Summary
Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.
Abstract
La diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón (MESC) es una herramienta potencial para dilucidar los mecanismos clave implicados en la neurogénesis y potencialmente ayudar en la medicina regenerativa. Aquí, establecimos un método eficiente y de bajo costo para la diferenciación neuronal de los MESC invitro, utilizando la estrategia de cribado combinatorio. En las condiciones definidas aquí, la formación de cuerpos embrionados de 2 días + protocolo de inducción de ácido retinoico de 6 días permite una diferenciación rápida y eficiente de los mESC en células precursoras neuronales (NPC), como lo ve la formación de A2lox bien apilado y similar a un neurite y 129 derivados que son nestin positivos. El estado saludable de los cuerpos embrionarios y el punto de tiempo en el que se aplica el ácido retinoico (AR), así como las concentraciones de AR, son críticos en el proceso. En la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas, N2B27 medio II (complementado por medio neurobasal) podría apoyar mejor el mantenimiento a largo plazo y la maduración de las células neuronales. El método presentado es altamente eficiente, de bajo costo y fácil de operar, y puede ser una poderosa herramienta para la neurobiología y la investigación en biología del desarrollo.
Introduction
Las células madre embrionarias (ESC) son pluripotentes y pueden diferenciarse en células precursoras neuronales (NPC) y posteriormente en neuronas bajo ciertas condiciones1. La neurogénesis basada en ESC proporciona la mejor plataforma para imitar la neurogénesis, sirviendo así como una herramienta útil para estudios de biología del desarrollo y potencialmente ayuda en medicina regenerativa2,3. En las últimas décadas, muchas estrategias se han divulgado para inducir neurogénesis embrionaria, como el método transgénico4,utilizando moléculas pequeñas5,utilizando una matriz 3D microambiente6,y la técnica de co-cultivo7. Sin embargo, la mayoría de estos protocolos son condicionantes o difíciles de operar, por lo que no son adecuados para su uso en la mayoría de los laboratorios.
Para encontrar un método fácil de operar y de bajo costo para lograr una diferenciación neuronal eficiente de los mESC, aquí se utilizó una estrategia de cribado combinatoria. Como se describe en la Figura 1,todo el proceso de neurogénesis embrionaria se dividió en 2 fases. La Fase I se refiere al proceso de diferenciación de los MESC a los PNJ, y la fase II se relaciona con la diferenciación posterior de los PNJ en las neuronas. Sobre la base de los principios de fácil operación, bajo costo, materiales fácilmente disponibles y alta eficiencia de diferenciación, se eligieron siete protocolos en la Fase I y tres protocolos en la Fase II basados en el sistema tradicional de cultivo monocapa adherente o sistema de formación de cuerpos embrionados8,9. La eficiencia de diferenciación de los protocolos en ambas fases se evaluó utilizando la observación de morfología celular y el ensayo de inmunofluorescencia. Mediante la combinación del protocolo más eficiente de cada fase, establecimos el método optimizado para la diferenciación neuronal de los mESC.
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Protocol
1. Cultivo de células madre embrionarias del ratón
- Prepare platos o platos de cultivo celular recubiertos de gelatina al 0,1%.
- Añadir 2 ml de gelatina esterilizada del 0,1% (0,1% w/v en agua) a platos de cultivo celular de 60 mm. Rockear suavemente para asegurar incluso el recubrimiento de los platos de cultivo celular.
- Coloque los platos en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y deje el recubrimiento durante 1 h.
- Retire la solución de gelatina del 0,1% antes de sembrar las células.
NOTA: Después de retirar la gelatina, no es necesario secar o lavar los platos recubiertos.
- Cultivo de células madre embrionarias del ratón (A2lox y 129)
- Incubar células mESC (A2lox y 129) en el 0,1% de gelatina recubierta de 60 mm de platos de cultivo celular en medio de crecimiento mESC a 37 °C en una incubadora de CO2 del 5%, respectivamente. El medio de crecimiento del mESC consiste en un 85% de eliminación dmem/F12, 15% reemplazo sérico knock-out (KSR), 0,1 mM β-mercaptoetanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% aminoácido no esencial (NEAA), 1% penicilina/estreptomicina (P/S), 1000 factor inhibitorio de leucemia U/mL (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inhibidor de GSK-3) y 0,33 nM PD0325901 (inhibidor de MEK).
PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es inflamable y tiene toxicidad por inhalación. Manténgase alejado de las fuentes de fuego y use una máscara para evitar la inhalación cuando se utilice. - Cambie el medio de crecimiento del MESC diariamente para un mejor crecimiento de A2lox y 129.
- Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, retire el medio y agregue 1 ml de 0,1% de trippsina al plato. Mezcle suavemente durante 30 s para asegurar una cobertura uniforme de trypsina en todas las células.
- Deje las celdas durante aproximadamente 1 minuto para probar eltamaño de la triptina y luego retire la trippsina usando pipeta de 1 ml.
- Añadir 2 ml de medio de crecimiento mESC al plato, pipeta arriba y abajo varias veces para hacer una sola suspensión celular.
- Contar la densidad de las células en la suspensión con la mayor precisión posible utilizando hemociclo.
- Divida las células en 7 grupos e induzca la diferenciación utilizando diferentes protocolos que se muestran en la Tabla 1.
- Incubar células mESC (A2lox y 129) en el 0,1% de gelatina recubierta de 60 mm de platos de cultivo celular en medio de crecimiento mESC a 37 °C en una incubadora de CO2 del 5%, respectivamente. El medio de crecimiento del mESC consiste en un 85% de eliminación dmem/F12, 15% reemplazo sérico knock-out (KSR), 0,1 mM β-mercaptoetanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% aminoácido no esencial (NEAA), 1% penicilina/estreptomicina (P/S), 1000 factor inhibitorio de leucemia U/mL (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inhibidor de GSK-3) y 0,33 nM PD0325901 (inhibidor de MEK).
2. Diferenciación de mESC a PNJ (Fase I)
- Prepare placas de cultivo celular recubiertas de gelatina al 0,1% o cubre manchas.
- Antes de su uso, prepare 0.1% de placas de gelatina recubiertas de 6 pozos o cubrecubres como en el paso 1.1.
- Diferenciación de fase I mediante el protocolo 1 (Tabla 1)
- Semillas de aproximadamente 2 x 104 mESC en 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Compruebe la densidad celular bajo un microscopio.
- Incubar las células a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 6 h para permitir el apego.
- Después del apego, saque de las células de la incubadora y lave las células dos veces con 2 ml de PBS.
- Agregue 2 ml de medio de diferenciación basal I(Tabla 1)a cada pozo y vuelva a colocar las células en la incubadora.
- Deje las células para la diferenciación durante 8 días. Reemplace el medio de diferenciación basal I cada 2 días.
- Diferenciación de fase I mediante el protocolo 2 (Tabla 1)
- Añadir 1,5 x 106 mESC en un plato bacteriano nodhesivo en 10 ml de medio de diferenciación basal I para permitir la formación de cuerpos embrionados a 37 °C en una incubadora de CO2 del 5%.
- Después de 2 días, transfiera los agregados celulares a 15 tubos centrífugas de ml y déjelos establecer por gravedad.
- Retire el sobrenadante y agregue 10 ml de medio de diferenciación basal fresco I para resuspend los cuerpos embrionados. Replantarlos en un nuevo plato bacteriano nodhesivo y permitir la diferenciación durante otros 2 días.
- Compruebe la formación de cuerpos embrionarios bajo el microscopio (Figura 2A).
- Recoger cuerpos embrionarios como se describe en los pasos 2.3.2-2.3.3. Semillas alrededor de 50 cuerpos embrionarios en 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en placas de 6 pozos recubiertas de gelatina del 0,1%.
- Prepare 1 mM de caldo ra totalmente trans (en DMSO) y guárdelo lejos de la luz en un congelador de -80 °C después del subenvasado.
NOTA: La AR es inestable, y se debe prestar atención a mantenerla alejada de la luz y reducir el contacto con el aire durante la preparación del caldo de RA. - Para la inducción de AR, agregue 2 μL de caldo de AR en cada pozo para hacer una concentración final de 1 μM.
- Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y diferencie durante otros 4 días.
- Cambie los 2 ml enteros del medio de diferenciación basal I (con 1 μM RA) cada 2 días.
- Diferenciación de fase I mediante el protocolo 3 (Tabla 1)
- Plantar 1,5 x 106 mESC en un plato bacteriano nodhesivo en 10 ml de medio de diferenciación basal I. Dejar durante 2 días para la formación de cuerpos embrionados a 37 °C en una incubadora de CO2 del 5%.
- Compruebe la formación de cuerpos embrionarios bajo un microscopio(Figura 2B).
- Transfiera los agregados celulares a tubos centrífugas de 15 ml y déjelos establecer por gravedad.
- Retire el sobrenadante cuidadosamente y agregue 10 ml de medio de diferenciación basal fresco I para volver a usarlos.
- Sembrar alrededor de 50 cuerpos embrionarios en 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%.
- Para la inducción de AR, agregue 2 μL de caldo de AR en cada pozo para hacer una concentración final de 1 μM.
- Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y diferencie durante otros 6 días. Cambie todo el medio de diferenciación basal I (con 1 μM RA) cada 2 días.
- Diferenciación de fase I mediante el protocolo 4 (Tabla 1)
- Semillas de aproximadamente 2 x 104 mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h.
- Después de la fijación, lave las células dos veces con 2 ml de PBS. Añadir 2 ml de medio de diferenciación basal I a cada pozo y permitir la diferenciación durante 4 días en la incubadora de CO2 del 5% a 37 °C.
- Para la inducción por AR, añadir 2 μL de caldo de AR trans en cada pozo (la concentración de trabajo es de 1 μM) para inducir la diferenciación durante otros 4 días.
- En todo el proceso, reemplace todo el medio cada 2 días.
- Diferenciación de fase I mediante el protocolo 5 (Tabla 1)
- Semillas de aproximadamente 2 x 104 mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h.
- Lave las células dos veces con 2 ml de PBS. Añadir 2 ml de medio de diferenciación basal I a cada pozo y permitir la diferenciación durante 2 días en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C.
- Para la posterior inducción de AR, añadir 2 μL de caldo de AR en cada pozo para hacer una concentración final de 1 μM. Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para inducir la diferenciación durante otros 6 días.
- En todo el proceso, reemplace todo el medio cada 2 días.
- Diferenciación de fase I mediante el protocolo 6 (Tabla 1)
- Plantar 1,5 x 106 mESC en un plato bacteriano nodhesivo en 10 ml de N2B27 medio II(Tabla 1)para permitir la formación de cuerpos embrionarios.
- Eldía 2, recoja los agregados celulares como se describe en los pasos 2.3.2-2.3.3 y resuspend los cuerpos embrionarios usando 10 ml de N2B27 medio II fresco.
- Replantarlos en un nuevo plato bacteriano nodhesivo y permitir la diferenciación durante otros 2 días en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. Compruebe la formación de cuerpos embrionarios bajo microscopio.
- El día4, recoge cuerpos embrionarios. Sembrar alrededor de 50 cuerpos embrionarios por pozo en placas de 6 pozos recubiertas de gelatina del 0,1% con 2 ml de N2B27 medio II.
- Añadir 2 μL de caldo de AR totalmente trans en cada pozo e inducir la diferenciación durante otros 4 días. Reemplace todo el medio (N2B27 medio II por 1 μM RA) cada dos días.
- Diferenciación de fase I mediante el protocolo 7 (Tabla 1)
- Semillas de aproximadamente 2 x 104 mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h.
- Lave las células dos veces con PBS. A continuación, añadir 2 ml de N2B27 medio II a cada pozo y permitir la diferenciación durante 8 días a 37 °C en una incubadora de CO2 del 5%.
- Cambie todo el medio N2B27 II cada 2 días.
3. Observación morfológica celular
- Compruebe el estado de diferenciación de los 7 grupos mencionados anteriormente diariamente bajo un microscopio de luz de contraste de fase invertido.
- Seleccione aleatoriamente al menos 12 campos y tome fotos para registrar los cambios morfológicos de cada grupo en D8.
4. Tinción de inmunofluorescencia
- Preparación de la muestra: Plecciones de semillas en 0.1% coverslips recubiertos de gelatina y permiten la diferenciación durante 8 días utilizando los protocolos mencionados en el paso 2.
- Enjuague: El día8, saque las muestras de la incubadora y retire el medio de diferenciación por aspiración. Enjuague suavemente las células una vez con 1 ml de PBS durante 5 minutos.
- Fijación: Agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% a cada muestra y fije las celdas durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Enjuague: Después de la fijación, enjuague suavemente las células con 1 ml de PBS 3 veces, durante 5 minutos cada una.
- Permeabilización: Añadir 1 ml de 0.2% TritonX-100 en PBS a cada muestra y dejar durante 8 minutos en RT.
- Enjuague: Después de la permeabilización, enjuague suavemente las células con 1 ml de PBS 3 veces, durante 5 minutos cada una.
- Bloqueo: Añadir 1 ml de suero de cabra al 10% en PBS a cada muestra e incubar en RT durante 1 h para bloquear cualquier interacción no específica.
- Incubación con anticuerpo primario
- Diluir el anticuerpo anti-Nestin a una proporción de 1:100 usando 5% suero de cabra en PBS.
- Aplicar 500 μL de anticuerpo diluido en diferentes muestras e incubar durante la noche a 4 °C.
- Enjuagar: Retire el anticuerpo y enjuague las muestras suavemente con 1 ml de PBS 3 veces durante 8 minutos cada una.
- Incubación con anticuerpo secundario
- Diluya el IgG anti-ratón de cabra con etiqueta Alexa Fluor 488 a una proporción de 1:500 usando un 5% de suero de cabra en PBS.
- Aplicar 500 μL de anticuerpo diluido en diferentes muestras e incubar en la oscuridad durante 2 h en RT.
NOTA: Después de aplicar anticuerpo secundario fluorescente, realice todos los pasos posteriores en la oscuridad para evitar que se calme la fluorescencia.
- Enjuague: Retire el anticuerpo secundario y enjuague las muestras suavemente con 1 ml de PBS 3 veces durante 8 minutos cada una.
- Tinción y montaje nuclear
- Coloque una gota del medio de montaje DAPI en el microsluro limpio.
- Retire cuidadosamente las muestras de las placas y coloque la muestra encima del medio de montaje DAPI con la celda boca abajo. Dejar en la oscuridad durante 5 minutos en RT.
- Retire el exceso de medio de montaje DAPI con papel absorbente.
- Observación de microscopía de fluorescencia
- Coloque las muestras bajo la microscopía de fluorescencia y detecte la señal de DAPI y Alexa Fluor 488 utilizando filtros adecuados.
- Elija de manera uniforme y aleatoria 10-15 campos visuales diferentes para cada muestra y grabe las imágenes con una cámara CCD.
5. Diferenciación de los PNJ a las neuronas (Fase II)
- Preparar derivados mESC en la diferenciación de fase I utilizando el protocolo 3 (8 días, Cuadro 1)como se detalla en el paso 2.4, que tiene la mayor eficiencia de diferenciación (véase la Figura 3).
NOTA: Después de la diferenciación de la fase I, el control de calidad debe llevarse a cabo utilizando la observación de morfología celular y el ensayo de inmunofluorescencia mencionado anteriormente, para garantizar un PNJ sano y de alto rendimiento. - Semillas de aproximadamente 5 x 105 derivados mESC dentro de 2 ml de medio de diferenciación basal I por pozo en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina al 0,1%. Divida aleatoriamente los derivados del mESC en 3 grupos, como el protocolo de fase II 1, el protocolo 2 y el protocolo 3, respectivamente.
- Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h. Lávalo dos veces con 2 ml de PBS.
- Añadir 2 ml de medio de diferenciación basal I, N2B27 medio I y N2B27 medio II(Tabla 2),respectivamente, a cada pozo de los grupos anteriores.
- Coloque las placas en la incubadora y deje diferenciar durante otros 10 días. Cambie el medio correspondiente cada 2 días.
- Compruebe el estado de diferenciación y registre los cambios morfológicos mencionados en el paso 3.
- El día 18, evaluar la generación de neuronas (β-Tubulin III positivo) y determinar la eficiencia de diferenciación de los 3 protocolos que se utilizan en el paso 4.
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Representative Results
La formación de cuerpos embrionados de 2 días + la inducción por AR de 6 días funciona mejor en la dirección de la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I). Para determinar el protocolo óptimo que mejor promueve la diferenciación de los MESC en PNJ (Fase I), se probaron 7 protocolos tanto en A2lox como en 129 mESCs(Cuadro 1)y se monitorizó el estado de diferenciación de cada grupo utilizando microscopio ligero. Como se muestra en la Figura 3A, la mayoría de los derivados A2lox y 129 bajo el tratamiento de "formación de cuerpos embrionados de 2 días + inducción de RA de 6 días" (Fase I-protocolo 3) mostraron morfologías bien apiladas y similares a neuritas, lo que indica la formación de NPCs. Sin embargo, las células con tratamiento de "formación de cuerpos embrionarios de 4 días + inducción por AR de 4 días" (Phase I-protocol 2) mostraron un estado pobre y apoptótico, que puede deberse a la falta de nutrientes dentro de los cuerpos embrionarios. El cultivo monocapa combinado con la inducción por AR (Fase I-protocolo 4 y 5) también podría dirigir la diferenciación de los MESC, mientras que la proporción de células similares a la neurita no era tanto como la del protocolo fase I 3. Mientras tanto, la mayoría de los derivados de A2lox y 129 en los protocolos de fase I 6 y 7 mostraron cuerpos celulares más pequeños y tendieron a someterse a apoptosis, lo que sugiere que N2B27 medio II no podía soportar la neurogénesis embrionaria de manera efectiva.
Para confirmar aún más la formación de PNJ, se detectó el porcentaje de células Nestin+ (marcador para PNJ) en cada grupo mediante un ensayo de inmunofluorescencia. En la Figura 3B,el porcentaje de células Nestin+ en la Fase I-protocolo 3 fue el más alto y alcanzó hasta 77,67 ± 4,33% y 69,33 ± 2,33% en A2lox y 129 derivados, respectivamente. En conjunto, el protocolo 3 de fase I funciona mejor para dirigir la diferenciación de los MESC en los PNJ.
N2B27 medio II puede inducir más eficazmente la diferenciación de los PNJ en las neuronas (Fase II). Se examinaron tres protocolos de diferenciación de fase II. Como se muestra en la Figura 4A,la observación morfológica mostró que la mayoría de los derivados A2lox y 129 en la fase II-protocolo 3 (diferenciación con N2B27 medio II) aparecieron las estructuras más prolongadas similares a las neuronas con neurites claros y extensiones del cuerpo celular para el día 18, lo que indica la aparición eficiente de neurogénesis. Los ensayos de inmunofluorescencia confirmaron además la generación de neuronas, con un porcentaje de células β-Tubulina III+ de hasta 67,75 ± 4,01% y 58,73 ± 7,25%, respectivamente, en A2lox y 129 derivados en D18(Figura 4B).
Para hacerlo más claro, se muestra un diagrama esquemático del método optimizado para la neurogénesis embrionaria en la Figura 5. Brevemente, 1,5 x 106 mESC se siembran en un plato bacteriano nodhesivo en 10 ml de medio de diferenciación basal I y permiten la formación de cuerpos embrionados durante 2 días. A continuación, los cuerpos embrionarios se recogen y plantan en las placas de 6 pozos recubiertas de gelatina del 0,1% con la concentración de 50 cuerpos embrionarios por pozo. Mientras tanto, la AR (1 μM) se añade durante otros 6 días. Desde el día 8 hasta el día 18, se elimina la AR y se aplica N2B27 medio II para dirigir la diferenciación posterior de los PNJ a las neuronas. Con un método tan combinado, se pueden formar neuronas robustas el día 18.
Figura 1: Diagrama del proceso de neurogénesis embrionaria. Esta cifra ha sido modificada desde Li et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La morfología de los cuerpos embrionarios. (A) Cuerpos embrionarios cultivados durante 4 días. B) Cuerpos embrionarios cultivados durante 2 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de eficiencia de los 7 protocolos de diferenciación de fase I utilizando A2lox y 129 mESCs. (A) Análisis morfológico de derivados de A2lox y 129 mESCs el día 8. Panel superior: Derivados de A2lox; Panel inferior: 129 derivados. (B) Detección de inmunofluorescencia para la formación de PNJ (Nestin+, verde). Los núcleos estaban etiquetados de azul con DAPI. Panel superior: Derivados A2lox en D8; Panel inferior: 129 derivados en D8. Los porcentajes de células Nestin+ de cada grupo se mostraron mediante histograma. Cada columna representa la media±SEM de tres experimentos independientes. *, p≤0.05; **, p≤0.01. Esta cifra ha sido modificada desde Li et al.10. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación de eficiencia de los 3 protocolos sobre diferenciación de fase II. (A) Análisis morfológico de derivados de A2lox y 129 mESC el día 18. Panel superior: Derivados de A2lox; Panel inferior: 129 derivados. (B) Detección de inmunofluorescencia para la formación de neuronas (β-Tubulina III+, rojo). Los núcleos estaban etiquetados de azul con DAPI. Panel superior: Derivados A2lox en D18; Panel inferior: 129 derivados en D18. Porcentajes de células β-Tubulina III+ de cada grupo se mostraron mediante histograma. Cada columna representa la media ± SEM de tres experimentos independientes. *, p≤0.05; **, p≤0.01. Esta cifra ha sido modificada desde Li et al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Breve modelo del método optimizado para la diferenciación neuronal de los MESC in vitro Esta cifra se ha modificado desde liet al.10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Diferenciación Fase I (8d) | ||
| Protocolos | Medio | |
| protocolo 1 | Diferenciación natural: Con medio de diferenciación basal sólo | Medio de diferenciación basal I: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0,1mM 2ME+ 1%P/S |
| protocolo 2 | Formación de cuerpos embrionarios de 4 días + inducción de RA de 4 días | |
| protocolo 3 | Formación de cuerpos embrionarios de 2 días + inducción de RA de 6 días | |
| protocolo 4 | Cultivo monocapa combinado con inducción ra: 4d (-RA) 4d (+RA) | |
| protocolo 5 | Cultivo monocapa combinado con inducción ra: 2d (-RA) 6d(+RA) | |
| protocolo 6 | Formación de cuerpos embrionarios (4 d) y diferenciación inducida con N2B27 medio II | N2B27 medio II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Medio neurobasal + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0,1mM 2ME |
| protocolo 7 | Cultivo monocapa con N2B27 medio II | |
Tabla 1: Detalles de los 7 protocolos utilizados en la diferenciación de fase I. Esta tabla ha sido modificada desde Li et al.10.
| Diferenciación Fase II (10d) | ||
| Protocolos | Medio | |
| protocolo 1 | Diferenciación natural: Con medio de diferenciación basal sólo | Medio de diferenciación basal I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0,1mM 2ME+ 1%P/S |
| protocolo 2 | Diferenciación con N2B27 medio I | N2B27 medio I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%GlutaMAX +0,1mM 2ME |
| protocolo 3 | Diferenciación con N2B27 medio II | N2B27 medio II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Medio neurobasal + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0,1mM 2ME |
Tabla 2: Detalles de los 3 protocolos utilizados en la diferenciación de fase II. Esta tabla ha sido modificada desde Li et al.10.
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Discussion
En el presente estudio, establecimos un método simple y eficaz para la diferenciación neuronal de los mESC, con materiales de bajo costo y fácil obtención. En este método, 2 días de formación de cuerpos embrionados seguidos de 6 días de inducción por AR pueden promover eficazmente la diferenciación de los MESC en LOSP (Fase I-protocolo 3). Para la diferenciación de fase II, N2B27 medio II (Fase II-protocolo 3) más eficazmente inducen la diferenciación de los NPC en las neuronas. Para garantizar el éxito, se debe prestar más atención a varios pasos críticos.
En primer lugar, el estado saludable de los cuerpos embrionarios es la clave para todo el proceso de diferenciación. La formación de cuerpos embrionarios tridimensionales se utiliza generalmente para dirigir la diferenciación de los ESC8. En este estudio, investigamos el tiempo adecuado de cultivo de suspensión de los cuerpos embrionarios. Como se muestra en la Figura 2,los cuerpos embrionarios redondos con núcleos brillantes se formaron después del cultivo de suspensión durante 2 días en esta condición. Sin embargo, cuando se cultivan durante 4 días, muchos cuerpos embrionarios se adhieren entre sí, y los núcleos se vuelven oscuros, lo que indica la apoptosis de las células en los núcleos. La diferenciación posterior confirmó además el peor efecto de la formación prolongada del cuerpo embrionario. En algunos estudios notificados, el cultivo de suspensión de cuerpos embrionarios podría durar hasta 10 días, utilizando medio con menor concentración de FBS o sin FBS11. El tiempo reducido para la formación de cuerpos embrionarios en el estudio puede deberse a una mayor concentración de FBS (15%) utilizado aquí, y se ha demostrado que 15% FBS puede promover mejor la formación y diferenciación de cuerpos embrionarios.
En segundo lugar, el punto de tiempo en el que se aplica la AR y la concentración de trabajo ra son críticos para la determinación del destino celular de los MESC. Ra, un derivado de la vitamina A, es uno de los morfógenos más importantes con acciones pleiotrópicas12. La AR puede regular múltiples vías de señal y afectar la determinación del destino celular de los ESC13,14. Los informes mostraron que el tratamiento a corto plazo de los mESC con AR durante la etapa de diferenciación temprana impedía la diferenciación espontánea y mantuvo la capacidad de autorretración de los MESC15. Otros sugirieron que la AR podría regular tanto la diferenciación de células germinales como la diferenciación neuronal de los ESC, que dependen del punto de tiempo16,17,18. En la condición presentada aquí, la AR añadió elsegundo día después de que la formación del cuerpo embrionario sea apropiada para dirigir la diferenciación en PNJ. Mientras tanto, la concentración de trabajo de la AR también es crítica. Las bajas concentraciones de AR (~10 nM) pueden inducir la diferenciación de los mESC en células similares al endodermo, mientras que las altas concentraciones de AR (1-5 μM) son más propensas a inducir la diferenciación en los PNJ13,14,15,16,17,18,19. Debido al uso de la AR, uno esperaría un efecto de caudalización; la diferenciación en las neuronas cerebrales de los antebrazo rara vez se vería y producir neuronas de hindbrain y los destinos de la médula espinal ocurriría20,21. Además, la AR es un agente de fácil acceso y bajo costo, y el uso de este protocolo puede ahorrar fondos de investigación para la mayoría de los laboratorios.
En tercer lugar, en las condiciones aquí presentadas, los PNJ generados después de la diferenciación de fase I pueden almacenarse y pasarse en condiciones adecuadas. La criopreservación con alta densidad celular (>2 x 106)utilizando Stem-Cellbanker puede reducir eficazmente el daño celular causado por la congelación para obtener una alta tasa de recuperación. Mientras tanto, los PNJ generados en el estudio se pueden pasar utilizando el medio N2B27 (49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Medio neurobasal + 2% B27) con una densidad celular superior a 5 x 105/cm2. Bajo baja densidad celular (menos de 0,5 x 105/cm2),los PNJ tienden a diferenciarse. Tal criopreservación celular y recuperación puede traer gran comodidad a la investigación.
Además, el medio neurobasal es esencial para la diferenciación de fase II. El medio neurobasal está diseñado específicamente para el mantenimiento a largo plazo y la maduración de células neuronales. Como se indica en N2B27 medio II(Tabla 2),la adición del medio Neurobasal podría apoyar mejor la diferenciación de los NPC en las neuronas.
Colectivamente, informamos de un método eficiente y de bajo costo para la diferenciación neuronal de los MESC in vitro, utilizando las estrategias de cribado combinatorio. El método establecido es muy fácil de implementar y es adecuado para su uso por la mayoría de los laboratorios. Este método optimizado puede ser una poderosa herramienta para la neurobiología y la investigación en biología del desarrollo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31501099) y el Departamento de Educación Media y Joven de la Provincia de Hubei, China (No. Q20191104). Además, agradecemos al profesor Wensheng Deng de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Wuhan por proporcionar las líneas de células madre embrionarias del ratón A2lox.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
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