Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/61190
* These authors contributed equally

Summary

Hier hebben we een goedkope en eenvoudig te bedienen methode opgezet die een snelle en efficiënte differentiatie van embryonale stamcellen naar neuronen stuurt. Deze methode is geschikt voor popularisering onder laboratoria en kan een nuttig hulpmiddel zijn voor neurologisch onderzoek.

Abstract

De neurale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) is een potentieel hulpmiddel om de belangrijkste mechanismen die betrokken zijn bij neurogenese op te helderen en mogelijk te helpen bij regeneratieve geneeskunde. Hier hebben we een efficiënte en goedkope methode voor neuronale differentiatie van mESCs in vitroopgezet, met behulp van de strategie van combinatorische screening. Onder de hier gedefinieerde omstandigheden maakt het 2-daagse embryoide lichaamsvorming + 6-daags retinoïnezuurinductieprotocol een snelle en efficiënte differentiatie van mESCs in neurale precursorcellen (NPC's) mogelijk, zoals blijkt uit de vorming van goed gestapelde en neurietachtige A2lox en 129 derivaten die Nestine-positief zijn. De gezonde toestand van embryonale lichamen en het tijdstip waarop retinoïnezuur (RA) wordt toegepast, evenals de RA-concentraties, zijn daarbij van cruciaal belang. In de daaropvolgende differentiatie van NPC's in neuronen zou N2B27 medium II (aangevuld met Neurobasal medium) het onderhoud en de rijping van neuronale cellen op lange termijn beter kunnen ondersteunen. De gepresenteerde methode is zeer efficiënt, goedkoop en eenvoudig te bedienen en kan een krachtig hulpmiddel zijn voor neurobiologie en ontwikkelingsbiologieonderzoek.

Introduction

Embryonale stamcellen (ECC's) zijn pluripotent en kunnen zich onder bepaalde omstandigheden onderscheiden in neurale precursorcellen (NPC's) en vervolgens in neuronen1. ESC-gebaseerde neurogenese biedt het beste platform om neurogenese na te bootsen, en dient zo als een nuttig hulpmiddel voor ontwikkelingsbiologische studies en mogelijk hulp bij regeneratieve geneeskunde2,3. In de afgelopen decennia zijn veel strategieën gerapporteerd voor het induceren van embryonale neurogenese, zoals de transgene methode4, met behulp van kleinemoleculen 5, met behulp van een 3D-matrix micromilieu6, en de co-cultuurtechniek7. De meeste van deze protocollen zijn echter beperkt of moeilijk te bedienen, dus ze zijn niet geschikt voor gebruik in de meeste laboratoria.

Om een eenvoudig te bedienen en goedkope methode te vinden om efficiënte neurale differentiatie van mESCs te bereiken, werd hier een combinatorische screeningstrategie gebruikt. Zoals beschreven in figuur 1,was het hele proces van embryonale neurogenese verdeeld in 2 fasen. Fase I verwijst naar het differentiatieproces van mESC's naar NPC's, en fase II heeft betrekking op de daaropvolgende differentiatie van NPC's in neuronen. Op basis van de principes van eenvoudige bediening, lage kosten, gemakkelijk beschikbare materialen en een hoge differentiatie-efficiëntie, werden zeven protocollen in fase I en drie protocollen in fase II gekozen op basis van het traditionele aanhankelijke monolaagcultuursysteem of embryooïde lichaamsvormingssysteem8,9. De differentiatie-efficiëntie van protocollen in beide fasen werd geëvalueerd met behulp van celmorfologieobservatie en immunofluorescentietest. Door het meest efficiënte protocol van elke fase te combineren, hebben we de geoptimaliseerde methode voor neurale differentiatie van mESCs vastgesteld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Muis embryonale stamcelcultuur

  1. Bereid 0,1% gelatine gecoate celkweekgerechten of borden.
    1. Voeg 2 ml gesteriliseerde 0,1% gelatine (0,1% w/v in water) toe aan 60 mm celkweekschalen. Rock zachtjes om een gelijkmatige coating van de celcultuurgerechten te garanderen.
    2. Doe de borden in een CO2-incubator van 5% bij 37 °C en laat 1 uur coaten.
    3. Verwijder de 0,1% gelatineoplossing voordat u de cellen zaait.
      OPMERKING: Na het verwijderen van de gelatine is het niet nodig om de gecoate vaat te drogen of te wassen.
  2. Muis embryonale stamcellen (A2lox en 129) cultuur
    1. Incubeer mESCs (A2lox en 129) cellen in de 0,1% gelatine gecoate 60 mm celkweekschalen in mESC groeimedium bij respectievelijk 37 °C in een CO2 incubator van 5%. Het mESC groeimedium bestaat uit 85% knock-out DMEM/F12, 15% Knock-out serumvervanging (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% niet-essentieel aminozuur (NEAA), 1% penicilline/streptomycine (P/S), 1000 U/ml leukemieremmerfactor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-remmer) en 0,33 nM PD0325901 (MEK-remmer).
      LET OP: β-mercaptoethanol is ontvlambaar en heeft inhalatietoxiciteit. Blijf uit de buurt van brandbronnen en draag een masker om inademing bij gebruik te voorkomen.
    2. Verander dagelijks het mESC groeimedium voor een betere groei van A2lox en 129.
    3. Wanneer de cellen 80% samenvloeiing bereiken, verwijdert u het medium en voegt u 1 ml trypsine van 0,1% toe aan de schaal. Schommel voorzichtig gedurende 30 s om een gelijkmatige dekking van trypsine op alle cellen te garanderen.
    4. Laat de cellen ongeveer 1 minuut om te proberenpsinize en verwijder vervolgens de trypsine met behulp van 1 ml pipet.
    5. Voeg 2 ml mESC-groeimedium toe aan de schaal, pipetteer meerdere keren op en neer om een enkele celophanging te maken.
    6. Tel de dichtheid van de cellen in de suspensie zo nauwkeurig mogelijk met behulp van hemocytometer.
    7. Verdeel de cellen in 7 groepen en induceer differentiatie met behulp van verschillende protocollen in tabel 1.

2. Differentiatie van mESCs naar NPC's (Fase I)

  1. Bereid 0,1% gelatine gecoate celkweekplaten of coverslips voor.
    1. Bereid voor gebruik 0,1% gelatine gecoate 6-put platen of coverslips zoals in stap 1.1.
  2. Fase I differentiatie met protocol 1 (Tabel 1)
    1. Zaai ongeveer 2 x 104 mESCs in 2 ml basaal differentiatiemedium I per put in de 0,1% gelatine gecoate 6-putplaten. Controleer de celdichtheid onder een microscoop.
    2. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 6 uur in een CO2-incubator van 5% om aanhechting mogelijk te maken.
    3. Haal na de bevestiging de cellen uit de incubator en was de cellen twee keer met 2 ml PBS.
    4. Voeg 2 ml basaal differentiatiemedium I (tabel 1) toe aan elke put en plaats de cellen terug in de incubator.
    5. Laat de cellen 8 dagen differentiëreren. Vervang het basale differentiatiemedium I om de 2 dagen.
  3. Fase I differentiatie met protocol 2 (Tabel 1)
    1. Voeg 1,5 x 106 mESCs toe aan een niet-adhesieve bacteriële schaal in 10 ml basaaldifferentiatiemedium I om embryoide lichaamsvorming bij 37 °C in een CO2-incubator van 5% mogelijk te maken.
    2. Breng na 2 dagen celaggregaten over in centrifugebuizen van 15 ml en laat ze bezinken door de zwaartekracht.
    3. Verwijder het supernatant en voeg 10 ml vers basaaldifferentiatiemedium I toe om de embryonale lichamen opnieuw te gebruiken. Herplant ze in een nieuwe niet-adhesieve bacteriële schaal en laat differentiatie nog 2 dagen toe.
    4. Controleer de vorming van embryonale lichamen onder de microscoop (figuur 2A).
    5. Verzamel embryonale lichamen zoals beschreven in de stappen 2.3.2-2.3.3. Zaai ongeveer 50 embryonale lichamen in 2 ml basaal differentiatiemedium I per put op 0,1% gelatinegecoate 6-putplaten.
    6. Bereid 1 mM all-trans RA voorraad (in DMSO) en bewaar uit de buurt van licht in een -80 °C vriezer na subverpakking.
      OPMERKING: RA is onstabiel en er moet aandacht worden besteed aan het uit de buurt houden van licht en het verminderen van luchtcontact tijdens de voorbereiding van RA-voorraad.
    7. Voeg voor RA-inductie 2 μL RA-voorraad toe aan elke put om een uiteindelijke concentratie van 1 μM te maken.
    8. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C en onderscheid nog 4 dagen.
    9. Verander elke 2 dagen de volledige 2 ml basaal differentiatiemedium I (met 1 μM RA).
  4. Fase I differentiatie met protocol 3 (Tabel 1)
    1. Plant 1,5 x 106 mESCs in een niet-adhesieve bacteriële schaal in 10 ml basale differentiatiemedium I. Laat 2 dagen voor embryoide lichaamsvorming bij 37 °C in een CO2-incubator van 5%.
    2. Controleer de vorming van embryonale lichamen onder een microscoop (figuur 2B).
    3. Breng celaggregaten over in centrifugebuizen van 15 ml en laat ze bezinken door de zwaartekracht.
    4. Verwijder het supernatant voorzichtig en voeg 10 ml vers basaaldifferentiatiemedium I toe om ze opnieuw te gebruiken.
    5. Zaai ongeveer 50 embryonale lichamen in 2 ml basaal differentiatiemedium I per put op 0,1% gelatinegecoate 6-putplaten.
    6. Voeg voor RA-inductie 2 μL RA-voorraad toe aan elke put om een uiteindelijke concentratie van 1 μM te maken.
    7. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C en differentieert nog 6 dagen. Verander elke 2 dagen het gehele basale differentiatiemedium I (met 1 μM RA).
  5. Fase I differentiatie met protocol 4 (Tabel 1)
    1. Zaai ongeveer 2 x 104 mESCs binnen 2 ml basaaldifferentiatiemedium I per put op de 0,1% gelatine gecoate 6-putplaten. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C om 6 uur te kunnen worden vastgehecht.
    2. Was de cellen na het bevestigen tweemaal met 2 ml PBS. Voeg 2 ml basale differentiatiemedium I toe aan elke put en zorg voor differentiatie gedurende 4 dagen in de 5% CO2 incubator bij 37 °C.
    3. Voeg voor RA-inductie 2 μL all-trans RA-bestand toe aan elke put (de werkconcentratie is 1 μM) om nog 4 dagen differentiatie te induceren.
    4. Vervang in het hele proces het hele medium om de 2 dagen.
  6. Fase I differentiatie met protocol 5 (Tabel 1)
    1. Zaai ongeveer 2 x 104 mESCs binnen 2 ml basaaldifferentiatiemedium I per put op de 0,1% gelatine gecoate 6-putplaten. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C om 6 uur te kunnen worden vastgehecht.
    2. Was de cellen tweemaal met 2 ml PBS. Voeg 2 ml basale differentiatiemedium I toe aan elke put en zorg voor differentiatie gedurende 2 dagen in de 5% CO2 incubator bij 37 °C.
    3. Voeg voor de daaropvolgende RA-inductie 2 μL RA-bestand toe aan elke put om een uiteindelijke concentratie van 1 μM te maken. Plaats de plaat in de 5% CO2-incubator bij 37 °C om nog 6 dagen differentiatie te induceren.
    4. Vervang in het hele proces het hele medium om de 2 dagen.
  7. Fase I differentiatie met protocol 6 (Tabel 1)
    1. Plant 1,5 x 106 mESCs in een niet-adhesieve bacteriële schaal in 10 ml N2B27 medium II (tabel 1) om de vorming van embryonale lichamen mogelijk te maken.
    2. Verzamel op de2e dag de celaggregaten zoals beschreven in stap 2.3.2-2.3.3 en resuspendeer de embryonale lichamen met 10 ml verse N2B27 medium II.
    3. Herplant ze in een nieuwe niet-adhesieve bacteriële schaal en laat nog 2 dagen differentiëring toe in de 5% CO2 incubator bij 37 °C. Controleer de vorming van embryonale lichamen onder de microscoop.
    4. Verzamel op de4e dag embryonale lichamen. Zaai ongeveer 50 embryonale lichamen per put op 0,1% gelatine-gecoate 6-put platen met 2 ml N2B27 medium II.
    5. Voeg 2 μL all-trans RA voorraad toe aan elke put en induceer differentiatie gedurende nog eens 4 dagen. Vervang het gehele medium (N2B27 medium II door 1 μM RA) om de twee dagen.
  8. Fase I differentiatie met protocol 7 (Tabel 1)
    1. Zaai ongeveer 2 x 104 mESCs binnen 2 ml basaaldifferentiatiemedium I per put op de 0,1% gelatine gecoate 6-putplaten. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C om 6 uur te kunnen worden vastgehecht.
    2. Was de cellen twee keer met PBS. Voeg vervolgens 2 ml N2B27 medium II toe aan elke put en zorg voor differentiatie gedurende 8 dagen bij 37 °C in een CO2-incubator van 5%.
    3. Wijzig elke 2 dagen het gehele N2B27 medium II.

3. Celmorfologie observatie

  1. Controleer dagelijks de differentiatiestatus van de bovengenoemde 7 groepen onder een omgekeerde fasecontrastlichtmicroscoop.
  2. Selecteer willekeurig ten minste 12 velden en maak foto's om de morfologische wijzigingen van elke groep op D8 vast te leggen.

4. Immunofluorescentiekleuring

  1. Monstervoorbereiding: Zaai mESCs op 0,1% gelatine gecoate coverslips en maak differentiatie gedurende 8 dagen mogelijk met behulp van de in stap 2 genoemde protocollen.
  2. Spoelen: Haal op de8e dag de monsters uit de incubator en verwijder het differentiatiemedium door aspiratie. Spoel de cellen één keer voorzichtig af met 1 ml PBS gedurende 5 minuten.
  3. Fixatie: Voeg 1 ml paraformaldehyde van 4% toe aan elk monster en fixeer de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  4. Spoelen: Spoel de cellen na fixatie voorzichtig 3 keer af met 1 ml PBS, telkens gedurende 5 minuten.
  5. Permeabilisatie: Voeg 1 ml van 0,2% TritonX-100 in PBS toe aan elk monster en laat 8 minuten bij RT staan.
  6. Spoelen: Spoel de cellen na permeabilisatie voorzichtig 3 keer af met 1 ml PBS, telkens gedurende 5 minuten.
  7. Blokkeren: Voeg 1 ml 10% geitenserum in PBS toe aan elk monster en incubeer gedurende 1 uur bij RT om niet-specifieke interacties te blokkeren.
  8. Incubatie met primair antilichaam
    1. Verdun het anti-Nestine antilichaam in een verhouding van 1:100 met 5% geitenserum in PBS.
    2. Breng 500 μL verdund antilichaam aan op verschillende monsters en broed 's nachts bij 4 °C.
  9. Spoelen: Verwijder het antilichaam en spoel de monsters voorzichtig af met 1 ml PBS 3 keer gedurende 8 minuten per stuk.
  10. Incubatie met secundair antilichaam
    1. Verdun de Alexa Fluor 488-gelabelde geitenantimuis IgG in een verhouding van 1:500 met behulp van 5% geitenserum in PBS.
    2. Breng 500 μL verdund antilichaam aan op verschillende monsters en incub in het donker gedurende 2 uur bij RT.
      OPMERKING: Voer na het aanbrengen van fluorescerend secundair antilichaam alle volgende stappen in het donker uit om fluorescentielessen te voorkomen.
  11. Spoelen: Verwijder het secundaire antilichaam en spoel de monsters voorzichtig af met 1 ml PBS 3 keer gedurende 8 minuten per stuk.
  12. Nucleaire kleuring en montage
    1. Plaats één druppel DAPI-montagemedium op de schone microslide.
    2. Haal voorzichtig de monsters uit de platen en plaats het monster bovenop het DAPI-montagemedium met de cel naar beneden. Laat 5 minuten in het donker staan bij RT.
    3. Verwijder overtollig DAPI-montagemedium met absorberend papier.
  13. Fluorescentiemicroscopie observatie
    1. Plaats de monsters onder de fluorescentiemicroscopie en detecteer het signaal voor DAPI en Alexa Fluor 488 met behulp van de juiste filters.
    2. Kies gelijkmatig en willekeurig 10-15 verschillende gezichtsvelden voor elk voorbeeld en neem de beelden op met een CCD-camera.

5. Differentiatie van NPC's naar neuronen (Fase II)

  1. Bereid mESC-derivaten voor onder fase I-differentiatie met behulp van protocol 3 (8 dagen, tabel 1)zoals beschreven in stap 2.4, dat de hoogste differentiatie-efficiëntie heeft (zie figuur 3).
    OPMERKING: Na fase I-differentiatie moet kwaliteitscontrole worden uitgevoerd met behulp van celmorfologieobservatie en immunofluorescentietest die hierboven wordt genoemd, om een gezonde en hoogrenderende NPC's te garanderen.
  2. Zaai ongeveer 5 x 105 mESC derivaten binnen 2 ml basaal differentiatiemedium I per put op de 0,1% gelatine gecoate 6-put platen. Verdeel de mESC-derivaten willekeurig in 3 groepen, zoals respectievelijk fase II-protocol 1, protocol 2 en protocol 3.
  3. Plaats de plaat in de 5% CO2 incubator bij 37 °C om 6 uur te kunnen worden vastgehecht. Was ze twee keer met 2 ml PBS.
  4. Voeg respectievelijk 2 ml basaal differentiatiemedium I, N2B27 medium I en N2B27 medium II (tabel 2) toe aan elke put van de bovenstaande groepen.
  5. Plaats de platen in de incubator en laat nog 10 dagen differentiëren. Wijzig het bijbehorende medium om de 2 dagen.
  6. Controleer de differentiatiestatus en noteer de morfologische veranderingen zoals vermeld in stap 3.
  7. Evalueer op dag 18 de generatie neuronen (β-Tubuline III positief) en bepaal de differentiatie-efficiëntie van de 3 protocollen met behulp van stap 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

2-daagse embryoide lichaamsvorming + 6-daagse RA-inductie werkt het beste bij het sturen van de differentiatie van mESC's naar NPC's (fase I). Om het optimale protocol te bepalen dat de differentiatie van mESCs in NPC's (Fase I) het beste bevordert, werden 7 protocollen getest op zowel A2lox als 129 mESCs (tabel 1) en werd de differentiatiestatus van elke groep gecontroleerd met behulp van een lichtmicroscoop. Zoals getoond in figuur 3A, vertoonden de meeste A2lox en 129 derivaten onder "2-daagse embryoide lichaamsvorming + 6-daagse RA-inductie" behandeling (Fase I-protocol 3) goed gestapelde en neurietachtige morfologieën, die de vorming van NPC's aanduiden. Echter, cellen met "4-daagse embryoide lichaamsvorming + 4-daagse RA inductie" behandeling (Fase I-protocol 2) vertoonden een slechte en apoptotische status, wat te wijten kan zijn aan het gebrek aan voedingsstoffen in embryonale lichamen. Monolaagcultuur in combinatie met RA-inductie (fase I-protocol 4 en 5) zou ook de differentiatie van mESC's kunnen sturen, terwijl het aandeel neurietachtige cellen niet zo groot was als dat in fase I-protocol 3. Ondertussen vertoonden de meeste A2lox en 129 derivaten in fase I-protocol 6 en 7 kleinere cellichamen en hadden de neiging om apoptose te ondergaan, wat suggereert dat N2B27 medium II embryonale neurogenese niet effectief kon ondersteunen.

Om de vorming van NPC's verder te bevestigen, werd het percentage Nestin+ cellen (marker voor NPC's) in elke groep gedetecteerd met behulp van een immunofluorescentietest. In figuur 3Bwas het percentage Nestin+ cellen in fase I-protocol 3 het hoogst en bereikte het tot 77,67 ± 4,33% en 69,33 ± 2,33% in respectievelijk A2lox en 129 derivaten. Gezamenlijk werkt fase I-protocol 3 het beste bij het sturen van de differentiatie van MESC's naar NPC's.

N2B27 medium II kan het meest effectief de differentiatie van NPC's in neuronen induceren (Fase II). Drie protocollen in fase II differentiatie werden onderzocht. Zoals getoond in figuur 4A,toonde morfologische observatie aan dat de meeste A2lox en 129 derivaten in fase II-protocol 3 (differentiatie met N2B27 medium II) op dag 18 de meest langdurige neuronachtige structuren leken met duidelijke neurieten en cellichaamsextensies, wat wijst op het efficiënte optreden van neurogenese. Immunofluorescentietests bevestigden verder de generatie neuronen, met het percentage β-Tubuline III+ cellen tot 67,75 ± 4,01% en 58,73 ± respectievelijk 7,25% in A2lox en 129 derivaten op D18 (figuur 4B).

Om het duidelijker te maken, wordt een schematisch diagram van de geoptimaliseerde methode voor embryonale neurogenese weergegeven in figuur 5. Kortom, 1,5 x 106 mESCs worden gezaaid in een niet-adhesieve bacteriële schaal in 10 ml basale differentiatiemedium I en maken embryoide lichaamsvorming gedurende 2 dagen mogelijk. Vervolgens worden embryonale lichamen verzameld en geplant in de 0,1% gelatinegecoate 6-putplaten met de concentratie van 50 embryonale lichamen per put. Ondertussen wordt RA (1 μM) nog 6 dagen toegevoegd. Van dag 8 tot dag 18 wordt RA verwijderd en wordt N2B27 medium II toegepast om de daaropvolgende differentiatie van NPC's naar neuronen te sturen. Met zo'n gecombineerde methode kunnen robuuste neuronen worden gevormd op dag 18.

Figure 1
Figuur 1: Diagram van het embryonale neurogeneseproces. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Li et al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: De morfologie van de embryonale lichamen. (A) Embryoide lichamen gedurende 4 dagen gekweekt. (B) Embryoide lichamen gedurende 2 dagen gekweekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Efficiëntievergelijking van de 7 protocollen voor fase I differentiatie met behulp van A2lox en 129 mESCs. (A) Morfologische analyse van A2lox en 129 mESCs derivaten op dag 8. Bovenpaneel: A2lox derivaten; Onderste paneel: 129 derivaten. (B) Immunofluorescentiedetectie voor de vorming van NPC's (Nestin+, groen). De kernen werden blauw gelabeld met DAPI. Bovenpaneel: A2lox derivaten op D8; Onderste paneel: 129 derivaten op D8. Percentages Nestin+ cellen van elke groep werden weergegeven door histogram. Elke kolom vertegenwoordigt het gemiddelde±SEM van drie onafhankelijke experimenten. *, p≤0,05; **, blz.≤0,01. Deze figuur is gewijzigd van Li et al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Efficiëntievergelijking van de 3 protocollen voor fase II differentiatie. (A) Morfologische analyse van A2lox en 129 mESCs derivaten op dag 18. Bovenpaneel: A2lox derivaten; Onderste paneel: 129 derivaten. (B) Immunofluorescentiedetectie voor de vorming van neuronen (β-Tubuline III+, rood). De kernen werden blauw gelabeld met DAPI. Bovenpaneel: A2lox derivaten op D18; Onderste paneel: 129 derivaten op D18. Percentages β-Tubuline III+ cellen van elke groep werden weergegeven door histogram. Elke kolom vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. *, p≤0,05; **, blz.≤0,01. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Li et al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Kort model van de geoptimaliseerde methode voor neuronale differentiatie van mESCs in vitro Dit cijfer is gewijzigd uit Liet al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Differentiatie fase I (8d)
Protocollen Media
protocol 1 Differentiatie natuurlijk: Met basaal differentiatiemedium alleen ik Basaal differentiatiemedium I:
DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0.1mM 2ME+ 1%P/S
protocol 2 4-daagse Embryoid Bodies vorming + 4-daagse RA inductie
protocol 3 2-daagse Embryoid Bodies vorming + 6-daagse RA inductie
protocol 4 Monolaagcultuur gecombineerd met RA inductie: 4d (-RA) 4d (+RA)
protocol 5 Monolaagcultuur gecombineerd met RA inductie: 2d (-RA) 6d(+RA)
protocol 6 Embryoide formatie van lichamen (4 d) en differentiatie geïnduceerd met N2B27 medium II N2B27 medium II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasaal medium + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0.1mM 2ME
protocol 7 Monolaagse cultuur met N2B27 medium II

Tabel 1: Details van de 7 protocollen die in fase I differentiatie worden gebruikt. Deze tabel is gewijzigd van Li et al.10.

Differentiatie fase II (10d)
Protocollen Media
protocol 1 Differentiatie natuurlijk: Met basaal differentiatiemedium alleen ik Basaal differentiatiemedium I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0.1mM 2ME+ 1%P/S
protocol 2 Differentiatie met N2B27 medium I N2B27 medium I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%GlutaMAX +0.1mM 2ME
protocol 3 Differentiatie met N2B27 medium II N2B27 medium II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasaal medium + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0.1mM 2ME

Tabel 2: Details van de 3 protocollen die worden gebruikt bij fase II-differentiatie. Deze tabel is gewijzigd van Li et al.10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In deze studie hebben we een eenvoudige en effectieve methode voor neuronale differentiatie van mESCs vastgesteld, met lage kosten en gemakkelijk te verkrijgen materialen. Bij deze methode kunnen 2 dagen embryoide lichaamsvorming gevolgd door 6 dagen RA-inductie de differentiatie van mESC's in NPC's effectief bevorderen (fase I-protocol 3). Voor de fase II-differentiatie induceert N2B27 medium II (Fase II-protocol 3) het meest effectief de differentiatie van NPC's in neuronen. Om succes te garanderen, moet meer aandacht worden besteed aan verschillende kritieke stappen.

Ten eerste is de gezonde toestand van embryonale lichamen de sleutel tot het hele differentiatieproces. Driedimensionale embryonale lichaamsvorming wordt meestal gebruikt om de differentiatie van ESCs 8 testuren. In deze studie onderzochten we de juiste suspensiecultuurtijd van embryonale lichamen. Zoals getoond in figuur 2,werden ronde embryonale lichamen met heldere kernen gevormd na suspensiecultuur gedurende 2 dagen in deze toestand. Wanneer ze echter 4 dagen worden gekweekt, hechten veel embryonale lichamen zich aan elkaar en worden de kernen donker, wat wijst op de apoptose van cellen in de kernen. De daaropvolgende differentiatie bevestigde verder het slechtere effect van langdurige embryonale lichaamsvorming. In sommige gerapporteerde studies kan de suspensiecultuur van embryonale lichamen wel 10 dagen duren, met behulp van medium met een lagere FBS-concentratie of zonder FBS11. De verminderde tijd voor embryonale lichaamsvorming in het onderzoek kan te wijten zijn aan de hogere FBS-concentratie (15%) hier gebruikt, en het is bewezen dat 15% FBS de vorming en differentiatie van embryonale lichamen beter kan bevorderen.

Ten tweede zijn het tijdstip waarop RA wordt toegepast en de RA-werkconcentratie van cruciaal belang voor de bepaling van het lot van de mESC's. RA, een derivaat van vitamine A, is een van de belangrijkste morfogeen met pleiotrope acties12. RA kan meerdere signaalroutes reguleren en de bepaling van het lot van de cellen van DEAC 'sbeïnvloeden 13,14. Uit rapporten bleek dat kortdurende behandeling van mESCs met RA tijdens de vroege differentiatiefase spontane differentiatie voorkwam en de zelfvernieuwingscapaciteit van mESCs15handhaafde . Anderen suggereerden dat RA zowel kiemceldifferentiatie als neurale differentiatie van ECC's kon reguleren, die tijdsafhankelijk zijn16,17,18. In de hier gepresenteerde aandoening is RA toegevoegd op de2e dag na embryonale lichaamsvorming geschikt om de differentiatie naar NPC's te sturen. Ondertussen is ook de werkconcentratie van RA van cruciaal belang. Lage RA-concentraties (~10 nM) kunnen de differentiatie van mESC 's in endodermachtige cellen veroorzaken, terwijl hoge RA-concentraties (1-5 μM) eerder differentiatie in NPC 's13,14,15,16,17,18,19veroorzaken . Vanwege het gebruik van RA zou men een caudalisatie-effect verwachten; de differentiatie in voorhersenneuronen zou zelden worden gezien en het opleveren van neuronen van hindbrain en ruggenmerg lot zou optreden20,21. Bovendien is RA een gemakkelijk beschikbaar en goedkoop middel, en het gebruik van dit protocol kan onderzoeksfondsen besparen voor de meeste laboratoria.

Ten derde kunnen de NPC's die na fase I differentiatie zijn gegenereerd, in de juiste omstandigheden worden opgeslagen en doorge passageerd. Cryopreservatie met hoge celdichtheid (>2 x 106) met behulp van Stamcelbanker kan effectief de celschade verminderen die wordt veroorzaakt door bevriezing om een hoog herstelpercentage te krijgen. Ondertussen kunnen NPC's die in de studie worden gegenereerd, worden doorge passageerd met behulp van N2B27-medium (49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasaal medium + 2% B27) met een celdichtheid van meer dan 5 x 105/cm2. Bij lage celdichtheid (minder dan 0,5 x 105/cm2)hebben NPC's de neiging om te differentiëren. Een dergelijke cel cryopreservatie en herstel kan het onderzoek veel gemak bieden.

Bovendien is neurobasaal medium essentieel voor de fase II-differentiatie. Neurobasaal medium is speciaal ontworpen voor langdurig onderhoud en rijping van neuronale cellen. Zoals vermeld in N2B27 medium II (tabel 2), zou de toevoeging van neurobasaal medium de differentiatie van NPC's in neuronen beter kunnen ondersteunen.

Gezamenlijk rapporteerden we een efficiënte en goedkope methode voor neuronale differentiatie van mESCs in vitro, met behulp van de strategieën van combinatorische screening. De gevestigde methode is zeer eenvoudig te implementeren en is geschikt voor gebruik door de meeste laboratoria. Zo'n geoptimaliseerde methode kan een krachtig hulpmiddel zijn voor neurobiologie en ontwikkelingsbiologieonderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 31501099) en de middelbare leeftijd en jongeren van het ministerie van Onderwijs van de provincie Hubei, China (nr. Het jaar 20191104). En we danken professor Wensheng Deng van wuhan University of Science and Technology voor het leveren van de muis embryonale stamcellijnen A2lox.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Nestin antibody [Rat-401] Abcam Ab11306 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit Sigma Aldrich T2200 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044 stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021) Selleck S1263 stored at -20 °C
Coverslips NEST 801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x) HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy Olympus CKX53
Gelatin Gibco CM0635B stored at room temperature
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061 stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12 Gibco 12660012 stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human Sigma L5283 stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield Abcam ab104139 stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution Gibco 11140076 stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum Jackson 005-000-121 stored at -20 °C
Neurobasal Medium Gibco 21103049 stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish Corning 3262
Phosphate Buffered Saline (1X) HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution HyClone SV30010 stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib) Selleck S1036 stored at -20 °C
Retinoic acid Sigma R2625 stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells Cyagen MUAES-01001 Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free) ZENOAQ stem cellbanker DMSO free stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution HyClone SH30042.01 stored at 4 °C
Triton X-100 Sigma T8787
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
6 - well plate Corning 3516
60 mm cell culture dish Corning 430166
15 ml centrifuge tube NUNC 339650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
  2. Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
  3. Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
  4. Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
  5. Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
  6. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
  7. Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
  8. Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
  9. Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
  10. Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
  11. Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
  12. Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
  13. Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
  14. Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
  15. Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
  16. Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
  17. Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
  18. Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
  19. Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
  20. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
  21. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).

Tags

Neurowetenschappen Muis embryonale stamcellen neurale differentiatie embryoid lichaam retinoïnezuur N2B27 medium
Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mao, X., Zhao, S. NeuronalMore

Mao, X., Zhao, S. Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro. J. Vis. Exp. (160), e61190, doi:10.3791/61190 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter