Summary
هنا، أنشأنا طريقة منخفضة التكلفة وسهلة التشغيل التي توجه التمايز السريع والفعال من الخلايا الجذعية الجنينية إلى الخلايا العصبية. هذه الطريقة مناسبة لتعميم بين المختبرات ويمكن أن تكون أداة مفيدة للبحوث العصبية.
Abstract
التمايز العصبي للخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs) هو أداة محتملة لتوضيح الآليات الرئيسية المشاركة في تكوين الخلايا العصبية ويحتمل أن تساعد في الطب التجديدي. هنا، أنشأنا طريقة فعالة ومنخفضة التكلفة للتمايز العصبي من mESCs في المختبر، باستخدام استراتيجية الفرز الجمعي. في ظل الظروف المحددة هنا، فإن تكوين الجسم الجنيني لمدة يومين + بروتوكول تحريض حمض الريتينويك لمدة 6 أيام يسمح بالتمايز السريع والفعال من الـ mESCs إلى خلايا السلائف العصبية (NPCs)، كما يتضح من تشكيل A2lox و129 مشتقة من النستين المرصوفة بشكل جيد والنوريت الشبيهة بالنيوتريت و129 مشتقًا إيجابيًا. الحالة الصحية للأجسام الجنينية ونقطة الوقت التي يتم فيها تطبيق حمض الريتينويك (RA) ، وكذلك تركيزات RA ، أمر حاسم في هذه العملية. في التمايز اللاحق من NPCs إلى الخلايا العصبية، N2B27 المتوسطة II (تكملها متوسطة العصبية) يمكن أن تدعم بشكل أفضل الصيانة على المدى الطويل ونضوج الخلايا العصبية. الطريقة المعروضة هي الكفاءة العالية ، وانخفاض التكلفة وسهلة التشغيل ، ويمكن أن تكون أداة قوية لبحوث البيولوجيا العصبية والتنمية البيولوجية.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) هي متعددة القدرات ويمكن أن تفرق إلى الخلايا السليفة العصبية (NPCs) وبعد ذلك إلى الخلايا العصبية في ظل ظروف معينة1. يوفر تكوين الخلايا العصبية القائم على ESC أفضل منصة لمحاكاة النشوء العصبي ، وبالتالي بمثابة أداة مفيدة لدراسات البيولوجيا التنموية ويحتمل أن تساعد في الطب التجديدي2،3. في العقود الماضية، وقد تم الإبلاغ عن العديد من الاستراتيجيات لتحفيز تكوين جيني الجنين، مثل طريقة المعدلة وراثيا4، باستخدام جزيئات صغيرة5، وذلك باستخدام مصفوفة 3D microenvironment6، و شارك في ثقافة تقنية7. ومع ذلك، فإن معظم هذه البروتوكولات إما محدودة أو صعبة التشغيل، وبالتالي فهي غير مناسبة للاستخدام في معظم المختبرات.
للعثور على طريقة سهلة التشغيل ومنخفضة التكلفة لتحقيق تمايز عصبي فعال من mESCs ، تم استخدام استراتيجية فحص الجمع بين الدمج هنا. كما هو موضح في الشكل 1، تم تقسيم العملية الكاملة من النشوء العصبي الجنيني إلى مرحلتين. وتشير المرحلة الأولى إلى عملية التمايز بين الـ mESCs إلى NPCs، وتتعلق المرحلة الثانية بالتمايز اللاحق من NPCs إلى الخلايا العصبية. استنادا إلى مبادئ عملية سهلة، وانخفاض تكلفة، والمواد المتاحة بسهولة وكفاءة عالية التمايز، تم اختيار سبعة بروتوكولات في المرحلة الأولى وثلاثة بروتوكولات في المرحلة الثانية على أساس نظام ثقافة أحادية الطبقات التقليدية أو نظام تكوين الجسم الجنينية8،9. وتم تقييم كفاءة التمايز في البروتوكولات في كلتا المرحلتين باستخدام الملاحظة مورفولوجيا الخلية و قياس المناعة. من خلال الجمع بين البروتوكول الأكثر كفاءة في كل مرحلة ، أنشأنا الطريقة المثلى للتمايز العصبي من mESCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ماوس الجنينية خلية جذعية ثقافة
- إعداد 0.1٪ الأطباق الجيلاتين ثقافة الخلية المغلفة أو لوحات.
- إضافة 2 مل من معقمة 0.1٪ الجيلاتين (0.1٪ ث / الخامس في الماء) إلى 60 ملم أطباق ثقافة الخلية. صخرة بلطف لضمان حتى طلاء أطباق ثقافة الخلية.
- وضع الأطباق في 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية والسماح للطلاء لمدة 1 ساعة.
- إزالة 0.1٪ حل الجيلاتين قبل البذر الخلايا.
ملاحظة: بعد إزالة الجيلاتين، ليست هناك حاجة لتجفيف أو غسل الأطباق المغلفة.
- الخلايا الجذعية الجنينية الفأر (A2lox و 129) ثقافة
- مبسة mESCs (A2lox و 129) الخلايا في 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 60 ملم أطباق ثقافة الخلية في المتوسط نمو mESC في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة، على التوالي. يتكون متوسط النمو mESC من 85٪ خروج المغلوب DMEM/F12، 15٪ استبدال مصل خروج المغلوب (KSR)، 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME)، 2 mM GlutaMAX، 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 1٪ البنسلين / ستريبتوميسين (P/ S)، 1000 U/mL عامل مثبط للوكيميا (LIF)، 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 المانع) و 0.33 nM PD0325901 (مثبطات MEK).
تنبيه: β-ميركابتول هو قابل للاشتعال وسمية استنشاق. الابتعاد عن مصادر الحريق وارتداء قناع لتجنب استنشاق عند الاستخدام. - تغيير متوسط نمو mESC يوميا لنمو أفضل من A2lox و 129.
- عندما تصل الخلايا التقاء 80٪ ، وإزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من 0.1 ٪ التربسين إلى الطبق. صخرة بلطف لمدة 30 ثانية لضمان تغطية حتى من التربسين على جميع الخلايا.
- ترك الخلايا لمدة 1 دقيقة ل تريبسينizeثم إزالة التربسين باستخدام ماصة 1 مل.
- إضافة 2 مل من متوسطة نمو mESC للطبق، والماصات صعودا وهبوطا عدة مرات لجعل تعليق خلية واحدة.
- عد كثافة الخلايا في التعليق بأكبر قدر ممكن من الدقة باستخدام مقياس الهيموسيت.
- تقسيم الخلايا إلى 7 مجموعات والحث على التمايز باستخدام بروتوكولات مختلفة هو مبين في الجدول 1.
- مبسة mESCs (A2lox و 129) الخلايا في 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 60 ملم أطباق ثقافة الخلية في المتوسط نمو mESC في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة، على التوالي. يتكون متوسط النمو mESC من 85٪ خروج المغلوب DMEM/F12، 15٪ استبدال مصل خروج المغلوب (KSR)، 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME)، 2 mM GlutaMAX، 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 1٪ البنسلين / ستريبتوميسين (P/ S)، 1000 U/mL عامل مثبط للوكيميا (LIF)، 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 المانع) و 0.33 nM PD0325901 (مثبطات MEK).
2- التمايز بين المراكز الفنية المتكاملة واللجان الوطنية (المرحلة الأولى)
- إعداد 0.1٪ الجيلاتين المغلفة لوحات الخلية أو الأغطية.
- قبل الاستخدام، قم بإعداد 0.1٪ من الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات أو الأغطية كما هو الحال في الخطوة 1.1.
- المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 1 (الجدول 1)
- البذور حوالي 2 × 104 mESCs في 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر في 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات. تحقق من كثافة الخلايا تحت المجهر.
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 ح للسماح.
- بعد التعلق ، أخرج من الخلايا من الحاضنة ، واغسل الخلايا مرتين بـ 2 مل من PBS.
- إضافة 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I(الجدول 1)إلى كل بئر ووضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة.
- ترك الخلايا للتمايز لمدة 8 أيام. استبدال متوسط التمايز القاعدي I كل 2 أيام.
- المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 2 (الجدول 1)
- إضافة 1.5 × 106 mESCs في طبق بكتيري غير التصّاد في 10 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I للسماح لتكوين الجسم الجنيني عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ .
- بعد يومين، يتم تجميع الخلايا في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 15 مل والسماح لهم تسوية من قبل الجاذبية.
- إزالة supernatant وإضافة 10 مل من التمايز القاعدي الطازج المتوسطة I لإعادة تعليق الهيئات الجنينية. إعادة زرعها في طبق بكتيري غير التصّاد جديد والسماح بالتمايز لمدة يومين آخرين.
- تحقق من تكوين الأجسام الجنينية تحت المجهر (الشكل 2A).
- جمع الأجسام الجنينية كما هو موضح في الخطوات 2.3.2-2.3.3. بذور حوالي 50 أجسام جنينية في 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات.
- إعداد 1 mM جميع الأسهم ترانس RA (في DMSO) وتخزينها بعيدا عن الضوء في -80 درجة مئوية الفريزر بعد التعبئة والتغليف الفرعي.
ملاحظة: RA غير مستقرة، وينبغي إيلاء الاهتمام للحفاظ عليه بعيدا عن الضوء والحد من الاتصال الجوي أثناء إعداد المخزون RA. - بالنسبة لـ RA التعريفي، أضف 2 ميكرولتر من مخزون RA في كل بئر لجعل التركيز النهائي 1 ميكرومتر.
- ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية واتمايز لمدة 4 أيام أخرى.
- تغيير كامل 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I (مع 1 μM RA) كل 2 أيام.
- المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 3 (الجدول 1)
- النبات 1.5 × 106 mESCs في طبق بكتيري غير التصّاد في 10 مل من التمايز القاعدي المتوسط I. اترك لمدة 2 أيام لتكوين الجسم الجنيني عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ .
- تحقق من تكوين الأجسام الجنينية تحت المجهر (الشكل 2B).
- نقل مجاميع الخلية في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 15 مل والسماح لهم تسوية من قبل الجاذبية.
- إزالة supernatant بعناية وإضافة 10 مل من تمايز القاعدية الطازجة المتوسطة I لإعادة الاعتماد عليها.
- بذور حوالي 50 هيئة جنينية في 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات.
- بالنسبة لـ RA التعريفي، أضف 2 ميكرولتر من مخزون RA في كل بئر لجعل التركيز النهائي 1 ميكرومتر.
- ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية وافرقها لمدة 6 أيام أخرى. تغيير كامل التمايز القاعدي المتوسطة I (مع 1 μM RA) كل 2 أيام.
- المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 4 (الجدول 1)
- البذور حول 2 × 104 mESCs داخل 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات. ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعلق لمدة 6 ساعات.
- بعد التعلق، وغسل الخلايا مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I إلى كل بئر والسماح للتمايز لمدة 4 أيام في 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- بالنسبة لـ RA التعريفي، أضف 2 ميكرولتر من مخزون جميع الأسهم العابرة لل RA في كل بئر (تركيز العمل هو 1 ميكرومتر) للحث على التمايز لمدة 4 أيام أخرى.
- في العملية برمتها، استبدال المتوسط بأكمله كل 2 أيام.
- المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 5 (الجدول 1)
- البذور حول 2 × 104 mESCs داخل 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات. ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعلق لمدة 6 ساعات.
- غسل الخلايا مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I إلى كل بئر والسماح للتمايز لمدة 2 أيام في 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- بالنسبة إلى تحريض RA اللاحق، أضف 2 ميكرولتر من مخزون RA في كل بئر لجعل التركيز النهائي 1 ميكرومتر. ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية للحث على التمايز لمدة 6 أيام أخرى.
- في العملية برمتها، استبدال المتوسط بأكمله كل 2 أيام.
- المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 6 (الجدول 1)
- النبات 1.5 × 106 mESCs في طبق بكتيري غير التصّاد في 10 مل من N2B27 متوسطة II(الجدول 1)للسماح لتكوين الأجسام الجنينية.
- في اليومالثاني، جمع مجاميع الخلية كما هو موضح في الخطوات 2.3.2-2.3.3 وإعادة تثبيت الأجسام الجنينية باستخدام 10 مل من N2B27 الطازجة المتوسطة الثانية.
- إعادة زرعها في طبق بكتيري جديد غير التصّاد والسماح بالتمايز لمدة يومين آخرين في حاضنة CO2 5٪ عند 37 درجة مئوية. تحقق من تكوين الأجسام الجنينية تحت المجهر.
- فياليوم الرابع، اجمع الجثث الجنينية. بذور حوالي 50 أجسام جنينية في كل بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-جيدا لوحات مع 2 مل من N2B27 المتوسطة II.
- إضافة 2 ميكرولتر من جميع الأسهم عبر RA في كل بئر والحث على التمايز لمدة 4 أيام أخرى. استبدال المتوسط بأكمله (N2B27 متوسطة II مع 1 μM RA) كل يومين.
- المرحلة الأولى التمايز باستخدام البروتوكول 7 (الجدول 1)
- البذور حول 2 × 104 mESCs داخل 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات. ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعلق لمدة 6 ساعات.
- غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثم، إضافة 2 مل من N2B27 متوسطة II إلى كل بئر والسماح للتمايز لمدة 8 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة.
- تغيير كامل N2B27 متوسطة II كل 2 أيام.
3- رصد مورفولوجيا الخلية
- تحقق من حالة التمايز للمجموعات السبع المذكورة أعلاه يوميًا تحت مجهر ضوء مقلوب على الطور.
- حدد عشوائيًا 12 حقلًا على الأقل، ثم قم بأخذ صور لتسجيل التغييرات المورفولوجية لكل مجموعة على D8.
4. وصمة المناعة
- إعداد العينة: بذور mESCs على 0.1٪ من الأغطية المغلفة بالجيلاتين وتسمح بالتمايز لمدة 8 أيام باستخدام البروتوكولات المذكورة في الخطوة 2.
- شطف: في اليومالثامن، خذ العينات من الحاضنة وأزل وسيط التمايز بالطموح. شطف بلطف الخلايا مرة واحدة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- التثبيت: إضافة 1 مل من 4٪ شبهformaldehyde لكل عينة وإصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- شطف: بعد التثبيت، شطف بلطف الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات، لمدة 5 دقائق لكل من.
- Permeabilization: إضافة 1 مل من 0.2٪ TritonX-100 في برنامج تلفزيوني لكل عينة وترك لمدة 8 دقائق في RT.
- شطف: بعد Permeabilization، بلطف شطف الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات، لمدة 5 دقائق لكل من.
- حظر: إضافة 1 مل من مصل الماعز 10٪ في برنامج تلفزيوني لكل عينة واحتضان في RT لمدة 1 ساعة لمنع أي تفاعلات غير محددة.
- حضانة مع الأجسام المضادة الأولية
- تمييع الأجسام المضادة نستين في نسبة 1:100 باستخدام مصل الماعز 5٪ في برنامج تلفزيوني.
- تطبيق 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة على عينات مختلفة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
- شطف: إزالة الأجسام المضادة وشطف العينات بلطف مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 8 دقائق لكل من.
- حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية
- تمييع اليكسا فلور 488 المسمى الماعز المضادة للماوس IgG بنسبة 1:500 باستخدام مصل الماعز 5٪ في برنامج تلفزيوني.
- تطبيق 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة على عينات مختلفة واحتضان في الظلام لمدة 2 ساعة في RT.
ملاحظة: بعد تطبيق الأجسام المضادة الثانوية الفلورية، قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في الظلام لمنع إخماد الفلورسين.
- شطف: إزالة الأجسام المضادة الثانوية وشطف العينات بلطف مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 8 دقائق لكل من.
- تلطيخ نووي وتصاعد
- ضع قطرة واحدة من DAPI المتوسطة على الميكروسلي نظيفة.
- خذ بعناية من العينات من اللوحات ووضع العينة على رأس متوسطة DAPI المتصاعدة مع وجه الخلية إلى الأسفل. اتركيه في الظلام لمدة 5 دقائق في RT.
- إزالة الزائدة DAPI تركيب المتوسطة مع ورقة ماصة.
- مجهر الفلورس الملاحظة
- ضع العينات تحت المجهر الفلوري وكشف الإشارة لDAPI وفلور اليكسا 488 باستخدام المرشحات المناسبة.
- بشكلٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍّّيّ وعشوائيّ، اختر 10-15 حقلًا بصريًّا مختلفًا لكلّ عينة، وسجلّ الصور باستخدام كاميرا CCD.
5- التمايز من المراكز الوطنية إلى الخلايا العصبية (المرحلة الثانية)
- إعداد مشتقات mESC في إطار المرحلة الأولى من التمايز باستخدام البروتوكول 3 (8 أيام، الجدول 1)كما هو مفصل في الخطوة 2-4، التي لديها أعلى كفاءة للتمايز (انظر الشكل 3).
ملاحظة: بعد المرحلة الأولى من التمايز، ينبغي أن يتم مراقبة الجودة باستخدام الملاحظة مورفولوجيا الخلية ومجايسة المناعة المذكورة أعلاه، لضمان وجود NPCs صحية وعالية الإنتاجية. - بذور حوالي 5 × 105 مشتقات mESC داخل 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة أنا في بئر على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 6-آبار لوحات. تقسيم مشتقات mESC عشوائياً إلى 3 مجموعات، كما المرحلة الثانية البروتوكول 1، البروتوكول 2، والبروتوكول 3، على التوالي.
- ضع اللوحة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية للسماح بالتعلق لمدة 6 ساعات. غسلها مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
- إضافة 2 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I، N2B27 المتوسطة I و N2B27 المتوسطة II(الجدول 2)،على التوالي، إلى كل بئر من الفئات المذكورة أعلاه.
- ضع اللوحات في الحاضنة واسمح بالتفريق لمدة 10 أيام أخرى. تغيير الوسط المطابق كل 2 أيام.
- تحقق من حالة التمايز وسجل التغييرات المورفولوجية كما هو مذكور في الخطوة 3.
- في يوم 18، تقييم جيل الخلايا العصبية (β-توبولين الثالث إيجابية) وتحديد كفاءة التمايز من البروتوكولات 3 باستخدام في الخطوة 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2-يوم تكوين الجسم الجنينية + 6 أيام RA التعريفي يعمل بشكل أفضل على توجيه التمايز من mESCs إلى NPCs (المرحلة الأولى). ولتحديد البروتوكول الأمثل الذي يعزز على أفضل أحسن ال أحسن الهون بين الـ mESCs إلى NPCs (المرحلة الأولى)، تم اختبار 7 بروتوكولات على كل من A2lox و129 mESCs(الجدول 1)وتم رصد حالة التمايز لكل مجموعة باستخدام المجهر الخفيف. كما هو مبين في الشكل 3A، أظهرت معظم A2lox و 129 مشتقات تحت "تكوين الجسم الجنينية لمدة يومين + 6 أيام RA التعريفي" (المرحلة الأولى البروتوكول 3) أظهرت مورفولوغيات مكدسة بشكل جيد ومثل نيوريت ، مما يشير إلى تشكيل NPCs. ومع ذلك، أظهرت الخلايا ذات "تكوين الجسم الجنيني لمدة 4 أيام + 4 أيام RA التعريفي" (المرحلة الأولى-البروتوكول 2) حالة سيئة ومهبوبة، والتي قد تكون بسبب نقص المغذيات داخل الأجسام الجنينية. ويمكن أيضاً أن توجه ثقافة أحادية الطبقة مع تحريض RA (المرحلة الأولى- البروتوكول 4 و5) التمايز بين الطبقات المتوسطة، في حين أن نسبة الخلايا الشبيهة بالنيوريت لم تكن بقدر ما كانت في المرحلة الأولى للبروتوكول 3. وفي الوقت نفسه، أظهرت معظم A2lox و 129 مشتقات في المرحلة الأولى البروتوكول 6 و 7 أصغر أجسام الخلايا وتميل إلى الخضوع للبروتوس، مما يشير إلى أن N2B27 المتوسطة الثانية لا يمكن أن تدعم تكوين الخلايا العصبية الجنينية بشكل فعال.
وللتأكد من تكوين المراكز الوطنية المعنية بالديون، تم الكشف عن النسبة المئوية لخلايا نستين + (علامة لـ NPCs) في كل مجموعة باستخدام مقايسة مناعية. في الشكل 3B،كانت النسبة المئوية لخلايا نستين+ في المرحلة الأولى البروتوكول 3 هي الأعلى ووصلت إلى 77.67 ± 4.33٪ و 69.33 ± 2.33٪ في A2lox و 129 مشتقات على التوالي. وإجمالاً، يعمل البروتوكول 3 للمرحلة الأولى على أفضل وجه على توجيه التمييز بين مراكز العمل المتعددة الأبعاد إلى مراكز وطنية.
N2B27 المتوسطة II يمكن أن تحفز على نحو أكثر فعالية التمايز من NPCs إلى الخلايا العصبية (المرحلة الثانية). وتم بحث ثلاثة بروتوكولات في المرحلة الثانية من التمييز. كما هو مبين في الشكل 4A، أظهرت الملاحظة المورفولوجية أن معظم A2lox و 129 مشتقات في المرحلة الثانية البروتوكول 3 (التمايز مع N2B27 المتوسطة II) ظهرت أكثر الهياكل التي تشبه الخلايا العصبية لفترات طويلة مع نيوريت واضحة وامتدادات جسم الخلية بحلول اليوم 18 ، مما يشير إلى حدوث فعال من تولد الخلايا العصبية. وأكد فحص المناعة مزيد من توليد الخلايا العصبية، مع نسبة من الخلايا β-توبولين الثالث + تصل إلى 67.75 ± 4.01٪ و 58.73 ± 7.25٪، على التوالي، في A2lox و 129 المشتقات على D18(الشكل 4B).
ولجعله أكثر وضوحاً، يظهر رسم تخطيطي للطريقة المثلى لنشوء النسل الجنيني في الشكل 5. باختصار، 1.5 × 106 mESCs هي البذور في طبق بكتيري غير التصيف في 10 مل من التمايز القاعدي المتوسطة I والسماح لتكوين الجسم الجنينية لمدة 2 أيام. ثم يتم جمع الجثث الجنينية وزرعها في 0.1٪ من الكبسولات المغلفة بالجيلاتين من 6 آبار مع تركيز 50 جثة جنينية في البئر. وفي الوقت نفسه، يتم إضافة RA (1 μM) لمدة 6 أيام أخرى. من يوم 8 إلى يوم 18، تتم إزالة RA، ويتم تطبيق N2B27 المتوسطة الثاني لتوجيه التمايز اللاحقة من NPCs إلى الخلايا العصبية. مع مثل هذه الطريقة مجتمعة، يمكن تشكيل الخلايا العصبية القوية في اليوم 18.
الشكل 1: رسم بياني لعملية النشوء العصبي الجنيني. وقد تم تعديل هذا الرقم من Li et al.10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مورفولوجيا الأجسام الجنينية. (أ)الهيئات الجنينية مثقفة لمدة 4 أيام. (ب) الهيئات الجنينية مثقفة لمدة 2 أيام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة الكفاءة للبروتوكولات السبعة بشأن تمايز المرحلة الأولى باستخدام A2lox و129 mESCs. (أ)التحليل المورفولوجي لمشتقات A2lox و 129 mESCs في اليوم الثامن. اللوحة العلوية: مشتقات A2lox؛ اللوحة السفلى: 129 مشتقات. (ب) الكشف المناعي للfluorescence لتشكيل NPCs (نستين + ، الأخضر). تم تسمية النوى الزرقاء مع DAPI. اللوحة العلوية: مشتقات A2lox على D8; اللوحة السفلية: 129 مشتقة على D8. تم عرض النسب المئوية لخلايا نيسين+ لكل مجموعة من خلال الرسم البياني. يمثل كل عمود متوسط ±SEM من ثلاث تجارب مستقلة. *، ص≤0.05؛ **، ص≤0.01. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي وآخرون10.
الشكل 4: مقارنة الكفاءة بين البروتوكولات الثلاثة بشأن تمييز المرحلة الثانية. (أ)تحليل مورفولوجي من A2lox و 129 مشتقات mESCs في اليوم 18. اللوحة العلوية: مشتقات A2lox؛ اللوحة السفلى: 129 مشتقات. (ب) الكشف المناعي عن تكوين الخلايا العصبية (β-توبولين الثالث + ، الأحمر). تم تسمية النوى الزرقاء مع DAPI. اللوحة العلوية: مشتقات A2lox على D18; اللوحة السفلية: 129 مشتقة على D18. وقد أظهرت النسب المئوية للخلايا β-توبولين الثالث+ لكل مجموعة من خلال الرسم البياني. يمثل كل عمود متوسط ± SEM لثلاث تجارب مستقلة. *، ص≤0.05؛ **، ص≤0.01. وقد تم تعديل هذا الرقم من Li et al.10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: نموذج موجز للطريقة المثلى للتمايز العصبي من mESCs في المختبر وقد تم تعديل هذا الرقم من ليت al.10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المرحلة الأولى من التمايز (8d) | ||
| البروتوكولات | وسائل الاعلام | |
| البروتوكول 1 | التمايز بشكل طبيعي: مع التمايز القاعدي المتوسطة أنا فقط | التمايز القاعدي المتوسطة I: DMEM/F12 +15٪ FBS + 1٪NEAA +0.1mM 2ME + 1٪ P / S |
| البروتوكول 2 | تكوين أجسام جنينية لمدة 4 أيام + تحريض RA لمدة 4 أيام | |
| البروتوكول 3 | تكوين أجسام جنينية لمدة يومين + تحريض RA لمدة 6 أيام | |
| البروتوكول 4 | ثقافة أحادية الطبقات جنبا إلى جنب مع RA التعريفي: 4d (-RA) 4d (+RA) | |
| البروتوكول 5 | ثقافة أحادية الطبقات جنبا إلى جنب مع RA التعريفي: 2d (-RA) 6d (+RA) | |
| البروتوكول السادس | تكوين الأجسام الجنينية (4 د) والتمايز الناجم عن N2B27 المتوسطة II | N2B27 متوسطة II: 49٪ DMEM/F12+ 1٪ N2 + 48٪ وسط عصبي + 2٪ B27 +1٪ GlutaMAX+ 0.1mM 2ME |
| البروتوكول 7 | ثقافة أحادية الطبقات مع N2B27 متوسطة II | |
الجدول 1: تفاصيل البروتوكولات السبعة المستخدمة في تمييز المرحلة الأولى. وقد تم تعديل هذا الجدول من Li et al.10.
| المرحلة الثانية من التمايز (10d) | ||
| البروتوكولات | وسائل الاعلام | |
| البروتوكول 1 | التمايز بشكل طبيعي: مع التمايز القاعدي المتوسطة أنا فقط | التمايز القاعدي المتوسط الأول: DMEM/F12 +15٪ FBS +1٪NEAA +0.1mM 2ME+ 1٪ P/S |
| البروتوكول 2 | التمايز مع N2B27 المتوسطة I | N2B27 المتوسطة I: DMEM/F12 + 1٪ N2 + 2٪ B27 + 1٪ GlutaMAX +0.1mM 2ME |
| البروتوكول 3 | التمايز مع N2B27 متوسطة II | N2B27 متوسطة II: 49٪ DMEM/F12+ 1٪ N2 + 48٪ وسط عصبي + 2٪ B27 +1٪ GlutaMAX+ 0.1mM 2ME |
الجدول 2: تفاصيل البروتوكولات الثلاثة المستخدمة في تمييز المرحلة الثانية. وقد تم تعديل هذا الجدول من Li et al.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، أنشأنا طريقة بسيطة وفعالة للتمايز العصبي من mESCs، مع انخفاض تكلفة والمواد التي تم الحصول عليها بسهولة. في هذه الطريقة، 2 أيام من تكوين الجسم الجنينية تليها 6 أيام من تحريض RA يمكن أن تعزز بشكل فعال التفريق بين mESCs إلى NPCs (المرحلة الأولى البروتوكول 3). بالنسبة للمرحلة الثانية من التمايز، فإن N2B27 المتوسطة II (المرحلة الثانية-البروتوكول 3) تحفز على نحو فعال على التمييز بين الشخصيات الوطنية إلى الخلايا العصبية. ولضمان النجاح، ينبغي إيلاء مزيد من الاهتمام لعدة خطوات حاسمة.
أولاً، الحالة الصحية للأجسام الجنينية هي المفتاح لعملية التمايز بأكملها. وعادة ما يستخدم تكوين الجسم الجنينية ثلاثية الأبعاد لتوجيه التمايز من ESCs8. في هذه الدراسة، قمنا بالتحقيق في وقت ثقافة التعليق السليم للأجسام الجنينية. كما هو مبين في الشكل 2، تشكلت الأجسام الجنينية جولة مع النواة مشرق بعد تعليق الثقافة لمدة 2 أيام في هذه الحالة. ومع ذلك ، عندما مثقف لمدة 4 أيام ، العديد من الهيئات الجنينية تلتصق ببعضها البعض ، وتصبح النواة مظلمة ، مما يشير إلى موت الخلايا في النوا. التمايز اللاحقة أكد أيضا أسوأ تأثير من تكوين الجسم الجنيني لفترات طويلة. في بعض الدراسات المبلغ عنها، يمكن أن تستمر ثقافة التعليق للأجسام الجنينية لمدة 10 أيام، باستخدام المتوسطة مع تركيز FBS أقل أو بدون FBS11. قد يكون انخفاض الوقت لتكوين الجسم الجنيني في الدراسة بسبب تركيز FBS العالي (15٪ ) المستخدمة هنا، وقد ثبت أن 15٪ FBS يمكن أن تعزز بشكل أفضل تشكيل وتمايز من الهيئات الجنينية.
ثانياً، تكون النقطة الزمنية التي يتم تطبيق RA فيها وتركيز العمل RA أمرًا حاسمًا لتحديد مصير الخلية لـ mESCs. RA, مشتق من فيتامين (أ), هي واحدة من morphogens أهم مع الإجراءات pleiotropic12. يمكن تنظيم RA مسارات إشارة متعددة وتؤثر على تحديد مصير الخلية من ESCs13،14. وأظهرت التقارير أن المعالجة قصيرة الأجل للـ mESCs مع RA خلال مرحلة التمايز المبكر حالت دون التمايز التلقائي والحفاظ على قدرة التجديد الذاتي للـ mESCs15. واقترح آخرون أن RA يمكن تنظيم كل من تمايز الخلايا الجرثومية والتمايز العصبي من ESCs، والتي هي فترة زمنية تعتمد16,17,18. في الحالة المعروضة هنا، وأضاف RA في اليومالثاني بعد تكوين الجسم الجنيني هو مناسبة لتوجيه التمايز إلى الشخصيات. وفي الوقت نفسه، فإن تركيز العمل من جمهورية أرمينيا هو أيضا أمر بالغ الأهمية. تركيزات RA منخفضة (~ 10 nM) قد تحفز على تمايز mESCs في خلايا تشبه الانسومرم ، في حين أن تركيزات RA عالية (1-5 μM) هي أكثر عرضة للحث على التمايز في13،14،15،16،17،18،19. نظرا لاستخدام RA, يمكن للمرء أن يتوقع تأثير الإبادة; التمايز في الخلايا العصبية المخية في الـ 5 سوف نادرا ما ينظر إليها والخلايا العصبية تسفر عن مصائر النخاع الشوكي ونخاع الشوكي تحدث20,21. وعلاوة على ذلك، RA هو وكيل متاحة بسهولة ومنخفضة التكلفة، واستخدام هذا البروتوكول يمكن أن توفر أموال البحوث لمعظم المختبرات.
ثالثا، في حالة المعروضة هنا، يمكن تخزين المراكز الوطنية المنشأة بعد المرحلة الأولى من التمايز والمرور في ظروف مناسبة. يمكن أن يؤدي الحفاظ على التبريد بكثافة الخلايا العالية (> 2 × 106) باستخدام مصرف الخلايا الجذعية إلى تقليل تلف الخلايا الناجم عن التجميد بشكل فعال للحصول على معدل استرداد مرتفع. وفي الوقت نفسه، يمكن تمرير NPCs التي تم إنشاؤها في الدراسة باستخدام N2B27 المتوسطة (49٪ DMEM/F12 + 1٪ N2 + 48٪ Neurobasal المتوسطة + 2٪ B27) مع كثافة الخلية أكثر من 5 × 105/ سم2. تحت كثافة الخلايا المنخفضة (أقل من 0.5 × 105/ سم2)، تميل NPCs إلى التمييز. مثل هذه الخلية cryopreservation والانتعاش يمكن أن تجلب راحة كبيرة للبحث.
وعلاوة على ذلك، فإن الوسط العصبي ضروري للتمايز في المرحلة الثانية. تم تصميم Neurobasal المتوسطة خصيصا للصيانة على المدى الطويل ونضج الخلايا العصبية. كما هو مدرج في N2B27 المتوسطة II(الجدول 2)،فإن إضافة وسيط Neurobasal يمكن أن تدعم بشكل أفضل التمايز من NPCs إلى الخلايا العصبية.
بشكل جماعي، أبلغنا عن طريقة فعالة ومنخفضة التكلفة للتمايز العصبي من mESCs في المختبر، وذلك باستخدام استراتيجيات الفرز الجمعي. الطريقة المنشأة سهلة جدا لتنفيذ وهي مناسبة للاستخدام من قبل معظم المختبرات. يمكن أن تكون هذه الطريقة المثلى أداة قوية لبحوث البيولوجيا العصبية والبيولوجيا التنموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 31501099) و"متوسط العمر" و"يونغ" من إدارة التعليم في مقاطعة هوبى، الصين (رقم 110099) Q20191104). ونشكر البروفيسور ونشينغ دينغ في جامعة ووهان للعلوم والتكنولوجيا على توفير خطوط الخلايا الجذعية الجنينية الماوس A2lox.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
