Summary
Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.
Abstract
Die neuronale Differenzierung embryonaler Stammzellen (mESCs) ist ein mögliches Werkzeug zur Aufklärung der Schlüsselmechanismen der Neurogenese und potenzieller Hilfe in der regenerativen Medizin. Hier haben wir eine effiziente und kostengünstige Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs in vitroetabliert, mit der Strategie des kombinatorischen Screenings. Unter den hier definierten Bedingungen ermöglicht die 2-tägige embryoide Körperbildung + 6-Tage-Retinoinsäure-Induktionsprotokoll eine schnelle und effiziente Differenzierung von mESCs in neuronale Vorläuferzellen (NPCs), wie die Bildung von gut gestapelten und neuritigen A2lox- und 129 Derivaten sieht, die Nestin-positiv sind. Der gesunde Zustand von embryoiden Körpern und der Zeitpunkt, an dem Retinsäure (RA) angewendet wird, sowie die RA-Konzentrationen sind dabei von entscheidender Bedeutung. In der anschließenden Differenzierung von NPCs in Neuronen könnte N2B27 medium II (ergänzt durch Neurobasal medium) die langfristige Erhaltung und Reifung neuronaler Zellen besser unterstützen. Die vorgestellte Methode ist hochgradig effizient, kostengünstig und einfach zu bedienen und kann ein leistungsfähiges Werkzeug für die Neurobiologie und Entwicklungsbiologieforschung sein.
Introduction
Embryonale Stammzellen (ESCs) sind pluripotent und können sich unter bestimmten Bedingungen in neuronale Vorläuferzellen (NPCs) und anschließend in Neuronen differenzieren1. ESC-basierte Neurogenese bietet die beste Plattform, um Neurogenese zu imitieren, und dient somit als nützliches Werkzeug für Entwicklungsbiologie-Studien und potenziell Hilfe in der regenerativen Medizin2,3. In den letzten Jahrzehnten wurden viele Strategien zur Induktion der embryonalen Neurogenese berichtet, wie die transgene Methode4, mit kleinen Molekülen5, mit einer 3D-Matrix-Mikroumgebung6, und die Co-Kultur-Technik7. Die meisten dieser Protokolle sind jedoch entweder bedingt oder schwer zu bedienen, daher sind sie für den Einsatz in den meisten Laboratorien nicht geeignet.
Um eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zu finden, um eine effiziente neuronale Differenzierung von mESCs zu erreichen, wurde hier eine kombinatorische Screening-Strategie verwendet. Wie in Abbildung 1beschrieben, wurde der gesamte Prozess der embryonalen Neurogenese in 2 Phasen unterteilt. Phase I bezieht sich auf den Differenzierungsprozess von mESCs in NPCs, und Phase II bezieht sich auf die nachfolgende Differenzierung von NPCs in Neuronen. Basierend auf den Prinzipien der einfachen Bedienung, der niedrigen Kosten, der leicht zugänglichen Materialien und der hohen Differenzierungseffizienz wurden sieben Protokolle in Phase I und drei Protokolle in Phase II auf der Grundlage des traditionellen stickigen Monolayer-Kultursystems oder embryoiden Körperbildungssystems8,9ausgewählt. Die Differenzierungseffizienz von Protokollen in beiden Phasen wurde mittels Zellmorphologiebeobachtung und Immunfluoreszenz-Assay evaluiert. Durch die Kombination des effizientesten Protokolls jeder Phase haben wir die optimierte Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs etabliert.
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Protocol
1. Maus embryonale Stammzellkultur
- Bereiten Sie 0,1% gelatinebeschichtete Zellkultur-Gerichte oder Teller zu.
- 2 ml sterilisierte 0,1% Gelatine (0,1% w/v in Wasser) zu 60 mm Zellkulturschalen hinzufügen. Schaukeln Sie sanft, um eine gleichmäßige Beschichtung der Zellkulturgerichte zu gewährleisten.
- Die Gerichte bei 37 °C in einen 5% CO2-Inkubator geben und 1 h beschichten lassen.
- Entfernen Sie die 0,1% Gelatinelösung, bevor Sie die Zellen säen.
HINWEIS: Nach dem Entfernen der Gelatine ist es nicht erforderlich, die beschichteten Gerichte zu trocknen oder zu waschen.
- Embryonale Stammzellen der Maus (A2lox und 129) Kultur
- Inkubieren Sie mESCs (A2lox und 129) Zellen in den 0,1% gelatinebeschichteten 60 mm Zellkulturschalen in mESC Wachstumsmedium bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator. Das mESC-Wachstumsmedium besteht aus 85% Knock-out DMEM/F12, 15% Knock-out Serumersatz (KSR), 0,1 mM β-Mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% nicht-essentielle Aminosäure (NEAA), 1% Penicillin/Streptomycin (P/S), 1000 U/mL Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-Hemmer) und 0,33 nM PD0325901 (MEK-Hemmer).
VORSICHT: β-Mercaptoethanol ist entzündlich und hat Inhalationstoxizität. Halten Sie sich von Brandquellen fern und tragen Sie eine Maske, um einEinatmen bei Gebrauch zu vermeiden. - Ändern Sie das mESC-Wachstumsmedium täglich für ein besseres Wachstum von A2lox und 129.
- Wenn die Zellen 80% Zusammenfluss erreichen, entfernen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml 0,1% Trypsin in die Schale. Sanft für 30 s schaukeln, um eine gleichmäßige Abdeckung von Trypsin auf allen Zellen zu gewährleisten.
- Lassen Sie die Zellen für etwa 1 min zu trypsinizeund dann entfernen Sie das Trypsin mit 1 ml Pipette.
- Fügen Sie 2 ml mL mESC Wachstumsmedium auf die Schale, Pipette nach oben und unten mehrmals, um eine einzellige Suspension zu machen.
- Zählen Sie die Dichte der Zellen in der Suspension so genau wie möglich mit Hämozytometer.
- Teilen Sie die Zellen in 7 Gruppen auf und induzieren Sie eine Differenzierung anhand verschiedener Protokolle, die in Tabelle 1dargestellt sind.
- Inkubieren Sie mESCs (A2lox und 129) Zellen in den 0,1% gelatinebeschichteten 60 mm Zellkulturschalen in mESC Wachstumsmedium bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator. Das mESC-Wachstumsmedium besteht aus 85% Knock-out DMEM/F12, 15% Knock-out Serumersatz (KSR), 0,1 mM β-Mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% nicht-essentielle Aminosäure (NEAA), 1% Penicillin/Streptomycin (P/S), 1000 U/mL Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-Hemmer) und 0,33 nM PD0325901 (MEK-Hemmer).
2. Differenzierung von mESCs zu NPCs (Phase I)
- 0,1% gelatinebeschichtete Zellkulturplatten oder Decklippen zubereiten.
- Vor Gebrauch 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten oder Decklippen wie in Schritt 1.1 zubereiten.
- Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 1 (Tabelle 1)
- Samen ca. 2 x 104 mESCs in 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen in den 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Überprüfen Sie die Zelldichte unter dem Mikroskop.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator für 6 h, um eine Anhaftung zu ermöglichen.
- Nach der Anhaftung nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator heraus und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS.
- Fügen Sie jedem Brunnen 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I (Tabelle 1) hinzu und legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator.
- Lassen Sie die Zellen für 8 Tage zur Differenzierung. Ersetzen Sie das Basaldifferenzierungsmedium I alle 2 Tage.
- Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 2 (Tabelle 1)
- Fügen Sie 1,5 x 106 mESCs in eine nicht klebende bakterielle Schale in 10 ml Basaldifferenzierungsmedium I ein, um die embryoide Körperbildung bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator zu ermöglichen.
- Nach 2 Tagen zellische Aggregate in 15 ml Zentrifugenrohre übertragen und durch Schwerkraft absetzen lassen.
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml frisches Basaldifferenzierungsmedium I hinzu, um die embryoiden Körper wieder auszusetzen. Pflanzen Sie sie in eine neue nicht klebende bakterielle Schale ein und ermöglichen eine Differenzierung für weitere 2 Tage.
- Überprüfen Sie die Bildung von embryoiden Körpern unter dem Mikroskop (Abbildung 2A).
- Sammeln Sie embryoide Körper, wie in den Schritten 2.3.2-2.3.3 beschrieben. Samen etwa 50 embryoide Körper in 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten.
- 1 mM All-Trans RA-Lager (in DMSO) vorbereiten und nach der Unterverpackung in einem -80 °C-Gefrierschrank vor dem Licht lagern.
HINWEIS: RA ist instabil, und es sollte darauf geachtet werden, es von Licht fernzuhalten und den Luftkontakt während der Vorbereitung des RA-Bestands zu reduzieren. - Für die RA-Induktion fügen Sie in jedem Bohrwert 2 L RA-Lager hinzu, um eine Endkonzentration von 1 M zu erreichen.
- Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator und differenzieren Sie sie weitere 4 Tage.
- Ändern Sie alle 2 Tage das gesamte 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I (mit 1 M RA).
- Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 3 (Tabelle 1)
- 1,5 x 106 mESCs in eine nicht klebende bakterielle Schale in 10 ml Basaldifferenzierungsmedium I pflanzen. 2 Tage für die embryoide Körperbildung bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator lassen.
- Überprüfen Sie die Bildung von embryoiden Körpern unter dem Mikroskop (Abbildung 2B).
- Zellaggregate in 15 ml Zentrifugenrohre übertragen und durch Schwerkraft absetzen lassen.
- Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und fügen Sie 10 ml frisches Basaldifferenzierungsmedium I hinzu, um sie wieder auszusetzen.
- Säen Sie etwa 50 embryoide Körper in 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten.
- Für die RA-Induktion fügen Sie in jedem Bohrwert 2 L RA-Lager hinzu, um eine Endkonzentration von 1 M zu erreichen.
- Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator und differenzieren Sie sie für weitere 6 Tage. Ändern Sie alle 2 Tage das gesamte Basaldifferenzierungsmedium I (mit 1 M RA).
- Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 4 (Tabelle 1)
- Samen ca. 2 x 104 mESCs innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen.
- Nach der Befestigung die Zellen zweimal mit 2 ml PBS waschen. Fügen Sie jeweils 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie eine Differenzierung für 4 Tage im 5% CO2-Inkubator bei 37 °C zu.
- Für die RA-Induktion fügen Sie jedem Bohrgut 2 L All-Trans-RA-Bestand (die Arbeitskonzentration beträgt 1 M) hinzu, um weitere 4 Tage differenzierungzuregen.
- Ersetzen Sie im gesamten Prozess alle 2 Tage das gesamte Medium.
- Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 5 (Tabelle 1)
- Samen ca. 2 x 104 mESCs innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS. Fügen Sie jeweils 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie eine Differenzierung für 2 Tage im 5% CO2-Inkubator bei 37 °C zu.
- Für die anschließende RA-Induktion fügen Sie jedem Bohrkörper 2 L RA-Bestand hinzu, um eine Endkonzentration von 1 m zu erreichen. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um für weitere 6 Tage eine Differenzierung zu induzieren.
- Ersetzen Sie im gesamten Prozess alle 2 Tage das gesamte Medium.
- Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 6 (Tabelle 1)
- 1,5 x 106 mESCs in eine nicht klebende bakterielle Schale in 10 ml N2B27 Medium II(Tabelle 1) pflanzen, um die Bildung embryoider Körper zu ermöglichen.
- Sammeln Sie am2. Tag die in den Schritten 2.3.2-2.3.3 beschriebenen Zellaggregate und setzen Sie die embryoiden Körper mit 10 ml frischem N2B27-Medium II wieder aus.
- Pflanzen Sie sie in eine neue nicht klebende bakterielle Schale ein und lassen Sie sie für weitere 2 Tage im 5% CO2-Inkubator bei 37 °C differenzierungen. Überprüfen Sie die Bildung von embryoiden Körpern unter dem Mikroskop.
- Sammeln Sie am4. Tag embryoide Körper. Samen etwa 50 embryoide Körper pro Brunnen auf 0,1% gelatinebeschichtete 6-Well-Platten mit 2 ml N2B27 Medium II.
- Fügen Sie in jedem Brunnen 2 L All-Trans-RA-Bestände hinzu und induzieren Sie weitere 4 Tage Differenzierung. Ersetzen Sie das gesamte Medium (N2B27 medium II mit 1 M RA) alle zwei Tage.
- Phase-I-Differenzierung mit Protokoll 7 (Tabelle 1)
- Samen ca. 2 x 104 mESCs innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Dann fügen Sie 2 ml N2B27 medium II zu jedem Brunnen hinzu und lassen Sie eine Differenzierung für 8 Tage bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator zu.
- Ändern Sie das gesamte N2B27 Medium II alle 2 Tage.
3. Zellmorphologie Beobachtung
- Überprüfen Sie den Differenzierungsstatus der oben genannten 7 Gruppen täglich unter einem invertierten Phasenkontrastlichtmikroskop.
- Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip mindestens 12 Felder aus, und nehmen Sie Fotos auf, um die morphologischen Veränderungen jeder Gruppe auf D8 aufzuzeichnen.
4. Immunfluoreszenzfärbung
- Probenvorbereitung: Seed mESCs auf 0,1% gelatinebeschichteten Abdeckungen und ermöglichen eine Differenzierung für 8 Tage unter Verwendung der in Schritt 2 genannten Protokolle.
- Spülen: Am8. Tag die Proben aus dem Inkubator nehmen und das Differenzierungsmedium durch Aspiration entfernen. Spülen Sie die Zellen einmal mit 1 ml PBS für 5 min.
- Fixierung: Fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd zu jeder Probe hinzu und fixieren Sie die Zellen für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
- Spülen: Spülen Sie die Zellen nach der Fixierung mit 1 ml PBS 3 mal, jeweils 5 min.
- Permeabilisierung: Fügen Sie 1 ml 0,2% TritonX-100 in PBS zu jeder Probe hinzu und lassen Sie sie 8 min bei RT.
- Spülen: Spülen Sie die Zellen nach permeabilisieren der Zellen mit 1 ml PBS 3 mal, jeweils 5 min.
- Blockierung: Fügen Sie 1 ml 10% Ziegenserum in PBS zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie bei RT für 1 h, um alle unspezifischen Wechselwirkungen zu blockieren.
- Inkubation mit primärem Antikörper
- Verdünnen Sie den Anti-Nestin-Antikörper im Verhältnis 1:100 mit 5% Ziegenserum in PBS.
- 500 l verdünnter Antikörper auf verschiedene Proben auftragen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Spülen: Entfernen Sie den Antikörper und spülen Sie die Proben vorsichtig mit 1 ml PBS 3 mal für jeweils 8 min.
- Inkubation mit Sekundärantikörper
- Verdünnen Sie das Alexa Fluor 488-markierte Ziegenanti-Maus-IgG im Verhältnis 1:500 mit 5% Ziegenserum in PBS.
- 500 l verdünnter Antikörper auf verschiedene Proben auftragen und bei RT 2 h im Dunkeln brüten.
HINWEIS: Führen Sie nach dem Auftragen eines fluoreszierenden Sekundärantikörpers alle nachfolgenden Schritte im Dunkeln aus, um eine Fluoreszenzabschreckung zu verhindern.
- Spülen: Entfernen Sie den sekundären Antikörper und spülen Sie die Proben vorsichtig mit 1 ml PBS 3 mal für jeweils 8 min.
- Nukleare Färbung und Montage
- Legen Sie einen Tropfen DAPI-Montagemedium auf den sauberen Mikroschlitten.
- Nehmen Sie die Proben vorsichtig von den Platten ab und legen Sie die Probe mit der Zelle nach unten auf das DAPI-Montagemedium. Lassen Sie im Dunkeln für 5 min bei RT.
- Entfernen Sie überschüssiges DAPI-Montagemedium mit saugfähigem Papier.
- Fluoreszenzmikroskopische Beobachtung
- Stellen Sie die Proben unter die Fluoreszenzmikroskopie und erkennen Sie das Signal für DAPI und Alexa Fluor 488 mit geeigneten Filtern.
- Wählen Sie gleichmäßig und zufällig 10-15 verschiedene visuelle Felder für jedes Sample aus und zeichnen Sie die Bilder mit einer CCD-Kamera auf.
5. Differenzierung von NPCs zu Neuronen (Phase II)
- Bereiten Sie mESC-Derivate nach Phase-I-Differenzierung nach Protokoll 3 (8 Tage, Tabelle 1) vor, wie in Schritt 2.4 beschrieben, das die höchste Differenzierungseffizienz hat (siehe Abbildung 3).
HINWEIS: Nach der Phase-I-Differenzierung sollte die Qualitätskontrolle mit Hilfe der oben genannten Zellmorphologiebeobachtung und Immunfluoreszenz-Assay durchgeführt werden, um eine gesunde und ertragreiche NPCs zu gewährleisten. - Samen ca. 5 x 105 mESC-Derivate innerhalb von 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I pro Brunnen auf die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten. Teilen Sie die mESC-Derivate nach dem Zufallsprinzip in 3 Gruppen auf, wie Phase II-Protokoll 1, Protokoll 2 und Protokoll 3.
- Legen Sie die Platte bei 37 °C in den 5% CO2-Inkubator, um eine Befestigung für 6 h zu ermöglichen. Waschen Sie sie zweimal mit 2 ml PBS.
- Fügen Sie 2 ml Basaldifferenzierungsmedium I, N2B27 Medium I und N2B27 Medium II (Tabelle 2) zu jedem Brunnen der oben genannten Gruppen hinzu.
- Legen Sie die Platten in den Inkubator und lassen Sie für weitere 10 Tage unterscheiden. Ändern Sie das entsprechende Medium alle 2 Tage.
- Überprüfen Sie den Differenzierungsstatus und zeichnen Sie die morphologischen Veränderungen auf, wie in Schritt 3 erwähnt.
- Bewerten Sie am 18. Tag die Erzeugung von Neuronen (β-Tubulin III positiv) und bestimmen Sie die Differenzierungseffizienz der 3 Protokolle unter Verwendung von Schritt 4.
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Representative Results
2-Tage embryoide Körperbildung + 6-Tage-RA-Induktion funktioniert am besten bei der Unterscheidung von mESCs in NPCs (Phase I). Um das optimale Protokoll zu bestimmen, das die Differenzierung von mESCs in NPCs (Phase I) am besten fördert, wurden 7 Protokolle sowohl auf A2lox als auch auf 129 mESCs (Tabelle 1) getestet und der Differenzierungsstatus jeder Gruppe mit Lichtmikroskop überwacht. Wie in Abbildung 3Adargestellt, zeigten die meisten A2lox- und 129-Derivate unter "2-Tage-Embryoid-Körperbildung + 6-Tage-RA-Induktionsbehandlung" (Phase I-Protokoll 3) gut gestapelte und neuritartige Morphologien, die auf die Bildung von NPCs hindeuten. Zellen mit "4-tage embryoider Körperbildung + 4-Tage-RA-Induktion" (Phase I-Protokoll 2) zeigten jedoch einen schlechten und apoptotischen Status, der auf den Mangel an Nährstoffen in embryoiden Körpern zurückzuführen sein kann. Die Monolayer-Kultur in Kombination mit der RA-Induktion (Phase I-Protokoll 4 und 5) könnte auch die Differenzierung von mESCs lenken, während der Anteil der neuritartigen Zellen nicht so hoch war wie der in Phase I-Protokoll 3. In der Zwischenzeit zeigten die meisten A2lox- und 129-Derivate in Phase I-Protokoll 6 und 7 kleinere Zellkörper und neigten zur Apoptose, was darauf hindeutet, dass N2B27 Medium II die embryonale Neurogenese nicht effektiv unterstützen konnte.
Um die Bildung von NPCs weiter zu bestätigen, wurde der Prozentsatz der Nestin+-Zellen (Marker für NPCs) in jeder Gruppe mit einem Immunfluoreszenz-Assay nachgewiesen. In Abbildung 3Bwar der Anteil der Nestin+-Zellen in Phase I-Protokoll 3 am höchsten und erreichte bis zu 77,67 ± 4,33 % bzw. 69,33 ± 2,33 % in A2lox- bzw. 129-Derivaten. Insgesamt funktioniert Phase I-Protokoll 3 am besten bei der Unterscheidung von mESCs in NPCs.
N2B27 Medium II kann am effektivsten die Differenzierung von NPCs in Neuronen induzieren (Phase II). Drei Protokolle in Phase-II-Differenzierung wurden untersucht. Wie in Abbildung 4Adargestellt, zeigte die morphologische Beobachtung, dass die meisten A2lox- und 129-Derivate in Phase II-Protokoll 3 (Differenzierung mit N2B27 medium II) die am weitesten verlängerten neuronenähnlichen Strukturen mit klaren Neuriten und Zellkörpererweiterungen bis Tag 18 aufwiesen, was auf das effiziente Auftreten der Neurogenese hindeutet. Immunfluoreszenz-Assays bestätigten ferner die Erzeugung von Neuronen, wobei der Anteil der β-Tubulin-III+-Zellen bis zu 67,75 ± 4,01 % bzw. 58,73 ± 7,25 % in A2lox- und 129-Derivaten auf D18 (Abbildung 4B) betrug.
Um es klarer zu machen, ist in Abbildung 5ein schematisches Diagramm der optimierten Methode für die embryonale Neurogenese dargestellt. Kurz gesagt, 1,5 x 106 mESCs werden in 10 ml Basaldifferenzierungsmedium I in eine nicht klebende Bakterienschale gesät und ermöglichen eine embryoide Körperbildung für 2 Tage. Dann werden embryoide Körper gesammelt und in die 0,1% gelatinebeschichteten 6-Well-Platten mit der Konzentration von 50 embryoiden Körpern pro Brunnen gepflanzt. In der Zwischenzeit wird RA (1 M) für weitere 6 Tage hinzugefügt. Von Tag 8 bis Tag 18 wird RA entfernt, und N2B27 Medium II wird angewendet, um die nachfolgende Differenzierung von NPCs auf Neuronen zu lenken. Mit einer solchen kombinierten Methode können an Tag 18 robuste Neuronen gebildet werden.
Abbildung 1: Diagramm des embryonalen Neurogeneseprozesses. Diese Zahl wurde von Li et al.10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Morphologie der embryoiden Körper. (A) Embryoide Körper, die 4 Tage lang kultiviert wurden. (B) Embryoide Körper, die 2 Tage lang kultiviert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Effizienzvergleich der 7 Protokolle zur Phase-I-Differenzierung mit A2lox und 129 mESCs. (A) Morphologische Analyse von A2lox- und 129 mESCs-Derivaten am 8. Tag. Oberteil: A2lox-Derivate; Untere Platte: 129 Derivate. (B) Immunfluoreszenznachweis zur Bildung von NPCs (Nestin+, grün). Die Kerne wurden blau mit DAPI beschriftet. Oberteil: A2lox-Derivate auf D8; Untere Platte: 129 Derivate auf D8. Prozentsätze der Nestin+-Zellen jeder Gruppe wurden durch Histogramm angezeigt. Jede Spalte stellt den Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten dar±. *, p≤0.05; **, p≤0.01. Diese Zahl wurde von Li et al.10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Effizienzvergleich der 3 Protokolle zur Phase-II-Differenzierung. (A) Morphologische Analyse von A2lox- und 129 mESCs-Derivaten am 18. Tag. Oberteil: A2lox-Derivate; Untere Platte: 129 Derivate. (B) Immunfluoreszenznachweis zur Bildung von Neuronen (β-Tubulin III+, rot). Die Kerne wurden blau mit DAPI beschriftet. Oberteil: A2lox-Derivate auf D18; Untere Platte: 129 Derivate auf D18. Prozentsätze der β-Tubulin III+ Zellen jeder Gruppe wurden durch Histogramm gezeigt. Jede Spalte stellt den Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten dar. *, p≤0.05; **, p≤0.01. Diese Zahl wurde von Li et al.10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Kurzmodell der optimierten Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs in vitro Diese Zahl wurde von Lietal. 10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Differenzierungsphase I (8d) | ||
| Protokolle | Medien | |
| Protokoll 1 | Differenzierung natürlich: Mit Basaldifferenzierungsmedium I nur | Basaldifferenzierungsmedium I: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0,1 mM 2ME+ 1%P/S |
| Protokoll 2 | 4-tage Embryoide Körperbildung + 4-Tage-RA-Induktion | |
| Protokoll 3 | 2-tage Embryoide Körperbildung + 6-Tage RA-Induktion | |
| Protokoll 4 | Monolayer-Kultur kombiniert mit RA-Induktion: 4d (-RA) 4d (+RA) | |
| Protokoll 5 | Monolayer-Kultur kombiniert mit RA-Induktion: 2d (-RA) 6d(+RA) | |
| Protokoll 6 | Embryoide Körperbildung (4 d) und Differenzierung induziert mit N2B27 medium II | N2B27 mittel II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasales Medium + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0.1mM 2ME |
| Protokoll 7 | Monolayer-Kultur mit N2B27 medium II | |
Tabelle 1: Einzelheiten der 7 Protokolle, die bei der Differenzierung der Phase I verwendet werden. Diese Tabelle wurde von Li et al.10geändert.
| Differenzierung Phase II (10d) | ||
| Protokolle | Medien | |
| Protokoll 1 | Differenzierung natürlich: Mit Basaldifferenzierungsmedium I nur | Basale Differenzierung smittel I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0.1mM 2ME+ 1%P/S |
| Protokoll 2 | Differenzierung mit N2B27 medium I | N2B27 mittel I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%GlutaMAX +0.1mM 2ME |
| Protokoll 3 | Differenzierung mit N2B27 medium II | N2B27 mittel II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasales Medium + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0.1mM 2ME |
Tabelle 2: Einzelheiten der drei Protokolle, die bei der Differenzierung nach Phase II verwendet werden. Diese Tabelle wurde von Li et al.10geändert.
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Discussion
In der vorliegenden Studie haben wir eine einfache und effektive Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs mit kostengünstigen und leicht zu erhaltenden Materialien etabliert. Bei dieser Methode können 2 Tage embryoiden Körperbildung gefolgt von 6 Tagen RA-Induktion die Differenzierung von mESCs in NPCs wirksam fördern (Phase I-Protokoll 3). Für die Phase-II-Differenzierung induzieren N2B27 Medium II (Phase II-Protokoll 3) am effektivsten die Differenzierung von NPCs in Neuronen. Um den Erfolg zu gewährleisten, sollten mehrere kritische Schritte stärker beachtet werden.
Erstens ist der gesunde Zustand von Embryokörpern der Schlüssel für den gesamten Differenzierungsprozess. Dreidimensionale embryoide Körperbildung wird in der Regel verwendet, um die Differenzierung von ESCs8zu lenken. In dieser Studie untersuchten wir die richtige Suspensionskulturzeit von embryoiden Körpern. Wie in Abbildung 2gezeigt, wurden runde Embryoide Körper mit hellen Kernen nach Suspensionskultur für 2 Tage in diesem Zustand gebildet. Wenn sie jedoch 4 Tage lang kultiviert werden, haften viele embryoide Körper aneinander, und die Kerne werden dunkel, was auf die Apoptose von Zellen in den Kernen hindeutet. Die anschließende Differenzierung bestätigte die schlimmere Wirkung einer längeren embryoiden Körperbildung. In einigen berichteten Studien, Suspensionskultur von embryoiden Körpern könnte für so lange wie 10 Tage dauern, mit Medium mit niedrigerFBS Konzentration oder ohne FBS11. Die verminderte Zeit für embryoide Körperbildung in der Studie kann auf die höhere FBS-Konzentration (15%) und es ist erwiesen, dass 15% FBS die Bildung und Differenzierung von embryoiden Körpern besser fördern kann.
Zweitens sind der Zeitpunkt, zu dem RA angewendet wird, und die RA-Arbeitskonzentration entscheidend für die Bestimmung des Zellschicksals von mESCs. RA, ein Derivat von Vitamin A, ist eines der wichtigsten Morphogene mit pleiotropen Aktionen12. RA kann mehrere Signalwege regulieren und die Zellschicksalsbestimmung von ESCs13,14beeinflussen. Berichte zeigten, dass die kurzfristige Behandlung von mESCs mit RA während der frühen Differenzierungsphase eine spontane Differenzierung verhinderte und die Selbsterneuerungskapazität von mESCs15aufrechterhielt. Andere schlugen vor, dass RA sowohl die Differenzierung von Keimzellen als auch die neuronale Differenzierung von ESCs regulieren könnte, die zeitpunktabhängig sind16,17,18. In dem hier vorgestellten Zustand, RA hinzugefügt am2. Tag nach embryoiden Körperbildung ist geeignet, um die Differenzierung in NPCs zu lenken. Inzwischen ist auch die Arbeitskonzentration von RA kritisch. Niedrige RA-Konzentrationen (ca. 10 nM) können die Differenzierung von mESCs in Endoderm-ähnliche Zellen induzieren, während hohe RA-Konzentrationen (1-5 m) eher eine Differenzierung in NPCs13,14,15,16,17,18,19induzieren. Aufgrund der Verwendung von RA würde man einen Caudalisierungseffekt erwarten; die Differenzierung in Vorhirn-Neuronen wäre selten zu sehen und nachgebende Neuronen von Hinterhirn- und Rückenmarksschicksalen würden20,21auftreten. Darüber hinaus ist RA ein leicht verfügbarer und kostengünstiger Agent, und die Verwendung dieses Protokolls kann Forschungsgelder für die meisten Labore sparen.
Drittens können die nPCs, die nach der Phase-I-Differenzierung erzeugt werden, in einem hier vorgestellten Zustand unter angemessenen Bedingungen gespeichert und durchlaufen werden. Die Kryokonservierung mit hoher Zelldichte (>2 x 106) mit Stem-Cellbanker kann die zellschädigenden Zellschäden, die durch das Einfrieren verursacht werden, effektiv reduzieren, um eine hohe Rückgewinnungsrate zu erhalten. In der Zwischenzeit können nPCs, die in der Studie generiert werden, mit N2B27 medium (49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasalmedium + 2% B27) mit einer Zelldichte von mehr als 5 x 105/cm2durchzogen werden. Bei geringer Zelldichte (weniger als 0,5 x 105/cm2)neigen NPCs dazu, sich zu differenzieren. Eine solche Zellkryokonservierung und Erholung kann große Bequemlichkeit für die Forschung bringen.
Darüber hinaus ist das neurobasale Medium für die Phase-II-Differenzierung von wesentlicher Bedeutung. Neurobasales Medium wurde speziell für die langfristige Erhaltung und Reifung der neuronalen Zelle entwickelt. Wie in N2B27 medium II (Tabelle 2) aufgeführt, könnte die Zugabe von Neurobasalmedium die Differenzierung von NPCs zu Neuronen besser unterstützen.
Gemeinsam berichteten wir über eine effiziente und kostengünstige Methode zur neuronalen Differenzierung von mESCs in vitro, unter Verwendung der Strategien des kombinatorischen Screenings. Die etablierte Methode ist sehr einfach zu implementieren und eignet sich für den Einsatz in den meisten Laboratorien. Eine solche optimierte Methode kann ein leistungsfähiges Werkzeug für die Neurobiologie und Entwicklungsbiologieforschung sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31501099) und der Middle-aged and Young of the Education Department of Hubei Province, China (Nr. Q20191104). Und wir danken Professor Wensheng Deng von der Wuhan University of Science and Technology für die Bereitstellung der mausembryonalen Stammzelllinien A2lox.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
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