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Biology

En la cuantificación vivo de la rotación de proteínas en el envejecimiento C. Elegans usando Dendra fotoconvertible2

Published: June 13, 2020 doi: 10.3791/61196
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Biology and Chemistry, University of Bremen

Summary

Aquí se presenta un protocolo para monitorear la degradación de la proteína huntingtina fusionada con el fluoróforo fotoconvertible Dendra2.

Abstract

Las proteínas se sintetizan y degradan constantemente dentro de una célula para mantener la homeostasis. Ser capaz de monitorear la degradación de una proteína de interés es clave para entender no sólo su ciclo de vida, sino también para descubrir desequilibrios en la red de proteostasis. Este método muestra cómo rastrear la degradación de la huntingtina de proteína causante de la enfermedad. Dos versiones de huntingtina fusionadas con Dendra2 se expresan en el sistema nervioso C. elegans: una versión fisiológica o una con un tramo expandido y patógeno de glutaminas. Dendra2 es una proteína fluorescente fotoconvertible; tras un corto pulso de irradiación ultravioleta (UV), Dendra2 cambia sus espectros de excitación/emisión de verde a rojo. Al igual que un experimento de persecución de pulsos, el volumen de negocios del rojo-Dendra2 convertido puede ser monitoreado y cuantificado, independientemente de la interferencia de green-Dendra2 recién sintetizado. Utilizando microscopía a base de confocal y debido a la transparencia óptica de C. elegans,es posible monitorear y cuantificar la degradación de la huntingtina-Dendra2 en un organismo vivo y envejecido. La huntingtina-Dendra2 neuronal se degrada parcialmente poco después de la conversión y se elimina aún más con el tiempo. Los sistemas que controlan la degradación son deficientes en presencia de huntingtina mutada y se ven afectados aún más por el envejecimiento. Los subtipos neuronales dentro del mismo sistema nervioso exhiben diferentes capacidades de rotación para huntingtina-Dendra2. En general, el seguimiento de cualquier proteína de interés fusionada con Dendra2 puede proporcionar información importante no sólo sobre su degradación y los actores de la red de proteostasis involucrados, sino también sobre su ubicación, tráfico y transporte.

Introduction

El proteome de un organismo vivo se está renovando constantemente. Las proteínas se degradan y sintetizan continuamente de acuerdo con la demanda fisiológica de una célula. Algunas proteínas se eliminan rápidamente, mientras que otras son de vida más larga. La monitorización de la dinámica de proteínas es una tarea más simple, precisa y menos invasiva cuando se utilizan proteínas fluorescentes codificadas genéticamente (OP). LosFP se forman autocatalíticamente y se pueden fusionar con cualquier proteína de interés (POI), pero no requieren que las enzimas se doblen o necesiten cofactores salvo oxígeno1. Recientemente se ha diseñado una nueva generación de FPs para cambiar de color tras la irradiación con un pulso de luz de longitud de onda determinada. Estos FPs fotoactivables (PAFP) permiten el etiquetado y seguimiento de PDI, o de los orgánulos o células en los que residen, y examinar sus parámetros cuantitativos y/o cualitativos2. Los FPs permiten rastrear el movimiento de cualquier PDI, la direccionalidad, la tasa de locomoción, el coeficiente de difusión, las fracciones móviles frente a las inmóviles, el tiempo que reside en un compartimiento celular, así como su tasa de rotación. Para orgánulos específicos, se pueden determinar la locomoción y el transporte, o eventos de fisión y fusión. Para un tipo de celda determinado, se puede establecer la posición, la tasa de división, el volumen y la forma de una celda. Fundamentalmente, el uso de PAFP permite el seguimiento sin visualización continua y sin interferencia de cualquier sonda recién sintetizada. Los estudios tanto en células como en organismos enteros han empleado con éxito PAFP para abordar cuestiones biológicas in vivo, como el desarrollo de cáncer y metástasis, montaje o desmontaje del citoesqueleto, e interacciones ARN-ADN/proteína3. En este manuscrito, la microscopía de luz y los PAFP se utilizan para descubrir las tasas de rotación de la proteína huntingtina propensa a la agregación (HTT) in vivo en un modelo C. elegans de enfermedad neurodegenerativa.

El protocolo descrito aquí cuantifica la estabilidad y degradación de la proteína de fusión huntingtina-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 es un PAFP monomérico de segunda generación4 que cambia irreversiblemente sus espectros de emisión/excitación de verde a rojo en respuesta a la luz UV o azul visible, con un aumento en su intensidad de hasta 4.000 veces5,6. La huntingtina es la proteína responsable de causar la enfermedad de Huntington (EH), un trastorno neurodegenerativo hereditario fatal. Huntingtin exon-1 contiene un tramo de glutaminas (CAG, Q). Cuando la proteína se expresa con más de 39T, se desmoría en una proteína mutante, tóxica y patógena. El HTT mutante es propenso a la agregación y conduce a la muerte y degeneración de las células neuronales, ya sea como especies oligoméricas cortas o como amiloides altamente estructurados más grandes7.

El nematodo es un sistema modelo para el estudio del envejecimiento y la neurodegeneración gracias a su facilidad de manipulación, naturaleza isogénica, corta vida útil, y su transparencia óptica8. Para estudiar la estabilidad de HTT in vivo, se expresó una construcción de fusión en el sistema nervioso de C. elegans. Un transgén HTT-D2 que contiene un tramo fisiológico de 25Q (HTTQ25-D2) o un tramo patológico de 97Qs (HTTQ97-D2) está sobreexpresado pan-neuronalmente a lo largo de la vida útil del nematodo9. Al someter a C. elegans en vivo a un punto de luz breve y centrado, una sola neurona es fotointerruptora y el HTT-D2 convertido es rastreado con el tiempo. Para establecer la cantidad de HTT-D2 degradada, la diferencia entre la señal roja del HTT-D2 recién convertido se compara con la señal roja restante de HTT-D2 después de un período de tiempo determinado. Por lo tanto, es posible investigar cómo la huntingtina se degrada cuando se encuentra en su forma expandida y tóxica en comparación con su forma fisiológica; cómo las neuronas anteriores o posteriores responden de manera diferente a la presencia de Q97 frente a Q25, especialmente durante períodos de tiempo prolongados; y cómo el colapso de la red de proteostasis (PN) durante el envejecimiento contribuye a las diferencias en las tasas de degradación. Estos resultados sólo describen un pequeño conjunto de observaciones sobre el volumen de negocios de HTT-D2. Sin embargo, muchas más preguntas biológicas relevantes tanto para el campo de la agregación de proteínas como para la proteostasis pueden abordarse con esta aplicación in vivo.

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Protocol

1. Generación de C. elegans que expresan la proteína de fusión neuronal Huntingtin-Dendra2

  1. Clonar el gen que codifica el PDI en un vector de expresión de nematodos (es decir, pPD95_75, Addgene #1494), por digestión de enzima de restricción tradicional10,ensamblaje Gibson11o cualquier método de elección. Inserte un promotor para impulsar la expresión en el tejido deseado o en la etapa de desarrollo deseada. Inserte el fluoróforo Dendra2 en N- o C-terminalmente en el marco con el PDI.
  2. Generar C. elegans transgénicos que expresen la construcción de fusión (por ejemplo, a través de la microinyección)12.
    NOTA: El plásmido que lleva el transgén permanecerá como una matriz extracromosomal. La integración de la construcción no es necesaria, pero se puede realizar si se desea13. En este protocolo, C. elegans fueron microinyecidos con un plásmido que lleva la construcción de fusión huntingtin exón 1-Dendra2 (HTT-D2) bajo el control del promotor pan-neuronal Prgef-1. La columna vertebral de la expresión C. elegans se obtuvo de Kreis et al.14, el exón huntingtina 1 con Q25 o Q97 se obtuvo de Juenemann et al.15, y Dendra2 se obtuvo de Hamer et al.16.

2. Coincidencia de edad y mantenimiento de C. elegans

  1. La edad coincide con todos los nematodos mediante la sincronización con el tratamiento de solución de hipoclorito alcalino17 o a través de la puesta de huevos durante 4 h a 20 oC. Para la puesta de óvulos, coloque 10 adultos gravidos en una placa de medios de crecimiento de nematodos recién sembrados (NGM) y déjela durante 4 horas antes de retirarla. Los huevos puestos en este intervalo de tiempo darán lugar a nematodos sincronizados.
  2. Mantener los C. elegans experimentales en placas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con la fuente de alimentos bacterianos E. coli OP50, después de la cría de nematodos estándar18.
  3. Cultivar nematodos a 20oC hasta la etapa deseada. Para este protocolo, las edades requeridas son los días 4 y 10.
    NOTA: Los adultos jóvenes en el día 4 pueden ser identificados por la presencia de huevos en sus gónadas y su alta movilidad. Los 10 nematodos del día son post-fértiles, y sufren deterioro de los tejidos y deterioro de la locomotora19.
  4. Para el día 10 nematodos, paso diario después de la etapa L4 en el día 3, una vez que los nematodos son fértiles, para evitar una población mixta.

3. Preparación de diapositivas de microscopía para imágenes

  1. Prepare las diapositivas de microscopía el día de la toma de imágenes. En un microondas, derretir la agarosa de grado general a una concentración de 3% (p/v) en ddH2O. Dejar enfriar ligeramente.
  2. Cortar la punta de una punta de pipeta de 1 ml y aspirar aproximadamente 400 l de agarosa derretida. Coloque suavemente unas gotas de agarosa en un portaobjetos de vidrio limpio e inmediatamente coloque otra diapositiva en la parte superior, asegurándose de que se crea una almohadilla delgada de agarosa entre los dos. Dejar secar antes de deslizar suavemente o levantar la corredera superior.
  3. Coloque los portaobjetos de agarosa en un recipiente humidificado para evitar que se sequen. Estos se pueden utilizar dentro de 2-3 h.
    NOTA: Evite la formación de pequeñas burbujas en la agarosa, ya que los nematodos pueden quedar atrapados en su interior.

4. Definición de parámetros del microscopio confocal

NOTA: Antes de montar los nematodos y la adquisición de datos, defina todos los ajustes en el software de adquisición confocal. La configuración se puede adaptar al hardware de imágenes y al software de su elección.

  1. Abra el software confocal y defina la configuración de imágenes láser. Establezca el camino de luz para excitación/emisión para Dendra2 verde a 486-553 nm y para Dendra2 rojo a 580-740 nm. Ajuste la potencia y la ganancia de ambos canales/láseres de acuerdo con la intensidad del fluoróforo. No cambie la ganancia digital o el desplazamiento y ajuste el agujero como completamente abierto.
  2. Defina la configuración de adquisición: seleccione un modo de canal secuencial y cambie la pista de cada fotograma. Establezca el modo de escaneo como fotograma y el tamaño del fotograma como 1.024 x 1.024, con un paso de línea de 1. Establezca el promedio en 2, y el promedio por el método medio y el modo de línea unidireccional. Establezca la profundidad de bits en 8 bits.
  3. Defina la configuración de adquisiciones multidimensionales para la conversión de Dendra2. Para la conversión y el blanqueo, utilice el láser de diodo de 405 nm establecido en un 60% de potencia de energía. Si está disponible, active el GaAsP de blanqueo seguro para proteger los detectores.
  4. Seleccione una serie temporal de dos ciclos, con un intervalo de 0,0 ms en el medio, y el inicio y la parada normales. Comience el blanqueo después del escaneo 1 de 2 y repita para 30 iteraciones. Deja de blanquear cuando la intensidad baje al 50%.
  5. Defina la velocidad de adquisición/permanencia de píxeles como rápida (p. ej., máximo de 12) para la conversión y la velocidad media (p. ej., medio 5) para capturar una imagen de ajuste.
    NOTA: Los parámetros de blanqueo definidos aquí son pautas. Para otros PDI etiquetados de Dendra2, los ajustes de potencia láser y las iteraciones y valores de blanqueo deben establecerse empíricamente.

5. Montaje de C. elegans en diapositivas de microscopía

NOTA: Si es posible, coloque un estereomicroscopio de montaje cerca de la configuración del microscopio confocal y monte los nematodos justo antes de la toma de imágenes.

  1. En la cubierta de vidrio deslice en el lado opuesto de la almohadilla de agarosa, dibuje una ventana con cuatro cuadrados con un marcador permanente y numérelos.
  2. Pipetear 15 l de levamisol en el centro de la almohadilla de agarosa. La concentración de levamisol variará según la edad del nematodo: Cuando el día de toma de imágenes 4 nematodos utilizan 2 mM de levamisol; cuando el día 10 nematodos utilizan 0,5 mM de levamisole.
  3. Transfiera cuatro nematodos al líquido usando un pico de alambre. Con la ayuda de un pico de pestañas, mueva suavemente cada nematodo individual a un cuadrado de ventana. Gire la pestaña para que cualquier rastro de E. coli OP50 se diluya y su fondo fluorescente no interfiera con la adquisición de la señal.
  4. Espere a que los nematodos casi dejen de moverse y coloque suavemente un resbalón de cubierta en la parte superior del líquido para inmovilizar los nematodos en la capa de levamisol entre la almohadilla de agarosa y el resbalón de la cubierta.
  5. Coloque la diapositiva invertida en la etapa confocal para tomar una imagen de los nematodos.

6. Conversión de Dendra2 verde: Adquisición de datos en el momento cero

NOTA: Los experimentos de persecución de pulsos comienzan convirtiendo irreversiblemente la proteína de fusión Dendra2 de un fluoróforo emisor verde a uno rojo.

  1. Usando el ocular del microscopio, localice el primer nematodo con un objetivo de 20x bajo fluorescencia verde. Concéntrese en la cabeza o la cola y cambie al modo confocal.
  2. Comience a escanear con láser en vivo con el láser azul de 488 nm para visualizar el Dendra2 verde en el canal verde EGFP (ex/em a 486-553 nm). Seleccione una sola neurona y concéntrela. Zoom 3x y aumentar el objetivo del rayo láser4.
    NOTA: Seleccione una neurona por nematodo. Cada neurona constituirá una muestra o punto de datos.
  3. Encuentra el plano de proyección máximo y, de acuerdo con el brillo del fluoróforo, aumenta o disminuye la ganancia o la potencia láser para obtener una imagen saturada pero no sobreexpuesta identificable por el indicador de rango de color. Una vez definido esto, detenga el escaneo.
    NOTA: No irradiar la muestra durante demasiado tiempo o con demasiada potencia, ya que la excitación con luz azul visible de 488 nm también puede convertir Dendra2, aunque lenta y menos eficientemente4.
  4. En el software, abra la pestaña para seleccionar las regiones de interés (ROI) y dibuje un primer ROI alrededor de la neurona seleccionada. Defina una segunda región de interés más grande que abarque la cabeza del nematodo e incluya el primer ROI.
  5. En la configuración de blanqueo, seleccione el primer ROI que se adquirirá, blanquea y analizará. Seleccione el segundo ROI que se adquirirá y analizará, pero no se blanquee.
  6. Establezca la velocidad de escaneo al máximo (es decir, morar rápidamente los píxeles) e inicie el experimento para convertir las neuronas Dendra2 seleccionadas.
    NOTA: Una vez realizado el experimento, la imagen adquirida dará como resultado dos imágenes: una antes y otra después de la conversión. Para el canal verde, la primera imagen debe tener una señal verde más alta que disminuya en la segunda imagen debido a la conversión de la Dendra2 verde. Para el canal rojo, la primera imagen debe ser negativa y no mostrar ninguna señal, con una señal roja que aparece en la imagen de conversión posterior. Si la señal verde no disminuye, la conversión no se produjo y los ajustes, como la potencia láser 405 o el número de iteraciones, deben modificarse. Si hay una señal roja en la primera imagen, entonces la potencia láser de 488 nm utilizada era demasiado alta y una parte del Dendra2 verde ya se convirtió en rojo. En este caso, se debe seleccionar una nueva neurona/nematodo.
  7. Inmediatamente después de la conversión, comience a escanear en vivo con el láser verde de 561 nm para visualizar Dendra2 en el canal rojo (ex/em a 580-740 nm). Encuentre el enfoque y la proyección máxima respectiva de la neurona convertida utilizando el indicador de color de rango para evitar la sobreexposición.
  8. Ajuste rápidamente la velocidad de escaneo a una velocidad de permanencia de píxeles más baja (por ejemplo, 5x) y adquiera una imagen instantánea de ambos canales a una resolución más alta. Esta imagen se define como punto de tiempo cero (T0) después de la conversión.
    NOTA: La velocidad de adquisición de la imagen convertida puede variar. Sin embargo, una vez elegida, esta velocidad debe mantenerse constante durante toda la recopilación de datos.
  9. Guarde el análisis con un nombre y/o número identificables, seguido de la etiqueta de tiempo cero (T0).
    NOTA: Es aconsejable guardar también la imagen del experimento de conversión (paso 6.6) para ilustrar la falta de señal roja antes de la conversión y su apariencia después.

7. Imágenes de Dendra2 rojo convertido para la adquisición de datos en un segundo punto de tiempo seleccionado

  1. Para realizar un seguimiento de la degradación de Dendra2 a lo largo del tiempo, defina un segundo punto de tiempo para volver a crear una imagen del mismo nematodo/neurona. Seleccione el segundo punto de tiempo experimentalmente para abordar cualquier pregunta biológica pertinente. Para el protocolo descrito aquí, Dendra2 se crea una imagen tanto en 2 h (T2) como en 24 h (T24) después de la conversión.
    1. En el punto de tiempo seleccionado, busque el mismo nematodo/neurona con el uso del ocular y la fluorescencia roja.
    2. Abra la imagen T0 del nematodo/neurona respectivo y vuelva a cargar/reutilizar la configuración de la imagen. Asegúrese de que la configuración de adquisición de la instantánea sea exactamente la misma al adquirir las imágenes T0, T2 y T24 h.
    3. Escaneando en vivo en el canal rojo, pon la neurona roja convertida en el foco. Debido a que el Dendra2 rojo se degrada con el tiempo, el indicador de rango mostrará una proyección máxima menos intensa. No cambie ningún parámetro de adquisición y obtenga una instantánea a la misma velocidad (por ejemplo, 5x) que la primera imagen.
  2. Para rastrear la degradación de Dendra2 después de 4 h o más, rescata los nematodos después de la conversión.
    1. Retire la diapositiva del microscopio inmediatamente después de convertir e imágenes de los cuatro nematodos. Retire suavemente el cubreobjetos y, con el uso de un pico de alambre, levante cada nematodo de la almohadilla de agarosa.
    2. Coloque cada nematodo individualmente en una placa NGM debidamente etiquetada e identificable.
    3. Para el segundo punto de tiempo, monte el nematodo de nuevo en una almohadilla de agarosa fresca y proceda con la toma de imágenes del Dendra2 rojo convertido siguiendo las instrucciones de la sección 6.

8. Análisis de imagen de Dendra2 convertido

NOTA: El análisis de la degradación de Dendra2 se realiza con el software Fiji/ImageJ20.

  1. Abra Fiji y arrastre y suelte el archivo .lsm en la barra de Fiji. Abra la imagen T0 tomada justo después de la conversión y la imagen del mismo nematodo tomada en el punto de tiempo seleccionado después de la conversión (T2 o T24 h).
    NOTA: Para rastrear la degradación de la proteína de interés fusionada con Dendra2 sólo es necesario analizar el canal rojo.
  2. Establecer los parámetros de medición desde el menú: Analizar ? Establecer medidas. Seleccione las funciones Area y Integrated Density.
  3. Seleccione la imagen obtenida con el canal rojo. Seleccione la herramienta Selección de polígonos en la barra de Fiji.
  4. Identifique la neurona convertida en la imagen T0 y dibuje un ROI a su alrededor utilizando la herramienta de selección.
    1. Para identificar correctamente los contornos de la neurona, resalte los umbrales de intensidad seleccionando en la barra Imagen . Ajustar ? Umbral. Arrastre el cursor de la barra para delinear el umbral y realizar un seguimiento alrededor de esta área con la herramienta polígono. Para generar un ROI preciso, también es posible utilizar el contorno de la neurona seleccionada desde el canal verde.
  5. Una vez realizada la selección en la ventana roja del canal, pulse Analizar . Medir. Aparecerá una ventana emergente denominada Resultados e incluirá los valores de ROI para Area, IntDeny RawIntDen.
  6. Realice el mismo proceso de selección y medición para la imagen del segundo punto de tiempo (T2 o T24 h).
  7. Copie los valores obtenidos en un software de hoja de cálculo, teniendo cuidado de registrar adecuadamente los valores en T0 después de la conversión, y en T2 o T24 h después de la conversión.

9. Cálculo de la relación de degradación de Dendra2

  1. Para calcular la relación de degradación, asigne primero un valor de 1 (o 100%) para cronometro la degradación desde el punto de tiempo cero (es decir, justo después de la conversión, cuando todo el Dendra2 rojo convertido todavía está presente). Esto resulta de dividir el valor de IntRawDen de T0 por sí mismo.
  2. Para calcular la reducción de la señal de intensidad de Dendra2 roja a lo largo del tiempo y la degradación, divida el valor de RawIntDen del segundo punto de tiempo (por ejemplo, T2 o T24 h) por el valor de RawIntDen de T0. El número resultante debe ser menor que 1. Estos valores también se pueden expresar como porcentajes, definiendo T0 como 100%.
  3. Repita la sección 7 para cada nematodo convertido. Para una representación gráfica de la degradación de Dendra2, trace un gráfico de dispersión o gráfico de barras con el porcentaje o los valores de relación de disminución de fluorescencia obtenidos en el eje y. Aplique cualquier análisis estadístico deseado e ilustre en el gráfico.

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Representative Results

Dos cepas de nematodos que expresan el fragmento de proteína huntingtina exon-1 en marco con la proteína fotoconvertible Dendra2 se obtuvieron mediante microinyección y los plásmidos se mantuvieron como una matriz extracrosómica. La construcción de fusión se expresó en todo el sistema nervioso de C. elegans desde el desarrollo durante el envejecimiento. Aquí, HTT-D2 contenía el estiramiento fisiológico de 25 poliglutaminas (HTTQ25-D2, Figura 1A) o una repetición totalmente penetrante y patógena con 97 glutaminas (HTTQ97-D2, Figura 1B). Inicialmente la proteína de fusión fue probada para asegurarse de que cambiaba de su espectro verde a su espectro rojo tras la irradiación UV. HTT-D2 cambió con éxito de verde a rojo exclusivamente dentro de la región iluminada. De acuerdo con la potencia y las iteraciones del pulso UV, y dependiendo del plano z y la penetración del rayo láser a través de la cutícula del nematodo, se convirtió una porción definida de HTT-D2, pero no todo. Una señal roja apareció dentro de las neuronas fotoconvertidas, colocando con el verde no convertido HTT-D2 (Figura 1C,D). Debido a la precisión de los haces de fotones de escaneo láser fue posible convertir un ROI preciso correspondiente a una sola neurona. Antes de la conversión, ninguna señal roja era visible cuando la muestra se excitaba en el canal rojo (Figura 2A). Tras la irradiación UV, la señal verde disminuyó como HTT-D2 se convirtió y finalmente apareció una señal roja(Figura 2B). HTT-D2 se degradó entonces con el tiempo, lo que resultó en una reducción en los niveles de HTT-D2 rojo(Figura 2C)y un posible aumento de la señal HTT-D2 verde, ya que se recién se sintetizó más proteína de fusión. Debido a que una disminución significativa ya era prominente a las 2 horas después de la conversión, se mantuvo este intervalo para detectar y cuantificar la degradación de HTT-D2. Es importante tener en cuenta que la degradación no es el único proceso que puede ocurrir después de la conversión de HTT-D2. El HTT-D2 convertido podría ser traficada y transportada a lo largo de axones, lo que resulta en una disminución de la señal roja no debido a la autorización. Sin embargo, con los ajustes empleados aquí y durante el corto lapso de tiempo de 2 h, no se observó la propagación de la señal roja, posiblemente debido al hecho de que el pequeño HTT-D2 se movió del soma al axón. Además, la conversión e imágenes de un solo soma neuronal entero ayudó a excluir los efectos de la difusión de HTT-D2 dentro de la misma neurona, porque todos los compartimentos celulares estaban siendo analizados simultáneamente. Para estudiar tanto la difusión como el transporte/tráfico es aconsejable obtener imágenes de aumento rápidas y más altas y rastrear una fracción más pequeña y posiblemente más móvil de la proteína de interés. También es importante tener en cuenta que dentro de un conjunto de experimentos, cada animal representó una repetición biológica. Sólo se hizo una imagen de una neurona por nematodo, se hizo una imagen de cada animal una vez por sesión y se produjeron imágenes durante tres sesiones, lo que constituyó repeticiones técnicas. Las tres sesiones requerían que los animales se sincronizaran en placas frescas antes de cada experimento, ya sea en el día 4 o el día 10, permitiendo cualquier variabilidad ambiental que se imponga a los nematodos. Tres sesiones también explican cualquier variabilidad derivada de la configuración de imágenes (por ejemplo, la potencia del láser varía debido a una temperatura diferente entre experimentos). Todas las réplicas biológicas obtenidas durante las tres sesiones (un mínimo de 20 animales) se consideraron muestras individuales y se utilizaron para establecer significación estadística.

Después de confirmar que ambas cepas de C. elegans HTT-D2 eran eficaces y establecer los parámetros óptimos de conversión, se investigaron las diferencias entre la rotación de una proteína HTT-D2 causante de la enfermedad (es decir, HTTQ97-D2) en comparación con su control fisiológicamente relevante (HTTQ25-D2). En primer lugar, se observó la degradación de HTT-D2 en diferentes neuronas (Figura 3). Se sabe que los subtipos de neuronas dentro del sistema nervioso del nematodo varían en su actividad metabólica y morfología21,posiblemente haciendo una diferencia en la degradación y reequilibrio del proteomo. Las neuronas de la región de la cola se compararon con las de la cabeza y se encontró que son significativamente más activas(Figura 3A). Este hallazgo sólo era válido para HTTQ25-D2 y no para HTTQ97-D2 patógeno, lo que sugiere que el PN no pudo eliminar HTT-D2 que contenía tramos de glutamina más largos en todo el sistema nervioso (Figura 3B).

Para confirmar aún más que el sistema modelo se comportó según lo esperado, los experimentos de conversión se realizaron durante un período más largo, permitiendo que las vías de degradación de las células eliminaran la proteína de interés casi por completo(Figura 4). De hecho, hubo una degradación significativamente mayor del control HTTQ25-D2 24 h después de la conversión que después de 2 h en las neuronas de la cabeza, y mucho más en las neuronas de cola (Figura 4A). Una vez más, las neuronas de cola posteriores eliminaron más activamente HTT-D2 rojo, incluso en un mayor tiempo de tiempo. Se detectó una tendencia similar para el HTTQ97-D2 causante de la enfermedad, con una reducción muy leve de la señal roja HTT-D2 durante 24 h. Sin embargo, HTTQ97-D2 no se eliminó tan fácilmente como HTTQ25-D2, especialmente después de 24 h. Puede ser que sólo la fracción HTTQ97-D2 soluble se degrade eficientemente, teniendo en cuenta la disminución inicial de la señal roja y su posterior disminución leve con el tiempo. Es importante destacar que había dos poblaciones de neuronas después de 24 h: una con una tasa de degradación más alta y otra en la que la señal roja HTT-D2 no se degradó en absoluto, o potencialmente incluso aumentó(Figura 4B). El aumento y la señal estable posiblemente representan especies ya agregadas o continuamente agregantes que eran sustancialmente más difíciles de eliminar de las células debido a su naturaleza amiloide apretadamente empaquetada. Estas inclusiones, presentes exclusivamente cuando los tramos de glutamina superaron el umbral de repetición de 40, y que aparecieron microscópicamente como focos, se han propuesto acumularse como depósitos que no se pueden eliminar fácilmente22. También es posible que un aumento de la señal fluorescente roja fuera un artefacto resultante de problemas técnicos (por ejemplo, el uso de parámetros de adquisición incorrectos, el rendimiento por bajo de la configuración de la microscopía o un proceso de recuperación/montaje erróneo). Al adquirir imágenes durante períodos de tiempo más largos, estas variables deben tenerse en cuenta.

Finalmente, debido a que se observaron trastornos neurodegenerativos como la EH en la vida adulta, se observó el efecto del envejecimiento en la tasa de degradación de la HTT-D2. Se realizaron experimentos de conversión en la cabeza y en las regiones de cola de nematodos jóvenes (día 4) frente a nematodos viejos (día 10) en ambas cepas HTT-D2 (Figura 5). Para las neuronas de la cabeza, no hubo ningún cambio significativo en la tasa de degradación debido al envejecimiento durante la vida útil de HTTQ25-D2 y HTTQ97-D2, posiblemente porque HTT-D2 se eliminó por igual a lo largo de la vida de cada nematodo. Sin embargo, se registró un cambio muy significativo al comparar nematodos viejos que contienen un estiramiento patológico o fisiológico de glutamina. HTTQ97-D2 no se degradó tan eficientemente como HTTQ25-D2, destacando la incapacidad del PN para eliminar especies agregadas y posiblemente tóxicas de huntingtina en nematodos más antiguos (Figura 5A). Una vez más, se observó un volumen de negocios más activo y significativo en las neuronas de cola. Al igual que en las neuronas de la cabeza, no se observó una rotación más robusta de HTTQ25-D2 en las neuronas de cola de los nematodos jóvenes en comparación con la cohorte más antigua, y la degradación fue igual en el día 4 y el día 10. Por el contrario, los cambios significativos en las tasas de degradación entre el control y las cepas patógenas de HTT-D2 aparecieron en los nematodos de los jóvenes de día 4, cada vez más significativos en el día 10. Es importante destacar que las neuronas de cola fueron capaces de hacer frente a HTTQ97-D2 tóxico en nematodos jóvenes, lo que ilustra que varios mecanismos concomitantes de PN podrían estar trabajando para eliminar la HTT-D2 (Figura 5B). En general, la actividad de PN disminuyó con el tiempo, posiblemente debido a efectos perjudiciales causados por el envejecimiento y la presencia de agregados.

Figure 1
Figura 1: C. elegans expresó huntingtina exón-1 fusionado con Dendra2 en el sistema nervioso. (A) Joven, día 4 C. elegans pan-neuronalmente expresando huntingtina exon-1 que contiene 25 glutaminas, fusionada a Dendra2 en su estado de excitación/emisión verde no convertido. Barra de escala a 100 m. Los recuadros muestran una imagen magnificada de la cabeza (arriba) y de las neuronas de la cola (abajo). Barra de escala insertada a 10 m. (B) Joven, día 4 C. elegans pan-neuronalmente expresando huntingtina exon-1 que contiene 97 glutaminas, fusionada a Dendra2 en su estado de excitación/emisión verde no convertido. Barra de escala de 100 m. Los insertos muestran una imagen magnificada de las neuronas de la cola (superior) y de la cabeza (abajo), y la cabeza de un nematodo del día 7 (extrema derecha). Barra de escala inserto a 10 m. Las puntas de flecha blancas apuntan a los focos HTTQ97-D2, que representan agregados de huntingtina. (C) Imagen de fusión de canales de HTTQ25-D2 con conversión de la región principal. Box representa la porción de todo el C. elegans que ha sido irradiado por UV. Barra de escala a 100 m. El recuadro muestra la emisión de Dendra2 a 488 nm (superior, verde) y a 561 nm (abajo, rojo). Barra de escala a 10 m. (D) Imagen de combinación de canales de HTTQ97-D2 con la conversión de la región principal. Barra de escala de 100 m. La caja representa la porción de todo el C. elegans que ha sido irradiado por UV. El recuadro muestra la emisión Dendra2 a 488 nm (superior, verde) y a 561 nm (abajo, rojo). Barra de escala a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: HTT-D2 rojo convertido disminuyó con el tiempo en neuronas individuales. Neuronas de cola de HTTQ25-D2. Dos neuronas se muestran simultáneamente e independientemente fotoconvertidas. Las imágenes representan secuencialmente tres puntos de tiempo: (A) Antes de la irradiación (antes), (B) inmediatamente después de la irradiación (conversión) y (C) 2 h después de la irradiación (después). El panel superior (canal verde) representa la señal HTT-D2 recogida a 486-553 nm de excitación/emisión. La región blanca de interés delinea las neuronas que han sido irradiadas. El panel central (canal rojo) muestra la señal HTT-D2 convertida recogida a 580-740 nm de excitación/emisión. El panel inferior es una combinación de los dos canales. Barra de escala de 5 m para todas las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Las neuronas de la cabeza y la cola mostraron diferentes tasas de degradación. Los gráficos de barras de columna muestran el porcentaje de intensidad roja en relación con el valor inicial en el momento de la conversión (es decir, 100%). La señal de Dendra2 roja convertida disminuyó en general durante el intervalo de 2 h como HTT-D2 se degradó dentro de las neuronas de C. elegans. Dentro del sistema nervioso del nematodo, los subtipos neuronales presentaban diferentes tasas de degradación, con neuronas de cola que mostraban una rotación más activa, pero sólo en nematodos que llevaban un estiramiento de poliglutamina no estratógeno. (A) Cuantificación de la degradación en la cabeza HTTQ25-D2 frente a las neuronas de cola. Media de SD, prueba t del estudiante de dos colas sin par. N a 23-28 muestras/nematodos se visualizan por región, *P < 0,05. (B) Cuantificación de la degradación en la cabeza HTTQ97-D2 frente a las neuronas de cola. Media de SD, prueba t del estudiante de dos colas sin par. N - 23-28 muestras/nematodos se visualizan por región, ns - no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: HTTQ97-D2 no se borró significativamente después de 24 h. Los gráficos de barras de columna muestran el porcentaje de intensidad roja en relación con el valor inicial en el momento de la conversión (es decir, 100%). La señal roja Convertida Dendra2 disminuyó a medida que HTT-D2 se degradó dentro de las neuronas de C. elegans. HTT-D2 exhibió diferentes tasas de degradación. Incluso durante períodos más largos después de la conversión, HTT-D2 patógeno no pudo ser eliminado en comparación con su control saludable. (A) Cuantificación de la tasa de degradación en HTTQ25-D2 en dos puntos de tiempo después de la conversión (2 h y 24 h) en las neuronas de la cabeza y la cola. Media: SD, análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). N a 21-28 muestras/nematodos se muestran por tiempo/región, *P < 0.05, ****P < 0.0001. (B) Cuantificación de la tasa de degradación en HTTQ97-D2 en dos puntos de tiempo después de la conversión (2 h y 24 h) en las neuronas de la cabeza y la cola. Media: SD, análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de comparación múltiple de Tukey.  N - 21-28 muestras/nematodos se visualizan por tiempo/región, ns - no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Los nematodos viejos y jóvenes que expresaban el HTT-D2 patógeno no lo degradaron eficientemente. Los gráficos de barras de columna muestran el porcentaje de intensidad roja en relación con el valor inicial en el momento de la conversión (es decir, 100%). La señal de Dendra2 roja convertida disminuyó a medida que HTT-D2 se degradaba dentro de las neuronas. A medida que el nematodo envejeció, su capacidad para degradar la HTT-D2 patógena se vio afectada adicionalmente en todo su sistema nervioso. (A) Cuantificación de la tasa de degradación en las neuronas de la cabeza de los nematodos HTTQ25-D2 jóvenes (día 4) y viejos (día 10) en comparación con los nematodos HTTQ97-D2 coincidentes con la edad. Media: SD, análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). N a 23-28 muestras/nematodos se muestran por cepa/día, ****P < 0.0001. (B) Tasa de degradación 2 h después de la conversión en las neuronas de cola de los nematodos jóvenes (día 4) y viejos (día 10) HTTQ25-D2, en comparación con los nematodos HTTQ97-D2 coincidentes con la edad. Media: SD, análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de comparación múltiple de Tukey. N a 23-28 muestras/nematodos se muestran por cepa/día, *P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Para comprender la función de una proteína es importante entender su síntesis, ubicación y degradación. Con el desarrollo de FPs novedosos, estables y brillantes, la visualización y supervisión de los PDI se ha vuelto más fácil y eficiente. Los PAFP de fusión expresada genéticamente, como Dendra2, están en una posición única para estudiar la estabilidad de un PDI. Tras la exposición a la luz púrpura-azul, Dendra2 se rompe en un lugar preciso dentro de una tríada de aminoácidos conservados. El fluoróforo experimenta un pequeño cambio estructural, resultando en un cambio completo de espectros de verde a rojo23. Este cambio permite la detección y supervisión de cualquier PDI vinculado a Dendra2. De hecho, estas construcciones de fusión se utilizaron por primera vez para crear una cepa reportera de C. elegans para estudiar el sistema ubiquitina-proteasoma in vivo16. Dendra2 también se empleó para comprender la vulnerabilidad de los subtipos neuronales selectivos y su capacidad para hacer frente a las proteínas de poliglutamina expandidas24,o monitorear la inducción de la autofagia en modelos de enfermedad de las neuronas motoras25.

Aquí se presenta un protocolo para controlar in vivo la degradación de la huntingtina, una proteína propensa a la agregación relacionada con la enfermedad de una manera no invasiva. Después de generar con éxito un modelo neuronal C. elegans de la EH, expresando HTT-D2 pan-neuronalmente, se cuantificaron las tasas de degradación de la HTT expandida y patógena en comparación con su contraparte fisiológica. Se observaron diferencias sorprendentes entre los subtipos neuronales, entre los nematodos jóvenes y envejecidos, y entre la capacidad del PN para hacer frente a las cargas de glutamina tóxicas a lo largo del tiempo. Esta técnica también se puede aplicar para seguir la ubicación y el movimiento de la huntingtina, así como su destino cuando se introducen perturbaciones en el PN. SiRNA knockdown de chaperones clave o la administración de compuestos que inhiben la actividad proteosoma puede descubrir la función y la importancia de estos componentes en proteínas propensas a la agregación: por ejemplo, si la PN activa nodos específicos para compensar las deficiencias26. También puede explicar los efectos perjudiciales causados por una enfermedad en comparación con los del envejecimiento normal.

Aunque se pueden abordar muchas preguntas diferentes con esta técnica, una vez que se ha generado un modelo deseado, se deben establecer parámetros correctos de conversión y detección para obtener datos fiables. También es crucial determinar los ajustes de conversión que permiten un rendimiento suficiente de proteína activada sin fotoblanqueo o fototoxicidad y sin conversión no deseada. Además, para cada proteína estudiada dentro de un sistema modelo específico, ya sea ex vivo o in vivo, es necesario establecer experimentalmente un período de tiempo lo suficientemente grande como para permitir una cuantificación precisa de la tasa de degradación.

Dendra2 ofrece una serie de ventajas sobre otros PAFP: 1) es monomérico y muy brillante; 2) tiene una fotoconversión de alto contraste y una señal fotoconvertida estable; 3) se puede activar con baja fototoxicidad por un láser azul de 488 nm, que es parte de la mayoría de las configuraciones de hardware confocal; 4) madura eficientemente a 37 oC para su aplicación en células de mamíferos; 5) no tiene efectos secundarios tóxicos cuando se expresa durante períodos prolongados de tiempo23,27; y 6) el sistema no se ve afectado por variaciones en los niveles de expresión entre o dentro de un organismo o célula, ya que sólo se cuantifica la relación de la señal Dendra2 antes y después de la conversión. Todas las propiedades enumeradas hacen de Dendra2 un fluoróforo ideal para rastrear la dinámica de proteínas en tiempo real y monitorear el destino celular.

Desafortunadamente, las proteínas de fusión Dendra2 sufren algunas limitaciones comunes del etiquetado de proteínas fluorescentes. La construcción es una especie quimérica a menudo experimentalmente sobreexpresada en los sistemas biológicos, aunque la expresión endógena podría establecerse a través de la ingeniería genómica. La tasa de degradación de Dendra2 en sí influye potencialmente en la degradación de la proteína diana, aunque ha sido descrita como una proteína27altamente estable y de larga duración. Además, Dendra2 no es adecuado para rastrear proteínas con rotaciones muy rápidas, ya que podría no tener tiempo para su propia maduración adecuada. Por último, los láseres de 405 nm, que son poco comunes, son preferidos para el fotointerrupción eficiente, aunque son más tóxicos para la muestra. De hecho, se puede utilizar menos luz azul fototóxica para visualizar Dendra2 verde y convertirlo cuando la potencia del láser está a alta intensidad. Esta característica en particular siempre debe tenerse en cuenta, ya que la exposición prolongada producirá conversión no deseada y mediciones potencialmente incorrectas. Por último, puede ser problemático utilizar Dendra2 en combinación con fluoróforos verdes o rojos. Sin embargo, muchos PAFP diferentes están disponibles para investigar la dinámica de varias proteínas simultáneamente.

Los experimentos que utilizan Dendra2 y otros PAFP se han relacionado con la recuperación de la fluorescencia después del fotoblancada (FRAP) y las técnicas de etiquetado radiactivo de persecución de pulsos. En un entorno FRAP es imposible distinguir las proteínas que vuelven a introducir un ROI de la proteína fluorescente recién formada, y es necesario un monitoreo y visualización constantes de la muestra. Con Dendra2, se generan dos poblaciones claramente distinguibles que se pueden observar de forma independiente a lo largo del tiempo por lo que la forma "inactiva" reemplazada y sintetizada de Dendra2 verde puede ser rastreada y cuantificada16. Dendra2 es también una sonda útil en microscopía de super resolución como microscopía fluorescente de reflexión interna total (TIRF)28 y microscopía de localización de fotoactivación (PALM)29. En un futuro próximo, estos avances permitirán una mejor localización y un seguimiento potencialmente de moléculas individuales de cualquier PDI, lo que permitirá descubrir diferencias más sutiles dentro y entre muestras y, en última instancia, producir nueva información sobre la vida y el destino de cualquier PDI dentro de un sistema biológico.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Reconocemos la beca DFG (KI-1988/5-1 to JK, NeuroCure PhD fellowship by the NeuroCure Cluster of Excellence to MLP) para su financiación. También reconocemos la instalación básica de imágenes del Instituto de Investigación Leibniz de Farmacología Molecular de Berlín (FMP) por proporcionar la configuración de imágenes. Además, queremos dar las gracias a Diogo Feleciano que estableció el sistema Dendra2 en el laboratorio y proporcionó instrucciones.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH + Co. KG 5210.2 NGM component
Agarose, Universal Grade Bio & Sell GmbH BS20.46.500 Mounting slide component
BD Bacto Peptone BD-Bionsciences 211677 NGM component
Deckgläser-18x18mm Carl Roth GmbH + Co. KG 0657.2 Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 Carl Zeiss AG Objective
Fiji/ImageJ 1.52p NIH Analysis Software
Levamisole Hydrochloride AppliChem GmbH A4341 Anesthetic
LSM710-ConfoCor3 Carl Zeiss AG Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope Leica Camera AG Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2 this paper C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2 this paper C. elegans strain
OP50 Escherichia coli CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OP50 Nematode food source
Sodium Chloride Carl Roth GmbH + Co. KG 3957.2 NGM component
Standard-Objektträger Carl Roth GmbH + Co. KG 0656.1 Glass slides
ZEN2010 B SP1 Carl Zeiss AG Confocal acquisition software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biología Número 160 C. elegans huntingtina red de proteostasis degradación Dendra2 fotoconversión microscopía confocal Fiji/ImageJ
En la cuantificación vivo de la rotación de proteínas en el envejecimiento <em>C. Elegans</em> usando Dendra fotoconvertible2
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Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In… More

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).

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