Summary
这里描述的方法是利用斑马鱼胚胎研究功能化纳米粒子在体内瞄准人类癌细胞的能力。此方法允许评估和选择最佳纳米粒子，供将来在大型动物和临床试验中进行测试。
Abstract
开发能够检测、瞄准和破坏癌细胞的纳米粒子在纳米医学领域有着浓厚的兴趣。将纳米技术与生物医学应用衔接，需要体内动物模型。小鼠代表传统的动物模型进行临床前测试;然而，由于每个母亲的后代有限，小鼠的保留费用相对昂贵，实验周期也很长。斑马鱼已成为一个强大的模型系统，用于发展和生物医学研究，包括癌症研究。特别是，由于其光学透明度和快速发展，斑马鱼胚胎非常适合实时体内监测癌细胞的行为及其与微环境的相互作用。该方法被开发成在透明卡斯珀斑马鱼胚胎中依次引入人类癌细胞和功能化纳米Casper粒子，并实时监测纳米粒子对癌细胞的体内识别和靶向。这种优化的协议表明，荧光标记的纳米粒子，与叶酸组功能化，可以专门识别和靶向转移性人类宫颈上皮癌细胞标记不同的荧光色素。识别和靶向过程可尽早在纳米粒子的注射后 30 分钟进行。整个实验只需要繁殖几对成年鱼，只需不到4天才能完成。此外，斑马鱼胚胎缺乏功能适应性免疫系统，允许广泛人类癌细胞的移植。因此，此处描述的协议的效用使纳米粒子能够对不同类型的人类癌细胞进行测试，从而促进在每个特定癌症环境中选择最佳纳米粒子，供将来在哺乳动物和诊所进行测试。
Introduction
能够检测、瞄准和破坏癌细胞的纳米粒子的发育引起了物理学家和生物医学研究人员的高度重视。纳米药物的出现导致了几种纳米粒子的发展，例如那些与靶向配体和/或化疗药物,1、2、32结合的粒子。纳米粒子的附加特性使其能够与生物系统相互作用，高效、精确地传感和监测生物事件以及治疗应用。黄金和氧化铁纳米粒子主要用于计算机断层扫描和磁共振成像应用。虽然金和氧化铁纳米粒子的酶活动允许通过色度测定检测癌细胞，但荧光纳米粒子非常适合体内成像应用4。其中，超亮荧光纳米粒子特别有益，因为它们能够用更少的颗粒和减少毒性早期检测癌症。
尽管有这些优点，纳米粒子需要利用体内动物模型进行实验，以选择合适的纳米材料和优化合成过程。此外，就像药物一样，纳米粒子依靠动物模型进行临床前测试，以确定其功效和毒性。使用最广泛的临床前模型是老鼠，它是一种哺乳动物，其维护成本相对较高。对于癌症研究，无论是基因工程小鼠还是异种移植小鼠，通常使用6,6，7。这些实验的长短通常从几周到几个月。特别是，对于癌症转移研究，癌细胞被直接注射到小鼠的循环系统中，如尾静脉和静脉8，9，10。,9,10这些模型只代表肿瘤细胞外在和殖民远距离器官时转移的结束阶段。此外，由于能见度问题，监测小鼠肿瘤细胞的肿瘤细胞迁移和纳米粒子靶向尤其具有挑战性。
斑马鱼（Danio rerio）由于其高繁殖性、低成本、快速发展、光学透明度和遗传保护，,已成为癌症研究的强大脊椎动物系统。斑马鱼比小鼠模型的另一个优点是鱼卵在子宫外受精，这使得胚胎在整个发育过程中受到监测。斑马鱼胚胎发育迅速，在受精后24小时内，脊椎动物体平面已形成13种。到72马力，卵子从卵子孵化，从胚胎过渡到煎蛋阶段。斑马鱼的透明度，特别是14，提供了一个独特的机会，可视化癌细胞的迁移，并识别和定位纳米粒子在活的动物。 Casper最后，斑马鱼以48马力发展其先天免疫系统，适应性免疫系统落后，在受精后28天才发挥作用。这种时间差距是将各种类型的人类癌细胞移植到斑马鱼胚胎而不经历免疫排斥的理想之选。
本文介绍，利用斑马鱼的透明度和快速发展，通过荧光纳米粒子在体内识别并定位人类癌细胞。在这项测定中，人类宫颈癌细胞（HeLa细胞）被基因工程表达红色荧光蛋白被注射到48马力胚胎的腹腔内血管化区域。20-24小时后，HeLa细胞已经通过鱼类循环系统扩散到整个胚胎。具有明显转移的胚胎被微缩，直接在眼睛后面用±0.5 nL的纳米粒子溶液，富毛细管床就位于眼睛后面。利用这种技术，超亮荧光二氧化硅纳米粒子可以快速瞄准 HeLa 细胞，在注射后 20-30 分钟。由于其简单性和有效性，斑马鱼代表了一个强大的体内模型，以测试各种纳米粒子的能力，他们的目标特定的癌细胞。
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Protocol
所有动物程序都经过波士顿大学医学院动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，其规程为：PROTO201800543。
1. 卡斯 珀斑马鱼 胚胎的生成
- 选择 至少 3个月的成年卡斯珀鱼进行自然繁殖，以产生透明的 卡斯珀 斑马鱼胚胎。
- 晚上用鱼水填充两室交配水箱，用分压器将上部水箱分开，将一条雄性鱼放入腔室的一侧，将一条或两条雌鱼放入室的另一侧，让鱼用分管隔夜分离。
- 第二天早上8点，当灯亮着时，拉出分隔线。添加人工富集植物，稍微倾斜顶室，形成浅水区。让鱼繁殖3-4小时。
- 提起包含鱼的交配罐的顶部室，并将它们返回到原来的鱼缸。
- 通过网状水浇灌，收集底部腔室中的鸡蛋。将鸡蛋转移到无菌培养皿中，密度不超过每盘200个鸡蛋。取出任何死鸡蛋或未受精卵，将菜中装满新鲜的鱼水。
注：受精和健康的鸡蛋应该是半透明和圆的。任何浑浊、白色或毁容的鸡蛋都应被移除。鱼水是从鱼设施的鱼缸中获得的。 - 在28.5°C的孵化器中孵育胚胎过夜。
- 第二天早上，使用《斑马鱼书》第16节中描述的标准方案漂白胚胎，将胚胎放回孵化器（可选步骤）。
- 下午把24个h分胚胎从孵化器中取出，用前鼻塞去掉胚胎。
- 从培养皿中的胚胎中去除尽可能多的鱼水，并在培养皿中加入几滴蛋白酶溶液（鱼水中1毫克/mL）。轻轻旋转培养皿。一旦胆小子出现分裂的迹象，移液胚胎上下几次分解胆子以释放胚胎。
- 立即将新鲜的鱼水加入培养皿中，一旦大多数胚胎从胚胎中出来，就终止这个过程。用鱼水冲洗胚胎3倍，去除漂浮的胆小子。将胚胎返回孵化器。
2. 人类癌细胞移植的准备
- 将培养箱温度设置为正好 35.5 °C。 使用培养箱内的温度计监控培养箱，确保温度稳定。
- 在玻璃瓶中自动保存 1 L 的鱼水。将 3% 的 agarose 溶液加入 3 g 电泳级 agarose 到 100 mL 的自动杀鱼水和微摇，直到 agarose 完全溶解。
- 将热的阿加罗斯溶液倒入培养皿中，直到其满3~4分。将微注射模具放在红糖上。确保模具未与培养皿底部接触，且下方没有气泡。
- 让溶液凝固，小心地从板材上取下模具。将盘子装满自动清洁鱼水，并在4°C时将盘子储存。 在收获 HeLa 细胞之前，在 35.5 °C 培养箱中预热阿加罗斯板和鱼水。
- 使用以下设置在移液器拉拔器上拉动 1.0 mm O.D. x 0.78 mm 硅酸盐玻璃毛细管：压力在 500，热量在 560，拉在 100，速度在 100，时间/延迟在 200。将针头放在用乙醇毛巾擦掉的大培养皿的培养皿上。
注意：拉针非常锋利和脆弱。处理时要小心。 - 通过将MS222溶解到自动捕获的鱼水中，准备三甲烷硫化酯（MS222，4毫克/mL）的库存溶液。使用前做好漩涡。在鱼水中稀释MS222库存溶液1：100（即将200 μL的MS222鱼种溶液加入20 mL的鱼水中，最终浓度为40微克/mL），使胚胎麻醉，执行以下程序。
- 培养hLabel HeLa细胞通过转PLenti6.2_miRFP670用一种龙体病毒使用描述的协议17。在移植前30分1小时采集RFP®HeLa细胞。
注：在37°C下，在完全生长的培养基（DMEM培养基，有10%FBS）中，在组织培养培养箱中培养人类 HeLa 细胞，辅以 5% CO2。- 通过组织培养罩中的吸气去除 HeLa 细胞介质。用无菌 PBS 短暂冲洗细胞层，以去除血清的所有痕迹。
- 将3.0 mL的无菌 Trypsin-EDTA溶液加入T-75烧瓶中，并将细胞放回37°C组织培养箱中3-5分钟，以促进酶消化。在显微镜下观察烧瓶，直到 ±80% 的细胞悬浮。
- 在烧瓶中加入6-8 mL的完整生长介质。通过轻轻移液将细胞收集到15 mL无菌管中。在 135 x g 下 离心 5 分钟。
- 在完全生长介质的3mL中吸升和重新暂停的 HeLa 细胞。重复上述清洗步骤2x。将细胞重新在1mL的完整生长介质中，并使用血细胞计在显微镜下计数细胞。
- 再次向下旋转细胞，取出上流液，并在浓度为 5 x 107 7 细胞/mL的 1.5 mL 微离心管中重新暂停细胞。在运送到鱼设施时，用一只手握住管子，使细胞保持温暖。
注：在注射胚胎之前或期间，通过将细胞储存在35.5°C培养箱内，始终保持细胞温暖。
3. 人类癌细胞移植
- 移植前使用乙醇毛巾（如剪刀、钳子、塑料移液器、剃须刀刀片）清理工作区。
- 使用塑料移液器在红糖板的凹槽内对齐胚胎。将胚胎放在一边，前朝前。
注：确保鱼水覆盖胚胎。将一些胚胎放在一边，不注射癌细胞，并用作对控。 - 打开空气源和微控制器。将 HeLa 细胞从培养箱中取出，并使用 P200 尖端将细胞上下移液 20-30 倍。使用带切端的凝胶加载尖端，立即将 3 μL 的细胞混合物加载到针头中。小心地将尖端插入针头的锐利下端。如果需要，摇动针头以确保细胞混合物向下移针以填充锋利的端。
- 将针头插入针架。用一对钳子小心地打开针尖。调整微注射器上的压力和持续时间，以推出针尖内的所有气泡。减少压力和喷射持续时间，直到注射液滴的大小为 ±1 nL。
- 将注射板放在显微镜下，使胚胎的蛋黄侧朝向针头。通过添加五滴稀释的MS222溶液（40μg/mL）来麻醉胚胎。
- 放置喷油器，让针头接触每个胚胎的腹腔。
- 通过踩脚踏板将细胞混合物注射到腹腔下血管化区域的胚胎中。
- 使用非多米诺手将注射板移动到下一个胚胎。同时踩脚踏板以继续喷射时，使用主导手伸展和缩回喷油器。将几滴无菌鱼水滴到已注射的胚胎上。一旦在盘子里的所有胚胎注射完成，用无菌鱼水洗掉胚胎，把它们放在无菌培养皿上，然后立即将它们移动到35.5°C的培养箱。
- 3小时后，检查注射的胚胎并取出死胚胎。
- 将活胚胎返回到35.5°C培养箱，孵育20-24小时，使 HeLa 细胞从注射部位扩散到身体的其他部位。
注：胚胎保存在35.5°C的培养箱中，允许人类癌细胞的生存和迁移，因为细胞在28.5°C下表现良好，温度鱼胚胎通常被孵育。
4. 纳米粒子或车辆的喷射
- 第二天早上，用五滴稀释的MS222溶液对移植的胚胎进行麻醉。不要添加太多的MS222，因为这会杀死胚胎。在荧光显微镜下，小心地拾取具有RFP®HeLa细胞尾部转移的胚胎，并把它们放入一个新的培养皿中，用无菌鱼水。
- 使用以下设置进行第 2 节中描述的注射针：压力在 500，热量在 645，拉力在 60，速度在 50，时间/延迟在 100。
- 按照步骤 3.1-3.3 中的步骤将胚胎和装载工具（例如 H2O）或纳米颗粒溶液对齐到针头中。
- 将 0.5 nL 的 1 mg/mL 纳米颗粒溶液注射到眼睛后面，然后按照步骤 3.5-3.6（图1B ）中所述继续注射。眼睛后面的这个位置富含毛细管，使纳米粒子进入循环。
- 按照类似的程序，注射用于将纳米粒子悬浮到胚胎中的车辆（如H2O），移植的HLa细胞和没有（即对控）的细胞（图1A，C）。
- 在35.5 °C下孵育所有注射胚胎。
5. 纳米粒子和癌细胞的成像和跟踪
- 在荧光显微镜下检查注射的胚胎，在0、30、60、90、120、180和210分钟后，在纳米粒子的注入后监测其在循环中的分布和癌细胞靶向程度。根据所测试的纳米粒子类型，在注射后30分钟就可以观察到纳米粒子对癌细胞的靶向。
- 将2-3个胚胎放入培养皿中，通过加入五滴稀释的MS222溶液（40μg/mL）来固定胚胎。一旦胚胎停止游泳，取出大部分水，让胚胎躺在它们的两侧。
- 使用一个移液器，其末端附着一个细而柔软的刷子，使胚胎对齐，使胚胎位于其两侧，前朝向前，只有一只眼睛可见。
- 以红色、蓝色和明亮的场通道以低放大倍率（2倍）成像胚胎，以捕获整个胚胎，并在较高的放大倍率（6.4倍）下重复以捕捉尾部区域。将胚胎聚焦在红色通道下，以避免纳米粒子出血。
注：胚胎在成像期间不得移动。任何移动都会导致图像模糊，无法重叠不同通道的图像。 - 成像后立即向胚胎添加新鲜的鱼水，并将它们返回到孵化器。重复步骤 5.2-5.4 以在不同时间点对胚胎进行成像。
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Representative Results
图 1 中的协议示意图说明了本研究的总体过程。透明 卡斯珀 雄性和雌性成年鱼被培育成胚胎（第1节）。RFP® HeLa 细胞在 48 hpf 的斑马鱼胚胎周围腔下被注射到血管化区域，以未插入的胚胎作为对数（第 3 节）。对于经历微注射的个体来说，胚胎的存活率通常很高，至少50%的胚胎移植在35.5°C孵化器中存活的癌细胞中，这是斑马鱼胚胎的温度低于理想，但是人类癌细胞的存活和迁移所需的温度。HeLa细胞具有高度侵入性，可内创并扩散到胚胎的尾部区域，只要注射后8小时。到移植后20-24小时，50%的移植胚胎显示出 HeLa 细胞转移性扩散的迹象。那些具有癌细胞尾部转移的胚胎被选用于下游实验。在72马力时，这些胚胎随后在眼睛后面注射蓝色荧光纳米粒子（第4 节和图1B），或仅与车辆作为控制（图1A）。年龄匹配的胚胎注射纳米粒子，但没有癌细胞移植是第二组对等细胞（图1C）。有关纳米粒子合成、制备和表征的更多详细信息，请参见 Peerzade 等人18。
在0，30，60，90，120，180，210分钟后纳米粒子，通过成像监测注射的胚胎，以确定纳米粒子与RFP®HeLa细胞的相互作用，使用车辆注射的胚胎作为对子。具体来说，使用荧光显微镜对RFP® HeLa细胞扩散到的斑马鱼尾部区域进行红、蓝、亮场照明成像（第5节）。Peerzade等人图5详细描述超亮纳米粒子在一定时间内靶向斑马鱼中异种移植癌细胞的能力。胚胎尾部看到的红点是转移性人类子宫颈癌细胞，在车辆和纳米粒子注射胚胎中可见（图2A，D;图 3A， D.不出所料，在仅车辆注射的胚胎中未检测到特定的蓝色荧光信号（图2B，E）。此外，当在红色和蓝色通道中捕获的图像被合并时，只观察到尾部区域的红色癌细胞没有任何蓝色信号（图2C，F）。然而，在注射超亮荧光二氧化硅纳米粒子的胚胎中，尾部有蓝点，在3.5小时左右的癌细胞附近和周围（图3B，E）。在从红色和蓝色通道捕获的叠加图像中，红色 HeLa 细胞和蓝色纳米粒子被同化，被视为粉红色点（图 3C， F）。在那些只注射纳米粒子但没有移植到 HeLa 细胞的胚胎中，蓝色荧光粒子没有浓缩到任何特定的细胞或区域，而是相对均匀地分布在胚胎的循环系统中，突出了血管（图4B，E）。不出所料，尽管有些弱背景荧光信号（图4A、C、D、F），但这些胚胎中未检测到特定的红色荧光信号。
该协议随后用于测试不同类型的纳米粒子18，19，20。,19,20根据所测试的纳米粒子的特性，在注射后30分钟就观察到了具有某些类型纳米粒子的癌细胞的结肠化。到120分钟，这些纳米粒子在鱼的尾部区域中，有80%的癌细胞被靶向。然而，对于其他纳米粒子，观察到癌细胞的最小靶向，与它们缺乏癌症特异性配体一致。详细的结果和分析包括在 Peerzade 等人（参见图 3 和图 4，补充图 S12-S16 和补充表 S6）18。这些结果表明，纳米粒子的差别定位与斑马鱼中异种移植的 HeLa 细胞不同。因此，使用这种协议，人们应该能够根据纳米粒子识别和靶向体内转移的人类癌细胞的能力来有效地选择纳米粒子。
图1：用于研究纳米粒子瞄准人类癌细胞能力的方案示意图。 透明 卡斯珀 胚胎是通过繁殖的雄性和雌性成年鱼产生的。受精胚胎被收集在培养皿中。在48马力时，RFP® HeLa细胞被注射到斑马鱼胚胎的腹腔中，使一些年龄匹配的胚胎未被注射为对基。在72马力时，选择具有转移性RFP® HeLa细胞的胚胎，分为两组：（A）注射车辆（H2O）作为控制，（B）注射悬浮在H2O中的纳米粒子。第三组是年龄匹配的胚胎，单独注射纳米粒子（C）。所有三组都用荧光显微镜成像。显示的盒装区域是捕获图像的地方（参见 图 2-图 4）。成年鱼的缩放条 = 1 毫米和胚胎 = 500 μm 。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图2：斑马鱼移植与转移性肝细胞没有纳米粒子。 只有红色荧光 HeLa 细胞在单个（A， D） 或红色通道和蓝色通道（C， F ） 的叠加图像中可见。通过车辆注射控制（B、E），在胚胎中未检测到特定的蓝色荧光信号。图像在 （A-C） 显示鱼尾区域盒装图 1A。图像中的图像 （D-F） 是 （ A-C ） 中装箱区域的放大视图。比例线在 （A-C） = 200 μm 和在 （D-F） = 100 μm。 请单击此处查看此数字的较大版本。
图3：斑马鱼中红色荧光希拉细胞和蓝色荧光纳米粒子的结肠化。 斑马鱼尾在红色和蓝色通道中以低（A-C） 和高 （D-F） 放大倍率进行成像。红色荧光信号显示转移性 HeLa 细胞 （A 、 D）， 而蓝色荧光信号显示纳米粒子 （ B 、E） 。来自红色和蓝色通道（C、F）的叠加图像显示了 HeLa 细胞和纳米粒子的结肠化.图像是在3.5小时注射超亮硅纳米粒子后拍摄的。图像中（A-C） 显示图 1B中的鱼尾区域。图像中的图像 （D-F） 是 （ A-C ） 中装箱区域的放大视图。比例线在 （A-C） = 100 μm 和在 （D-F） = 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：斑马鱼注射纳米粒子，没有人类的希拉细胞。蓝色荧光纳米粒子被分配到个体（B、E）胚胎的循环系统中，并叠加了红色和蓝色通道（C、F）的图像。除了斑马鱼胚胎常见的背景荧光外，在低或高放大（A、D）时没有明显的红色荧光。图像中（A-C）显示图1C 中的鱼尾区域。图像中的图像 （D-F） 是 （ A-C ） 中装箱区域的放大视图。比例线在 （A-C） = 100 μm 和在 （D-F） = 50 μm。 Please click here to view a larger version of this figure.
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Discussion
此处描述的协议利用斑马鱼作为体内系统来测试纳米粒子识别和靶向转移性人类癌细胞的能力。有几个因素会影响实验的成功执行。首先，胚胎需要在48马力时完全发育。胚胎的正确发育阶段使它们能够忍受人类癌细胞的移植并存活下来。与年龄较大、发育较发达的胚胎相比，48马力以下的胚胎存活率要低得多。其次，癌细胞应尽可能保持健康，确保它们：1） 在指数生长阶段21，2）21移植前30分-1小时新鲜收获，3）保持温暖。第三，针不能堵塞。在将细胞混合物加载到针头中之前，将 HeLa 细胞上下移位至少 20 倍。第四，必须使用不同类型的针头进行人体癌细胞移植和纳米粒子注射。人体细胞移植的针头相对较宽，有一个角度，以避免细胞堵塞，而用于纳米粒子注射的针头是锋利和薄的。第五，注射的位置不同。人类细胞移植的位置是腹腔，但对于纳米粒子注射，针应该插入眼皮后，那里有丰富的毛细血管。最后，进行移植的个人的技能很重要。有经验的个体可以准确地将 HeLa 细胞注射到腹腔空间中，而缺乏经验的人通常会将肿瘤细胞注射到蛋黄区域，而肿瘤细胞很少扩散到鱼体内。同样，胚胎的存活率要高得多，当一个有经验的个人处理，至少有50%的胚胎移植与癌细胞生存。
虽然斑马鱼胚胎通常在28.5°C下孵育，但人类癌细胞需要更高的温度才能存活并迁移22，23。,23为了让鱼胚胎和人类癌细胞存活，移植人体癌细胞的胚胎在35.5°C下孵育。虽然将癌细胞传递到蛋黄囊可能更容易，但它们几乎不会扩散到循环系统中。因此，将癌细胞注射到腹腔下的血管化区域，以确保癌细胞的内膜和扩散至关重要。此外，在注射和成像过程中对胚胎进行麻醉时，必须注意不要添加太多或太集中的MS222。为了帮助纳米粒子的成像和可视化，选择了卡斯珀斑马鱼而不是AB鱼。卡斯珀鱼是纳克和罗伊的双突变体，缺乏黑色素细胞和虹膜，导致透明度相比AB鱼14。卡斯珀斑马鱼的透明度能够监测纳米粒子在循环中的扩散，以及纳米粒子对癌细胞的定位。该协议的挑战是，如果一个没有经验的个体进行人类癌细胞的移植，胚胎的死亡率相对较高。有趣的是，在眼睛后面稍微注射纳米粒子的耐受性相对较好。这可能是由于使用更薄的针头相比，用于肿瘤细胞移植的针头。为了避免损害人类癌细胞，必须使用具有宽开口的针头，但如果处理不当，这些针头可能会导致胚胎受损。
该协议利用卡斯珀斑马鱼可视化转移癌细胞的目标与功能化纳米粒子在体内。这种测定的一个主要优点是，它允许研究人员在斑马鱼发育过程中进行实时成像，以监测癌细胞与纳米粒子的相互作用。事实上，由于其高繁殖度和迅速发展，斑马鱼使研究人员,在18天、19天、20日,、24,日获得结果。此外，如果大多数胚胎在注射特定类型的纳米粒子后死亡，这种检测还允许从进一步研究中消除有毒的纳米粒子。虽然斑马鱼不是哺乳动物，但它有助于以快速、经济的方式选择大量的纳米粒子，为大型动物的下游研究和临床试验提供有用的信息。综合起来，斑马鱼通过帮助选择合适的纳米普子，通过癌症特异性靶向，帮助选择合适的纳米普子，用于早期发现和可能破坏癌细胞，从而在纳米医学和纳米技术中产生了影响。
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Disclosures
I.S. 宣布对纳米科学解决方案有限责任公司感兴趣（获得 STTR NIH R41AI142890 赠款）。所有其他作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢凯莉·史密斯女士、郭女士和亚历山大·弗洛鲁先生对手稿进行校对。H.F.感谢国家卫生和、美国癌症协会（RSG-17-204 01-TBG）和圣鲍德里克基金会的资助。F.J.F.L.承认波士顿大学创新中心-布纳诺癌症纳米技术跨学科培训（XTNC）的奖学金。I.S 确认 NSF 支持（授权 CBET 1605405）和 NIH R41AI142890。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
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