Summary
这里介绍的是一个协议，用于监测蛋白质亨廷顿蛋白的降解，该蛋白与光可转换的荧光素Dendra2有关。
Abstract
蛋白质在细胞内不断合成和降解，以保持平衡。能够监测感兴趣的蛋白质的降解，不仅是了解其生命周期的关键，也是发现蛋白质组网络中的不平衡的关键。此方法演示如何跟踪致病蛋白亨廷顿蛋白的降解。与Dendra2融合的两种亨廷顿蛋白在C.elegans神经系统中表达：一种是生理版本，另一种是含有扩大和致病性的谷氨酰胺。Dendra2是一种光可转换荧光蛋白;在短的紫外线（UV）辐照脉冲下，Dendra2将其激发/发射光谱从绿色切换为红色。与脉冲追逐实验类似，可以监控和量化转换红-Dendra2的周转率，而不管新合成的 green-Dendra2 的干扰。使用基于共体显微镜的，由于C.elegans的光学透明度，可以监测和量化亨廷顿-Dendra2在活体，老化的生物体的降解。神经元亨廷顿蛋白-Dendra2在转换后很快部分退化，并随着时间的推移进一步清除。控制降解的系统缺乏突变亨廷顿蛋白的存在，并且随着老化而进一步受损。同一神经系统内的神经元亚型表现出不同的转液能力，用于亨廷顿-登德拉2。总体而言，监测与Dendra2融合的任何感兴趣的蛋白质，不仅可以提供重要信息，包括其降解和所涉及的蛋白酶网络的玩家，而且可提供有关其位置、贩运和运输的重要信息。
Introduction
生物体的蛋白质组在不断更新。蛋白质根据细胞的生理需求不断降解和合成。一些蛋白质很快被消除，而另一些则寿命更长。使用基因编码的荧光蛋白 （FPs） 时，监测蛋白质动力学是一项更简单、更准确、侵入性更小的任务。FPs以自动催化形式形成，可以融合到任何感兴趣的蛋白质（POI），但不需要酶折叠或需要辅助因子，但氧气1。新一代 FP 最近被设计为在照射时使用确定波长的光脉冲切换颜色。这些光激活的FP（PAFP）允许标记和跟踪POIS，或他们居住的细胞器或细胞，并检查其定量和/或定性参数2。FPs 能够跟踪任何 POI 的移动、方向性、运动速率、扩散系数、移动分数与移动分数、它驻留在一个蜂窝隔间中的时间以及其周转率。对于特定的细胞器，运动和运输，或裂变和融合事件可以确定。对于特定的单元格类型，可以建立单元格的位置、分割速率、体积和形状。至关重要的是，PAFP 的使用允许无需连续可视化，也无需任何新合成探头的干扰即可进行跟踪。细胞和整个生物体的研究已经成功地使用PAFP来解决体内的生物问题，如癌症和转移的发展，细胞骨架的组装或分解，以及RNA-DNA/蛋白质相互作用3。在这份手稿中，光显微镜和PAFP用于在神经退行性疾病的C.elegans模型中发现体内容易聚集的蛋白质亨廷顿蛋白（HTT）的周转率。
此处描述的协议量化了融合蛋白亨廷顿蛋白（HTT-D2）的稳定性和降解性。Dendra2 是第二代单体 PAFP4，它不可逆转地将其发射/激发光谱从绿色切换到红色，以响应紫外线或可见蓝光，其强度增加高达 4，000 倍5，,6。亨廷顿是导致亨廷顿舞蹈症（HD）的蛋白质，这是一种致命的遗传性神经退行性疾病。亨廷顿-1含有一段谷氨酰胺（CAG，Q）。当蛋白质以超过39Q表达时，它误入突变、有毒和致病性蛋白质。突变HTT容易聚集，导致神经元细胞死亡和退化，无论是短寡聚物种或较大的高度结构化淀粉样体7。
线虫是研究衰老和神经退化的模型系统，由于其操作方便性、等基因性、寿命短和光学透明度8。为了研究HTT体内的稳定性，在C.elegans的神经系统中表达了一种融合结构。HTT-D2 转基因含有 25Qs （HTTQ25-D2） 或 97Qs （HTTQ97-D2） 的病理拉伸，在整个线虫的生命周期9中，泛神经表达过度。通过将实时C. elegans接受简短且聚焦的光点，单个神经元被拍照切换，并随着时间的推移跟踪转换的 HTT-D2。为了确定HTT-D2的降解量，将刚转换的HTT-D2的红色信号与确定一段时间后HTT-D2的剩余红色信号进行比较。因此，与生理形态相比，发现亨廷顿蛋白的膨胀和毒性形式时，可以研究亨廷顿素是如何降解的;前神经元或后神经元对Q97与Q25的存在的反应如何不同，尤其是在较长的时间段内;以及蛋白质组菌网络 （PN） 在老化期间的崩溃如何导致降解率的差异。这些结果只描述了一组关于HTT-D2周转率的少量观测结果。然而，与蛋白质聚集和蛋白质结合领域相关的更多生物学问题可以通过这种体内应用加以解决。
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Protocol
1. 表达神经元亨廷顿-登德拉2融合蛋白的C.elegans的一代
- 通过传统的限制性酶消化10、吉布森组装11或任何选择方法，克隆线虫表达载体（即pPD95_75、Addgene #1494）中编码POI的基因。插入启动子，在所需的组织中或在所需的发育阶段驱动表达。将 Dendra2 荧光团（N-或C-终端）与POI一起插入框架中。
- 生成表达聚变构造的转基因C.elegans（例如，通过微注射）12。
注：携带转基因质粒将用作染色体外阵列。构造的集成是没有必要的，但如果需要，可以执行13。在该协议中，C.elegans被微注入一个质粒携带融合结构亨廷顿1-Dendra2（HTT-D2）在泛神经元促进剂Prgef-1的控制之下。C. elegans表达骨干来自克雷斯等人14，第25或Q97的亨廷顿1号从Juenemann等人第15名获得，Dendra2从哈默等人获得。
2. C. elegans 的年龄匹配和维护
- 年龄匹配所有线虫，通过同步碱性次氯酸盐溶液处理17或通过产卵4小时在20°C。对于产卵，将10名成年成人放在新鲜种子线虫生长介质（NGM）板上，在取出前离开4小时。在这个时间跨度下蛋会产生同步线虫。
- 保持实验C.埃利根在线虫生长介质（NGM）板种子与细菌食物来源大肠杆菌OP50，遵循标准线虫养殖18。
- 在20°C下将线虫生长到所需的阶段。对于此协议，所需年龄为第 4 天和 10 天。
注：第4天的年轻人可以通过他们的性腺中蛋的存在和他们的高流动性来识别。年龄10天线虫是后肥，并经历组织恶化和机车下降19。 - 对于第10天线虫，每天经过L4阶段后的第3天，一旦线虫是肥沃的，以避免混合种群。
3. 准备用于成像的显微镜幻灯片
- 在成像当天准备显微镜幻灯片。在微波炉中，在ddH2O中以浓度为3%（w/v）的熔融一般品位的阿加糖。让微冷。
- 切开1 mL移液器尖端，吸气约400μL的融化的藻糖。轻轻地将几滴阿加糖放在干净的玻璃滑梯上，并立即将另一张滑轨放在顶部，确保在两者之间创建细薄的阿加罗斯垫。在轻轻滑动或提起顶部滑轨之前，请晾干。
- 将加湿容器中的气糖垫滑梯放在，以防止其干燥。这些可以在2-3小时内使用。
注：避免在红糖中形成小气泡，因为线虫可能被困在里面。
4. 共体显微镜参数的定义
注：在安装线虫和数据采集之前，请定义共和采集软件上的所有设置。这些设置可以适应所需的成像硬件和软件。
- 打开共和软件并定义激光成像设置。将绿色 Dendra2 的激发/发射光路设置为 486-553 nm，将红色 Dendra2 设置为 580-740 nm。根据荧光团的强度调整两个通道/激光的功率和增益。不要更改数字增益或偏移，将针孔设置为完全打开。
- 定义采集设置：选择顺序通道模式并切换跟踪每帧。将扫描模式设置为帧，帧大小设置为 1，024 x 1，024，线步数为 1。将平均值设置为 2，按均值方法和单向线模式进行平均。将位深度设置为 8 位。
- 定义 Dendra2 转换的多维采集设置。对于转换和漂白，请使用 405 nm 二极管激光器，其功率为 60%。如果可用，请激活安全漂白 GaAsP 以保护探测器。
- 选择两个周期的时间序列，间隔为 0.0 ms，并且正常启动和停止。扫描 1 后开始漂白 2，重复 30 次迭代。当强度降至 50% 时，停止漂白。
- 定义用于转换的采集/像素停留速度（例如，最大值 = 12）和用于捕获快照图像的中等速度（例如，中等 = 5）。
注：此处定义的漂白参数是指南。对于其他 Dendra2 标记的 POIS，必须以经验方式建立激光功率设置和漂白迭代和值。
5.将 C. elegans安装到显微镜幻灯片上
注：如果可能，在共声显微镜设置附近放置一个安装式立体显微镜，并在成像前安装线虫。
- 在阿加罗斯垫对面的玻璃盖幻灯片上，画一个带四个方块的窗口，并加一个永久标记并编号。
- 在阿加罗斯垫中间的 Levamisole 中移液 15 μL。列维米索的浓度会因线虫的年龄而变化：成像第4天线虫使用2mM列维米索;当成像第 10 天线虫使用 0.5 mM levamisole 时。
- 使用线挑将四根线虫转移到液体中。在睫毛选择的帮助下，轻轻地将每个线虫移动到窗口广场。旋转睫毛，使大肠杆菌OP50的任何痕迹被稀释，其荧光背景不会干扰信号采集。
- 等待线虫几乎停止移动，轻轻地将盖滑放在液体顶部，以固定线虫在阿加罗斯垫和盖滑之间的利瓦米索层。
- 将倒置的幻灯片放在共和舞台上，以成像线虫。
6. 绿色 Dendra2 的转换：时间零时的数据采集
注：脉冲追逐实验从不可逆转地将Dendra2融合蛋白从绿色发射荧光团转化为红色荧光蛋白开始。
- 使用显微镜的目镜，在绿色荧光下定位具有 20 倍目标的第一个线虫。聚焦头部或尾部，切换到共聚焦模式。
- 使用 488 nm 蓝色激光开始实时激光扫描，以可视化 EGFP 绿色通道中的绿色 Dendra2（ex/em = 486-553 nm）。选择单个神经元并聚焦它。放大3倍，增加激光束4的目标。
注：每个线虫选择一个神经元。每个神经元将构成一个样本或数据点。 - 查找最大投影平面，根据荧光团的亮度，增加或减少增益或激光功率，以获得颜色范围指示器可识别的饱和且未曝光的图像。定义后，停止扫描。
注意：不要照射样品太久或功率太大，因为用可见的蓝色488 nm光的激发也可以转换Dendra2，尽管速度缓慢，效率较低。 - 在软件中，打开选项卡以选择感兴趣的区域 （ROI），并在所选神经元周围绘制第一个 ROI。定义更大的第二个感兴趣区域，包括线虫的头部，包括第一个 ROI。
- 在漂白设置中，选择要获取、漂白和分析的第一个 ROI。选择要获取和分析但未漂白的第二个 ROI。
- 将扫描速度设置为最大值（即快速像素停留），并开始实验以转换选定的 Dendra2 神经元。
注：实验完成后，获取的图片将产生两个图像：一个在转换前，一个在转换后。对于绿色通道，第一个图像应具有较高的绿色信号，该信号由于绿色 Dendra2 的转换而在第二个图像中减小。对于红色通道，第一个图像应为负数且不显示任何信号，转换后图像中将显示红色信号。如果绿色信号不减小，则未发生转换，应修改设置，如 405 激光功率或迭代次数。如果第一个图像中存在红色信号，则使用的 488 nm 激光功率过高，并且部分绿色 Dendra2 已转换为红色。在这种情况下，应选择新的神经元/线虫。 - 转换后，立即开始使用绿色 561 nm 激光进行实时扫描，以在红色通道中可视化 Dendra2（ex/em = 580-740 nm）。使用范围颜色指示器查找转换神经元的焦点和相应最大投影，以避免过度曝光。
- 快速将扫描速率设置为较低的像素停留速度（例如 5 倍），以更高的分辨率获取两个通道的快照图像。此图像定义为转换后的时间点零 （T0）。
注：转换图像的采集速度可以变化。但是，一旦选择，此速度需要在整个数据收集过程中保持不变。 - 使用可识别的名称和/或数字保存扫描，后跟时间零标签 （T0）。
注：建议还保存转换实验的图像（步骤 6.6），以说明转换前和转换后出现的红色信号不足。
7. 在选定的第二时间点对转换后的红色 Dendra2 进行数据采集的成像
- 要跟踪 Dendra2 随时间而退化，请定义第二个时间点以重新成像相同的线虫/神经元。以实验方法选择第二个时间点，以解决任何相关的生物问题。对于此处描述的协议，Dendra2 在转换后两次图像均在 2 小时 （T2） 和 24 小时 （T24） 。
- 在选定的时间点，使用目镜和红色荧光找到相同的线虫/神经元。
- 打开相应线虫/神经元的 T0 图像，并重新加载/重用图像设置。在获取 T0、T2 和 T24 h 图像时，确保快照的采集设置完全相同。
- 在红色通道中实时扫描，将转换后的红色神经元集中到焦点。由于红色 Dendra2 会随着时间的推移而降级，因此范围指示器将显示不太强烈的最大投影。不要更改任何采集参数，并且以与第一张图像相同的速度（例如 5 倍）获取快照。
- 为了跟踪Dendra2在4小时或更长时间后退化，在转换后拯救线虫。
- 转换和成像四个线虫后立即从显微镜上取下幻灯片。轻轻取下盖玻片，并使用线挑，从 agarose 垫上提起每个线虫。
- 将每个线虫单独放在贴有适当标签和可识别的 NGM 板上。
- 对于第二个时间点，再次将线虫安装到新鲜的红糖垫上，按照第 6 节中的说明继续对转换后的红色 Dendra2 进行成像。
8. 转换的登德拉2的图像分析
注：使用斐济/ImageJ软件20对Dendra2的降解进行分析。
- 打开斐济，然后将 .lsm 文件拖下斐济栏。打开转换后拍摄的 T0 图像以及转换后在所选时间点（T2 或 T24 h）拍摄的相同线虫的图像。
注：要跟踪与Dendra2融合的蛋白质的降解，只需要分析红色通道。 - 从菜单中建立测量参数：分析 |设置测量。选择"面积"和"集成密度"功能。
- 选择使用红色通道获得的图像。从斐济条中选择多边形选择工具。
- 识别 T0 图像上转换的神经元，并使用选择工具在图像周围绘制 ROI。
- 要正确识别神经元的轮廓，请通过从条形图像中选择突出强度阈值 |调整 |阈值。拖动条形光标以描绘阈值，然后使用多边形工具跟踪此区域。为了产生准确的投资回报率，还可以使用绿色通道中所选神经元的轮廓。
- 在红色通道窗口中进行选择后，按"分析| "测量。将显示一个名为"结果"的弹出窗口，其中包括"区域Area"、"IntDen"和"RawIntDen"的 ROI 值。 IntDen
- 对第二个时间点（T2 或 T24 h）的图像执行相同的选择和测量过程。
- 将获取的值复制到电子表格软件中，注意在转换后在 T0 和转换后 T2 或 T24 h 适当记录值。
9. 计算登德拉2降解比率
- 要计算降解比率，请先分配值 1（或 100%）时间从时间点零（即，转换后，当所有红色Dendra2转换仍然存在）的退化时间）。这是由于 T0 的 IntRawDen 值本身而导致的。
- 要计算红色 Dendra2 强度信号随时间而减少和退化，请将第二个时间点（例如 T2 或 T24 h）的 RawIntDen 值除以 T0的 RawIntDen值。结果数字应小于 1。这些值也可以表示为百分比，将 T0 定义为 100%。
- 对转换的每个线虫重复第 7 节。对于 Dendra2 退化的图形表示，使用 y 轴中荧光减减的百分比或比率值绘制散点图或条形图。应用任何所需的统计分析，并在图表上说明。
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Representative Results
通过微注射获得两种线虫菌株，在框架中表达亨廷顿-1蛋白片段，并结合光可转换蛋白Dendra2获得，质粒作为染色体外阵列保存。融合结构从整个老化过程中在整个C.elegans神经系统中表达。在这里，HTT-D2 包含生理 25 多聚聚聚三聚胺拉伸 （HTTQ25-D2，图 1A ） 或完全青素和致病性重复与 97 谷氨酰胺 （HTTQ97-D2，图 1B）.最初，对融合蛋白进行了测试，以确保在紫外线照射后，它从绿色光谱变为红色光谱。HTT-D2 仅在照明区域内从绿色切换到红色。根据紫外脉冲的功率和迭代，并根据激光束通过线虫的角质层的 z 平面和切入，转换了 HTT-D2 的一个定义部分，但并不是所有的。光转换神经元中出现红色信号，与绿色非转换 HTT-D2（图1C，D） 形成。由于激光扫描光子束的精度，可以转换与单个神经元对应的精确 ROI。转换前，当样本在红色通道中兴奋时，看不到红色信号（图2A）。紫外线照射后，绿色信号随着HTT-D2的转换而减弱，红色信号最终出现（图2B）。HTT-D2会随着时间而退化，导致红色HTT-D2（图2C）水平降低，绿色HTT-D2信号可能增加，因为新合成了更多的融合蛋白。由于转换后2小时已显著减少，因此保持了检测和量化HTT-D2降解的间隔。需要注意的是，降解并不是 HTT-D2 转换后可能发生的唯一过程。转换后的HTT-D2可以沿轴孔贩运和运输，导致红色信号减少，而不是由于间隙。然而，由于此处采用的设置以及 2 h 的短时间跨度，未观察到红色信号的传播，可能是因为小 HTT-D2 从 soma 移动到轴孔。此外，转换和成像单个整个神经元母细胞有助于排除同一神经元中HTT-D2扩散的影响，因为所有细胞隔间都同时进行分析。为了研究扩散或运输/贩运，建议获得快速和更高的放大倍率图像，并跟踪感兴趣的蛋白质中更小、可能更移动的分数。还必须注意，在一组实验中，每个动物代表一个生物重复。每个线虫只有一个神经元被成像，每个动物每期成像一次，成像发生在三个会话，这构成了技术重复。三个会议要求动物在每次实验前在新鲜盘子里同步，无论是第4天还是第10天，都允许对线虫施加任何环境变异。三个会话还解释成像设置引起的任何变异（例如，由于实验之间的温度不同而变化的激光功率）。在三届会议期间获得的所有生物复制（至少20只动物）都被视为个别样本，并用于确定统计意义。
在确认两种C.elegans HTT-D2菌株均有效并建立最佳转化参数后，对致病HTT-D2蛋白（即HTTQ97-D2）与其生理相关控制（HTTQ25-D2）的周转率之间的差异进行了调查。首先，观察到不同神经元中HTT-D2的降解（图3）。众所周知，线虫神经系统内神经元的亚型在代谢活性和形态学21上各不相同，可能改变蛋白质组退化和再平衡。将尾部区域的神经元与头部神经元进行比较，发现其活性明显增强（图3A）。这一发现仅适用于HTTQ25-D2，不适用于致病性HTTQ97-D2，这表明PN无法去除含有整个神经系统较长的谷氨酰胺的HTT-D2（图3B）。
为了进一步确认模型系统的行为符合预期，转换实验进行了较长的时间，使细胞的降解途径几乎完全消除感兴趣的蛋白质（图4）。事实上，在转换后，控制HTTQ25-D2 24h的降解明显大于头部神经元的2小时后，尾部神经元的降解程度也明显增加（图4A）。再次，后尾神经元更积极地去除红色HTT-D2，甚至超过增加的时间跨度。在致病的HTTQ97-D2中检测到类似的趋势，红色HTT-D2信号在24小时后略有减少。但是，HTTQ97-D2 的删除不像 HTTQ25-D2 那样容易，尤其是在 24 小时之后。可能只有可溶性HTTQ97-D2分数被有效降解，导致红色信号的初始减少，并且随着时间的推移，其进一步轻微下降。重要的是，在24小时之后有两个神经元群：一个是降解率较高的神经元，另一个是红色HTT-D2信号没有降解，甚至可能增加（图4B）。增加和稳定的信号可能代表已经聚合或持续聚合的物种，由于它们紧密包装的淀粉样蛋白性质，这些物种很难从细胞中清除。这些内含物，只存在于谷氨酰胺拉伸超过40重复阈值，并出现微观作为foci，已被假设积累为沉积物，不容易删除22。红色荧光信号的增加也可能是技术问题（例如，使用错误的采集参数、显微镜设置的性能低于标准或错误的恢复/安装过程）造成的伪影。在较长时间内获取图像时，必须考虑这些变量。
最后，由于神经退行性疾病，如HD在成人生活中表现出来，因此观察到衰老对HTT-D2降解率的影响。在HTT-D2菌株中幼年（第4天）与老（第10天）线虫的头部和尾部区域进行了转换实验（图5）。对于头部神经元，由于HTTQ25-D2和HTTQ97-D2的使用寿命内老化，降解率没有显著变化，可能是因为HTT-D2在整个线虫的生命周期内均被去除。然而，在比较含有病理或生理谷氨酰胺拉伸的旧线虫时，记录了一个非常显著的变化。HTTQ97-D2没有像HTTQ25-D2那样有效降解，这突出了PN无法去除较老线虫中聚合的、可能有毒的亨廷顿蛋白物种（图5A）。同样，观察到尾部神经元的更活跃和显著的周转。与头部神经元一样，与较老的线虫相比，在年轻线虫的尾部神经元中未观察到更强劲的HTTQ25-D2的周转量，在第4天和第10天，退化相等。相反，控制与致病性HTT-D2菌株之间的降解率在幼日4线虫中出现显著变化，在第10天变得更加显著。重要的是，尾部神经元能够应对年轻线虫中的有毒HTTQ97-D2，说明各种伴随的PN机制可能正在作用，以消除HTT-D2（图5B）。总体而言，PN 活性会随着时间的推移而减少，这可能是由于老化和聚合的存在造成的有害影响。
图1：C.埃利根斯表示在神经系统中与Dendra2融合的亨廷顿-1。（A） 年轻，第4天C.elegans泛神经元表达亨廷顿-1含有25谷氨酰胺，融合到Dendra2在其未转换的绿色激发/排放状态。比例线 = 100 μm. 内集显示头部（顶部）和尾部（底部）神经元的放大图像。插入比例杆 = 10 μm. （B） 年轻， 第 4天 C. elegans泛神经元表达亨廷顿 exon-1 含有 97 谷氨酰胺， 融合到 Dendra2 在其未转换的绿色激发/发射状态.比例线 = 100 μm. 内集显示尾部（顶部）和头部（底部）神经元的放大图像，以及第 7 天线虫（最右）的头部。插入比例线 = 10 μm. 白色箭头指向 HTTQ97-D2 foci，描绘亨廷顿聚合。（C） 通道合并HTTQ25-D2图像与头部区域的转换。框表示被紫外线照射的整个 C. elegans部分。比例线 = 100 μm. 插图显示 Dendra2 发射在 488 nm （顶部， 绿色） 和 561 nm（底部，红色）。比例线 = 10 μm. （D） 通道将 HTTQ97-D2 的通道合并图像与头部区域的转换。比例线 = 100 μm. 框表示整个C. elegans被紫外线照射的部分。插入显示 Dendra2 发射在 488 nm（顶部，绿色）和在 561 nm（底部，红色）。比例线 = 10 μm.请单击此处查看此图的较大版本。
图2：转换后的红色HTT-D2在单个神经元中随着时间的推移而减少。HTTQ25-D2 的尾部神经元。两个神经元同时显示和独立光转换。图像按顺序描绘了三个时间点：辐照前（前）（前），（B）照射（转换）后，照射后（转换）和辐照后（照射后）2小时。顶部面板（绿色通道）表示在 486-553 nm 激励/发射时收集的 HTT-D2 信号。感兴趣的白色区域描绘了被辐照的神经元。中间面板（红色通道）显示在 580-740 nm 激励/发射时收集的转换 HTT-D2 信号。底部面板是两个通道的合并。所有图像的缩放栏 = 5 μm。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：头部和尾部神经元表现出不同的降解率。柱条图显示转换时红色强度相对于初始值的百分比（即 100%）。转换后的红色Dendra2信号在2小时间隔内整体下降，因为HTT-D2在C.elegans的神经元内退化。在线虫的神经系统神经元亚型表现出不同的降解率，尾部神经元表现出更活跃的周转，但只在线虫携带非致病性多糖胺拉伸。（A） HTTQ25-D2 头与尾部神经元降解的定量。均值 = SD，未配对双尾学生 t 测试。N = 每个区域成像的 23-28 个样本/线虫，*P < 0.05。（B） HTTQ97-D2头部与尾部神经元降解的定量。均值 = SD，未配对双尾学生 t 测试。N = 23-28 样本/线虫每个区域成像，ns = 无显著。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：HTTQ97-D2在24小时后未明显清除。柱条图显示转换时红色强度相对于初始值的百分比（即 100%）。转换后的红色Dendra2信号随着HTT-D2在C.elegans神经元内退化而减少。HTT-D2表现出不同的降解率。即使在转换后较长时间，致病性HTT-D2不能删除相比，其健康控制。（A） 在头部和尾部神经元转换后（2小时和24小时）两个时间点对HTTQ25-D2的降解率进行量化。均值 = SD，方差的双向分析 （ANOVA）。N = 每个时间/区域成像的 21-28 个样本/线虫，*P < 0.05，***P < 0.0001。（B） 在头部和尾部神经元转换后两个时间点（2 小时和 24 小时）对 HTTQ97-D2 的降解速率进行量化。均值 = SD，方差的双向分析 （ANOVA），然后是 Tukey 的多重比较后临时测试。 N = 21-28 样本/线虫，每个时间/区域成像，ns = 无显著。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：表达致病性HTT-D2的老线虫和幼线虫没有有效地降解它。柱条图显示转换时红色强度相对于初始值的百分比（即 100%）。转换后的红色Dendra2信号随着HTT-D2在神经元内退化而减少。随着线虫的老化，其降解致病性HTT-D2的能力在其神经系统中进一步受损。（A） 与年龄匹配的HTTQ97-D2线虫相比，幼年（第4天）和老（第10天）头神经元的降解率的定量化。均值 = SD，方差的双向分析 （ANOVA）。N = 23-28 样本/线虫，每株/天成像，***P < 0.0001。（B） 与年龄匹配的HTTQ97-D2线虫相比，幼年（第4天）和老（第10天）HTTQ25-D2线虫的尾部神经元转化后降解率2小时。均值 = SD，方差的双向分析 （ANOVA），然后是 Tukey 的多重比较后临时测试。N = 每株/天成像的 23-28 个样本/线虫，*P < 0.05，***P < 0.001，***P < 0.0001。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
要理解蛋白质的功能，了解其合成、位置和降解非常重要。随着新型、稳定、明亮的 FP 的发展，可视化和监控 POIs 变得更加简单和高效。基因表达聚变PAFP，如Dendra2具有独特的定位，可以研究POI的稳定性。当暴露在紫蓝色光下时，Dendra2在保存的氨基酸三合体内的精确位置断裂。荧光团经历了一个小的结构变化，导致光谱从绿色到红色23的完全转移。这种转变允许检测和监测与Dendra2相关的任何POI。事实上，这些聚变构造首先被用来创建一个C.elegans记者应变来研究体内的泛素蛋白酶体系统。Dendra2还被用来了解选择性神经元亚型的脆弱性及其处理扩大的多聚葡萄糖胺蛋白24的能力，或监测自噬诱导在运动神经元疾病模型25。
这里提出了一个协议，以监测体内亨廷顿蛋白的降解，亨廷顿蛋白是一种与疾病相关的容易聚集的蛋白质，以非侵入性的方式出现。在成功生成HD神经元C.elegans模型，以泛神经元表达HTT-D2后，对扩展和致病HTT与生理对应物的降解率进行了量化。在神经元亚型之间、年轻线虫和老年线虫之间以及PN处理有毒谷氨酰胺负荷的能力之间观察到显著差异。该技术也可以应用于跟踪亨廷顿蛋白的位置和运动，以及它的命运时，对PN的扰动介绍。siRNA敲掉抑制蛋白酶体活性的关键伴生或化合物的给药，可以发现这些成分在容易聚集的蛋白质中的功能和重要性：例如，PN是否激活特定节点以弥补缺陷26。与正常衰老相比，它也可以解释疾病造成的有害影响。
虽然可以使用这种技术解决许多不同的问题，但一旦生成了所需的模型，必须建立正确的转换和检测参数才能获得可靠的数据。此外，确定转化设置，允许足够的活性蛋白产生，没有光漂白或光毒性，没有不希望的转换。此外，对于特定模型系统内的每一个已研究的蛋白质，无论是外体还是体内，都有必要在实验中建立足够大的时间段，以便准确量化降解率。
Dendra2 与其他 PAFP 相比具有一系列优势：1） 它是单体且非常明亮;2）具有高对比度光转换和稳定光转换信号;3） 它可以通过蓝色 488 nm 激光以低光毒性激活，这是大多数共和硬件设置的一部分;4）它在37°C时有效成熟，用于哺乳动物细胞;5）它没有任何毒性副作用时，表达长时间23，27;23,和 6） 系统不受生物体或细胞之间或内部表达水平变化的影响，因为只有转换前和转换后 Dendra2 信号的比例是量化的。所有列出的属性使Dendra2成为实时跟踪蛋白质动力学和监测细胞命运的理想荧光团。
不幸的是，Dendra2融合蛋白存在荧光蛋白标签的一些常见局限性。该构造是一个在生物系统中经常通过实验过度表达的嵌合物种，尽管内源表达可以通过基因组工程建立。Dendra2本身的降解率可能影响目标蛋白的降解，尽管它被描述为一种高度稳定、寿命长的蛋白质27。此外，Dendra2不适合跟踪具有非常快的周转率的蛋白质，因为它可能没有时间进行自己的适当成熟。最后，405 nm 激光器（不常见）是高效拍照的首选，尽管它们对样品毒性更高。事实上，更少的光毒性蓝光可用于可视化绿色Dendra2，并在激光功率处于高强度时进行转换。应始终牢记此特定功能，因为长时间暴露会产生不需要的转换和潜在的错误测量。最后，将 Dendra2 与绿色或红色荧光泳结合使用可能会有问题。然而，许多不同的PAFP可以同时研究几种蛋白质的动力学。
利用Dendra2和其他PAFP的实验与光漂白（FRAP）和放射性脉冲追逐标签技术后荧光恢复有关。在 FRAP 环境中，无法区分重新进入 ROI 的蛋白质和新形成的荧光蛋白，因此需要不断监测和可视化样品。使用Dendra2，生成两个可明显区分的种群，可以随着时间的推移独立观察，因此可以跟踪和量化被替换和新合成的绿色Dendra2的"非活动"形式。Dendra2也是超分辨率显微镜中有用的探针，如总内部反射荧光显微镜（TIRF）28和光激活定位显微镜（PALM）29。29在不久的将来，这种进步将允许更好地定位和潜在的单分子跟踪任何POI，从而能够发现样品内部和样本之间的更细微的差异，并最终产生关于生物系统内任何POI的生命和命运的新信息。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢DFG（KI-1988/5-1到JK，神经库博士奖学金由神经治疗卓越集群到M MLP）的资金。我们还感谢柏林莱布尼茨分子药理学研究所（FMP）的成像核心设施提供成像设置。此外，我们要感谢迪奥戈·费莱西亚诺，他建立了Dendra2系统，并提供了指导。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
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