Summary
Her etablerede vi en billig og nem at betjene metode, der dirigerer hurtig og effektiv differentiering fra embryonale stamceller til neuroner. Denne metode er velegnet til popularisering blandt laboratorier og kan være et nyttigt værktøj til neurologisk forskning.
Abstract
Den neurale differentiering af mus embryonale stamceller (MESCs) er et potentielt redskab til at belyse de vigtigste mekanismer, der er involveret i neurogenese og potentielt støtte i regenerativ medicin. Her etablerede vi en effektiv og billig metode til neuronal differentiering fra mESC'er in vitro, ved hjælp af strategien for kombinatorisk screening. Under de betingelser, der er defineret her, tillader den 2-dages embryoide kropsdannelse + 6-dages retinosyreinduktionsprotokol hurtig og effektiv differentiering fra mESC'er til neurale prækursorceller (NPC'er), som det ses ved dannelsen af godt stablet og neuritlignende A2lox og 129 derivater, der er Nestin-positive. Den sunde tilstand af embryoiøse kroppe og det tidspunkt, hvor retinosyre (RA) påføres, samt RA-koncentrationerne er kritiske i processen. I den efterfølgende differentiering fra NPC'ere til neuroner kunne N2B27 medium II (suppleret med Neurobasal medium) bedre understøtte langsigtet vedligeholdelse og modning af neuronale celler. Den præsenterede metode er meget effektiv, billig og nem at betjene, og kan være et kraftfuldt værktøj til neurobiologi og udviklingsbiologisk forskning.
Introduction
Embryonale stamceller (ESC'er) er pluripotente og kan differentiere sig til neurale prækursorceller (NPC'ere) og derefter til neuroner under visse betingelser1. ESC-baseret neurogenese giver den bedste platform til at efterligne neurogenese og tjener dermed som et nyttigt værktøj til udviklingsbiologiske undersøgelser og potentielt støtte i regenerativ medicin2,3. I de seneste årtier er mange strategier blevet rapporteret for at fremkalde embryonal neurogenese, såsom den transgene metode4, ved hjælp af små molekyler5, ved hjælp af en 3D-matrix mikromiljø6, og co-kultur teknikken7. De fleste af disse protokoller er dog enten begrænset eller svære at betjene, og de er derfor ikke egnede til brug i de fleste laboratorier.
For at finde en nem at betjene og billig metode til at opnå effektiv neural differentiering fra mESC'er blev der brugt en kombinatorisk screeningsstrategi her. Som beskrevet i figur 1blev hele processen med embryonal neurogenese opdelt i 2 faser. Fase I henviser til differentieringsprocessen fra MESC'er til NPC'ere, og fase II vedrører den efterfølgende differentiering fra NPC'er til neuroner. Baseret på principperne om nem betjening, lave omkostninger, let tilgængelige materialer og høj differentieringseffektivitet blev syv protokoller i fase I og tre protokoller i fase II valgt baseret på det traditionelle klæbende monolayerkultursystem eller embryoid kropsdannelsessystem8,9. Differentieringseffektiviteten af protokoller i begge faser blev evalueret ved hjælp af cellemorfologiobservation og immunfluorescensanalyse. Ved at kombinere den mest effektive protokol i hver fase etablerede vi den optimerede metode til neural differentiering fra MESC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mus embryonale stamcellekultur
- Forbered 0,1% gelatinebelagte cellekulturretter eller tallerkener.
- Der tilsættes 2 ml steriliseret 0,1% gelatine (0,1% m/v i vand) til 60 mm cellekulturretter. Rock forsigtigt for at sikre jævn belægning af cellekulturretterne.
- Sæt opvasken i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C og lad belægningen i 1 time.
- Fjern 0,1% gelatineopløsningen, før du sår cellerne.
BEMÆRK: Når gelatinen er fjernet, er det ikke nødvendigt at tørre eller vaske de belagte retter.
- Mus embryonale stamceller (A2lox og 129) kultur
- Inkubere mESC'er (A2lox og 129) celler i de 0,1% gelatinebelagte 60 mm cellekulturretter i mESC-vækstmedium ved henholdsvis 37 °C i en 5% CO 2-inkubator. mESC-vækstmediet består af 85% knock-out DMEM/F12, 15% Knock-out serumudskiftning (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% ikke-essentiel aminosyre (NEAA), 1% penicillin/streptomycin (P/S), 1000 U/mL leukæmihæmmerfaktor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-hæmmer) og 0,33 nM PD0325901 (MEK-hæmmer).
ADVARSEL: β mercaptoethanol er brandfarligt og har toksicitet ved indånding. Holdes væk fra brandkilder og bære en maske for at undgå indånding, når du bruger. - Skift mESC-vækstmediet dagligt for bedre vækst i A2lox og 129.
- Når cellerne når 80% sammenløb, skal du fjerne mediet og tilføje 1 mL på 0,1% trypsin til skålen. Sten forsigtigt i 30 s for at sikre jævn dækning af trypsin på alle celler.
- Lad cellerne stå i ca. 1 minut for at trypsinisereog derefter fjerne trypsinen ved hjælp af 1 mL pipette.
- Tilsæt 2 mL mESC vækstmedium til skålen, pipette op og ned flere gange for at lave en enkelt celleaffjedring.
- Tæl tætheden af cellerne i suspensionen så præcist som muligt ved hjælp af hæmocytometer.
- Inddel cellerne i 7 grupper, og fremkald differentiering ved hjælp af forskellige protokoller, der er vist i tabel 1.
- Inkubere mESC'er (A2lox og 129) celler i de 0,1% gelatinebelagte 60 mm cellekulturretter i mESC-vækstmedium ved henholdsvis 37 °C i en 5% CO 2-inkubator. mESC-vækstmediet består af 85% knock-out DMEM/F12, 15% Knock-out serumudskiftning (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% ikke-essentiel aminosyre (NEAA), 1% penicillin/streptomycin (P/S), 1000 U/mL leukæmihæmmerfaktor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-hæmmer) og 0,33 nM PD0325901 (MEK-hæmmer).
2. Differentiering fra MESC'er til NPC'ere (fase I)
- Forbered 0,1% gelatine belagt celle kultur plader eller coverslips.
- Før brug fremstilles 0,1% gelatinebelagte 6-brønds plader eller coverslips som i trin 1.1.
- Fase I differentiering ved hjælp af protokol 1 (tabel 1)
- Frø ca. 2 x 104 mESC'er i 2 ml basal differentieringsmedium I pr. brønd i de 0,1% gelatinebelagte 6-brønds plader. Kontroller celletætheden under et mikroskop.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO 2-inkubator i 6 timer for at give mulighed for fastgørelse.
- Efter fastgørelse tages ud af cellerne fra inkubatoren, og cellerne vaskes to gange med 2 mL PBS.
- Der tilsættes 2 mL basal differentieringsmedium I (Tabel 1) til hver brønd og sættes cellerne tilbage i inkubatoren.
- Lad cellerne blive til differentiering i 8 dage. Udskift det basale differentieringsmedium I hver anden dag.
- Fase I differentiering ved hjælp af protokol 2 (tabel 1)
- Der tilsættes 1,5 x 106 mESC'er til en ikke-klæbende bakterieskål i 10 mL basal differentieringsmedium I for at give mulighed for embryonal kropsdannelse ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
- Efter 2 dage, overføre celle aggregater i 15 mL centrifuge rør og lad dem bosætte sig ved tyngdekraften.
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 10 mL frisk basaldifferentieringsmedium I for at opsætte embryoiøse kroppe igen. Genplante dem i en ny nonadhesive bakteriel parabol og tillade differentiering i yderligere 2 dage.
- Kontroller dannelsen af embryoiøse kroppe under mikroskopet (Figur 2A).
- Embryonlegemer som beskrevet i trin 2.3.2-2.3.3. Frø omkring 50 embryoiøse organer i 2 ml basal differentiering medium I per godt på 0,1% gelatine-belagt 6-brønd plader.
- Der fremstilles 1 mM all-trans RA-lager (i DMSO) og opbevares væk fra lys i en fryser på -80 °C efter underemballering.
BEMÆRK: RA er ustabil, og der skal lægges vægt på at holde den væk fra lys og reducere luftkontakten under forberedelsen af RA-bestanden. - For RA-induktion tilsættes 2 μL RA-bestand til hver brønd for at opnå en endelig koncentration på 1 μM.
- Pladen anbringes i 5% CO 2-inkubatoren ved 37 °C og differentieres i yderligere 4 dage.
- Der skiftes hele 2 mL basal differentieringsmedium I (med 1 μM RA) hver anden dag.
- Fase I differentiering ved hjælp af protokol 3 (tabel 1)
- Plant 1,5 x 106 mESC'er i en ikke-klæbende bakterieskål i 10 mL basal differentieringsmedium I. Lad det stå i 2 dage for embryonal kropsdannelse ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
- Kontroller dannelsen af embryoiøse kroppe under et mikroskop (figur 2B).
- Overfør celleaggregater til 15 mL centrifugerør og lad dem slå sig ned ved tyngdekraften.
- Fjern supernatanten forsigtigt og tilsæt 10 mL frisk basal differentiering medium I for at genbruge dem.
- Frø omkring 50 embryoiøse organer i 2 ml basal differentiering medium I per godt på 0,1% gelatine-belagt 6-brønd plader.
- For RA-induktion tilsættes 2 μL RA-bestand til hver brønd for at opnå en endelig koncentration på 1 μM.
- Pladen anbringes i 5% CO 2-inkubatoren ved 37 °C og differentieres i yderligere 6 dage. Hele det basale differentieringsmedium I (med 1 μM RA) ændres hver anden dag.
- Fase I differentiering ved hjælp af protokol 4 (tabel 1)
- Frø ca. 2 x 104 mESC'er inden for 2 ml basal differentieringsmedium I pr. godt på de 0,1% gelatinebelagte 6-brønds plader. Pladen anbringes i 5% CO 2-inkubatoren ved 37 °C for at give mulighed for fastgørelse i 6 timer.
- Efter fastgørelse vaskes cellerne to gange med 2 mL PBS. Der tilsættes 2 mL basal differentieringsmedium I til hver brønd, og der tillades differentiering i 4 dage i 5% CO 2-inkubatoren ved 37 °C.
- For RA-induktion tilsættes 2 μL all-trans RA-bestand i hver brønd (arbejdskoncentrationen er 1 μM) for at fremkalde differentiering i yderligere 4 dage.
- I hele processen skal du udskifte hele mediet hver 2. dag.
- Fase I differentiering ved hjælp af protokol 5 (tabel 1)
- Frø ca. 2 x 104 mESC'er inden for 2 ml basal differentieringsmedium I pr. godt på de 0,1% gelatinebelagte 6-brønds plader. Pladen anbringes i 5% CO 2-inkubatoren ved 37 °C for at give mulighed for fastgørelse i 6 timer.
- Cellerne vaskes to gange med 2 mL PBS. Der tilsættes 2 mL basal differentieringsmedium I til hver brønd, og der tillades differentiering i 2 dage i 5% CO 2-inkubatoren ved 37 °C.
- For den efterfølgende RA-induktion tilsættes 2 μL RA-bestand i hver brønd for at opnå en endelig koncentration på 1 μM. Pladen anbringes i 5% CO 2-inkubatoren ved 37 °C for at fremkalde differentiering i yderligere 6 dage.
- I hele processen skal du udskifte hele mediet hver 2. dag.
- Fase I differentiering ved hjælp af protokol 6 (tabel 1)
- Plant 1,5 x 106 mESC'er i en ikke-klæbende bakterieskål i 10 mL N2B27 medium II (Tabel 1) for at muliggøre dannelse af embryoiøse kroppe.
- På den andendag indsamles celleaggregaterne som beskrevet i trin 2.3.2-2.3.3, og embryoidenslegemer genbruges ved hjælp af 10 mL frisk N2B27 medium II.
- Genplante dem i en ny ikke-klæbende bakteriel skål og tillade differentiering i yderligere 2 dage i 5% CO2 inkubator ved 37 °C. Kontroller dannelsen af embryoide organer under mikroskop.
- På den4. dag skal du samle embryoide kroppe. Frø omkring 50 embryoiøse organer per godt på 0,1% gelatine-belagt 6-brønd plader med 2 ml N2B27 medium II.
- Der tilsættes 2 μL all-trans RA-bestand til hver brønd, og der fremkaldes differentiering i yderligere 4 dage. Hele mediet (N2B27 medium II udskiftes med 1 μM RA) hver anden dag.
- Fase I differentiering ved hjælp af protokol 7 (tabel 1)
- Frø ca. 2 x 104 mESC'er inden for 2 ml basal differentieringsmedium I pr. godt på de 0,1% gelatinebelagte 6-brønds plader. Pladen anbringes i 5% CO 2-inkubatoren ved 37 °C for at give mulighed for fastgørelse i 6 timer.
- Vask cellerne to gange med PBS. Derefter tilsættes 2 mL N2B27 medium II til hver brønd og giver mulighed for differentiering i 8 dage ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
- Skift hele N2B27 medium II hver 2. dag.
3. Observation af cellemorfologi
- Kontroller differentieringsstatus for de ovennævnte 7 grupper dagligt under et omvendt fasekontrastlysmikroskop.
- Vælg tilfældigt mindst 12 felter, og tag billeder for at registrere de morfologiske ændringer i hver gruppe på D8.
4. Immunfluorescens farvning
- Prøveforberedelse: Frø mESC'er på 0,1% gelatinebelagte coverslips og giver mulighed for differentiering i 8 dage ved hjælp af de protokoller, der er nævnt i trin 2.
- Skyl: På den8. dag skal du tage prøverne ud af inkubatoren og fjerne differentieringsmediet ved aspiration. Skyl forsigtigt cellerne én gang med 1 mL PBS i 5 min.
- Fiksering: Der tilsættes 1 mL paraformaldehyd på 4% til hver prøve, og cellerne fastgøres i 20 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Skyl: Efter fiksering skylles cellerne forsigtigt med 1 mL PBS 3 gange i 5 minutter hver.
- Permeabilisering: Der tilsættes 1 mL på 0,2% TritonX-100 i PBS til hver prøve og efterlades i 8 min ved RT.
- Skyl: Efter permeabilisering skylles cellerne forsigtigt med 1 mL PBS 3 gange i 5 minutter hver.
- Blokering: Der tilsættes 1 mL 10% gedeserum i PBS til hver prøve og inkuberes ved RT i 1 time for at blokere eventuelle ikke-specifikke interaktioner.
- Inkubation med primært antistof
- Anti-Nestin-antistoffet fortyndes i et forhold på 1:100 ved hjælp af 5% gedeserum i PBS.
- Der påføres 500 μL fortyndet antistof på forskellige prøver, og der inkuberes natten over ved 4 °C.
- Skyl: Fjern antistoffet og skyl prøverne forsigtigt med 1 mL PBS 3 gange i 8 min hver.
- Inkubation med sekundært antistof
- Fortynd Alexa Fluor 488-mærket ged anti-mus IgG i et forhold på 1:500 ved hjælp af 5% gedeserum i PBS.
- Der påføres 500 μL fortyndet antistof på forskellige prøver, og der inkuberes i mørke i 2 timer ved RT.
BEMÆRK: Når du har anvendt fluorescerende sekundært antistof, skal du udføre alle de efterfølgende trin i mørket for at forhindre fluorescensslukning.
- Skyl: Fjern det sekundære antistof, og skyl prøverne forsigtigt med 1 mL PBS 3 gange i 8 min hver.
- Nuklear farvning og montering
- Placer en dråbe DAPI monteringsmedium på det rene mikroslide.
- Tag forsigtigt prøverne ud af pladerne, og læg prøven oven på DAPI-monteringsmediet med cellen med forsiden nedad. Lad i mørke i 5 min på RT.
- Fjern overskydende DAPI monteringsmedium med absorberende papir.
- Fluorescens mikroskopi observation
- Placer prøverne under fluorescensmikroskopien, og detekter signalet for DAPI og Alexa Fluor 488 ved hjælp af korrekte filtre.
- Vælg jævnt og tilfældigt 10-15 forskellige visuelle felter for hver prøve, og optag billederne med et CCD-kamera.
5. Differentiering fra NPC'ere til neuroner (fase II)
- Forbered mESC-derivater under fase I-differentiering ved hjælp af protokol 3 (8 dage, tabel 1) som beskrevet i trin 2.4, som har den højeste differentieringseffektivitet (se figur 3).
BEMÆRK: Efter fase I-differentiering bør kvalitetskontrol udføres ved hjælp af ovennævnte cellemorfologiobservation og immunfluorescensanalyse for at sikre sunde og højtydende NPC'ere. - Frø omkring 5 x 105 mESC derivater inden for 2 ml basal differentiering medium I per godt på 0,1% gelatine-belagt 6-brønd plader. Fordel tilfældigt mESC-derivaterne i 3 grupper, som henholdsvis fase II-protokol 1, protokol 2 og protokol 3.
- Pladen anbringes i 5% CO 2-inkubatoren ved 37 °C for at give mulighed for fastgørelse i 6 timer. Vask dem to gange med 2 mL PBS.
- Der tilsættes henholdsvis 2 mL basal differentieringsmedium I, N2B27 medium I og N2B27 mellem II (tabel 2), til hver brønd i ovennævnte grupper.
- Placer pladerne i inkubatoren og lad dem differentiere i yderligere 10 dage. Skift det tilsvarende medie hver anden dag.
- Kontroller differentieringsstatussen, og registrer de morfologiske ændringer som nævnt i trin 3.
- På dag 18 skal du evaluere generationen af neuroner (β-Tubulin III positive) og bestemme differentieringseffektiviteten af de 3 protokoller, der bruger i trin 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2-dages embryoid kropsdannelse + 6-dages RA induktion fungerer bedst på at lede differentieringen af mESC'er i NPC'ere (fase I). For at bestemme den optimale protokol, der bedst fremmer differentieringen af MESC'er i NPC'ere (fase I), blev 7 protokoller testet på både A2lox og 129 mESC 'er (tabel 1), og differentieringsstatus for hver gruppe blev overvåget ved hjælp af lysmikroskop. Som det fremgår af figur 3A, viste de fleste A2lox- og 129-derivater under "2-dages embryonal kropsdannelse + 6-dages RA-induktion" behandling (fase I-protokol 3) velstakkede og neuritlignende morfologier, som angiver dannelsen af NPC'er. Celler med "4-dages embryoid kropsdannelse + 4-dages RA induktion" behandling (fase I-protokol 2) viste imidlertid dårlig og apptotisk status, hvilket kan skyldes manglen på næringsstof i embryoiøse kroppe. Monolayerkultur kombineret med RA-induktion (fase I-protokol 4 og 5) kunne også styre differentieringen af MESC'er, mens andelen af neuritlignende celler ikke var så meget som i fase I-protokol 3. I mellemtiden viste de fleste A2lox og 129 derivater i fase I-protokol 6 og 7 mindre cellelegemer og havde tendens til at gennemgå apoptose, hvilket tyder på, at N2B27 medium II ikke kunne understøtte embryonal neurogenese effektivt.
For yderligere at bekræfte dannelsen af NPC'ere blev procentdelen af Nestin+-celler (markør for NPC'er) i hver gruppe påvist ved hjælp af en immunfluorescensanalyse. I figur 3Bvar procentdelen af Nestin+-celler i fase I-protokol 3 den højeste og nåede op på 77,67 ± henholdsvis 4,33 % og 69,33 ± 2,33 % i henholdsvis A2lox og 129 derivater. Samlet set fungerer fase I-protokol 3 bedst til at dirigere differentiering af MESC'er til NPC'ere.
N2B27 medium II kan mest effektivt fremkalde differentiering fra NPC'ere til neuroner (fase II). Tre protokoller i fase II-differentiering blev undersøgt. Som det fremgår af figur 4A, viste morfologiske observationer, at de fleste A2lox- og 129-derivater i fase II-protokol 3 (differentiering med N2B27-medium II) syntes at være de mest langvarige neuronlignende strukturer med klare neuritter og cellekropsudvidelser på dag 18, hvilket indikerer den effektive forekomst af neurogenese. Immunfluorescensanalyser bekræftede yderligere generering af neuroner med procentdelen af β-Tubulin III+ celler op til 67,75 ± 4,01% og 58,73 ± henholdsvis 7,25% i A2lox og 129 derivater på D18 (Figur 4B).
For at gøre det tydeligere vises et skematisk diagram over den optimerede metode til embryonal neurogenese i figur 5. Kort, 1,5 x 106 mESC'er er seedet ind i en nonadhesive bakteriel parabol i 10 mL basal differentiering medium I og giver mulighed for embryoid kropsdannelse i 2 dage. Derefter indsamles embryoidelegemer og plantes i de 0,1% gelatinebelagte 6-brønds plader med koncentrationen af 50 embryoiøse kroppe pr. Brønd. I mellemtiden tilsættes RA (1 μM) i yderligere 6 dage. Fra dag 8 til dag 18 fjernes RA, og N2B27 medium II anvendes til at lede den efterfølgende differentiering fra NPC'ere til neuroner. Med en sådan kombineret metode kan robuste neuroner dannes på dag 18.
Figur 1: Diagram over den embryonale neurogeneseproces. Dette tal er blevet ændret fra Li et al.10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Morfologien af de embryoide kroppe. (A)Embryoiøse kroppe dyrket i 4 dage. (B) Embryoiøse organer dyrket i 2 dage. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Effektivitetssammenligning af de 7 protokoller om fase I-differentiering ved hjælp af A2lox og 129 MESC'er. (A) Morfologisk analyse af A2lox- og 129 mESC-derivater på dag 8. Øverste panel: A2lox derivater; Nederste panel: 129 derivater. (B) Påvisning af immunfluorescens i dannelsen af NPC'ere (Nestin+, grøn). Kernerne var mærket blå med DAPI. Øverste panel: A2lox derivater på D8; Nederste panel: 129 derivater på D8. Procentdele af Nestin+-celler i hver gruppe blev vist af histogrammet. Hver kolonne repræsenterer middelværdi±SEM for tre uafhængige eksperimenter. *, s.≤0.05; **, s.≤0.01. Dette tal er blevet ændret fra Li et al.10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Effektivitetssammenligning af de tre protokoller om fase II-differentiering. (A) Morfologisk analyse af A2lox- og 129 mESC-derivater på dag 18. Øverste panel: A2lox derivater; Nederste panel: 129 derivater. (B) Påvisning af immunfluorescens ved dannelse af neuroner (β-Tubulin III+, rød). Kernerne var mærket blå med DAPI. Øverste panel: A2lox derivater på D18; Nederste panel: 129 derivater på D18. Procentdele af β-Tubulin III+ celler i hver gruppe blev vist ved histogram. Hver kolonne repræsenterer gennemsnittet ± SEM af tre uafhængige eksperimenter. *, s.≤0.05; **, s.≤0.01. Dette tal er blevet ændret fra Li et al.10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kort model af den optimerede metode til neuronal differentiering fra MESC'er in vitro Dette tal er blevet ændret fra Liet al.10. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Differentieringsfase I (8d) | ||
| Protokoller | Medier | |
| protokol 1 | Differentiering naturligt: Med basal differentiering medium jeg kun | Basal differentieringsmedium I: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0,1mM 2ME+ 1%P/S |
| protokol 2 | 4-dages Embryoid Organer dannelse + 4-dages RA induktion | |
| protokol 3 | 2-dages Embryoid Organer dannelse + 6-dages RA induktion | |
| protokol 4 | Monolayer kultur kombineret med RA induktion: 4d (-RA) 4d (+RA) | |
| protokol 5 | Monolayerkultur kombineret med RA-induktion: 2d (-RA) 6d(+RA) | |
| protokol 6 | Dannelse af embryoiøse kroppe (4 d) og differentiering induceret med N2B27 medium II | N2B27 medium II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasal medium + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0,1mM 2ME |
| protokol 7 | Monolayer kultur med N2B27 medium II | |
Tabel 1: Nærmere oplysninger om de 7 protokoller, der anvendes i fase I-differentiering. Tabellen er ændret fra Li et al.10.
| Differentieringsfase II (10d) | ||
| Protokoller | Medier | |
| protokol 1 | Differentiering naturligt: Med basal differentiering medium jeg kun | Basal differentieringsmedium I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0,1mM 2ME+ 1%P/S |
| protokol 2 | Differentiering med N2B27 medium I | N2B27 medium I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%GlutaMAX +0,1mM 2ME |
| protokol 3 | Differentiering med N2B27 mellem II | N2B27 medium II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasal medium + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0,1mM 2ME |
Tabel 2: Nærmere oplysninger om de 3 protokoller, der anvendes i fase II-differentiering. Tabellen er ændret fra Li et al.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse etablerede vi en enkel og effektiv metode til neuronal differentiering fra mESC'er med lave omkostninger og let opnåede materialer. I denne metode kan 2 dages embryoid kropsdannelse efterfulgt af 6 dages RA induktion effektivt fremme differentieringen af mESC'er i NPC'ere (fase I-protokol 3). For fase II differentiering, N2B27 medium II (fase II-protokol 3) mest effektivt fremkalde differentiering fra NPC'ere i neuroner. For at sikre succes bør der lægges større vægt på flere kritiske trin.
For det første er embryoiøse organers sunde tilstand nøglen til hele differentieringsprocessen. Tredimensionel embryoid kropsdannelse bruges normalt til at lede differentieringen afESC'er 8. I denne undersøgelse undersøgte vi den korrekte suspensionskulturtid for embryoide kroppe. Som vist i figur 2blev runde embryoidelegemer med lyse kerner dannet efter suspensionskultur i 2 dage i denne tilstand. Men når de dyrkes i 4 dage, klæber mange embryoiøse kroppe til hinanden, og kernerne bliver mørke, hvilket indikerer apoptose af celler i kernerne. Den efterfølgende differentiering bekræftede yderligere den værre effekt af langvarig embryoid kropsdannelse. I nogle rapporterede undersøgelser kan suspensionskulturen af embryoiøse kroppe vare så længe som 10 dage ved hjælp af medium med lavere FBS-koncentration eller uden FBS11. Den reducerede tid til dannelse af embryoiøse organer i undersøgelsen kan skyldes den højere FBS-koncentration (15 %) anvendes her, og det er blevet bevist, at 15% FBS bedre kan fremme dannelsen og differentieringen af embryoiøse organer.
For det andet er det tidspunkt, hvor RA anvendes, og ra-arbejdskoncentrationen afgørende for celle skæbne bestemmelse af MESC'er. RA, et derivat af vitamin A, er en af de vigtigste morfoger med pleiotropiske handlinger12. RA kan regulere flere signalveje og påvirke bestemmelsen af celle skæbne af ESC'er13,14. Rapporter viste , at kortvarig behandling af MESC'er med ra i den tidlige differentieringsfase forhindrede spontan differentiering og opretholde selvfornyelseskapacitet hosMESC'er 15. Andre foreslog, at RA kunne regulere både kimcelledifferentiering og neural differentiering fra ESC'er, som er tidsafhængige16,17,18. I den tilstand, der præsenteres her, ra tilføjet på 2nd dag efter embryonale organ dannelse er egnet til at lede differentiering i NPC'ere. I mellemtiden er arbejdskoncentrationen af RA også kritisk. Lave RA-koncentrationer (~10 nM) kan medføre differentiering af mESC'er i endodermlignende celler, mens høje RA-koncentrationer (1-5 μM) er mere tilbøjelige til at fremkalde differentiering i NPC'ere13,14,15,16,17,18,19. På grund af brugen af RA, ville man forvente en kausalisering effekt; differentieringen i forgrunden hjernen neuroner ville sjældent ses og giver neuroner af hindbrain og rygmarv skæbner ville forekomme20,21. Desuden er RA et let tilgængeligt og billigt middel, og brugen af denne protokol kan spare forskningsmidler til det meste laboratorium.
For det tredje kan de NPC'ere, der genereres efter fase I-differentiering, opbevares og passeres under ordentlige forhold. Kryopræservering med høj celletæthed (>2 x 106) ved hjælp af Stamcellebanker kan effektivt reducere celleskader forårsaget af frysning for at få en høj restitutionshastighed. I mellemtiden kan NPC'ere, der genereres i undersøgelsen, passeres ved hjælp af N2B27-medium (49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasal medium + 2% B27) med en celletæthed mere end 5 x 105/ cm2. Under lav celletæthed (mindre end 0,5 x 105/cm2) har NPC'er en tendens til at differentiere. En sådan celle kryopræservering og nyttiggørelse kan bringe stor bekvemmelighed til forskningen.
Desuden er Neurobasal medium afgørende for fase II differentiering. Neurobasal medium er designet specielt til langsigtet vedligeholdelse og modning af neuronal celle. Som anført i N2B27 medium II (Tabel 2), kunne tilsætningen af Neurobasal medium bedre understøtte differentieringen fra NPC'ere til neuroner.
Samlet set rapporterede vi en effektiv og billig metode til neuronal differentiering fra MESC'er in vitro ved hjælp af strategierne for kombinatorisk screening. Den etablerede metode er meget nem at implementere og er velegnet til brug af de fleste laboratorier. En sådan optimeret metode kan være et kraftfuldt værktøj til neurobiologi og udviklingsbiologisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 31501099) og midaldrende og unge i Uddannelsesafdelingen i Hubei-provinsen, Kina (nr. Q20191104). Og vi takker professor Wensheng Deng ved Wuhan University of Science and Technology for at levere musens embryonale stamcellelinjer A2lox.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
