быстро (2 ч). Анализ CTmin уменьшает ошибку экспериментатора и может измерять большое количество людей одновременно. Протокол тепла KDT генерирует видеозапись каждого анализа и, таким образом, устраняет предвзятость экспериментатора и необходимость непрерывного мониторинга людей в режиме реального времени.

Introduction

Тепловые пределы насекомых
Изменение состояния окружающей среды, включая температуру, является основным фактором, влияющим на производительность, фитнес, выживание и географическоераспределение организмов 1,,2. Верхние и нижние тепловые пределы определяют теоретический диапазон сред, которые организм может переносить, и, следовательно, эти пределы являются важными предикторами распределения растений и животных, особенно вусловиях изменения климата 3,,4. Таким образом, протоколы точного измерения тепловых пределов являются важными инструментами для экологов, физиологов, эволюционных биологов и биологов-экологов.

Как наиболее распространенные и разнообразные наземные животные, насекомые часто используются для измерения тепловых пределов. Критические тепловые максимы (CTmax)и критическая тепловая минима (CTmin)обычно используются для оценки внутри- и межвидового изменениятеплотерпимости 5,,6,,7. ХотяКТ макс иКТ мин могут быть измерены для нескольких фенотипов, в том числе роста, репродуктивного производства и поведения, они чаще всего применяются клокомотивной функции 5,,6,7. Таким образом,КТ макс (также называемый температурой теплового нокдауна) иКТ мин часто определяются как высокие и низкие температуры, при которых насекомые теряют двигательнуюфункцию и не могут оставаться в вертикальном положении 5,,6,,7,,8,,9,,10,,11. КТ мин совпадает с наступлением холодовой комы, обратимый паралич вызван холодными температурами6. Хотя паралич на тепловых пределов часто обратимым, продолжающееся воздействие этих температур приводит к экологической смерти5.

Общие методы измерения тепловых пределов
Различные аппараты были использованы для измерения тепловых пределов (обобщено в Sinclair et al.) 6.Кратко, насекомые нагреваются илиохлаждаются в инкубаторах 12,,13,контейнеры погружены вжидкие ванны 11,,14,,15,,16,алюминиевые блоки 10,17, иликуртки контейнеры 18, и контролируется до тех пор, пока движение прекращается. Для мониторинга насекомых во время анализа наиболее распространенным методом является прямое наблюдение, в котором люди постоянно контролируются в режиме реального времени или ретроспективно сзаписанным видео6,9,,10,,11,,15,,17. Хотя методы прямого наблюдения имеют минимальные требования к оборудованию, они являются трудоемкими и ограничивают пропускную способность. Кроме того, насекомые могут наблюдаться косвенно, собирая людей в дискретное время, как онипадают с окуней 6,,19,,20,21 или с помощью мониторовактивности 13.

Косвенные методы измерения тепловых пределов, как правило, имеют более высокую пропускную способность и потенциально менее подвержены ошибкам, чем методы прямого наблюдения. Наиболее распространенным методом для косвенного мониторинга используется куртка с температурнымконтролем колонки 6,,8,,19,,20,,21. Насекомые помещаются внутри колонны с окунями, а температура внутренней камеры контролируется путем перекачки жидкости из контролируемой температурой жидкой ванны через куртку подкладка колонны. Лица, достигаемые своего теплового предела, падают со своего окуня и собираются при дискретных температурах или интервалах времени. Хотя этот метод хорошо работает дляКТ мин, было установлено, непригодным дляКТ макс, потому что мухи добровольно выйти из нижней части колонки, когда температура повышается. Новый метод, описанный здесь, обходит эту проблему, индивидуально содержащий мух во время автоматизированных измерений.

В дополнение к методу наблюдения, два типа температурных режимов обычно используются для оценки верхних тепловых пределов. Динамические анализы состоят из постепенного повышения температуры до тех пор, пока двигательная функция не будет утрачена; что температура динамическаяКТ макс7,8,9,13. В отличие от этого, статические анализы состоят из постоянной стрессовой температуры до тех пор, пока двигательная функция не будет потеряна; этот момент времени является тепло нокдаун время (тепло KDT), также называемыйстатический КТ макс (sCTмакс)в недавней работе по J'rgensen и др.7,8,9,16,22. Хотя CTмакс и тепло нокдаун анализы (тепло KD анализы) производят метрики с различными единицами, математическое моделирование двух черт указывает, что они дают сопоставимую информацию о теплотерпимости и оба экологически актуальны8,9. Динамические анализы дают температуру, которую можно сравнить с условиями окружающей среды, и они предпочтительнее, когда существуют большие различия в теплотерпимости, такие как сравнения между видами с широко различными тепловыми нишами. Однако, из-за высокого No 10 для накопления тепловой травмы, статический анализ может быть предпочтительнее для обнаружения небольших размеров эффекта, таких как внутриспецифические различия втеплотерпимости 9. Кроме того, практически говоря, статический анализ требует менее сложного оборудования, чем динамический анализ.

Цель
Цель данной работы заключается в формализации методовКТ мин и тепла KD анализы, которые могут быть использованы в будущих исследованиях для оценки тепловых пределов пестрых насекомых. Протоколы адаптированы из ранее установленных методологий и предназначены для высокой пропускной способности, автоматизированы и экономически эффективны. Оба анализа могут быть завершены в течение короткого периода времени (2 ч), что означает, что несколько экспериментов могут быть проведены в течение одного дня, производя большие объемы данных без ущерба для повторяемости или точности. С помощью этой установки, теплоносимость 96 мух могут быть измерены одновременно, в то время как столб дляКТ мин может ввести более 100 мух, при условии, что есть адекватная площадь поверхности для окуня.

Метод высокой пропускной способности для наблюдения заКТ мин изменяет общую методологию колонки пиджака с добавлением инфракрасного датчика для автоматического подсчета мух. Использование инфракрасного датчика для подсчета голосов было впервые предложено Shuman et al. в 1996году 23, но не было широко принято. Добавление инфракрасного датчика позволяет создавать непрерывные данные, а не собирать данные через дискретные промежутки времени. Этот протокол также сводит к минимуму ошибку экспериментатора, устраняя ручной ввод данных и необходимость вручную переключать трубки сбора ниже вытехаемой колонки в дискретных точках времени.

Метод высокой пропускной способности для записи тепла KDT изменяется из двух предыдущих исследований теплоносимости унасекомых 10,12. Отдельные мухи хранятся в пластине 96 хорошо в температуре контролируемых инкубатор и видео записывается. Этот протокол сводит к минимуму предвзятость экспериментатора в определении тепла KDT, потому что эксперименты могут быть рассмотрены и проверены, отывав запись. Этот протокол также предоставляет набор пользовательских скриптов Python, которые могут быть использованы для ускорения видео-анализа. Использование отдельных скважин устраняет помехи, которые могут возникнуть, когда другие люди перемещаются или падают, что может быть проблемой, когда группы людей наблюдаются в тойже арене 10,17. Кроме того, контролируемый температурой инкубатор обеспечивает стабильную температуру во всех 96 скважинах, в отличие от температурного градиента, иногда наблюдаемого в контролируемом температуройалюминиевом блоке 10. Также обратите внимание, что метод записи 96 хорошо может быть адаптирован для измерения динамическогоКТ макс и потенциально КТмин (см. Обсуждение).

Чтобы продемонстрировать каждый протокол, тепловые пределы взрослых drosophila меланогастер женщин из избранных линий Drosophila меланогастер генетической справочной панели (DGRP)были сравнены 24. Эти линии были выбраны потому, что предварительные эксперименты показали значительные различия в термической толерантности. Эти анализы оказались надежными методами распознавания различий в термической толерантности. Следующие два протокола, высокой пропускной способностиКТ мин анализ (раздел 1) и высокой пропускной способности тепла KD анализ (раздел 2), описывают необходимые действия для производстваКТ мин и тепла KDT данных для любого подвижного насекомого стадии жизни способны установки в аппаратах, таких как взрослый Drosophila. ДляКТ мин также важно, чтобы насекомое было в состоянии окуня. Здесь каждый анализ демонстрируется у взрослого Drosophila melanogaster. Тем не менее, изменения могут потребоваться для других такс или этапов жизни6. Незначительные изменения могут включать в себя использование окуня материал с большими отверстиями для размещения крупных образцов вКТ мин анализа или с помощью камеры более высокого качества, чтобы различить тонкие KDT медленно движущихся насекомых или стадии жизни в тепловой анализ KD. Этот протокол не описывает методы подготовки мух, но важно стандартизировать протоколы воспитания для обеспечения повторяемости25 (см. Гарсия и Teets26 и Teets и Хан27). Представленные протоколы включают информацию о том, как создавать и настроим аппараты, как записывать измерения, а также краткое описание анализа данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Высокая пропускная способностьКТ мин анализ

  1. Сборка куртки колонки (Рисунок 1A, Рисунок 2)
    1. Вырезать самые широкие (7 см х 6,35 см х 0,3 см) и узкие (5,7 см х 5,1 см х 0,3 см) акриловые трубки одинаковой длины (31,5 см) с ножовкой(рисунок 2А). Эти две трубы будут внешние и внутренние стены куртку колонки.
    2. Вырезать два кольца (2 см в ширину) от среднего размера (6,35 см х 5,7 см х 0,3 см) акриловая трубка с ножовкой(рисунок 2А). Эти два кольца будут промемителями между внутренними и внешними трубами, создавая пространство между двумя длинными акриловыми трубками для потока жидкости.
    3. Тщательно просверлите два отверстия во внешней (широкой) акриловой трубке, одно отверстие в верхней части и одно внизу. Убедитесь, что каждое отверстие 3,5 см от конца трубки. Просверлите отверстия на противоположных сторонах трубки(рисунок 2B).
    4. Чтобы уменьшить растрескивание, поместите ленту на трубку над пятном будущего отверстия и сверлите очень медленно на самом низком крутящем моменте установки сверла.
    5. Используя резьбовой кран, нить обоих отверстий, так что шланг адаптеры могут быть привинчены в два отверстия внешней трубки. Чтобы уменьшить растрескивание, используйте смазку и нить медленно вручную.
    6. Сдвиньте два промеща на внутреннюю куртку, по одному на каждом конце (внизу и сверху). Оставьте небольшое пространство (0,5 см) между спейсером и концом внутренней куртки(рисунок 2B).
    7. Сварить спейсеры на место с помощью акрилового цемента.
    8. После цемента на внутренней трубе и spacers наборы, слайд этой конструкции в большую внешнюю трубку с отверстиями. Убедитесь, что внешние и внутренние трубки промыть на обоих концах. От конца проемы будут 0,5 см, образуя небольшие траншеи на обоих концах колонны(рисунок 2C).
    9. Сварить внешнюю трубку для спейсеров с помощью акрилового цемента, используя регулируемые стальные зажимы, чтобы держать аппарат вместе. Подождите, пока цемент установить.
    10. Нить шланг адаптеры в отверстия внешней трубки в настоящее время закреплены на проемы и внутренней трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптеры должны только нить в наружной трубе, а не в открытом пространстве между внутренней и внешней труб. Если шланг адаптеры поток слишком далеко, сократить их до соответствующей длины с ножовкой.
    11. Печать шланг адаптеры в их нити на внешней трубе с силиконовым герметиком.
    12. Заполните две траншеи между внутренними и внешними трубами на обоих концах куртки колонны с силиконовым герметиком.
    13. Чтобы протестировать столбец, прикрепите трубы диаметром 0,6 см к адаптерам шланга. Соедините адаптер в нижней части столбца с источником воды с трубками, а адаптер в верхней части колонны к стоку с другим куском труб.
    14. Пройдите воду через аппарат снизу вверх и проверьте наличие утечек. Если есть утечки, определить, где они приходят и печать с силиконом.
  2. Настройка куртки колонки и Drosophila Воронка монитор (DFM)
    1. Закрепте куртку колонку на реторты стенд с трех-зубец реторты зажим. Выровнять столбец вертикально с одним концом открытым к потолку, а другой открыт для лабораторной скамейке (Рисунок 1B).
    2. Соедините входную и выходную жидкость из контролируемой температурой рефрижераторной ванны с соплами адаптера колонны с пластиковыми трубами диаметром 0,6 см(рисунок 1B). Подключите вход жидкости к сопла в нижней части столбца и выход жидкости к сопла в верхней части столбца.
    3. Вырезать два 3 см толщиной круговой пены изоляционные пробки (такую же окружность, как открытие внутреннего отсека колонны). Убедитесь, что штепсельные вилки плотно подходят и уплотняются внутренней колонкой при вставке на обоих концах(рисунок 1B).
    4. Прокалывайте отверстие через центр одной из пробок и пронизывайте голый конец термокоупля через отверстие около 5 см и закрепните лентой. Подключите другой конец термокупла в термокомпле регистратор данных.
    5. Подключите регистратор термокопольных данных к компьютеру.
    6. Клин два куска пластиковых желоба охранник (5 см х 7 см, с 0,5 см диаметром отверстия) внутри колонны, чтобы функционировать в качестве окуня материала. Поместите одну часть охранника 2/3rds из верхней части колонны, а другой 1/3rd из верхней части колонны(рисунок 1B).
    7. Закрепите нижнюю вилку (без термокомпыля) и верхнюю штепсельную вилку (с термокуплом). Когда штепсельная вилка вставляется в верхней части колонны, убедитесь, что термокомп не касается сторон колонны.
    8. Отрегулируйте высоту колонны на стенде реторты так, чтобы между нижней частью колонны и верхней скамейкой было расстояние 25 см.
    9. Закрепте кольцо реторты (диаметр 5 см) к реторте, стойте на 5 см ниже нижней части колонны и поверните кольцо в сторону колонны.
    10. Установите DFM прямо на кольцо реторты(рисунок 1B). Подключите все электронные компоненты: источник питания, интерфейс питания и компьютер в соответствии с протоколом производителя.
    11. Как только компоненты подключены, следуйте протоколу производителя, чтобы закончить установку программного обеспечения DFM и DFM.
  3. CtМин Анализа
    1. Поверните входные и выходные клапаны жидкой ванны в открытые позиции.
    2. Нажмите кнопку питания, чтобы включить ванну с температурой, а затем нажмите кнопку воспроизведения, чтобы запустить программу повышения и поддержания температуры ванны до 25 градусов по Цельсию. Дайте жидкой ванне и колонке 5-10 мин, чтобы достичь и поддерживать 25 градусов по Цельсию.
    3. Снимите штепсельную вилку в верхней части колонны и замените ее воронкой (диаметр 5,08 см; см. рисунок 1C).
    4. Нажмите мух из их пищевой флакон в колонку.
    5. Удалите воронку и заменить его на верхнюю вилку быстро, будьте осторожны, чтобы не позволить мухам бежать. Дайте мух 5 минут, чтобы поселиться, иногда нажав нижней вилкой, чтобы поощрять мух подняться.
    6. Нажмите кнопку пуска на жидкой ванне и начнитепрограмму КТ мин рампирования (25 градусов по Цельсию в течение 5 мин; от 25 градусов по Цельсию до 10 градусов по Цельсию при 0,5 градусов по Цельсию/мин; 10 градусов по Цельсию в течение 2 минут; затем от 10 градусов по Цельсию до -10 градусов по Цельсию при 0,25 градусов по Цельсию/мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие варианты этого протоколаКТ мин ramping могут быть использованы в зависимости от исследовательского вопроса (например, сравнения последствий различных темпов наращивания на CTмин28).
    7. Нажмите откройте программное обеспечение для записи термокомпов на компьютере, а затем нажмите значок Record, чтобы начать запись температуры внутри колонки каждую секунду в течение всего анализа. Убедитесь, что каждая запись температуры включает в себя штамп времени, специфичный для второго, так что данные о температуре могут быть впоследствии объединены с данными из DFM.
    8. Добавьте 5 мл этанола 90% в коническую центрифугу 15 мл и поместите его в стойку под колонной.
    9. Иногда, нажмите нижнюю вилку столбца, чтобы побудить любых мух на дно, чтобы подняться. Большинство мух будет на окуне или в верхней части колонны на 15 градусов по Цельсию.
    10. При 15 градусов по Цельсию снимите нижнюю вилку и соберите мух, все еще на нижней вилке этанола. Подсчитайте и обратите внимание, что эти мухи были собраны при 15 градусов по Цельсию, ноих КТ мин неизвестно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура, при которой нижняя вилка удаляется должны быть решены до анализа и на основе прогнозируемыхКТ мин испытательного вида или лечения. Для этого анализа, 15 КК был выбран на основе КТмин этих конкретных линий DGRP найти в предварительных анализов.
    11. Поместите стеклянную воронку внешнего диаметра диаметром 75 мм в DFM. Отрегулируйте кольцо реторты, DFM и воронку так, чтобы они были под колонной. Убедитесь, что губа воронки полностью уплотняет дно колонны(рисунок 1D).
    12. Вставьте дно воронки в трубку сбора 15 мл(рисунок 1D).
    13. Откройте программное обеспечение DFM на компьютере, нажав на значок программного обеспечения. Программное обеспечение немедленно начнет запись времени / даты, когда мухи достигают ихКТ мин. Мухи, которые достигают ихКТ мин теряют нервно-мышечной функции и падают с их окуней, а затем через DFM.
    14. Монитор ли все мухи достигли их КТ мин,как температура уменьшается, проверяя верхнюю вилку и окуней, чтобы увидеть, если какие-либо мухи по-прежнему сидел (т.е., по-прежнему поддержания нервно-мышечной функции). Судебное разбирательство заканчивается, когда все мухи достигли своейКТ мин.
    15. В конце пробной версии отрегулируйте DFM и воронку от отверстия столбца. Некоторые мухи могут достигать своейКТ мин, но остаются застряли в колонке (т.е. вклинивается в окуня или оборванных одним tarsal крюк). Откройте верхнюю вилку и удалите этих мух. КТмин этих мух неизвестно.
    16. Объедините выходные файлы .txt из программного обеспечения для записи термокупл (т.е. температуры, даты и времени) и программного обеспечения DFM (т.е. количество мух через воронку, дату и время) с использованием команды Merge в RStudio. Слияние двух файлов на основе общей переменной даты/времени.

2. Высокая пропускная способность тепла KD анализ

  1. Сборка и подготовка аппарата
    1. С клеем, исправить стальной тканой проволочной сетки (1,5 мм диафрагмы) в нижней части 96 хорошо не дна пластины.
    2. Прикрепите магниты к противоположным сторонам нижней части 96 хорошо без дна пластины с горячим клеем пистолет и горячий клей (Рисунок 3).
    3. Для изготовления пользовательских перегородки крышкой с клейкой пленкой, предназначенной для 96 хорошо пластин, придерживаться двух пленок липкие стороны вместе, чтобы сформировать гребень пластиковый лист.
    4. Поместите пластиковые листы над пластиной 96 хорошо и использовать ленту, чтобы придерживаться его на всех четырех сторонах пластины. Над отверстием к каждому наилучшим образом на плите, отрежьте 'x' в пластичном листе с резаком коробки (т.е., 96 итог x's).
    5. Анестезия мух с CO2 и загрузить их индивидуально в каждый колодец модифицированных 96 хорошо не дна пластины с аспиратором и перегородки крышкой. Снимите крышку перегородки с пластины 96 хорошо в то время как мухи анестезированы с CO2 и заменить его плотно облегающей ясной крышкой.
    6. Поместите 96 хорошо без дна пластины загружены мухами и с четкой плотной крышкой на питание. Убедитесь, что мухи имеют по крайней мере 48 ч между анестезией CO2 и началом анализа (шаги 2.2.1-2.2.5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дно модифицированного 96 хорошо не дно пластины изготовлены из сетки, так мух анестезии с CO2 могут быть загружены и оставлены на питание, по крайней мере 48 ч до начала судебного разбирательства. Можно использовать любой пластиковый контейнер шириной 8,5 см и длиной 13 см, который имеет глубину не менее 2 см для размещения 1 см глубокого слоя пищи.
    7. Зафиксните веб-камеру на дне внутренней части контролируемого температурой инкубатора лентой. Назначай камеру прямо вверх(рисунок 4). Закрепт полку инкубатора примерно на 10 см над камерой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Веб-камера указывает вверх и записывает 96 хорошо пластины снизу, чтобы обеспечить как можно больше поверхности хорошо в поле зрения, как это возможно (например, не заблокирован из виду хорошо стены пластины). Когда мухи достигают КДТ, они падают на дно колодец; в этом случае, сторона ближе всего к веб-камере, и поэтому в поле зрения, независимо от того, насколько далеко их хорошо от центра зрения.
    8. Подключите веб-камеру к компьютеру.
    9. Лентой прикрепите белый лист бумаги (8,5 см х 13 см; точная площадь нижней части пластины 96 хорошо) к нижней частиполки (рисунок 4). Убедитесь, что бумага заполняет весь кадр при просмотре через веб-камеру.
    10. Поместите источник света в инкубатор. Используйте бумагу или другие материалы, чтобы ослабить освещение и свести к минимуму блики.
      ПРИМЕЧАНИЕ Шаг 2.1.10 специфичен для каждого инкубатора, потому что освещение и отражения различаются между инкубаторами. Цель состоит в том, чтобы иметь достаточное освещение в инкубаторе, чтобы обеспечить хороший контраст между мухами в каждом хорошо и белый лист бумаги за пластиной при просмотре с веб-камеры.
  2. Выполнение тепла KD анализ
    1. Установите инкубатор до 37,5 градусов по Цельсию и подождите около 30 минут, чтобы дать инкубатору время для достижения и поддержания желаемой температуры. Точная температура будет зависеть от оцениваемого насекомого и любых других соображений времени.
    2. Поместите 96 хорошо пластины перевернутый в инкубатор, так что в нижней части пластины (сетка стороны) против белой бумаги на дне лотка (Рисунок 4). Обратите внимание на ориентацию колодцев (колонки и названия строк) на подносе и в рамке веб-камеры. Цветная лента по бокам 96 хорошо пластины и края белого листа бумаги может проверить ориентацию (Рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что температура инкубатора соответствует температуре внутри пластины 96 хорошо, записывая температуру внутри пластины с термосюплом во время испытания тепла KD анализа. Кроме того, целесообразно проверить, что существует незначительное изменение температуры между скважинами 96 хорошо пластины с несколькими термоотеса перед проведением тепла KD анализа.
    3. Закройте дверь инкубатора.
    4. Нажмите Запись на программное обеспечение для записи видео.
    5. После 2 ч, проверьте запись, чтобы увидеть, что все мухи достигли своего последнего места отдыха и перестал двигаться. После того, как все мухи перестали двигаться, нажмите Stop на программное обеспечение для записи видео. Для генотипов, опробованных здесь, в возрасте 25 градусов по Цельсию, большинство мух достигают своего KDT на 60 мин9при 37,5 градусов по Цельсию (также см.
    6. Утилизация мух.
    7. Используйте пользовательские скрипты Python(Дополнительное кодирование файлов 1-3), чтобы приблизить время в видео, когда мухи достигают своего тепла KDT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.2.7 не является обязательным. Для ускорения анализа видео был разработан набор пользовательских скриптов Python для измерения изменений плотности пикселей с течением времени в каждой из систем (см. Дополнительный файл кодирования). Когда мухи перестают двигаться, плотность пикселей постоянна, и участок этих данных может быть использован для определения приблизительного времени на видео, когда мухи сбиваются. Хотя этот скрипт можно использовать для автоматизации анализа данных, в настоящее время незначительные недостатки в видео приводят к незначительным расхождениям между изменениями плотности пикселей и истинным временем KD.
    8. Нажмите открыть видео файл и записать KDT каждой мухи в каждой хорошо. Наиболее последовательной мерой тепла KDT между испытаниями и наблюдателями является запись времени, в которое муха достигает своего последнего места отдыха.
    9. Отслеживайте видео в обратном направлении, сосредоточившись на одной колодец, и увечья время, в которое муха впервые перемещается со своего последнего места отдыха. Повторите этот процесс для каждого хорошо.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Тепловые пределы (т.е.КТ мин и тепловой КДТ) женщин из группы генетических справочных данных Drosophila melanogaster (DGRP) были измерены, чтобы продемонстрировать данные о высокой пропускной способности, полученные в результате двух описанных протоколов. CTмин был просасирован с помощью линий DGRP 714 (n No 37) и 913 (n No 45). Тепло KDT был проанализирован и по сравнению с линиями DGRP 189 (n No 42) и 461 (n No 42), и видеофайлы были проанализированы вручную. Общее время экспериментов, включая просмотр видео, заняло 2 ч для каждого протокола.

Самки из линии DGRP 913 имели значительно более низкие средние температуры CTmin, чем самки из линии DGRP 714(рисунок 5A; Уилкоксон ранга сумма теста, W No 1585, P Lt; 0,001). Эти две линии имели четкое четкоераспределениеКТ мин : линия 913была КТ мин 5,00 ± 1,35 кк (средний ± SD) и линия 714 был CTмин 9,60 ± 1,53 градусов по Цельсию.

Тепло КДТ при температуре 37,5 градусов по Цельсию значительно отличалось между самками от линий DGRP 73 и 461(рисунок 5B; Уилкоксон ранга сумма теста, W No 1658,5, P Lt; 0,001). Несмотря на различия в КДТ обеих линий, различия в тепловых КДТ между линиями были легко обнаружены. Линия 73 имела на 14,8 мин больше среднего KDT, чем линия 461 (линия 73 средняя KDT, 55.58 ± 6.92 мин; Линия 461 означает KDT, 40,78 ± 6,64 мин).

Figure 1
Рисунок 1: Настройка куртку колонку дляКТ мин анализа. (A)Собранная колонна в куртке. (B)Куртка колонки с верхней и нижней пробки уплотнения внутренней камеры. Термокомп через отверстие в верхней вилке. DFM устанавливается на кольцо реторты под колонной и перемещается в сторону. (C)Начало анализаКТ мин. Верхняя вилка была удалена и мухи были налил во внутреннюю камеру через воронку в верхней части открытия колонны. (D) Куртка колонки и DFM во времяКТ мин анализа. Нижняя вилка была удалена из столбца, а DFM и воронка были расположены ниже столбца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Техническая иллюстрация колонны в куртке. (A)Каждый кусок акриловой трубки вырезать по длине: i) два кольца спейсера сократить до 3,5 см в длину (шаг 1.1.2):ii). самый широкий акриловый разрез труб до 31,5 см (шаг 1.1.1); и iii самая узкая акриловая трубка, вырезанная до 31,5 см (шаг 1.1.1). (B)Два отверстия (серый) пробурены в самый широкий кусок акриловой трубки, 3,5 см с каждого конца и на противоположных сторонах (i; шаг 1.1.2). Сборка самой узкой части акриловой трубки с двумя кольцами-космонавтами (ii; шаги 1.1.6 и 1.1.7). (C)Завершенная колонка в куртке после шагов 1.1.8-1.1.12. Адаптеры шланга обозначены серым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Нижний (слева) и верхний (справа) вид на 96 хорошо не-нижней пластины. Стальная тканая сетка крепится к нижней части модифицированной пластины без дна 96. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Настройка инкубатора для анализа тепла KD. (A)Веб-камера и этап, установленные на расстоянии. (B)Веб-камера и установка сцены в инкубаторе до начала судебного разбирательства. Веб-камера крепится к полу инкубатора, а лоток на 10 см выше веб-камеры. (C) Ориентация 96 хорошо пластины на белой сцене над веб-камерой во время тепла KD анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Нижние и верхние тепловые пределы выбранных линий из генетической справочной группы Drosophila (DGRP). (A)CTмин значения двух линий DGRP. (B)Тепло KDT двух линий DGRP на 37,5 градусов по Цельсию, пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 6: Выход активности из сценариев видео-анализа тестового набора данных. Каждый участок представляет данные о деятельности из одной пластины 96 хорошо. Всего было проверено и показано 84 образца. Ну ID помечены справа от каждой гистограммы.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту цифру.

Дополнительный кодирующий файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодирующий файл 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный кодирующий файл 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion


Эти два метода, описанные выше, генерируют высокотемпутные данные экологически релевантных метрик для верхних и нижних тепловых пределов. Эти протоколы основаны на ранее установленных методологиях, общих для исследования тепловых пределов насекомых (обобщенные в Sinclair et al.) 6.Оба протокола могут быть завершены в короткий промежуток времени (по 2 ч каждый), производить наборы данных с большими размерами выборки, не жертвовать повторяемость или точность, и свести к минимуму ошибку экспериментатора, устраняя ручной записи данных и ввода (CTмин анализ), или путем создания резервного копирования видеозаписи каждого анализа (тепло KD анализ).

Репрезентативные результаты были получены путем сравнения тепловых пределов взрослых самок из выбранных линий DGRP24. Оба анализа показали значительные различия в тепловой толерантности между линиями. Размер эффекта между линиями в каждом из этих анализов был относительно большим, что, в свою очередь, позволяло проводить надежную дифференциацию групп с визуальными и статистическими сопоставлениями. Большая разница в KDT между двумя линиями DGRP подчеркивает потенциальное преимущество статического анализа над динамическим анализом; статические анализы могут быть лучше в состоянии обнаружить меньшие различия между группами, чем динамическиеанализы 9. Две линии DGRP, подвергаемые тепловому анализу KD, отличались в среднем KDT на 14,8 мин. Для справки, используя динамический протокол рампирования, Rolandi et al.13 показали, что разница самыхвысоких и низких максимальных значений КТ 34 линий DGRP составила всего 1,42 градуса по Цельсию, или lt;6 мин с пандусом 0,25 градусов по Цельсию/мин.

По сравнению с другими методами, Есть несколько преимуществ какКТ мин анализа и тепла KD анализ описано здесь. Автоматизированный подсчет ванализе CT min уменьшает количество времени, которое экспериментатор проводит в аппарате, тем самым увеличивая количество времени, которое может быть потрачено на другие задачи. Стоимость строительства акриловой куртке колонке составляет $ 50, по сравнению с оценками $ 400 на покупку на заказ стеклянной куртке колонке. При тепловом анализе KD видеозапись устраняет необходимость прямых наблюдений в режиме реального времени и занимает небольшое количество физического пространства на образец. Другие протоколы, такие, как те, которые используются в J'rgensen et al.9, используют большой аквариум для просмотра лиц, погруженных в отдельные флаконы, но этот метод требует хорошо обученных следователей, чтобы быстро проверить флаконы для движения и большое количество места для аппарата. Rolandi et al.13 использовали инфракрасные датчики для обнаружения движения или отсутствиядвижения при максимуме КТ в 96 пластинах, в то время как этот тепловой анализ KD использует недорогую веб-камеру ($70) для обнаружения движения. Эта камера может обнаруживать тонкие движения, которые могут быть пропущены инфракрасным монитором активности.

Кроме того, был разработан набор настраиваемых скриптов для быстрой оценки KDT в тепловом анализе KD(Дополнительный кодирующий файл 1-3). Эти скрипты могут быть использованы для экономии времени путем получения грубого приближения тепла KDT в каждом задолго до просмотра видео, и с более высоким качеством видео эти скрипты потенциально могут автоматизировать запись данных. Три скрипта для обработки видео были предоставлены: FirstFrame.py (Дополнительный кодирующий файл 1), который определяет первый образ кадр видео; WellDefine.py (Дополнительный кодирующий файл 2), который определяет каждый отдельный колодец из 96 хорошо пластины в первом кадре изображения; и MotionDetect.py (Дополнительный кодирующий файл 3), который преобразует видеофейл в сигнал активности, вычисляя изменение плотности пикселей между последовательными кадрами. Единственным входом в программу является видео файл, и выход включает в себя сводную статистику и набор данных по тайм-ряду активности на колодец(рисунок 6). Различия в плотности пикселей между видеорамки преобразуются с помощью фильтра серой шкалы для уменьшения размеров изображения, гауссийского фильтра низкого прохода для снижения шума изображения и морфологической операции расширения для увеличения границ движущихся объектов. В этом случае активность определяется как абсолютная разница значений пикселей между последовательными кадрами. Тепло KDT можно оценить как индекс последнего кадра, содержащего значение активности, больше нуля. Например, кадр, в котором активность в последний раз была записана в хорошо g12 наборавыборочных данных (рисунок 6) был сразу после 2000 с (33,33 мин), как указано на плоской линии. Наблюдатель может воспроизведения цифрового видео и быстро найти тепла KDT хорошо g12 с этой маркой времени.

С незначительными изменениями и устранением неполадок есть дополнительные приложения для обоих анализов, в первую очередь с тепловым анализом KD. Настройка видеозаписи может быть изменена для записи статического холодного нокдауна, времени восстановления комы или потенциально динамическихзначений CT max и CTmin. Холод кома время восстановления количество времени, которое требуется человеку, чтобы возобновить движение после холодного стресса29. Таким образом, холод комы время восстановления может быть измерена с этой установки, вызывая холод комы в 96 хорошо пластины, а затем с помощью видео установки для записи времени восстановления в инкубаторе. Наконец, при тщательной тонкой настройке,динамический CT max или CTmin может быть записан в программируемом ramping инкубаторе. Тщательное внимание к температуре внутри каждой из 96 скважин было бы проблемой, поскольку небольшие колебания температуры в инкубаторе могут быть увеличены между скважинами по мере изменения температуры.

При выполнении анализа КТ мин или тепловогоKD следует учитывать ряд соображений. Прежде всего, качество, возраст, пол, этап жизни, генетический фон, и предыдущий опыт насекомого может повлиять на тепловыепределы 6,,13,,30,,31. Для обоих анализов, испытуемые должны быть пестрым. Во-вторых, только одна группа может быть просасирована в то время, для каждогоаппарата КТ мин. Таким образом, при сравнении процедур необходимо учитывать такиепеременные, какдиурнальную вариацию в термической толерантности 32,33. Одним из решений этой проблемы является проведениеКТ мин анализы нескольких условий лечения с несколькими аппаратами в то же время. В-третьих, некоторые виды могут не подходить для одного или обоих анализов. Например, некоторые виды могут не легко подниматься или летать на окунях в анализе КТмин или могут прекратить деятельность при высоких температурах до их тепла KDT достигнут, что сделает его трудно различить время нокдауна. Наконец, для обеспечения точных сопоставлений в тепловом анализе КД крайне важно, чтобы критерии КДТ (шаг 2.2.8) соответствовали репликациям, наблюдателям, испытаниям и т.д. Для размещения различных видов насекомых могут потребоваться изменения в любом из испытательных аппаратов. Потенциальные изменения включают в себя использование различных типов окуней для анализаКТ мин, используя пластины клеточной культуры с меньшим количеством скважин и больше места (48, 24, 12 или 6 скважин) вместо 96 хорошо пластины для размещения крупных насекомых, или корректировки температуры, используемой для тепла KD анализа для обеспечения нокдаун время, которое не слишком быстро или слишком медленно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Элли Маккейб за помощь в воспитании мух. Эта работа поддерживается Министерством сельского хозяйства США Национальный институт продовольствия и сельского хозяйства Hatch проекта гранта 1010996 и Национальный научный фонд грант OIA-1826689 В.М.Т.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) Thermo Scientific; Waltham, MA 153-5401
C922 Pro Stream Webcam Logitech; Newark, CA 960-001087
Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm Any Any
Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44036
Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 440515
Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm United States Plastic Corp., OH 44041
Clear silicone sealant Any Any
Collection tube (15 ml) Any Any
Cordless Drill Any Any
Drosophila Funnel Monitor (DFM) TriKinetics; Waltham, MA DFM Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point
DAM data collection software TriKinetics; Waltham, MA Records data input from the DFM
Fly Storage Lid FlySorter; Seatle, WA FS-96LID-5PK Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay
Fly Storage Plate FlySorter; Seatle, WA FS-96PLATE-5PK Used to hold flies during in the sCTmax assay
Fly Food Tray FlySorter; Seatle, WA FS-TRAY-5PK Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay
Glass funnel Kimax 28950-75 75mm
Gutter guard Any Any ~0.5 cm diameter openings
Hacksaw Any Any
Heratherm Thermo Scientific incubator Thermo Scientific; Waltham, MA OMS100
Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 United States Plastic Corp., OH 61135
Hot glue gun and glue Any Any
Light Source Any Any
Magnets Any Any
OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software OMEGA; Norwalk, CT
OMEGA thermocouple (Type T) OMEGA; Norwalk, CT 5LRTC-TT-K-20-36
Plastic funnel Any Any 2" diameter
Plastic tubing - 0.6 cm diameter United States Plastic Corp., OH 62852
Retort ring Any Any 2" diameter
Retort stand Any Any
Retort three-prong clamp Any Any
Rstudio
Serial port connector (PSIU9) TriKinetics; Waltham, MA PSIU9 Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections
Styrofoam (2" thick) Any Any
Tape Any Any
Uninterrupted Power Supply (PS9-1) TriKinetics; Waltham, MA PS9-1 Power supply for the DFM and PSIU9
Weld-on #4 Acrylic Cement United States Plastic Corp., OH 45737

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. Angilletta, M. J. Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , New York, NY. (2009).
  3. Coumou, D., Rahms Torf, S. A decade of weather extremes. Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).
  4. Wang, G., Dillon, M. E. Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles. Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).
  5. MacMillan, H. A. Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits. Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).
  6. Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow. Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).
  7. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: History and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  8. Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. Unifying indices of heat tolerance in ectotherms. Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).
  9. Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).
  10. Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects. Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).
  11. Andersen, J. L., et al. How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits. Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).
  12. Hu, X. P., Appel, A. G. Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).
  13. Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).
  14. Overgaard, J., Kristensen, T. N., Sørensen, J. G. Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods. PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).
  15. Klok, C. J., Chown, S. L. Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae). Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).
  16. Salachan, P. V., Burgaud, H., Sørensen, J. G. Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).
  17. Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates. Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).
  18. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus. Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).
  19. Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects. British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).
  20. Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field. Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).
  21. Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster. Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).
  22. Sørensen, M. H., et al. Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect. Biology Letters. 15 (10), (2019).
  23. Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products. Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).
  24. MacKay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  25. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: A laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
  26. Garcia, M. J., Teets, N. M. Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).
  27. Teets, N. M., Hahn, D. A. Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability. Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).
  28. Kelty, J. D., Lee, R. E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).
  29. MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. Mechanisms underlying insect chill-coma. Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).
  30. Salachan, P. V., Sørensen, J. G. Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations. Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).
  31. Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster. Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).
  32. Kelty, J. D., Lee, R. E. Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles. Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).
  33. Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. Insects at low temperatures: An ecological perspective. Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).

Tags

Биология Выпуск 160 тепловые ограничения критическая тепловая минима,КТмин критическийтепловоймаксимум КТ макс тепло сбить время KDT насекомые Drosophila меланогастер
Высокая пропускная способность анализ критических тепловых пределов у насекомых
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Awde, D. N., Fowler, T. E.,… More

Awde, D. N., Fowler, T. E., Pérez-Gálvez, F., Garcia, M. J., Teets, N. M. High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects. J. Vis. Exp. (160), e61186, doi:10.3791/61186 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter