Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/61190
Automatic Translation
*1, *2
1Wuhan Center for Disease Control and Prevention, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology
* These authors contributed equally

Summary

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

Abstract

הבידול העצבי של תאי גזע עובריים של העכבר (mESCs) הוא כלי פוטנציאלי להבהיר את מנגנוני המפתח המעורבים נוירוגנזה ופוטנציאל לסייע ברפואה רגנרטיבית. כאן, הקמנו שיטה יעילה בעלות נמוכה עבור בידול עצבי מ mESCs במבחנה, באמצעות האסטרטגיה של הקרנה קומבינטורית. בתנאים המוגדרים כאן, היווצרות הגוף העוברי בן היומיים + פרוטוקול אינדוקציה של חומצה רטינואית למשך 6 ימים מאפשרת בידול מהיר ויעיל של MESCs לתאי מבשר עצביים (NPCs), כפי שניתן לראות על ידי היווצרות של A2lox מוערמים היטב דמויי נויריט ו -129 נגזרות שהן חיוביות של נסטין. המצב הבריא של גופים עובריים ואת נקודת הזמן שבה חומצה רטינואית (RA) מוחל, כמו גם ריכוזי RA, הם קריטיים בתהליך. בהבחנה הבאה מ NPCs לתוך נוירונים, N2B27 בינוני II (בתוספת מדיום Neurobasal) יכול לתמוך טוב יותר תחזוקה לטווח ארוך והתבגרות של תאים עצביים. השיטה המוצגת היא יעילה מאוד, בעלות נמוכה וקלה לתפעול, ויכולה להיות כלי רב עוצמה למחקר נוירוביולוגי וביולוגיה התפתחותית.

Introduction

תאי גזע עובריים (ESCs) הם פלוריפוטנטיים ויכולים להבדיל לתאי מבשר עצביים (NPCs) ולאחר מכן לנוירונים בתנאים מסוימים1. נוירוגנזה מבוססת ESC מספקת את הפלטפורמה הטובה ביותר לחקות נוירוגנזה, ובכך לשמש כלי שימושי למחקרים ביולוגיים התפתחותיים וסיוע פוטנציאלי ברפואה רגנרטיבית2,3. בעשורים האחרונים, אסטרטגיות רבות דווחו על גרימת נוירוגנזה עוברית, כגון השיטה הטרנסגנית4, באמצעות מולקולות קטנות5, באמצעות microenvironment מטריצה 3D6, ואת טכניקת תרבות משותפת7. עם זאת, רוב הפרוטוקולים האלה הם גם תנאי מוגבל או קשה לתפעול, ולכן הם אינם מתאימים לשימוש ברוב המעבדות.

כדי למצוא שיטה קלה לתפעול ועלות נמוכה להשגת בידול עצבי יעיל מ- mESCs, נעשה כאן שימוש באסטרטגיית סינון קומבינטורית. כפי שמתואר באיור 1, כל התהליך של נוירוגנזה עוברית חולק לשני שלבים. שלב I מתייחס לתהליך הבידול מ- mESCs ל- NPCs, והשלב השני מתייחס להבחנה הבאה מ- NPCs לנוירונים. בהתבסס על עקרונות הפעולה הקלה, עלות נמוכה, חומרים זמינים בקלות ויעילות בידול גבוהה, שבעה פרוטוקולים בשלב I ושלושה פרוטוקולים בשלב II נבחרו על סמך מערכת התרבות המונולאייה המסורתית או מערכת היווצרות הגוף העוברי8,9. יעילות הבידול של פרוטוקולים בשני השלבים הוערכה באמצעות תצפית מורפולוגיה של התא ומבחן כשל חיסוני. באמצעות שילוב הפרוטוקול היעיל ביותר של כל שלב, הקמנו את השיטה האופטימלית לבידול עצבי מ- mESCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבות תאי גזע עובריים של עכבר

  1. הכינו 0.1% מנות או צלחות של תרביות תאים מצופות ג'לטין.
    1. הוסיפו 2 מ"ל של ג'לטין מעוקר 0.1% (0.1% w/v במים) למנות תרבית תאים 60 מ"מ. רוק בעדינות כדי להבטיח אפילו ציפוי של מנות תרבות התא.
    2. שים את הכלים לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ולאפשר ציפוי במשך 1 שעה.
    3. הסר את תמיסת הג'לטין 0.1% לפני זריעת התאים.
      הערה: לאחר הסרת הג'לטין, אין צורך לייבש או לשטוף את הכלים המצופה.
  2. תאי גזע עובריים של עכבר (A2lox ו-129) תרבות
    1. דגירה mESCs (A2lox ו 129) תאים ב 0.1% ג'לטין מצופה 60 מ"מ כלי תרבות התא במדיום צמיחה mESC ב 37 °C (79 °F) ב 5% CO2 חממה, בהתאמה. מדיום הצמיחה mESC מורכב 85% נוקאאוט DMEM/F12, 15% החלפת סרום נוקאאוט (KSR), 0.1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), 1000 U/mL גורם מעכב לוקמיה (LIF), 10 nM CHIR-99021 (מעכב GSK-3) ו 0.33 ננומטר PD0325901 (מעכב MEK).
      התראה: β-מרקפטותנול הוא דליק ויש לו רעילות שאיפה. יש להרחיק ממקורות אש ולחבוש מסכה כדי למנוע שאיפה בעת השימוש.
    2. שנה את מדיום הצמיחה mESC מדי יום לצמיחה טובה יותר של A2lox ו 129.
    3. כאשר התאים מגיעים 80% מפגש, להסיר את המדיום ולהוסיף 1 מ"ל של 0.1% טריפסין למנה. בעדינות רוק במשך 30 s כדי להבטיח אפילו כיסוי של טריפסין על כל התאים.
    4. השאר את התאים במשך כ 1 דקות כדי לנסותize ולאחר מכן להסיר את טריפסין באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
    5. הוסף 2 מ"ל של מדיום צמיחה mESC למנה, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להפוך את השעיית תא יחיד.
    6. לספור את הצפיפות של התאים בהשעיה במדויק ככל האפשר באמצעות hemocytometer.
    7. חלק את התאים ל- 7 קבוצות ו לגרום לבידול באמצעות פרוטוקולים שונים המוצגים בטבלה 1.

2. בידול מ- MESCs ל- NPCs (שלב I)

  1. מכינים 0.1% צלחות תרבית תאים מצופות ג'לטין או כיסויים.
    1. לפני השימוש, להכין 0.1% ג'לטין מצופה 6-well צלחות או coverslips כמו בשלב 1.1.
  2. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 1 (טבלה 1)
    1. זרעים על 2 x 104 mESCs ב 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל באר 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. בדוק את צפיפות התא תחת מיקרוסקופ.
    2. דגירה התאים ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2 אינקובטור עבור 6 שעות כדי לאפשר התקשרות.
    3. לאחר ההחזקה, להוציא את התאים מן האינקובטור, ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS.
    4. מוסיפים 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי I(טבלה 1)לכל באר ומחזירים את התאים לאינקובטור.
    5. השאירו את התאים לבידול במשך 8 ימים. החלף את מדיום הבידול הבסיסי אני כל יומיים.
  3. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 2 (טבלה 1)
    1. הוסף 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית nonadhesive ב 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני כדי לאפשר היווצרות גוף עוברי ב 37 °C (79 °F) באינקובטור 5% CO2.
    2. לאחר יומיים, להעביר אגרגטים תא לתוך 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל ולתת להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.
    3. הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי טרי אני כדי resuspend הגופים העובריים. לשתול אותם מחדש לתוך צלחת חיידקית חדשה nonadhesive ולאפשר בידול עוד 2 ימים.
    4. בדקו את היווצרות הגופים העובריים מתחת למיקרוסקופ (איור 2A).
    5. לאסוף גופים עובריים כמתואר בשלבים 2.3.2-2.3.3. זרעים על 50 גופים עובריים ב 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות.
    6. הכינו מלאי RA כל-טרנס של 1 מ"מ (ב-DMSO) וחסנו הרחק מהאור במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחר אריזת משנה.
      הערה: RA אינו יציב, ויש להקדיש תשומת לב כדי להרחיק אותו מאור ולצמצם מגע אוויר במהלך הכנת מלאי RA.
    7. עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר.
    8. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס להבדיל עוד 4 ימים.
    9. לשנות את כל 2 מ"ל של בינוני בידול בסיסי I (עם 1 μM RA) כל 2 ימים.
  4. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 3 (טבלה 1)
    1. צמח 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית לא מתקנת ב 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי I. להשאיר במשך 2 ימים להיווצרות גוף עוברי ב 37 °C (69 °F) באינקובטור 5% CO2.
    2. בדוק את היווצרותם של גופים עובריים תחת מיקרוסקופ (איור 2B).
    3. להעביר צבירות תאים לתוך 15 צינורות צנטריפוגה מ"ל ולתת להם להתיישב על ידי כוח הכבידה.
    4. הסר את supernatant בזהירות ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי טרי אני כדי resuspend אותם.
    5. זרעים על 50 גופים עובריים לתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות.
    6. עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר.
    7. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס להבדיל עוד 6 ימים. שנה את כל מדיום הבידול הבסיסי I (עם 1 מיקרומטר RA) כל 2 ימים.
  5. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 4 (טבלה 1)
    1. זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.
    2. לאחר הקובץ המצורף, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני אני לכל באר ולאפשר בידול במשך 4 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F).
    3. עבור אינדוקציה RA, להוסיף 2 μL של מלאי RA כל טרנס לתוך כל באר (ריכוז העבודה הוא 1 מיקרומטר) כדי לגרום לבידול עוד 4 ימים.
    4. בכל התהליך, להחליף את המדיום כולו כל 2 ימים.
  6. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 5 (טבלה 1)
    1. זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.
    2. לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני אני לכל באר ולאפשר בידול במשך 2 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F).
    3. עבור אינדוקציה RA הבאים, להוסיף 2 μL של מלאי RA לתוך כל באר כדי להפוך את הריכוז הסופי של μM 1. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס כדי לגרום לבידול עוד 6 ימים.
    4. בכל התהליך, להחליף את המדיום כולו כל 2 ימים.
  7. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 6 (טבלה 1)
    1. צמח 1.5 x 106 mESCs לתוך צלחת חיידקית לא מתקנת ב 10 מ"ל של N2B27 בינוני II (טבלה 1) כדי לאפשר היווצרות גופים עובריים.
    2. ביוםהשני, לאסוף את צבירות התא כמתואר בשלבים 2.3.2-2.3.3 ולהזרים מחדש את הגופים העובריים באמצעות 10 מ"ל של N2B27 בינוני II טרי.
    3. לשתול אותם מחדש לתוך צלחת חיידקית חדשה nonadhesive ולאפשר בידול עוד 2 ימים באינקובטור 5% CO2 ב 37 °C (69 °F). בדוק את היווצרותם של גופים עובריים תחת מיקרוסקופ.
    4. ביום הרביעי, לאסוף גופות עובריות. זרעים על 50 גופים עובריים לכל באר על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות עם 2 מ"ל של N2B27 בינוני II.
    5. הוסף 2 μL של מלאי RA כל טרנס לתוך כל באר ולגרום בידול עוד 4 ימים. החלף את המדיום כולו (N2B27 בינוני II עם 1 μM RA) כל יומיים.
  8. בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 7 (טבלה 1)
    1. זרעים על 2 x 104 mESCs בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות.
    2. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של N2B27 בינוני II לכל באר ולאפשר בידול במשך 8 ימים ב 37 °C (69 °F) ב 5% CO2 חממה.
    3. שנה את כל המדיום II של N2B27 כל יומיים.

3. התבוננות במורפולוגיה של התא

  1. בדוק את מצב הבידול של 7 הקבוצות שהוזכרו לעיל מדי יום תחת מיקרוסקופ אור ניגודיות פאזה הפוך.
  2. בחר באופן אקראי לפחות 12 שדות וצלם תמונות כדי לתעד את השינויים המורפולוגיים של כל קבוצה ב- D8.

4. כתמי כשל חיסוני

  1. הכנה לדוגמה: זרעי mESCs על 0.1% כריכות מצופות ג'לטין ולאפשר בידול במשך 8 ימים באמצעות הפרוטוקולים שהוזכרו בשלב 2.
  2. לשטוף: ביום8, לקחת את הדגימות מן האינקובטור ולהסיר את מדיום הבידול על ידי שאיפה. יש לשטוף בעדינות את התאים פעם אחת ב-1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.
  3. קיבוע: להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde לכל מדגם ולתקן את התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  4. לשטוף: לאחר קיבעון, בעדינות לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד.
  5. חדירה: להוסיף 1 מ"ל של 0.2% TritonX-100 ב PBS לכל מדגם ולהשאיר במשך 8 דקות ב RT.
  6. לשטוף: לאחר חדירה, בעדינות לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים, במשך 5 דקות כל אחד.
  7. חסימה: הוסף 1 מ"ל של סרום עזים 10% ב- PBS לכל מדגם ודגירה ב- RT למשך שעה אחת כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות.
  8. דגירה עם נוגדן ראשוני
    1. לדלל את הנוגדן אנטי נסטין ביחס של 1:100 באמצעות 5% סרום עזים ב PBS.
    2. החל 500 μL של נוגדן מדולל לדגימות שונות דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. לשטוף: להסיר את הנוגדן ולשטוף את הדגימות בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים במשך 8 דקות כל אחד.
  10. דגירה עם נוגדן משני
    1. לדלל את אלקסה פלואור 488-שכותרתו עז נגד עכבר IgG ביחס של 1:500 באמצעות 5% סרום עזים ב- PBS.
    2. החל 500 μL של נוגדן מדולל לדגימות שונות דגירה בחושך במשך 2 שעות ב RT.
      הערה: לאחר החלת נוגדן משני פלואורסצנטי, בצע את כל השלבים הבאים בחושך כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.
  11. לשטוף: להסיר את הנוגדן המשני ולשטוף את הדגימות בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 3 פעמים במשך 8 דקות כל אחד.
  12. כתמים גרעיניים והרכבה
    1. הנח טיפה אחת של מדיום הרכבה DAPI על המיקרו-מפולת הנקייה.
    2. בזהירות להוציא את הדגימות מן הצלחות ומניחים את המדגם על גבי המדיום הרכבה DAPI עם התא עם הפנים כלפי מטה. השאירו בחושך במשך 5 דקות ב- RT.
    3. הסר מדיום הרכבה עודף של DAPI עם נייר סופג.
  13. תצפית מיקרוסקופית פלואורסצנטית
    1. מניחים את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולזהות את האות עבור DAPI ואלכסה פלואור 488 באמצעות מסננים נאותים.
    2. בחר באופן שווה ואקראי 10-15 שדות חזותיים שונים עבור כל דגימה והקלט את התמונות במצלמת CCD.

5. בידול מ- NPCs לנוירונים (שלב II)

  1. הכן נגזרות mESC תחת בידול שלב I באמצעות פרוטוקול 3 (8 ימים, טבלה 1) כמפורט בשלב 2.4, בעל יעילות הבידול הגבוהה ביותר (ראה איור 3).
    הערה: לאחר שלב I בידול, בקרת איכות צריכה להתבצע באמצעות תצפית מורפולוגיה התא ו immunofluorescence הבדיקה שהוזכרו לעיל, כדי להבטיח NPCs בריא ותשואה גבוהה.
  2. זרעים על 5 x 105 נגזרות mESC בתוך 2 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני לכל טוב על 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות. חלק באופן אקראי את נגזרות mESC ל- 3 קבוצות, כפרוטוקול שלב II 1, פרוטוקול 2 ופרוטוקול 3, בהתאמה.
  3. מניחים את הצלחת לתוך 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (6 °F) כדי לאפשר חיבור עבור 6 שעות. לשטוף אותם פעמיים עם 2 מ"ל של PBS.
  4. הוסף 2 מ"ל של בידול בסיסי בינוני I, N2B27 בינוני I ו N2B27 בינוני II(טבלה 2),בהתאמה, לכל באר של הקבוצות לעיל.
  5. מניחים את הצלחות לתוך האינקובטור ולאפשר להבדיל עוד 10 ימים. שנה את המדיום המתאים כל יומיים.
  6. בדוק את מצב הבידול ותעד את השינויים המורפולוגיים כאמור בשלב 3.
  7. ביום 18, להעריך את הדור של נוירונים (β-Tubulin השלישי חיובי) ולקבוע את יעילות הבידול של 3 פרוטוקולים באמצעות בשלב 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

היווצרות גוף עוברי של יומיים + אינדוקציה RA של 6 ימים פועלת בצורה הטובה ביותר על בימוי הבידול של MESCs לתוך NPCs (שלב I). כדי לקבוע את הפרוטוקול האופטימלי המקדם בצורה הטובה ביותר את הבידול של MESCs לתוך NPCs (שלב I), 7 פרוטוקולים נבדקו הן על A2lox ו 129 mESCs (טבלה 1) ואת מצב הבידול של כל קבוצה היה במעקב באמצעות מיקרוסקופ אור. כפי שמוצג באיור 3A, רוב נגזרות A2lox ו-129 תחת טיפול "היווצרות גוף עוברי בן יומיים + אינדוקציה RA של 6 ימים" (שלב I-protocol 3) הראו מורפולוגיות מוערמות היטב ונויריטים, המעידות על היווצרות NPCs. עם זאת, תאים עם "היווצרות הגוף העוברי 4 ימים + 4 ימים RA אינדוקציה" טיפול (שלב I-פרוטוקול 2) הראו מצב לקוי אפופטוטי, אשר עשוי להיות בשל חוסר מזינים בתוך גופים עובריים. תרבות המונולאייר בשילוב עם אינדוקציה RA (שלב I-פרוטוקול 4 ו -5) יכול גם לכוון את הבידול של mESCs, בעוד את החלק היחסי של תאים דמויי נויריט לא היה כמו זה בשלב I-פרוטוקול 3. בינתיים, רוב A2lox ו 129 נגזרות בשלב I-פרוטוקול 6 ו 7 הראו גופי תאים קטנים יותר נטו לעבור אפופטוזיס, מה שמרמז כי N2B27 בינוני II לא יכול לתמוך נוירוגנזה עוברית ביעילות.

כדי לאשר עוד יותר את היווצרותם של NPCs, אחוז תאי נסטין + (סמן עבור NPCs) בכל קבוצה זוהו באמצעות בדיקת כשל חיסוני. באיור 3B, אחוז תאי נסטין+ בשלב I-protocol 3 היה הגבוה ביותר והגיע עד 77.67 ± 4.33% ו-69.33 ± 2.33% בנגזרים A2lox ו-129, בהתאמה. באופן קולקטיבי, שלב I-protocol 3 פועל בצורה הטובה ביותר על בימוי הבידול של MESCs לתוך NPCs.

N2B27 בינוני II יכול לגרום ביעילות רבה את הבידול מ NPCs לתוך נוירונים (שלב II). נבחנו שלושה פרוטוקולים בשלב השני של הבידול. כפי שמוצג באיור 4A, תצפית מורפולוגית הראתה כי רוב נגזרות A2lox ו-129 בשלב II-protocol 3 (בידול עם N2B27 medium II) הופיעו במבנים דמויי הנוירונים הממושכים ביותר עם נויריטים ברורים והרחבות גוף תאים עד יום 18, מה שמצביע על התרחשות יעילה של נוירוגנזה. בדיקות אימונופלואורסצנטיות אישרו עוד יותר את דור הנוירונים, כאשר אחוז תאי β-טובולין III+ עד 67.75 ± 4.01% ו-58.73 ± 7.25%, בהתאמה, ב-A2lox וב-129 נגזרות על D18 (איור 4B).

כדי להבהיר זאת, מוצג באיור 5תרשים סכמטי של השיטה הממוטבת לנורוגנזה עוברית . בקצרה, 1.5 x 106 mESCs הם זרע לתוך צלחת חיידקית nonadhesive ב 10 מ"ל של מדיום בידול בסיסי אני ולאפשר היווצרות גוף עוברי במשך 2 ימים. לאחר מכן, גופים עובריים נאספים ונשתלים לתוך 0.1% מצופה ג'לטין 6-באר צלחות עם ריכוז של 50 גופים עובריים לכל באר. בינתיים, RA (1 מיקרומטר) מתווסף עוד 6 ימים. מיום 8 עד יום 18, RA מוסר, ו N2B27 בינוני II מוחל כדי לכוון את ההבחנה הבאה מ NPCs לנוירונים. בשיטה משולבת כזו, נוירונים חזקים יכולים להיווצר ביום 18.

Figure 1
איור 1: תרשים של תהליך הנוירוגנזה העוברית. נתון זה שונה מ- Li et al.10. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: המורפולוגיה של הגופים העובריים. (A)גופים עובריים תרבותיים במשך 4 ימים. (B)גופים עובריים בתרבית במשך יומיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: השוואת יעילות של 7 הפרוטוקולים על בידול שלב I באמצעות A2lox ו- 129 mESCs. (A)ניתוח מורפולוגי של נגזרות A2lox ו 129 mESCs ביום 8. פאנל עליון: נגזרות A2lox; פאנל תחתון: 129 נגזרים. (B)זיהוי שפעת חיסונית להיווצרות NPCs (נסטין +, ירוק). הגרעינים סומנו כחולים עם DAPI. פאנל עליון: נגזרות A2lox על D8; פאנל תחתון: 129 נגזרים על D8. אחוזי תאי נסטין+ של כל קבוצה הוצגו על-ידי היסטוגרמה. כל עמודה מייצגת את הממוצע±SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. *, עמ'≤0.05; **, עמ'≤0.01. איור זה שונה מ- Li et al.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: השוואת יעילות של 3 הפרוטוקולים על בידול שלב II. (A)ניתוח מורפולוגי של נגזרות A2lox ו 129 mESCs ביום 18. פאנל עליון: נגזרות A2lox; פאנל תחתון: 129 נגזרים. (B) זיהוי חיסוני להיווצרות נוירונים (β-טובולין III+, אדום). הגרעינים סומנו כחולים עם DAPI. פאנל עליון: נגזרות A2lox על D18; פאנל תחתון: 129 נגזרים על D18. אחוזי תאי β-טובולין III+ של כל קבוצה הוצגו על ידי היסטוגרמה. כל עמודה מייצגת את הממוצע ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. *, עמ'≤0.05; **, עמ'≤0.01. נתון זה שונה מ- Li et al.10. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דגם קצר של השיטה הממוטבת לבידול עצבי מ- mESCs במבחנה נתון זה שונה מ- Liet al.10. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בידול שלב I (8d)
פרוטוקולים מדיה
פרוטוקול 1 בידול טבעי: עם מדיום בידול בסיסי אני רק בידול בסיסי בינוני I:
DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0.1m 2ME+ 1%P/S
פרוטוקול 2 היווצרות גופים עובריים ל-4 ימים + אינדוקציה RA ל-4 ימים
פרוטוקול 3 היווצרות גופים עובריים למשך יומיים + אינדוקציה RA ל-6 ימים
פרוטוקול 4 תרבות מונולאייר בשילוב עם אינדוקציה RA: 4d (-RA) 4d (+RA)
פרוטוקול 5 תרבות המונולאייר בשילוב עם אינדוקציה RA: 2d (-RA) 6d(+RA)
פרוטוקול 6 היווצרות גופים עובריים (4 ד) ובידול המושרה עם N2B27 בינוני II N2B27 בינוני II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% מדיום נוירובאסלי + 2% B27 +1%גלוטמקס+ 0.1mM 2ME
פרוטוקול 7 תרבות מונולאייר עם N2B27 בינוני II

טבלה 1: פירוט 7 הפרוטוקולים המשמשים לבידול שלב I. טבלה זו שונתה מ- Li et al.10.

בידול שלב II (10d)
פרוטוקולים מדיה
פרוטוקול 1 בידול טבעי: עם מדיום בידול בסיסי אני רק מדיום בידול בסיסי I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0.1mM 2ME+ 1%P/S
פרוטוקול 2 בידול עם N2B27 בינוני I N2B27 בינוני I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%גלוטמקס +0.1mM 2ME
פרוטוקול 3 בידול עם N2B27 בינוני II N2B27 בינוני II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% מדיום נוירובאסלי + 2% B27 +1%גלוטמקס+ 0.1mM 2ME

טבלה 2: פירוט 3 הפרוטוקולים המשמשים לבידול שלב II. טבלה זו שונתה מ- Li et al.10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר הנוכחי, הקמנו שיטה פשוטה ויעילה עבור בידול עצבי מ mESCs, עם עלות נמוכה וחומרים שהושגו בקלות. בשיטה זו, 2 ימים של היווצרות הגוף העוברי ואחריו 6 ימים של אינדוקציה RA יכול לקדם ביעילות את הבידול של mESCs לתוך NPCs (שלב I-פרוטוקול 3). עבור הבידול שלב II, N2B27 בינוני II (שלב II-פרוטוקול 3) ביעילות רבה לגרום את ההבחנה מ NPCs לתוך נוירונים. כדי להבטיח הצלחה, יש להקדיש תשומת לב רבה יותר למספר שלבים קריטיים.

ראשית, המצב הבריא של גופים עובריים הוא המפתח לכל תהליך הבידול. היווצרות גוף עוברי תלת מימדי משמש בדרך כלל כדי לכוון את הבידול של ESCs8. במחקר זה חקרנו את זמן תרבות ההשעיה הנכון של גופים עובריים. כפי שמוצג באיור 2, גופים עובריים עגולים עם ליבות בהירות נוצרו לאחר תרבות השעיה במשך יומיים במצב זה. עם זאת, כאשר תרבותי במשך 4 ימים, גופים עובריים רבים לדבוק זה בזה, ואת הליבות להיות כהה, המציין את האפופטוזיס של תאים בליבות. ההבחנה שלאחר מכן אישרה עוד יותר את ההשפעה הגרועה יותר של היווצרות גוף עוברי ממושך. בכמה מחקרים שדווחו, תרבות ההשעיה של גופים עובריים יכולה להימשך עד 10 ימים, באמצעות בינוני עם ריכוז FBS נמוך יותר או ללא FBS11. הזמן המופחת להיווצרות גוף עוברי במחקר עשוי לנבע מריכוז FBS גבוה יותר (15%) בשימוש כאן, והוכח כי 15% FBS יכול לקדם טוב יותר את היווצרות ובידול של גופים עובריים.

שנית, נקודת הזמן שבה מופעל RA וריכוז העבודה RA הם קריטיים לקביעת גורל התא של mESCs. RA, נגזרת של ויטמין A, הוא אחד המורפוגנים החשובים ביותר עם פעולות pleiotropic12. RA יכול לווסת מסלולי אות מרובים ולהשפיע על קביעת גורל התא של ESCs13,14. דוחות הראו כי טיפול לטווח קצר של MESCs עם RA בשלב הבידול המוקדם מנע בידול ספונטני ולשמור על יכולת חידוש עצמי של mESCs15. אחרים הציעו כי RA יכול לווסת הן את הבידול של תאי הנבט והן את הבידול העצבי מ- ESCs, שהם תלויים בנקודת זמן16,17,18. במצב המוצג כאן, RAהוסיף ביום השני לאחר היווצרות הגוף העוברי מתאים להכוונת הבידול לתוך NPCs. בינתיים, ריכוז העבודה של RA הוא גם קריטי. ריכוזי RA נמוכים (~ 10 nM) עלולים לגרום לבידול של MESCs לתאים דמויי אנדודרם, ואילו ריכוזי RA גבוהים (1-5 מיקרומטר) נוטים יותר לגרום לבידול לתוך NPCs13,14,15,16,17,18,19. בשל השימוש RA, אפשר היה לצפות אפקט caudalization; ההבחנה לתוך נוירונים במוח הפתח ייראה לעתים רחוקות מניב נוירונים של גורלות hindbrain וחוט השדרה יתרחש20,21. יתר על כן, RA הוא סוכן זמין בקלות בעלות נמוכה, ואת השימוש בפרוטוקול זה יכול לחסוך כספי מחקר עבור רוב המעבדה.

שלישית, במצב המוצג כאן, NPCs שנוצר לאחר שלב אני בידול ניתן לאחסן ומעבר בתנאים נאותים. Cryopreservation עם צפיפות תאים גבוהה (>2 x 106) באמצעות Stem-Cellbanker יכול להפחית ביעילות את הנזק לתאים הנגרמת על ידי הקפאה כדי לקבל קצב התאוששות גבוה. בינתיים, NPCs שנוצר במחקר ניתן לעבור באמצעות N2B27 בינוני (49% DMEM / F12 + 1% N2 + 48% מדיום Neurobasal + 2% B27) עם צפיפות תאים יותר מ 5 x 105/ ס"מ2. תחת צפיפות תאים נמוכה (פחות מ- 0.5 x 105/cm2), NPCs נוטים להבדיל. הקפאה והתאוששות תאים כאלה יכולים להביא נוחות רבה למחקר.

יתר על כן, מדיום נוירובאסלי חיוני לבידול שלב II. מדיום נוירובאסלי תוכנן במיוחד עבור תחזוקה ארוכת טווח והתבגרות של תא עצבי. כפי שצוין N2B27 בינוני II (טבלה 2), התוספת של מדיום Neurobasal יכול לתמוך טוב יותר את הבידול מ NPCs לתוך נוירונים.

באופן קולקטיבי, דיווחנו על שיטה יעילה וזולה לבידול עצבי מ- mESCs במבחנה, תוך שימוש באסטרטגיות של סינון קומבינטורי. השיטה שנקבעה קלה מאוד ליישום ומתאימה לשימוש על ידי רוב המעבדות. שיטה ממוטבת כזו יכולה להיות כלי רב עוצמה למחקר נוירוביולוגי וביולוגיה התפתחותית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '31501099) ואת בגיל העמידה וצעיר של מחלקת החינוך של מחוז חוביי, סין (לא. רבעון 20191104). כמו כן, אנו מודים לפרופסור וונשנג דנג מאוניברסיטת ווהאן למדע וטכנולוגיה על שסיפק את קווי תאי הגזע העובריים של העכבר A2lox.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Nestin antibody [Rat-401] Abcam Ab11306 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit Sigma Aldrich T2200 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044 stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021) Selleck S1263 stored at -20 °C
Coverslips NEST 801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x) HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy Olympus CKX53
Gelatin Gibco CM0635B stored at room temperature
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061 stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12 Gibco 12660012 stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human Sigma L5283 stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield Abcam ab104139 stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution Gibco 11140076 stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum Jackson 005-000-121 stored at -20 °C
Neurobasal Medium Gibco 21103049 stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish Corning 3262
Phosphate Buffered Saline (1X) HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution HyClone SV30010 stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib) Selleck S1036 stored at -20 °C
Retinoic acid Sigma R2625 stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells Cyagen MUAES-01001 Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free) ZENOAQ stem cellbanker DMSO free stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution HyClone SH30042.01 stored at 4 °C
Triton X-100 Sigma T8787
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
6 - well plate Corning 3516
60 mm cell culture dish Corning 430166
15 ml centrifuge tube NUNC 339650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
  2. Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
  3. Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
  4. Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
  5. Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
  6. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
  7. Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
  8. Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
  9. Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
  10. Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
  11. Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
  12. Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
  13. Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
  14. Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
  15. Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
  16. Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
  17. Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
  18. Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
  19. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  20. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
  21. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).

Tags

מדעי המוח גיליון 160 תאי גזע עובריים של העכבר בידול עצבי גוף עוברי חומצה רטינואית בינוני N2B27
התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mao, X., Zhao, S. Neuronal… More

Mao, X., Zhao, S. Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro. J. Vis. Exp. (160), e61190, doi:10.3791/61190 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter