Summary
Her etablerte vi en lav pris og enkel å betjene metode som leder rask og effektiv differensiering fra embryonale stamceller til nevroner. Denne metoden er egnet for popularisering blant laboratorier og kan være et nyttig verktøy for nevrologisk forskning.
Abstract
Den nevrale differensieringen av mus embryonale stamceller (mESCs) er et potensielt verktøy for å belyse de viktigste mekanismene som er involvert i nevrogenese og potensielt hjelpe til med regenererende medisin. Her etablerte vi en effektiv og rimelig metode for nevronal differensiering fra mESCs in vitro, ved hjelp av strategien for kombinatorisk screening. Under betingelsene som er definert her, tillater den 2-dagers embryoide kroppsdannelsen + 6-dagers retinosyreinduksjonsprotokoll rask og effektiv differensiering fra mESCer til nevrale forløperceller (NPCer), sett ved dannelsen av godt stablet og neurittlignende A2lox og 129 derivater som er Nestin-positive. Den sunne tilstanden til embryolegemer og tidspunktet da retinsyre (RA) påføres, samt RA-konsentrasjonene, er kritiske i prosessen. I den påfølgende differensieringen fra NpCer til nevroner, kunne N2B27 medium II (supplert med Neurobasal medium) bedre støtte det langsiktige vedlikeholdet og modningen av nevronale celler. Den presenterte metoden er svært effektivitet, lave kostnader og enkel å betjene, og kan være et kraftig verktøy for nevrobiologi og utviklingsbiologi forskning.
Introduction
Embryonale stamceller (ESCer) er pluripotente og kan differensiere til nevrale forløperceller (NpCer) og deretter inn i nevroner under visse forhold1. ESC-basert nevrogenese gir den beste plattformen for å etterligne nevrogenese, og fungerer dermed som et nyttig verktøy for utviklingsbiologistudier og potensielt hjelp til regenerativ medisin2,3. I de siste tiårene har mange strategier blitt rapportert for å indusere embryonal nevrogenese, for eksempel den transgenemetoden 4, ved hjelp av småmolekyler 5, ved hjelp av et 3D-matrisemikromiljø6, og co-kulturteknikken7. Imidlertid er de fleste av disse protokollene enten tilstandsbegrenset eller vanskelig å betjene, og dermed er de ikke egnet for bruk i de fleste laboratorier.
For å finne en enkel å betjene og lav pris metode for å oppnå effektiv neural differensiering fra mESCer, ble en kombinatorisk screeningstrategi brukt her. Som beskrevet i figur 1ble hele prosessen med embryonisk nevrogenese delt inn i 2 faser. Fase I refererer til differensieringsprosessen fra mESCer til NPCer, og fase II er relatert til den påfølgende differensieringen fra NpCer til nevroner. Basert på prinsippene for enkel drift, lave kostnader, lett tilgjengelige materialer og høy differensieringseffektivitet, ble syv protokoller i fase I og tre protokoller i fase II valgt basert på det tradisjonelle tilhengerkultursystemet eller embryoidkroppsdannelsessystem 8,9. Differensieringseffektiviteten til protokoller i begge faser ble evaluert ved hjelp av cellemorfologiobservasjon og immunofluorescence analyse. Gjennom å kombinere den mest effektive protokollen i hver fase, etablerte vi den optimaliserte metoden for neural differensiering fra mESCer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mus embryonale stamcellekultur
- Forbered 0,1% gelatinbelagte cellekulturretter eller tallerkener.
- Tilsett 2 ml sterilisert 0,1% gelatin (0,1% w / v i vann) til 60 mm cellekulturretter. Rock forsiktig for å sikre jevn belegg av cellekulturretter.
- Legg oppvasken i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C og la belegget i 1 time.
- Fjern 0,1% gelatinoppløsning før du sår cellene.
MERK: Etter at du har fjernet gelatinen, er det ikke nødvendig å tørke eller vaske de belagte rettene.
- Mus embryonale stamceller (A2lox og 129) kultur
- Inkuber mESCs (A2lox og 129) celler i 0,1% gelatinbelagte 60 mm cellekulturretter i mESC vekstmedium ved henholdsvis 37 °C i en 5 % CO2 inkubator. MESC vekstmediet består av 85% knock-out DMEM / F12, 15% Knock-out serum erstatning (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1 % ikke-essensiell aminosyre (NEAA), 1 % penicillin/streptomycin (P/S), 1000 U/ml leukemihemmerifaktor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-hemmer) og 0,33 nM PD0325901 (MEK-hemmer).
FORSIKTIG: β-mercaptoetanol er brannfarlig og har innåndingstoksisitet. Hold deg unna brannkilder og bruk en maske for å unngå innånding ved bruk. - Endre mESC vekst medium daglig for bedre vekst av A2lox og 129.
- Når cellene når 80% samløpet, fjern mediet og legg til 1 ml 0,1% trypsin til parabolen. Stein forsiktig i 30 s for å sikre jevn deksel av trypsin på alle celler.
- La cellene stå i ca 1 min for å prøve ogderetter fjerne trypsin ved hjelp av 1 ml pipette.
- Tilsett 2 ml mESC vekstmedium til parabolen, pipette opp og ned flere ganger for å lage en enkelt celle suspensjon.
- Telle tettheten av cellene i suspensjonen så nøyaktig som mulig ved hjelp av hemocytometer.
- Del cellene i 7 grupper og induser differensiering ved hjelp av forskjellige protokoller som vises i tabell 1.
- Inkuber mESCs (A2lox og 129) celler i 0,1% gelatinbelagte 60 mm cellekulturretter i mESC vekstmedium ved henholdsvis 37 °C i en 5 % CO2 inkubator. MESC vekstmediet består av 85% knock-out DMEM / F12, 15% Knock-out serum erstatning (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1 % ikke-essensiell aminosyre (NEAA), 1 % penicillin/streptomycin (P/S), 1000 U/ml leukemihemmerifaktor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-hemmer) og 0,33 nM PD0325901 (MEK-hemmer).
2. Differensiering fra mESCer til NPCer (fase I)
- Forbered 0,1% gelatinbelagte cellekulturplater eller dekkslips.
- Før bruk, forberede 0,1% gelatin belagt 6-brønn plater eller dekklips som i trinn 1.1.
- Fase I differensiering ved hjelp av protokoll 1 (Tabell 1)
- Frø ca 2 x 104 ml i 2 ml basal differensieringsmedium I per brønn i de 0,1% gelatinbelagte 6-brønnsplatene. Kontroller celletettheten under et mikroskop.
- Inkuber cellene ved 37 °C i en 5 % CO2 inkubator i 6 timer for å tillate tilbehør.
- Etter vedlegg, ta ut av cellene fra inkubatoren, og vask cellene to ganger med 2 ml PBS.
- Tilsett 2 ml basal differensieringsmedium I (tabell 1) til hver brønn og sett cellene tilbake i inkubatoren.
- La cellene være forskjellige i 8 dager. Erstatt basal differensieringsmediet I hver 2.
- Fase I differensiering ved hjelp av protokoll 2 (Tabell 1)
- Tilsett 1,5 x 106 mESCer i en ikke-adheiv bakterierett i 10 ml basal differensieringsmedium I for å tillate embryoid kroppsdannelse ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
- Etter 2 dager, overføre celleaggregater i 15 ml sentrifuge rør og la dem bosette seg ved tyngdekraften.
- Fjern det overnaturlige og tilsett 10 ml frisk basal differensieringsmedium I for å gjenbruke embryolegemene. Plante dem til en ny nonadhesive bakteriell tallerken og tillate differensiering i ytterligere 2 dager.
- Kontroller dannelsen av embryolegemer under mikroskopet (figur 2A).
- Samle embryolegemer som beskrevet i trinn 2.3.2-2.3.3. Frø ca 50 embryoidlegemer i 2 ml basal differensieringsmedium I per godt på 0,1% gelatinbelagte 6-brønnplater.
- Forbered 1 mM all-trans RA lager (i DMSO) og lagre vekk fra lys i en -80 ° C fryser etter underemballasje.
MERK: RA er ustabil, og det bør tas hensyn til å holde den borte fra lys og redusere luftkontakten under fremstilling av RA-lager. - For RA-induksjon, tilsett 2 μL RA-lager i hver brønn for å lage en endelig konsentrasjon på 1 μM.
- Plasser platen i 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C og differensier i ytterligere 4 dager.
- Bytt hele 2 ml basal differensieringsmedium I (med 1 μM RA) annenhver dag.
- Fase I differensiering ved hjelp av protokoll 3 (Tabell 1)
- Plant 1,5 x 106 mESCer i en ikke-adhemmende bakterierett i 10 ml basal differensieringsmedium I. La stå i 2 dager for embryoid kroppsdannelse ved 37 °C i en 5 % CO2 inkubator.
- Kontroller dannelsen av embryolegemer under et mikroskop (figur 2B).
- Overfør celleaggregater til 15 ml sentrifugerør og la dem bosette seg ved tyngdekraften.
- Fjern supernatanten nøye og tilsett 10 ml frisk basal differensieringsmedium I for å gjenbruke dem.
- Frø ca 50 embryoidlegemer i 2 ml basal differensieringsmedium I per godt på 0,1% gelatinbelagte 6-brønnsplater.
- For RA-induksjon, tilsett 2 μL RA-lager i hver brønn for å lage en endelig konsentrasjon på 1 μM.
- Plasser platen i 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C og differensier i ytterligere 6 dager. Bytt hele basal differensieringsmediet I (med 1 μM RA) annenhver dag.
- Fase I differensiering ved hjelp av protokoll 4 (Tabell 1)
- Frø ca 2 x 104 ml innen 2 ml basal differensieringsmedium I per godt på de 0,1% gelatinbelagte 6-brønnsplatene. Plasser platen i 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C for å tillate feste i 6 timer.
- Etter vedlegg, vask cellene to ganger med 2 ml PBS. Tilsett 2 ml basal differensieringsmedium I til hver brønn og la det være differensiering i 4 dager i 5% CO2 inkubator ved 37 °C.
- For RA-induksjon, tilsett 2 μL av all-trans RA-lager i hver brønn (arbeidskonsentrasjonen er 1 μM) for å indusere differensiering i ytterligere 4 dager.
- I hele prosessen erstatter du hele mediet hver 2.
- Fase I differensiering ved hjelp av protokoll 5 (Tabell 1)
- Frø ca 2 x 104 ml innen 2 ml basal differensieringsmedium I per godt på de 0,1% gelatinbelagte 6-brønnsplatene. Plasser platen i 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C for å tillate feste i 6 timer.
- Vask cellene to ganger med 2 ml PBS. Tilsett 2 ml basal differensieringsmedium I til hver brønn og la det være differensiering i 2 dager i 5% CO2 inkubator ved 37 °C.
- For den påfølgende RA-induksjonen, tilsett 2 μL RA-lager i hver brønn for å lage en endelig konsentrasjon på 1 μM. Plasser platen i 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C for å indusere differensiering i ytterligere 6 dager.
- I hele prosessen erstatter du hele mediet hver 2.
- Fase I differensiering ved hjelp av protokoll 6 (Tabell 1)
- Plant 1,5 x 106 mESCer i en ikke-adhemmende bakterierett i 10 ml N2B27 medium II (tabell 1) for å tillate embryofødt legemer dannelse.
- På den andredagen samler du celleaggregatene som beskrevet i trinn 2.3.2-2.3.3 og gjenbruker embryolegemene ved hjelp av 10 ml frisk N2B27 medium II.
- Plante dem til en ny nonadhesive bakteriell rett og tillate differensiering i ytterligere 2 dager i 5% CO2 inkubator ved 37 °C. Kontroller dannelsen av embryolegemer under mikroskop.
- På denfjerde dagen samler embryolegemer. Frø ca 50 embryolegemer per godt på 0,1% gelatinbelagte 6-brønnsplater med 2 ml N2B27 medium II.
- Tilsett 2 μL av all-trans RA-lager i hver brønn og induser differensiering i ytterligere 4 dager. Bytt ut hele mediet (N2B27 medium II med 1 μM RA) annenhver dag.
- Fase I differensiering ved hjelp av protokoll 7 (Tabell 1)
- Frø ca 2 x 104 ml innen 2 ml basal differensieringsmedium I per godt på de 0,1% gelatinbelagte 6-brønnsplatene. Plasser platen i 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C for å tillate feste i 6 timer.
- Vask cellene to ganger med PBS. Deretter legger du til 2 ml N2B27 medium II til hver brønn og tillater differensiering i 8 dager ved 37 °C i en 5 % CO2 inkubator.
- Endre hele N2B27 medium II annenhver dag.
3. Celle morfologi observasjon
- Kontroller differensieringsstatusen til de ovennevnte 7 gruppene daglig under et invertert fasekontrastlysmikroskop.
- Velg tilfeldig minst 12 felt og ta bilder for å registrere de morfologiske endringene i hver gruppe på D8.
4. Immunofluorescence flekker
- Prøveklargjøring: FrømESCer på 0,1% gelatinbelagte dekkslepper og la til differensiering i 8 dager ved hjelp av protokollene nevnt i trinn 2.
- Skyll: På den8. Skyll cellene forsiktig én gang med 1 ml PBS i 5 min.
- Fiksering: Tilsett 1 ml 4% paraformaldehyd i hver prøve og fest cellene i 20 min ved romtemperatur (RT).
- Skyll: Etter fiksering, skyll forsiktig cellene med 1 ml PBS 3 ganger, i 5 min hver.
- Permeabilisering: Legg til 1 ml på 0,2% TritonX-100 i PBS til hver prøve og la stå i 8 min ved RT.
- Skyll: Etter permeabilisering, skyll forsiktig cellene med 1 ml PBS 3 ganger, i 5 min hver.
- Blokkering: Tilsett 1 ml 10 % geiteserum i PBS i hver prøve og inkuber ved RT i 1 time for å blokkere eventuelle ikke-spesifikke interaksjoner.
- Inkubasjon med primært antistoff
- Fortynn anti-Nestin-antistoffet i forholdet 1:100 ved hjelp av 5% geiteserum i PBS.
- Påfør 500 μL fortynnet antistoff på forskjellige prøver og inkuber over natten ved 4 °C.
- Skyll: Fjern antistoffet og skyll prøvene forsiktig med 1 ml PBS 3 ganger i 8 min hver.
- Inkubasjon med sekundært antistoff
- Fortynn Alexa Fluor 488-merket geit anti-mus IgG i forholdet 1:500 ved hjelp av 5% geit serum i PBS.
- Påfør 500 μL fortynnet antistoff på forskjellige prøver og inkuber i mørket i 2 timer ved RT.
MERK: Etter påføring av fluorescerende sekundært antistoff, utfør alle de påfølgende trinnene i mørket for å forhindre fluorescensslukking.
- Skyll: Fjern det sekundære antistoffet og skyll prøvene forsiktig med 1 ml PBS 3 ganger i 8 min hver.
- Kjernefysisk farging og montering
- Plasser en dråpe DAPI-monteringsmedium på det rene mikroraset.
- Ta forsiktig ut av prøvene fra platene og plasser prøven på toppen av DAPI-monteringsmediet med cellen med forsiden ned. La stå i mørket i 5 min ved RT.
- Fjern overflødig DAPI-monteringsmedium med absorberende papir.
- Fluorescens mikroskopi observasjon
- Plasser prøvene under fluorescensmikroskopien og oppdag signalet for DAPI og Alexa Fluor 488 ved hjelp av riktige filtre.
- Jevnt og tilfeldig plukke 10-15 forskjellige visuelle felt for hvert eksempel og ta opp bildene med et CCD-kamera.
5. Differensiering fra NPCer til nevroner (fase II)
- Klargjør mESC-derivater under fase I differensiering ved hjelp av protokoll 3 (8 dager, tabell 1) som beskrevet i trinn 2.4, som har høyest differensieringseffektivitet (se figur 3).
MERK: Etter fase I differensiering bør kvalitetskontroll utføres ved hjelp av cellemorfologiobservasjon og immunofluorescence analyse nevnt ovenfor, for å sikre en sunn og høy-yield NPCer. - Frø ca 5 x 105 mESC derivater innen 2 ml basal differensiering medium I per godt på 0,1% gelatinbelagte 6-brønnplater. Del mESC-derivatene tilfeldig i 3 grupper, som henholdsvis fase II-protokoll 1, protokoll 2 og protokoll 3.
- Plasser platen i 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C for å tillate feste i 6 timer. Vask dem to ganger med 2 ml PBS.
- Tilsett henholdsvis 2 ml basal differensieringsmedium I, N2B27 medium I og N2B27 medium II (tabell 2) til hver brønn av gruppene ovenfor.
- Plasser platene i inkubatoren og la det differensiere i ytterligere 10 dager. Endre tilsvarende medium hver 2.
- Kontroller differensieringsstatusen og registrer de morfologiske endringene som nevnt i trinn 3.
- På dag 18, vurdere generering av nevroner (β-Tubulin III positiv) og bestemme differensiering effektivitet av 3 protokoller ved hjelp av i trinn 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2-dagers embryoid kroppsdannelse + 6-dagers RA induksjon fungerer best på å lede differensiering av mESCer i NPCer (fase I). For å finne den optimale protokollen som best fremmer differensieringen av mESCer i NPCer (fase I), ble 7 protokoller testet på både A2lox og 129 mESCer (tabell 1) og differensieringsstatusen for hver gruppe ble overvåket ved hjelp av lysmikroskop. Som vist i figur 3Aviste de fleste A2lox- og 129 derivater under "2-dagers embryofødt kroppsdannelse + 6-dagers RA-induksjon" behandling (fase I-protokoll 3) godt stablet og nøyrittlignende morfologier, noe som indikerer dannelsen av NPCer. Celler med "4-dagers embryoid kroppsdannelse + 4-dagers RA induksjon" behandling (Fase I-protokoll 2) viste dårlig og apoptotisk status, noe som kan skyldes mangel på næringsstoffer i embryolegemer. Monolayer kultur kombinert med RA induksjon (Fase I-protokoll 4 og 5) kan også lede differensiering av mESCer, mens andelen neuritt-lignende celler ikke var så mye som i fase I-protokoll 3. I mellomtiden viste de fleste A2lox og 129 derivater i fase I-protokoll 6 og 7 mindre cellelegemer og hadde en tendens til å gjennomgå apoptose, noe som tyder på at N2B27 medium II ikke kunne støtte embryonal nevrogenese effektivt.
For ytterligere å bekrefte dannelsen av NpCer ble prosentandelen av Nestin+ celler (markør for NpCer) i hver gruppe oppdaget ved hjelp av en immunfluorescence analyse. I figur 3Bvar prosentandelen av Nestin+-celler i fase I-protokoll 3 den høyeste og nådde opp til henholdsvis 77,67 ± 4,33 % og 69,33 ± 2,33 % i A2lox og 129 derivater. Til sammen fungerer fase I-protokoll 3 best med å lede differensieringen av MESCer til NPCer.
N2B27 medium II kan mest effektivt indusere differensieringen fra NpCer til nevroner (fase II). Tre protokoller i fase II differensiering ble undersøkt. Som vist i figur 4Aviste morfologisk observasjon at de fleste A2lox- og 129 derivater i fase II-protokoll 3 (differensiering med N2B27 medium II) dukket opp de mest langvarige nevronlignende strukturer med klare nevritt og cellekroppsutvidelser innen dag 18, noe som indikerer den effektive forekomsten av nevrogenese. Immunofluorescence analyser ytterligere bekreftet generering av nevroner, med prosentandelen av β-Tubulin III + celler opp til 67,75 ± 4,01% og 58,73 ± 7,25%, henholdsvis i A2lox og 129 derivater på D18 (Figur 4B).
For å gjøre det klarere, vises et skjematisk diagram av den optimaliserte metoden for embryonisk nevrogenese i figur 5. Kort sagt, 1,5 x 106 mESCs seedes inn i en ikke-adheesiv bakteriell rett i 10 ml basal differensiering medium I og tillater embryoid kroppsdannelse i 2 dager. Deretter samles embryoide kropper og plantes i de 0,1% gelatinbelagte 6-brønnsplatene med konsentrasjonen av 50 embryolegemer per brønn. I mellomtiden tilsettes RA (1 μM) i ytterligere 6 dager. Fra dag 8 til dag 18 fjernes RA, og N2B27 medium II påføres for å lede den påfølgende differensieringen fra NPCer til nevroner. Med en slik kombinert metode kan robuste nevroner dannes på dag 18.
Figur 1: Diagram over embryonale nevrogeneseprosessen. Dette tallet er endret fra Li et al.10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologien til embryolegemene. (A) Embryoid organer dyrket i 4 dager. (B) Embryoid organer dyrket i 2 dager. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effektivitetssammenligning av de 7 protokollene på fase I differensiering ved hjelp av A2lox og 129 mESCer. (A) Morfologisk analyse av A2lox og 129 mESCs derivater på dag 8. Øvre panel: A2lox derivater; Nedre panel: 129 derivater. (B)Immunofluorescence deteksjon for dannelsen av NPCer (Nestin +, grønn). Kjernene ble merket blå med DAPI. Øvre panel: A2lox derivater på D8; Nedre panel: 129 derivater på D8. Prosentandeler av Nestin+-celler i hver gruppe ble vist av histogrammet. Hver kolonne representerer ±SEM for tre uavhengige eksperimenter. *, p≤0.05; **, s ≤0.01. Dette tallet er endret fra Li et al.10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effektivitetssammenligning av de 3 protokollene om fase II-differensiering. (A) Morfologisk analyse av A2lox og 129 mESCs derivater på dag 18. Øvre panel: A2lox derivater; Nedre panel: 129 derivater. (B)Immunofluorescence deteksjon for dannelsen av nevroner (β-Tubulin III +, rød). Kjernene ble merket blå med DAPI. Øvre panel: A2lox derivater på D18; Nedre panel: 129 derivater på D18. Prosentandeler av β-Tubulin III+ celler i hver gruppe ble vist ved histogrammet. Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. *, p≤0.05; **, s ≤0.01. Dette tallet er endret fra Li et al.10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kort modell av den optimaliserte metoden for nevronal differensiering fra mESCs in vitro Dette tallet er endret fra Liet al.10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Differensiering Fase I (8d) | ||
| Protokoller | Media | |
| protokoll 1 | Differensiering naturlig: Med basal differensieringsmedium jeg bare | Basal differensiering medium I: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0.1mM 2ME+ 1%P/S |
| protokoll 2 | 4-dagers embryoidlegemer dannelse + 4-dagers RA induksjon | |
| protokoll 3 | 2-dagers embryoidlegemer dannelse + 6-dagers RA induksjon | |
| protokoll 4 | Monolayer kultur kombinert med RA induksjon: 4d (-RA) 4d (+RA) | |
| protokoll 5 | Monolayer kultur kombinert med RA induksjon: 2d (-RA) 6d (+RA) | |
| protokoll 6 | Embryoid formasjon av organer (4 d) og differensiering indusert med N2B27 medium II | N2B27 medium II: 49% DMEM/ F12 + 1% N2 + 48% Neurobasal medium + 2% B27 +1% GlutaMAX + 0.1mM 2ME |
| protokoll 7 | Monolayer kultur med N2B27 medium II | |
Tabell 1: Detaljer om de 7 protokollene som brukes i fase I differensiering. Denne tabellen er endret fra Li et al.10.
| Differensiering Fase II (10d) | ||
| Protokoller | Media | |
| protokoll 1 | Differensiering naturlig: Med basal differensieringsmedium jeg bare | Basal differensiering medium I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0.1mM 2ME+ 1%P/S |
| protokoll 2 | Differensiering med N2B27 medium I | N2B27 medium I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%GlutaMAX +0.1mM 2ME |
| protokoll 3 | Differensiering med N2B27 medium II | N2B27 medium II: 49% DMEM/ F12 + 1% N2 + 48% Neurobasal medium + 2% B27 +1% GlutaMAX + 0.1mM 2ME |
Tabell 2: Detaljer om de 3 protokollene som brukes i fase II differensiering. Denne tabellen er endret fra Li et al.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den nåværende studien etablerte vi en enkel og effektiv metode for nevronal differensiering fra mESCer, med lave kostnader og lett oppnådde materialer. I denne metoden kan 2 dager med embryoid kroppsdannelse etterfulgt av 6 dager med RA-induksjon effektivt fremme differensiering av mESCer i NPCer (fase I-protokoll 3). For fase II differensiering induserer N2B27 medium II (Fase II-protokoll 3) mest effektivt differensieringen fra NPCer til nevroner. For å sikre suksess, bør mer oppmerksomhet rettes mot flere kritiske trinn.
For det første er den sunne tilstanden til embryoide kropper nøkkelen til hele differensieringsprosessen. Tredimensjonal embryoid kroppsdannelse brukes vanligvis til å lede differensieringen av ESCer8. I denne studien undersøkte vi riktig suspensjon kultur tid av embryoide organer. Som vist i figur 2ble runde embryolegemer med lyse kjerner dannet etter suspensjonskultur i 2 dager i denne tilstanden. Men når de dyrkes i 4 dager, holder mange embryoide kropper seg til hverandre, og kjernene blir mørke, noe som indikerer apoptose av celler i kjernene. Den påfølgende differensieringen bekreftet ytterligere den verre effekten av langvarig embryoid kroppsdannelse. I noen rapporterte studier kan suspensjonskulturen av embryolegemer vare så lenge som 10 dager, ved hjelp av medium med lavere FBS-konsentrasjon eller uten FBS11. Redusert tid for embryofødt kroppsdannelse i studien kan skyldes høyere FBS-konsentrasjon (15 %) brukes her, og det har vist seg at 15% FBS bedre kan fremme dannelsen og differensieringen av embryolegemer.
For det andre er tidspunktet hvor RA brukes og RA-arbeidskonsentrasjonen avgjørende for celleskjebnebestemmelse av mESCer. RA, et derivat av vitamin A, er en av de viktigste morfogenene med pleiotropiske handlinger12. RA kan regulere flere signalveier og påvirke celleskjebnebestemmelse av ESCs13,14. Rapporter viste at kortsiktig behandling av mESCer med RA i løpet av tidlig differensieringsstadium forhindret spontan differensiering og opprettholder selvfornyelseskapasiteten til mESCs15. Andre foreslo at RA kunne regulere både bakteriecelledilatering og nevrale differensiering fra ESCer, som er tidsavhengige16,17,18. I tilstanden som presenteres her, RA lagt påden andre dagen etter embryoid kroppsdannelse er hensiktsmessig for å lede differensiering i NPCer. I mellomtiden er arbeidskonsentrasjonen av RA også kritisk. Lave RA-konsentrasjoner (~10 nM) kan indusere differensiering av MESCer i endoderm-lignende celler, mens høye RA-konsentrasjoner (1-5 μM) er mer sannsynlig å indusere differensiering i NPCer13,14,15,16,17,18,19. På grunn av bruk av RA, ville man forvente en caudalization effekt; differensieringen i fore hjernen nevroner ville bli sjelden sett og gir nevroner av hindbrain og ryggmargskjebner villeskje 20,21. Videre er RA et lett tilgjengelig og rimelig middel, og bruken av denne protokollen kan spare forskningsmidler for de fleste laboratorier.
For det tredje, i tilstand presentert her, kan NPCene som genereres etter fase I differensiering lagres og passeres under riktige forhold. Kryopreservasjon med høy celletetthet (> 2 x 106) ved hjelp av Stem-Cellbanker kan effektivt redusere celleskaden forårsaket av frysing for å få høy utvinningshastighet. I mellomtiden kan NPCer generert i studien bli passasjer ved hjelp av N2B27 medium (49% DMEM / F12 + 1% N2 + 48% Neurobasal medium + 2% B27) med en celletetthet mer enn 5 x 105/ cm2. Under lav celletetthet (mindre enn 0,5 x 105/cm2)har NPCer en tendens til å skille mellom. Slike celle kryopreservation og utvinning kan gi stor bekvemmelighet til forskningen.
Videre er Neurobasal medium avgjørende for fase II differensiering. Neurobasal medium er designet spesielt for langsiktig vedlikehold og modning av nevronal celle. Som oppført i N2B27 medium II (Tabell 2), kan tillegg av Neurobasal medium bedre støtte differensieringen fra NPCer til nevroner.
Samlet rapporterte vi en effektiv og rimelig metode for nevronal differensiering fra mESCs in vitro, ved hjelp av strategiene for kombinatorisk screening. Den etablerte metoden er veldig enkel å implementere og er egnet for bruk av de fleste laboratorier. En slik optimalisert metode kan være et kraftig verktøy for nevrobiologi og utviklingsbiologi forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 31501099) og middelaldrende og unge i utdanningsavdelingen i Hubei-provinsen, Kina (nr. kvartal 20191104). Og vi takker professor Wensheng Deng ved Wuhan University of Science and Technology for å ha gitt musen embryonale stamcellelinjer A2lox.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
