Summary
Здесь мы установили недорогой и простой в эксплуатации метод, который направляет быструю и эффективную дифференциацию от эмбриональных стволовых клеток к нейронам. Этот метод подходит для популяризации среди лабораторий и может быть полезным инструментом для неврологических исследований.
Abstract
Нейронная дифференциация эмбриональных стволовых клеток мыши (mESCs) является потенциальным инструментом для выяснения ключевых механизмов, участвующих в нейрогенезе и потенциально помощи в регенеративной медицине. Здесь мы создали эффективный и недорогой метод дифференциации нейронов от mESCs invitro, используя стратегию комбинаторного скрининга. В условиях, определенных здесь, 2-дневное формирование эмбрионального тела - 6-дневный протокол индукции ретинойной кислоты позволяет быстро и эффективно дифференцироваться от mESCs в нейронные клетки-предшественники (NPC), о чем говорится в формировании хорошо сложенных и нейритных A2lox и 129 производных, которые являются положительными Nestin. Здоровое состояние эмбриональных тел и точка времени применения ретинойной кислоты (РА), а также концентрации РА имеют решающее значение в этом процессе. В последующей дифференциации от NPC в нейроны, N2B27 среднего II (дополнено Neurobasal среды) может лучше поддерживать долгосрочное обслуживание и созревание нейрональных клеток. Представленный метод является высокоэффективным, недорогим и простым в эксплуатации, и может быть мощным инструментом для нейробиологии и исследований биологии развития.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки (ESCs) плюрипотенты и могут дифференцироваться в нервные клетки-предшественники (NPC), а затем в нейроны при определенныхусловиях 1. ESC основе нейрогенеза обеспечивает лучшую платформу для имитации нейрогенеза, таким образом, выступающей в качестве полезного инструмента для развития биологии исследований и потенциально помощьв регенеративной медицине 2,3. В последние десятилетия, многие стратегии были зарегистрированы для индуцирования эмбрионального нейрогенеза, таких кактрансгенный метод 4, используянебольшие молекулы 5, используя микропрофизнь 3Dматрицы 6, и метод совместнойкультуры 7. Тем не менее, большинство из этих протоколов являются либо состояние ограничено или трудно работать, поэтому они не подходят для использования в большинстве лабораторий.
Чтобы найти простой в эксплуатации и недорогой метод для достижения эффективной нейронной дифференциации от mESCs, стратегия комбинаторного скрининга была использована здесь. Как описано на рисунке 1,весь процесс эмбрионального нейрогенеза был разделен на 2 фазы. Фаза I относится к процессу дифференциации от MESCs в NPC, и фаза II относится к последующей дифференциации от NPC в нейроны. На основе принципов простой работы, низкой стоимости, легкодоступных материалов и высокой эффективности дифференциации, семь протоколов в фазе I и три протокола в фазе II были выбраны на основе традиционной системы монослойной культуры приверженцев или эмбриональной системыформирования тела 8,9. Эффективность дифференциации протоколов в обоих фазах оценивалась с использованием наблюдения за морфологией клеток и анализа иммунофлуоресценции. Объединив наиболее эффективный протокол каждой фазы, мы создали оптимизированный метод нейронной дифференциации от mESCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Мышь эмбриональной культуры стволовых клеток
- Подготовка 0,1% желатина покрытием клеточной культуры блюда или тарелки.
- Добавьте 2 мл стерилизованного 0,1% желатина (0,1% ж/д в воде) к блюдам клеточной культуры 60 мм. Рок мягко, чтобы обеспечить равномерное покрытие клеточной культуры блюд.
- Положите посуду в 5% CO2 инкубатор при 37 градусов по Цельсию и позволяют покрытие для 1 ч.
- Удалите раствор желатина 0,1% перед посевом клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: После удаления желатина, нет необходимости сушить или мыть посуду с покрытием.
- Мышь эмбриональных стволовых клеток (A2lox и 129) культуры
- Инкубировать mESCs (A2lox и 129) клетки в 0,1% желатина покрытием 60 мм клеточной культуры блюда в mESC среднего роста при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатор, соответственно. Среда роста mESC состоит из 85% нокаута DMEM/F12, 15% замены сыворотки (KSR), 0,1 мМ β-меркаптоэтанола (2ME), 2 мМ GlutaMAX, 1% несущественных аминокислот (NEAA), 1% пенициллин/стрептомицин (P/S), 1000 ингибитора лейкемии U/mL (LIF), 10 nM CHIR-99021 (ингибитор GSK-3) и 0,33 nM PD0325901 (ингибитор MEK).
ВНИМАНИЕ: β меркаптоэтанол легковоспламеняющийся и имеет ингаляционную токсичность. Держитесь подальше от источников огня и носить маску, чтобы избежать вдыхания при использовании. - Изменение среды роста mESC ежедневно для лучшего роста A2lox и 129.
- Когда клетки достигнут 80% слияния, удалите среду и добавьте 1 мл 0,1% трипсина в блюдо. Аккуратно рок для 30 с, чтобы обеспечить даже покрытие трипсина на всех клетках.
- Оставьте клетки примерно на 1 мин, чтобы трипсинize, а затем удалить трипсин с помощью 1 мл пипетки.
- Добавьте 2 мл среды роста mESC к блюду, пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы сделать одну подвеску клетки.
- Подсчитайте плотность клеток в подвеске как можно точнее с помощью гемоцитометра.
- Разделите ячейки на 7 групп и индуцировать дифференциацию с помощью различных протоколов, показанных в таблице 1.
- Инкубировать mESCs (A2lox и 129) клетки в 0,1% желатина покрытием 60 мм клеточной культуры блюда в mESC среднего роста при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатор, соответственно. Среда роста mESC состоит из 85% нокаута DMEM/F12, 15% замены сыворотки (KSR), 0,1 мМ β-меркаптоэтанола (2ME), 2 мМ GlutaMAX, 1% несущественных аминокислот (NEAA), 1% пенициллин/стрептомицин (P/S), 1000 ингибитора лейкемии U/mL (LIF), 10 nM CHIR-99021 (ингибитор GSK-3) и 0,33 nM PD0325901 (ингибитор MEK).
2. Дифференциация от MESCs к NPC (Фаза I)
- Подготовка 0,1% желатина покрытием пластины клеточной культуры или coverslips.
- Перед использованием, подготовить 0,1% желатина покрытием 6-хорошо пластин или coverslips как в шаге 1.1.
- Дифференциация фазы I с использованием протокола 1( Таблица 1)
- Семя около 2 х 104 mESCs в 2 мл базальной дифференциации среднего I на хорошо в 0,1% желатина покрытием 6-хорошо пластин. Проверьте плотность клеток под микроскопом.
- Инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатор для 6 ч, чтобы обеспечить крепление.
- После вложения вывих из клеток из инкубатора, и мыть клетки в два раза с 2 мл PBS.
- Добавьте 2 мл базальной дифференциации среды I (Таблица 1) к каждому хорошо и положить клетки обратно в инкубатор.
- Оставьте клетки для дифференциации на 8 дней. Заменить базальной дифференциации среды я каждые 2 дня.
- Дифференциация фазы I с использованием протокола 2( Таблица 1)
- Добавьте 1,5 х10 6 мЕКС в неклейвую бактериальную тарелку в 10 мл базальной дифференциации среды I, чтобы обеспечить формирование эмбрионального тела при 37 градусах Цельсия в инкубаторе CO2 на 5%.
- Через 2 дня, передача клеток агрегатов в 15 мл центрифуг трубки и пусть они оседают под действием силы тяжести.
- Удалите супернатант и добавьте 10 мл свежей базальной дифференциации среды I для повторного перерасхода эмбриональных тел. Пересадить их в новое неклейвое бактериальное блюдо и дать дифференциацию еще на 2 дня.
- Проверьте образование эмбриональных тел под микроскопом(рисунок 2A).
- Соберите эмбриональные тела, описанные в шагах 2.3.2-2.3.3. Семя около 50 эмбриональных тел в 2 мл базальной дифференциации среды I на хорошо на 0,1% желатина покрытием 6-хорошо пластин.
- Подготовьте 1 мММ все-транс РА бульон (в DMSO) и хранить вдали от света в морозильной камере -80 градусов по Цельсию после суб-упаковки.
ПРИМЕЧАНИЕ: РА нестабильна, и следует обратить внимание на то, чтобы держать ее подальше от света и уменьшить воздушный контакт во время подготовки запасов РА. - Для индукции РА добавьте 2 МКЛ запасов РА в каждую колодец, чтобы сделать окончательную концентрацию 1 МКМ.
- Поместите пластину в 5% CO2 инкубатор при 37 градусов по Цельсию и дифференцировать еще на 4 дня.
- Изменение всего 2 мл базальной дифференциации среды I (с 1 МК РА) каждые 2 дня.
- Дифференциация фазы I с использованием протокола 3( Таблица 1)
- Завод 1,5 х 106 mESCs в неклейкие бактериальные блюда в 10 мл базальной дифференциации среды I. Оставьте на 2 дня для эмбрионального формирования тела при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатора.
- Проверьте образование эмбриональных тел под микроскопом(рисунок 2B).
- Передача ячейки агрегируется в 15 мл центрифуг трубки и пусть они оседают под действием силы тяжести.
- Удалите супернатант тщательно и добавить 10 мл свежей базальной дифференциации среды I, чтобы повторно их перерасходовать.
- Семя около 50 эмбриональных тел в 2 мл базальной дифференциации среды I на хорошо на 0,1% желатина покрытием 6-хорошо пластин.
- Для индукции РА добавьте 2 МКЛ запасов РА в каждую колодец, чтобы сделать окончательную концентрацию 1 МКМ.
- Поместите пластину в инкубатор 5% CO2 при 37 градусов по Цельсию и продифференцировать еще на 6 дней. Изменение всей базальной дифференциации среды I (с 1 МК РА) каждые 2 дня.
- Дифференциация фазы I с использованием протокола 4( Таблица 1)
- Семя около 2 х 104 mESCs в пределах 2 мл базальной дифференциации среды I на хорошо на 0,1% желатина покрытием 6-хорошо пластин. Поместите пластину в инкубатор 5% CO2 при 37 градусах Цельсия, чтобы обеспечить крепление на 6 ч.
- После вложения, мыть клетки дважды с 2 мл PBS. Добавьте 2 мл базальной дифференциации среднего I к каждой хорошо и обеспечить дифференциацию в течение 4 дней в 5% CO2 инкубатор при 37 градусов по Цельсию.
- Для индукции РА добавьте 2 МКЛ всего транс РА в каждую колодец (рабочая концентрация составляет 1 МКМ), чтобы вызвать дифференциацию еще на 4 дня.
- В течение всего процесса, заменить весь носитель каждые 2 дня.
- Дифференциация фазы I с использованием протокола 5( Таблица 1)
- Семя около 2 х 104 mESCs в пределах 2 мл базальной дифференциации среды I на хорошо на 0,1% желатина покрытием 6-хорошо пластин. Поместите пластину в инкубатор 5% CO2 при 37 градусах Цельсия, чтобы обеспечить крепление на 6 ч.
- Вымойте клетки дважды с 2 мл PBS. Добавьте 2 мл базальной дифференциации среднего I к каждой хорошо и обеспечить дифференциацию в течение 2 дней в 5% CO2 инкубатор при 37 градусов по Цельсию.
- Для последующей индукции РА добавьте 2 МКЛ запасов РА в каждую колодец, чтобы сделать окончательную концентрацию в 1 МКМ. Поместите пластину в инкубатор 5% CO2 при 37 градусах по Цельсию, чтобы вызвать дифференциацию еще на 6 дней.
- В течение всего процесса, заменить весь носитель каждые 2 дня.
- Дифференциация фазы I с использованием протокола 6( Таблица 1)
- Завод 1,5 х 106 mESCs в неклейкие бактериальные блюда в 10 мл N2B27 среднего II (Таблица 1), чтобы обеспечить формирование эмбриональных тел.
- На 2-й день соберитеагрегаты клеток, описанные в шагах 2.3.2-2.3.3, и повторно посовекуйте эмбриональные тела, используя 10 мл свежей среды N2B27 II.
- Пересаживайте их в новое неклеядное бактериальное блюдо и дайте дифференциацию еще на 2 дня в инкубаторе 5% CO2 при 37 градусах Цельсия. Проверьте образование эмбриональных тел под микроскопом.
- На4-й день собирайте эмбриональные тела. Семя около 50 эмбриональных тел на колодец на 0,1% желатина покрытием 6-хорошо пластин с 2 мл N2B27 среднего II.
- Добавьте 2 МКЛ все-транс РА запасов в каждой хорошо и вызвать дифференциацию еще на 4 дня. Замените всю среду (N2B27 medium II на 1 МКР) каждые два дня.
- Дифференциация фазы I с использованием протокола 7( Таблица 1)
- Семя около 2 х 104 mESCs в пределах 2 мл базальной дифференциации среды I на хорошо на 0,1% желатина покрытием 6-хорошо пластин. Поместите пластину в инкубатор 5% CO2 при 37 градусах Цельсия, чтобы обеспечить крепление на 6 ч.
- Вымойте клетки дважды с PBS. Затем добавьте 2 мл N2B27 среднего II к каждой хорошо и обеспечить дифференциацию в течение 8 дней при 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатора.
- Изменение всего N2B27 среды II каждые 2 дня.
3. Наблюдение за морфологией клеток
- Проверьте статус дифференциации вышеупомянутых 7 групп ежедневно под перевернутым фазово-контрастным световым микроскопом.
- Случайным образом выберите не менее 12 полей и сфот фотографируете морфологические изменения каждой группы на D8.
4. Иммунофлуоресценция окрашивания
- Подготовка образца: Семенные mESCs на 0,1% крышки с покрытием желатина и позволяют дифференциации в течение 8 дней с использованием протоколов, упомянутых в шаге 2.
- Промыть: На8-й день, взять образцы из инкубатора и удалить дифференциации среды по стремлению. Аккуратно промойте клетки один раз с 1 мл PBS в течение 5 мин.
- Фиксация: Добавьте 1 мл 4% параформалдегида в каждый образец и зафиксируете клетки в течение 20 минут при комнатной температуре (RT).
- Промыть: После фиксации, осторожно промыть клетки с 1 мл PBS 3 раза, в течение 5 минут каждый.
- Permeabilization: Добавить 1 мл 0,2% TritonX-100 в PBS к каждому образцу и оставить на 8 мин на RT.
- Промыть: После протеабилизации, аккуратно промыть клетки с 1 мл PBS 3 раза, в течение 5 минут каждый.
- Блокировка: Добавить 1 мл 10% козьей сыворотки в PBS к каждому образцу и инкубировать на RT в течение 1 ч, чтобы блокировать любые неспецифические взаимодействия.
- Инкубация с первичными антителами
- Разбавить анти-nestin антитела в соотношении 1:100 с использованием 5% козьей сыворотки в PBS.
- Нанесите 500 МКЛ разбавленных антител на различные образцы и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Промыть: Удалить антитела и промыть образцы осторожно с 1 мл PBS 3 раза в течение 8 минут каждый.
- Инкубация со вторичными антителами
- Разбавить Alexa Fluor 488 помечены коза анти-мышь IgG в соотношении 1:500 использованием 5% козьей сыворотки в PBS.
- Нанесите 500 МКЛ разбавленных антител на различные образцы и инкубировать в темноте в течение 2 ч на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: После применения флуоресцентных вторичных антител, выполнить все последующие шаги в темноте, чтобы предотвратить закалку флуоресценции.
- Промыть: Удалить вторичное антитело и промыть образцы осторожно с 1 мл PBS 3 раза в течение 8 минут каждый.
- Ядерное окрашивание и монтаж
- Поместите одну каплю среды крепления DAPI на чистый микросвод.
- Тщательно вывих из образцов из пластин и поместите образец на верхней части DAPI монтаж среды с ячейкой лицом вниз. Оставьте в темноте на 5 минут на RT.
- Удалите излишки DAPI монтажной среды с абсорбющей бумагой.
- Наблюдение за микроскопией флуоресценции
- Поместите образцы под микроскопию флуоресценции и обнаружите сигнал для DAPI и Alexa Fluor 488 с помощью соответствующих фильтров.
- Равномерно и случайным образом выбрать 10-15 различных полей зрения для каждого образца и записывать изображения с камерой CCD.
5. Дифференциация от NPC к нейронам (Фаза II)
- Подготовка производных mESC в соответствии с дифференциацией фазы I с использованием протокола 3 (8 дней, таблица 1), как подробно описано в шаге 2.4, который имеет самую высокую эффективность дифференциации (см. рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: После дифференциации фазы I контроль качества должен осуществляться с использованием наблюдения за морфологией клеток и анализа иммунофторесценции, упомянутых выше, для обеспечения здорового и высокодоходного NPC. - Семя около 5 х 105 mESC производных в пределах 2 мл базальной дифференциации среды I на хорошо на 0,1% желатина покрытием 6-хорошо пластин. Случайным образом разделите производные mESC на 3 группы, как протокол фазы II 1, протокол 2 и протокол 3, соответственно.
- Поместите пластину в инкубатор 5% CO2 при 37 градусах Цельсия, чтобы обеспечить крепление на 6 ч. Вымойте их дважды с 2 мл PBS.
- Добавьте 2 мл базальной дифференциации среды I, N2B27 средних I и N2B27 средних II(таблица 2), соответственно, к каждой из вышеуказанных групп.
- Поместите пластины в инкубатор и дайте дифференцировать еще на 10 дней. Изменение соответствующей среды каждые 2 дня.
- Проверьте статус дифференциации и завещайте морфологические изменения, упомянутые в шаге 3.
- На 18-й день оцените генерацию нейронов (β-Тубулин III положительный) и определите эффективность дифференциации 3 протоколов, использующих в шаге 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2-дневное формирование эмбрионального тела - 6-дневная индукция РА лучше всего работает над направлением дифференциации МЕКС в NPC (Фаза I). Для определения оптимального протокола, который наилучшим образом способствует дифференциации MESCs в NPC (Фаза I), 7 протоколов были протестированы как на A2lox и 129 mESCs (Таблица 1) и дифференциации статус каждой группы был проверен с помощью светового микроскопа. Как показано на рисунке 3A, большинство A2lox и 129 производных в рамках "2-дневного эмбрионального формирования тела и 6-дневной индукции РА" лечение (Фаза I-протокол 3) показали хорошо сложены и нейрит-как морфологии, которые указывают на формирование NPC. Тем не менее, клетки с "4-дневным эмбриональным формированием тела и 4-дневной индукцией РА" (Фаза I-протокол 2) показали плохой и апоптотический статус, который может быть вызван отсутствием питательных веществ в эмбриональных телах. Культура монослой в сочетании с индукцией RA (Фаза I-протокол 4 и 5) также может направлять дифференциацию mESCs, в то время как доля нейрит-как клетки была не так много, как в фазе I-протокол 3. Между тем, большинство A2lox и 129 производных в фазе I-протокол 6 и 7 показали меньшие тела клеток и, как правило, проходят апоптоз, предполагая, что N2B27 среднего II не может поддерживать эмбриональный нейрогенез эффективно.
Для дальнейшего подтверждения образования NPC, процент клеток Нестина (маркер для NPC) в каждой группе были обнаружены с помощью иммунофлуоресценции анализа. На рисунке 3Bпроцент клеток Nestin в фазе I-протокола 3 был самым высоким и достиг 77,67 ± 4,33% и 69,33 ± 2,33% в A2lox и 129 производных соответственно. В совокупности Фаза I-протокол 3 лучше всего работает над направлением дифференциации MESCs в NPC.
N2B27 средний II может наиболее эффективно вызвать дифференциацию от NPC в нейроны (Фаза II). Были рассмотрены три протокола дифференциации фазы II. Как показано на рисунке 4A, морфологические наблюдения показали, что большинство A2lox и 129 производных в фазе II-протокол 3 (дифференциация с N2B27 среды II) появились самые длительные нейрон-подобные структуры с четкими невритов и расширения клеток тела на 18 день, что свидетельствует об эффективном возникновении нейрогенеза. Иммунофлюоресценция анализы также подтвердили генерацию нейронов, с процентом β-Тубулин III "клеток до 67,75 ± 4,01% и 58,73 ± 7,25%, соответственно, в A2lox и 129 производных на D18 (рисунок 4B).
Чтобы было понятнее, схематическая схема оптимизированного метода эмбрионального нейрогенеза показана на рисунке 5. Короче говоря, 1,5 х 106 mESCs посеяны в неклейкие бактериальные блюда в 10 мл базальной дифференциации среды I и позволяют эмбрионального формирования тела в течение 2 дней. Затем эмбриональные тела собираются и высаживаются в 0,1% пластин с покрытием желатина 6-хорошо с концентрацией 50 эмбриональных тел на колодец. Между тем, РА (1 МКМ) добавляется еще на 6 дней. С 8-го дня до 18-го дня, РА удаляется, и N2B27 среды II применяется для прямого последующей дифференциации от NPC к нейронам. С помощью такого комбинированного метода, надежные нейроны могут быть сформированы на 18-й день.
Рисунок 1: Диаграмма эмбрионального процесса нейрогенеза. Эта цифра была изменена с Li et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Морфология эмбриональных тел. (A)Эмбриональные тела, культурные в течение 4 дней. (B)Эмбриональные тела, культурные в течение 2 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сравнение эффективности 7 протоколов дифференциации фазы I с использованием A2lox и 129 mESCs. (A)Морфологический анализ производных A2lox и 129 mESCs на 8-й день. Верхняя панель: производные A2lox; Нижняя панель: 129 производных. (B)Обнаружение иммунофлуоресценции для формирования NPC (Nestin, зеленый). Ядра были помечены синим цветом с DAPI. Верхняя панель: производные A2lox на D8; Нижняя панель: 129 производных на D8. Проценты клеток Nestin' каждой группы были показаны гистограммой. Каждая колонка представляет ±SEM трех независимых экспериментов. в, стр.≤0,05; Вопрос, стр.≤0.01. Эта цифра была изменена с Li et al.10.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 4: Сравнение эффективности 3 протоколов по дифференциации фазы II. (A)Морфологический анализ производных A2lox и 129 mESCs на 18-й день. Верхняя панель: производные A2lox; Нижняя панель: 129 производных. (B)Обнаружение иммунофлуоресценции для формирования нейронов (β-Тубулин III, красный). Ядра были помечены синим цветом с DAPI. Верхняя панель: производные A2lox на D18; Нижняя панель: 129 производных на D18. Проценты клеток β-Тубулина III" каждой группы были показаны гистограммой. Каждая колонка представляет среднее ± SEM трех независимых экспериментов. в, стр.≤0,05; Вопрос, стр.≤0.01. Эта цифра была изменена с Li et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Краткая модель оптимизированного метода дифференциации нейронов от mESCs in vitro Эта цифра была изменена с Liet al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Дифференциация Фаза I (8d) | ||
| Протоколы | Носителя | |
| протокол 1 | Дифференциация естественно: С базальной дифференциации среды я только | Базальная дифференциация среды I: DMEM/F12 (15%FBS) - 1%NEAA -0,1 мМ 2МЕЗ 1%P/S |
| протокол 2 | 4-дневное формирование эмбриональных тел - 4-дневная индукция РА | |
| протокол 3 | 2-дневное формирование эмбриональных тел - 6-дневная индукция РА | |
| протокол 4 | Культура монослой в сочетании с индукцией РА: 4d (-RA) 4d (ЗР) | |
| протокол 5 | Культура монослой в сочетании с индукцией РА: 2d (-RA) 6d (З РА) | |
| протокол 6 | Формирование эмбриональных тел (4 г) и дифференциация, индуцированная N2B27 medium II | N2B27 средний II: 49% DMEM/F12 " 1% N2 - 48% Нейробазальная среда - 2% B27 (1%GlutaMAX) 0,1 мМм 2ME |
| протокол 7 | Культура монослой с N2B27 среды II | |
Таблица 1: Подробная информация о 7 протоколах, используемых в дифференциации фазы I. Эта таблица была изменена от Li et al.10.
| Дифференциация Фаза II (10d) | ||
| Протоколы | Носителя | |
| протокол 1 | Дифференциация естественно: С базальной дифференциации среды я только | Базальная дифференциация среды I: DMEM/F12 (15%FBS) 1%NEAA (0,1 мМ 2ME) 1%P/S |
| протокол 2 | Дифференциация со средним I N2B27 | N2B27 средний I: DMEM/F12 - 1%N2 - 2%B27 - 1%GlutaMAX 0,1 мМм 2ME |
| протокол 3 | Дифференциация со средним N2B27 II | N2B27 средний II: 49% DMEM/F12 " 1% N2 - 48% Нейробазальная среда - 2% B27 (1%GlutaMAX) 0,1 мМм 2ME |
Таблица 2: Подробная информация о 3 протоколах, используемых в дифференциации фазы II. Эта таблица была изменена от Li et al.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании мы создали простой и эффективный метод дифференциации нейронов от mESCs, с низкой стоимостью и легко полученными материалами. В этом методе, 2 дня эмбрионального формирования тела следуют 6 дней индукции РА может эффективно способствовать дифференциации MESCs в NPC (Фаза I-протокол 3). Для дифференциации фазы II N2B27 medium II (Фаза II-протокол 3) наиболее эффективно индуцирует дифференциацию от NPC к нейронам. Для обеспечения успеха следует уделять больше внимания нескольким важнейшим шагам.
Во-первых, здоровое состояние эмбриональных тел является ключом ко всему процессу дифференциации. Трехмерное формирование эмбрионального тела обычно используется для прямого дифференциации ESCs8. В этом исследовании мы исследовали правильное время культуры суспензии эмбриональных тел. Как показано на рисунке 2, круглые эмбриональные тела с яркими ядрами были сформированы после культуры подвески в течение 2 дней в этом состоянии. Однако, когда культурные в течение 4 дней, многие эмбриональные тела придерживаются друг к другу, и ядра становятся темными, что указывает на апоптоз клеток в ядрах. Последующая дифференциация еще больше подтвердила худший эффект длительного эмбрионального формирования организма. В некоторых зарегистрированных исследованиях, подвеска культуры эмбриональных тел может длиться до тех пор, как 10 дней, используя средние с более низкой концентрацией FBS или без FBS11. Сокращение времени для формирования эмбрионального тела в исследовании может быть связано с более высокой концентрацией FBS (15%) используется здесь, и было доказано, что 15% FBS может лучше способствовать формированию и дифференциации эмбриональных тел.
Во-вторых, точка времени, в которой применяется РА, и рабочая концентрация РА имеют решающее значение для определения судьбы клеток mESCs. РА, производная витамина А, является одним из наиболее важных морфогенов с плейотропными действиями12. RA может регулировать несколько сигнальных путей и влиять на определение судьбы клетокESCs 13,14. Отчеты показали, что кратковременное лечение МЕКС с РА на ранней стадии дифференциации предотвращает спонтанную дифференциацию и поддерживает способность к самообувестиmESCs 15. Другие предположили, что РА может регулировать как дифференциацию зародышевых клеток, так и нейронную дифференциацию от ESCs, которыезависят от времени 16,17,18. В состоянии, представленном здесь, РА добавил на2-й день после эмбрионального формирования тела подходит для направления дифференциации в NPC. Между тем, рабочая концентрация РА также имеет решающее значение. Низкие концентрации РА (10 нМ) могут вызвать дифференциацию МЦК на эндодермоподобные клетки, в то время как высокие концентрации РА (1-5 МКМ) с большей вероятностью вызывают дифференциацию в NPC13,14,15,16,17,18,19. В связи с использованием РА можно было бы ожидать эффекта каудализации; дифференциация в предф.нейронов мозга будет редко видели и уступая нейронов заднего мозга и спинного мозгасудьбы будут происходить 20,21. Кроме того, РА является легкодоступной и недорогой агент, и использование этого протокола может сэкономить средства на исследования для большинства лабораторий.
В-третьих, в состоянии, представленном здесь, NPC, генерируемые после дифференциации фазы I, могут храниться и проходиться в надлежащих условиях. Криоконсервация с высокой плотностью клеток (Nogt;2 x 106) с помощью Stem-Cellbanker может эффективно уменьшить повреждение клеток, вызванное замораживанием, чтобы получить высокий уровень восстановления. Между тем, NPC, генерируемые в исследовании, могут быть получены с помощью среды N2B27 (49% DMEM/F12' 1% N2 и 48% нейробазальной среды и 2% B27) с плотностью клеток более 5 х 105/см 2. При низкой плотности клеток (менее 0,5 х 105/см 2),NPC, как правило, дифференцировать. Такое криоконсервация клеток и восстановление может принести большое удобство для исследования.
Кроме того, нейробазальная среда имеет важное значение для дифференциации фазы II. Нейробазальная среда разработана специально для длительного обслуживания и созревания нейрональных клеток. Как узнать в N2B27 medium II (Таблица 2), добавление neurobasal среды может лучше поддерживать дифференциацию от NPC в нейроны.
В совокупности мы сообщили об эффективном и недорогом методе дифференциации нейронов от mESCs in vitro, используя стратегии комбинаторного скрининга. Установленный метод очень прост в реализации и подходит для использования большинством лабораторий. Такой оптимизированный метод может быть мощным инструментом для нейробиологии и исследований биологии развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 31501099) и среднего возраста и молодежи Департамента образования провинции Хубэй, Китай (No. 20191104). И, мы благодарим профессора Wensheng Deng на университете науки и технологии Wuhan для обеспечивать линии стволовой клетки мыши зародышевые A2lox.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
