I Vivo Kvantifisering av proteinomsetning i aldring C. Elegans ved hjelp av photoconvertible Dendra2

Summary

Presentert her er en protokoll for å overvåke nedbrytning av protein huntingtin smeltet til fotokonverterbar fluorophore Dendra2.

Abstract

Proteiner syntetiseres og degraderes hele tiden i en celle for å opprettholde homeostase. Å kunne overvåke nedbrytningen av et protein av interesse er nøkkelen til å forstå ikke bare livssyklusen, men også å avdekke ubalanser i proteostasenettverket. Denne metoden viser hvordan du sporer nedbrytningen av det sykdomsfremkallende proteinjakttinet. To versjoner av huntingtin smeltet til Dendra2 uttrykkes i C. elegans nervesystemet: en fysiologisk versjon eller en med en utvidet og patogen strekning av glutaminer. Dendra2 er et fotokonverterbart fluorescerende protein; ved en kort ultrafiolett (UV) bestrålingspuls, bytter Dendra2 eksitasjons-/utslippsspektraen fra grønt til rødt. I likhet med et pulsjakteksperiment, kan omsetningen til den konverterte rød-Dendra2 overvåkes og kvantifiseres, uavhengig av interferens fra nylig syntetisert grønn-Dendra2. Ved hjelp av konkalsk-basert mikroskopi og på grunn av den optiske gjennomsiktigheten til C. elegans,er det mulig å overvåke og kvantifisere nedbrytningen av huntingtin-Dendra2 i en levende, aldrende organisme. Neuronal huntingtin-Dendra2 er delvis degradert kort tid etter konvertering og ryddet videre over tid. Systemene som kontrollerer nedbrytning er mangelfulle i nærvær av mutert huntingtin og er ytterligere svekket med aldring. Nevronale undertyper i samme nervesystem viser ulike omsetningskapasiteter for huntingtin-Dendra2. Samlet sett kan overvåking av protein av interesse smeltet til Dendra2 gi viktig informasjon ikke bare om nedbrytning og aktørene i proteostasenettverket som er involvert, men også på plassering, menneskehandel og transport.

Introduction

Proteomen til en levende organisme fornyer seg hele tiden. Proteiner er kontinuerlig degradert og syntetisert i henhold til den fysiologiske etterspørselen til en celle. Noen proteiner elimineres raskt, mens andre lenger blir levd. Overvåking av proteindynamikk er en enklere, mer nøyaktig og mindre invasiv oppgave når du bruker genetisk kodede fluorescerende proteiner (FPer). FPs danner autokatalytisk og kan smeltes til ethvert protein av interesse (POI), men krever ikke enzymer for å brette eller trenger kofaktorer spare for oksygen¹. En nyere generasjon av FPs har nylig blitt utviklet for å bytte farge ved bestråling med en lys puls av bestemt bølgelengde. Disse fotoaktivatable FPs (PAFPs) tillater merking og sporing av POIer, eller organeller eller celler de bor i, og for å undersøke deres kvantitative og / eller kvalitative parametere². FPs gjør det mulig å spore noen POI bevegelse, retningsbestemthet, frekvensen av bevegelse, koeffisient av diffusjon, mobil versus immobile fraksjoner, tiden den ligger i ett mobilrom, samt omsetningshastigheten. For spesifikke organeller kan bevegelse og transport, eller fisjon og fusjonshendelser bestemmes. For en bestemt celletype kan en celleposisjon, delingshastighet, volum og form opprettes. Avgjørende, bruk av PAFPs tillater sporing uten kontinuerlig visualisering og uten interferens fra noen nylig synthetized probe. Studier både i celler og i hele organismer har brukt PAFPs for å løse biologiske spørsmål in vivo, for eksempel utvikling av kreft og metastase, montering eller demontering av cytoskeleton, og RNA-DNA/ protein interaksjoner³. I dette manuskriptet brukes lysmikroskopi og PAFPs til å avdekke omsetningsraten til aggregasjonsutsatt protein huntingtin (HTT) in vivo i en C. elegans modell av nevrodegenerativ sykdom.

Protokollen som er beskrevet her kvantifiserer stabiliteten og nedbrytningen av fusjonsproteinet huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 er en andregenerasjons monomeric PAFP⁴ som irreversibelt bytter sin utslipp / eksitasjonspektrast fra grønn til rød som svar på enten UV eller synlig blått lys, med en økning i intensiteten på opptil 4000 ganger^5,6. Huntingtin er proteinet som er ansvarlig for å forårsake Huntington sykdom (HS), en dødelig arvelig nevrodegenerativ lidelse. Huntingtin exon-1 inneholder en strekning av glutaminer (CAG, Q). Når proteinet uttrykkes med over 39Q, feilfolder det inn i et mutert, giftig og patogent protein. Mutant HTT er utsatt for aggregering og fører til nevronal celle død og degenerasjon, enten som korte oligomeriske arter eller som større svært strukturerte amyloider⁷.

Nematoden er et modellsystem for å studere aldring og nevrodegenerasjon takket være sin enkle manipulasjon, isogen natur, kort levetid og optisk gjennomsiktighet⁸. For å studere stabiliteten til HTT in vivo, ble en fusjonskonstruksjon uttrykt i nervesystemet til C. elegans. En HTT-D2 transgene som inneholder enten en fysiologisk strekning av 25Qs (HTTQ25-D2) eller en patologisk strekning på 97Qs (HTTQ97-D2) er overexpressed pan-neuronally gjennom nematodens levetid⁹. Ved å utsette live C. elegans til et kort og fokusert lyspunkt, er et enkelt nevron fotowitched og den konverterte HTT-D2 spores over tid. For å fastslå mengden HTT-D2 degradert, sammenlignes forskjellen mellom det røde signalet til den nykonverterte HTT-D2 med det gjenværende røde signalet til HTT-D2 etter en bestemt tidsperiode. Derfor blir det mulig å undersøke hvordan huntingtin brytes ned når det finnes i sin utvidede og giftige form sammenlignet med den fysiologiske formen; hvordan fremre eller bakre nevroner reagerer annerledes på tilstedeværelsen av Q97 versus Q25, spesielt over lengre tidsperioder; og hvordan sammenbruddet av proteostase nettverket (PN) under aldring bidra til forskjellene i nedbrytning priser. Disse resultatene beskriver bare et lite sett med observasjoner om omsetningen av HTT-D2. Imidlertid kan mange flere biologiske spørsmål som er relevante for både feltet proteinaggregasjon og proteostase, løses med denne in vivo-applikasjonen.

Protocol

1. Generasjon av C. elegans uttrykker nevronal Huntingtin-Dendra2 fusjon protein

1. Klone genet koding POI i en nematode uttrykk vektor (dvs. pPD95_75, Addgene #1494), ved tradisjonell begrensning enzym fordøye^10,Gibson montering¹¹, eller noen metode for valg. Sett inn en promotor for å drive uttrykk i et ønsket vev eller på et ønsket utviklingsstadium. Sett Dendra2 fluorophore enten N- eller C-terminalt inn i rammen med interessepunktet.
2. Generer transgene C. elegans som uttrykker fusjonskonstruksjonen (f.eks. via mikroinjeksjon)¹².
   MERK: Plasmiden som bærer transgenet vil forbli som en ekstrakromosomal matrise. Integrering av konstruksjonen er ikke nødvendig, men kan utføres hvis ønskelig¹³. I denne protokollen ble C. elegans mikroinjisert med en plasmid som bærer fusjonskonstruksjonen huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) under kontroll av pan-neuronal promoter Prgef-1. C. elegans uttrykk ryggraden ble hentet fra Kreis et al.¹⁴, huntingtin exon 1 med enten Q25 eller Q97 ble hentet fra Juenemann et al.¹⁵, og Dendra2 ble hentet fra Hamer et al.¹⁶.

2. Aldersmatching og vedlikehold av C. elegans

1. Alder matcher alle nematoder ved å synkronisere enten med alkalisk hypoklorittoppløsningsbehandling¹⁷ eller via egglegging i 4 timer ved 20 °C. For egglegging, plasser 10 gravid voksne på en nyseedet nematode vekst media (NGM) plate og la stå i 4 timer før du fjerner. Eggene lagt i denne timespan vil gi opphav til synkroniserte nematoder.
2. Hold eksperimentelle C. elegans på nematode vekst media (NGM) plater seeded med bakteriell mat kilde E. coli OP50, etter standard nematode husdyrhold¹⁸.
3. Grow nematoder ved 20 °C til ønsket stadium. For denne protokollen er de nødvendige alderene dag 4 og 10.
   MERK: Unge voksne på dag 4 kan identifiseres ved tilstedeværelse av egg i sine gonader og deres høye mobilitet. Alderen dag 10 nematoder er post-fruktbare, og gjennomgå vev forverring og lokomotiv nedgang¹⁹.
4. For dag 10 nematoder, passerer daglig etter L4-scenen på dag 3, når nematoder er fruktbare, for å unngå en blandet befolkning.

3. Utarbeidelse av mikroskopilysbilder for bildebehandling

1. Forbered mikroskopilysbildene på bildedagen. I en mikrobølgeovn oppsto smelte generell karakter agarose med en konsentrasjon på 3% (w / v) i ddH₂O. La avkjøles litt.
2. Skjær spissen av en 1 ml pipettespiss og aspirer omtrent 400 μL smeltet agarose. Legg forsiktig noen dråper agarose på en ren glasssklie og plasser umiddelbart en annen lysbilde på toppen, og pass på at en tynn pute av agarose er opprettet mellom de to. La tørke før du forsiktig skyver eller løfter toppen skyve av.
3. Plasser agarose pad lysbildene i en fuktet beholder for å hindre dem i å tørke ut. Disse kan brukes innen 2-3 timer.
   MERK: Unngå dannelse av små bobler i agarose, da nematodene kan fanges inne.

4. Definisjon av konfusiske mikroskopparametere

MERK: Før nematoder og datainnsamling monteres, må du definere alle innstillingene på den konsernkale anskaffelsesprogramvaren. Innstillingene kan tilpasses bildemaskinvare og programvare du velger.

1. Åpne den konsernkale programvaren og definer innstillingene for laseravbildning. Still inn lysbanen for eksitasjon/utslipp for grønn Dendra2 på 486-553 nm og for rød Dendra2 på 580-740 nm. Juster kraften og gevinsten av begge kanaler/ lasere i henhold til intensiteten av fluorophore. Ikke endre den digitale forsterkningen eller forskyvningen og still inn pinhullet som helt åpent.
2. Definer anskaffelsesoppsettet: Velg en sekvensiell kanalmodus og bytt spor hver ramme. Angi skannemodus som ramme, og rammestørrelsen som 1024 x 1 024, med et linjetrinn på 1. Sett snittet til 2, og gjennomsnitt med gjennomsnittlig metode og modus for enveislinje. Sett bitdybden til 8 biter.
3. Definer innstillingene for flerdimensjonale anskaffelser for konvertering av Dendra2. For konvertering og bleking bruk 405 nm diode laser satt til 60% energieffekt. Hvis det er tilgjengelig, aktiverer du den sikre blekingen GaAsP for å beskytte detektorene.
4. Velg en tidsserie med to sykluser, med et 0,0 ms-intervall i mellom, og normal start og stopp. Start bleking etter skanning 1 av 2 og gjenta for 30 gjentakelser. Slutt å bleke når intensiteten faller til 50%.
5. Definer hastigheten på anskaffelse/pikseldvrang like raskt (f.eks. maksimum = 12) for konvertering og middels hastighet (f.eks. medium = 5) for å ta et snap-bilde.
   MERK: Blekeparametrene som er definert her, er retningslinjer. For andre Dendra2-merkede POI-er må laserkraftinnstillingene og blekende gjentakelser og verdier etableres empirisk.

5. Montering av C. elegans på mikroskopilysbilder

MERK: Hvis det er mulig, plasser et monteringssterekrokop nær det konfuskale mikroskopoppsettet og monter nematodene like før bildebehandling.

1. På glassdekselet glir på motsatt side av agarose-puten, tegn et vindu med fire ruter med en permanent markør og nummerer dem.
2. Pipette 15 μL levamisole i midten av agarose puten. Konsentrasjonen av levamisole vil variere i henhold til nematodens alder: Når bildedag 4 nematoder bruker 2 mM levamisole; når bildebehandling dag 10 nematoder bruker 0,5 mM levamisole.
3. Overfør fire nematoder til væsken ved hjelp av en trådplukk. Ved hjelp av en øyenvippeplukk, flytt forsiktig hver enkelt nematode til et vinduskorg. Drei øyevippen slik at eventuelle spor av E. coli OP50 fortynnes og dens fluorescerende bakgrunn forstyrrer ikke signaloppkjøpet.
4. Vent til nematodene nesten slutter å bevege seg og legg forsiktig et dekselslip på toppen av væsken for å immobilisere nematodene i laget av levamisole mellom agaroseputen og dekkslipen.
5. Plasser det inverterte lysbildet på confocal scenen for å bilde nematodene.

6. Konvertering av grønn Dendra2: Datainnhenting på tidspunktet null

MERK: Pulsjakteksperimentene starter med å irreversibelt konvertere Dendra2-fusjonsproteinet fra en grønn emitterende fluorofore til en rød.

1. Bruk mikroskopets okular, finn den første nematoden med et 20x-mål under grønn fluorescens. Fokuser på hodet eller halen og bytt til konfuseringsmodus.
2. Start live laserskanning med den blå laseren på 488 nm for å visualisere den grønne Dendra2 i egfp grønn kanal (ex/em = 486-553 nm). Velg en enkelt nevron og ta det i fokus. Zoom inn 3x og øk målet for laserstrålen⁴.
   MERK: Velg ett nevron per nematode. Hver nevron vil utgjøre ett utvalg eller datapunkt.
3. Finn det maksimale projeksjonsplanet og, i henhold til lysstyrken på fluorophore, øke eller redusere forsterkning eller laserkraft for å oppnå et mettet, men ikke overeksponert bilde identifiserbar av fargeområdeindikatoren. Når dette er definert, stopper du skanningen.
   MERK: Ikke bestråle prøven for lenge eller med for mye strøm, da eksitasjon med synlig blått 488 nm-lys også kan konvertere Dendra2, om enn sakte og mindre effektivt⁴.
4. Åpne kategorien I programvaren for å velge interesseområdene (ROIer) og tegne en første avkastning rundt det valgte nevronen. Definer en større andre interesseregion som omfatter nematodens hode og inkludert den første avkastningen.
5. I blekingsinnstillingene velger du for den første avkastningen som skal anskaffes, bleket og analyseres. Velg for den andre avkastningen som skal anskaffes og analyseres, men ikke bleket.
6. Sett skannehastigheten til maksimum (dvs. rask piksel dvs.
   MERK: Når eksperimentet er ferdig, vil det anskaffede bildet resultere i to bilder: ett før og ett etter konvertering. For den grønne kanalen, bør det første bildet ha et høyere grønt signal som avtar i det andre bildet på grunn av konvertering av den grønne Dendra2. For den røde kanalen skal det første bildet være negativt og ikke vise noe signal, med et rødt signal som vises i bildet etter konvertering. Hvis det grønne signalet ikke avtar, konverteringen ikke forekommer, og innstillingene, for eksempel 405 laser makt eller antall iterasjoner, bør endres. Hvis det er et rødt signal i det første bildet, var 488 nm laserkraften som ble brukt for høy, og en del av den grønne Dendra2 ble allerede konvertert til rødt. I dette tilfellet bør en ny nevron / nematode velges.
7. Umiddelbart etter konvertering, start live skanning med den grønne 561 nm laser for å visualisere Dendra2 i den røde kanalen (ex / em = 580-740 nm). Finn fokus og respektive maksimal projeksjon av den konverterte nevronen ved hjelp av rekkeviddefargeindikatoren for å unngå overeksponering.
8. Sett raskt skannehastigheten til en lavere pikselhastighet (f.eks. 5x) og få et øyeblikksbilde av begge kanalene med høyere oppløsning. Dette bildet er definert som tidspunkt null (T0) etter konvertering.
   MERK: Anskaffelseshastigheten for det konverterte bildet kan varieres. Men når valgt, denne hastigheten må holde seg konstant gjennom datainnsamlingen.
9. Lagre skanningen med et identifiserbart navn og/eller tall, etterfulgt av time zero-etiketten (T0).
   MERK: Det anbefales også å lagre bildet av konverteringseksperimentet (trinn 6.6) for å illustrere mangelen på rødt signal før konvertering og utseendet etterpå.

7. Bilde av konvertert rød Dendra2 for datainnsamling på et valgt andre tidspunkt

1. For å spore Dendra2 nedbrytning over tid, definere et andre tidspunkt for å reimage samme nematode / neuron. Velg det andre tidspunktet eksperimentelt for å løse et relevant biologisk spørsmål. For protokollen som er beskrevet her, er Dendra2 avbildet både på 2 h (T2) og 24 h (T24) etter konvertering.
   1. På det valgte tidspunktet, finn samme nematode / nevron ved bruk av okularet og rød fluorescens.
   2. Åpne T0-bildet av den respektive nematode/nevronen, og last inn/gjenbruk bildeinnstillingene. Kontroller at anskaffelsesinnstillingene for øyeblikksbildet er nøyaktig de samme når du anskaffer T0-, T2- og T24 h-bildene.
   3. Skanning live i den røde kanalen, bringe den konverterte røde nevronen i fokus. Fordi den røde Dendra2 forringes over tid, vil rekkeviddeindikatoren vise en mindre intens maksimal projeksjon. Ikke endre noen oppkjøpsparametere og få et øyeblikksbilde med samme hastighet (f.eks. 5x) som det første bildet.
2. For å spore nedbrytningen av Dendra2 etter 4 timer eller lenger, redde nematodene etter konvertering.
   1. Fjern lysbildet fra mikroskopet umiddelbart etter konvertering og avbildning av de fire nematodene. Fjern forsiktig dekkslippen og ved bruk av en trådplukk, løft hver nematode fra agarose-puten.
   2. Plasser hver nematode individuelt på en passende merket og identifiserbar NGM-plate.
   3. For andre gangs punkt, monter nematoden igjen på en frisk agarose pad og fortsett med avbildningen av den konverterte røde Dendra2 etter instruksjonene i avsnitt 6.

8. Bildeanalyse av konvertert Dendra2

MERK: Analyse av nedbrytning av Dendra2 utføres med Fiji/ImageJ-programvare²⁰.

1. Åpne Fiji og dra og slipp .lsm-filen i Fiji-baren. Åpne T0-bildet tatt like etter konvertering og bildet av samme nematode tatt på valgt tidspunkt etter konvertering (T2 eller T24 h).
   MERK: For å spore nedbrytningen av proteinet av interesse smeltet til Dendra2 bare den røde kanalen må analyseres.
2. Opprette måleparametrene fra menyen: Analyser | Angi målinger. Velg funksjonene Område og integrert tetthet.
3. Velg bildet som er oppnådd med den røde kanalen. Velg polygonvalgverktøyet fra Fiji-linjen.
4. Identifiser det konverterte nevronen på T0-bildet og tegn en avkastning rundt det ved hjelp av markeringsverktøyet.
   1. Hvis du vil identifisere konturene til nevronen på riktig måte, markerer du intensitetsterskler ved å velge fra linjen Bilde | Juster | Terskel. Dra stolpen markøren for å avgrense terskelen og spore rundt dette området med polygonverktøyet. For å generere en nøyaktig avkastning, er det også mulig å bruke konturen av det valgte nevronen fra den grønne kanalen.
5. Når valget er gjort i det røde kanalvinduet, trykker du analyser | Mål. Et popup-vindu med navnet Resultater vises og inkluderer roi-verdiene for Område, IntDenog RawIntDen.
6. Utfør samme prosess med valg og måling for bildet av det andre tidspunktet (T2 eller T24 h).
7. Kopier de inntringede verdiene til en regnearkprogramvare, og vær forsiktig med å registrere verdiene på T0 etter konvertering på riktig måte, og på T2 eller T24 timer etter konvertering.

9. Beregning av forholdet mellom Dendra2 nedbrytning

1. Hvis du vil beregne forholdet mellom nedbrytning, må du først tilordne en verdi på 1 (eller 100 %) til tid nedbrytningen fra tidspunkt null (dvs. like etter konvertering, når alle de røde Dendra2 konvertert er fortsatt til stede). Dette skyldes å dele verdien av IntRawDen av T0 av seg selv.
2. Hvis du vil beregne reduksjonen av det røde Dendra2-intensitetssignalet over tid, og nedbrytningen, deler du verdien av RawIntDen for det andre tidspunktet (f.eks. T2 eller T24 h) med verdien av RawIntDen of T0. Det resulterende tallet skal være mindre enn 1. Disse verdiene kan også uttrykkes som prosenter, og definerer T0 som 100 %.
3. Gjenta avsnitt 7 for hver nematode konvertert. For en grafisk representasjon av nedbrytningen av Dendra2, kan du kartlegge et punkttegn eller stolpediagram med prosent- eller ratioverdiene for fluorescensreduksjon oppnådd i y-aksen. Bruk en hvilken som helst ønsket statistisk analyse og illustrere den på grafen.

Representative Results

To nematodestammer som uttrykker huntingtin exon-1 proteinfragment i ramme med det fotokonverterbare proteinet Dendra2 ble oppnådd via mikroinjeksjon og plasmidene ble holdt som en ekstrakromosomal matrise. Fusjonskonstruksjonen ble uttrykt i hele C. elegans nervesystemet fra utvikling gjennom aldring. Her inneholdt HTT-D2 enten den fysiologiske 25 polyglutaminstrekningen (HTTQ25-D2, figur 1A)eller en fullstendig penetrant og patogen gjentakelse med 97 glutaminer (HTTQ97-D2, figur 1B). I utgangspunktet ble fusjonsproteinet testet for å sikre at det endret seg fra sitt grønne spektrum til sitt røde spektrum ved UV-bestråling. HTT-D2 byttet fra grønt til rødt utelukkende innenfor det opplyste området. Ifølge kraften og iterasjonene til UV-pulsen, og avhengig av z-flyet og penetransen til laserstrålen gjennom neglebåndet på nematoden, ble en definert del av HTT-D2 konvertert, men ikke alle. Et rødt signal dukket opp i de fotokonverterte nevronene, colocalizing med den grønne ikke-konvertert HTT-D2 (Figur 1C, D). På grunn av nøyaktigheten av laserskanning foton bjelker var det mulig å konvertere en presis avkastning som tilsvarer en enkelt nevron. Før konverteringen var det ikke synlig med rødt signal da prøven var spent i den røde kanalen (Figur 2A). Ved UV-bestråling ble det grønne signalet redusert da HTT-D2 ble konvertert og et rødt signal endelig dukket opp (Figur 2B). HTT-D2 ble deretter degradert over tid, noe som resulterte i en reduksjon i nivåene av rød HTT-D2(Figur 2C)og en mulig økning av det grønne HTT-D2-signalet, da mer fusjonsprotein nylig ble syntetisert. Fordi en betydelig nedgang allerede var fremtredende ved 2 timer etter konvertering, ble dette intervallet for å oppdage og kvantifisere nedbrytningen av HTT-D2 opprettholdt. Det er viktig å merke seg at nedbrytning ikke er den eneste prosessen som kan oppstå etter konvertering av HTT-D2. KonvertertE HTT-D2 kan bli smuglet og transportert langs aksoner, noe som resulterer i en reduksjon i det røde signalet ikke på grunn av klaring. Men med de innstillingene som er ansatt her og over den korte tidsperioden på 2 timer, ble det ikke observert spredning av det røde signalet, muligens på grunn av det faktum at lille HTT-D2 ble flyttet fra soma til akson. Videre, konvertering og bildebehandling en enkelt hel nevronal soma bidro til å utelukke effekten av HTT-D2 diffusjon i samme nevron, fordi alle cellulære rom ble analysert samtidig. For å studere både diffusjon eller transport / menneskehandel er det tilrådelig å få raske og høyere forstørrelsesbilder og spore en mindre og muligens mer motil brøkdel av proteinet av interesse. Det er også viktig å merke seg at i et sett med eksperimenter representerte hvert dyr en biologisk gjentakelse. Bare ett nevron per nematode ble avbildet, hvert dyr ble avbildet en gang per økt, og bildebehandling skjedde over tre økter, noe som utgjorde tekniske repetisjoner. De tre øktene krevde at dyrene ble synkronisert på ferske plater før hvert eksperiment enten på dag 4 eller dag 10, noe som åpner for hva miljøvariabilitet er pålagt nematodene. Tre økter tar også høyde for alle variasjoner som oppstår fra bildebehandlingsoppsettet (f.eks. laserkraften varierer på grunn av en annen temperatur mellom eksperimenter). Alle biologiske replikeringer oppnådd i løpet av de tre øktene (minimum 20 dyr) ble ansett som individuelle prøver og benyttet til å etablere statistisk signifikans.

Etter å ha bekreftet at begge C. elegans HTT-D2-stammene var effektive og etablerte de optimale konverteringsparametrene, ble forskjellene mellom omsetningen av et sykdomsfremkallende HTT-D2-protein (dvs. HTTQ97-D2) sammenlignet med den fysiologisk relevante kontrollen (HTTQ25-D2) undersøkt. For det første ble nedbrytningen av HTT-D2 i forskjellige nevroner observert (figur 3). Det er kjent at undertyper av nevroner i nematodens nervesystem varierer i deres metabolske aktivitet og morfologi²¹, muligens gjør en forskjell i nedbrytning og rebalansering av proteomet. Nevronene i haleregionen ble sammenlignet med de i hodet og funnet å være betydelig mer aktive (figur 3A). Dette funnet var bare gyldig for HTTQ25-D2 og ikke for patogene HTTQ97-D2, noe som tyder på at PN ikke kunne fjerne HTT-D2 som inneholder lengre glutaminstrekninger i hele nervesystemet (figur 3B).

For ytterligere å bekrefte at modellsystemet oppførte seg som forventet, ble konverteringseksperimenter utført over en lengre periode, slik at cellenes nedbrytningsveier kunne eliminere proteinet av interesse nesten helt (figur 4). Faktisk var det betydelig mer nedbrytning av kontroll HTTQ25-D2 24 timer etter konvertering enn etter 2 timer i hodet nevroner, og mye mer i halen nevroner (Figur 4A). Igjen, bakre hale nevroner mer aktivt fjernet rød HTT-D2, selv over en økt tidspenn. En lignende trend ble påvist for sykdomsfremkallende HTTQ97-D2, med en svært liten reduksjon av det røde HTT-D2-signalet over 24 timer. HTTQ97-D2 ble imidlertid ikke fjernet like lett som HTTQ25-D2, spesielt etter 24 timer. Det kan være at bare den løselige HTTQ97-D2-fraksjonen er effektivt degradert, og står for den første reduksjonen av det røde signalet og den ytterligere milde nedgangen over tid. Viktigere var det to populasjoner av nevroner etter 24 timer: en med høyere nedbrytningshastighet og en hvor det røde HTT-D2-signalet ikke ble degradert i det hele tatt, eller potensielt til og med økt (figur 4B). Økt og stabilt signal representerer muligens allerede aggregert eller kontinuerlig aggregering av arter som var vesentlig vanskeligere å fjerne fra cellene på grunn av deres tettpakkede amyloid natur. Disse inneslutningene, som utelukkende finnes når glutaminstrekninger oversteg 40-gjentakelsesterskelen, og som dukket opp mikroskopisk som foci, har blitt hypotetisk å akkumulere som innskudd som ikke lett kan fjernes²². Det er også mulig at en økning i det røde fluorescerende signalet var en artefakt som følge av tekniske problemer (f.eks. bruk av feil oppkjøpsparametere, sub-par-ytelse for mikroskopioppsettet eller en feilaktig gjenopprettings-/monteringsprosess). Når du anskaffer bilder over lengre perioder, må disse variablene tas i betraktning.

Til slutt, fordi nevrodegenerative lidelser som HS manifest i voksenlivet, effekten av aldring på frekvensen av HTT-D2 nedbrytning ble observert. Konverteringseksperimenter ble utført i hodet og haleregionene av unge (dag 4) versus gamle (dag 10) nematoder i begge HTT-D2 stammer (Figur 5). For hodenevronene var det ingen signifikant endring i nedbrytningsraten på grunn av aldring i løpet av levetiden til både HTTQ25-D2 og HTTQ97-D2, muligens fordi HTT-D2 ble fjernet likt gjennom hele levetiden til hver nematode. Imidlertid ble en svært betydelig endring registrert ved sammenligning av gamle nematoder som inneholder enten en patologisk eller en fysiologisk glutaminstrekning. HTTQ97-D2 ble ikke degradert like effektivt som HTTQ25-D2, og fremhevet PNs manglende evne til å fjerne aggregerte og muligens giftige arter av huntingtin hos eldre nematoder (Figur 5A). Igjen ble det observert en mer aktiv og betydelig omsetning i halenevronene. Som i hodet nevroner, en mer robust omsetning av HTTQ25-D2 ble ikke observert i halen nevroner av unge nematoder sammenlignet med den eldre kohorten, og nedbrytning var lik på dag 4 og dag 10. Omvendt dukket betydelige endringer i nedbrytningsrater mellom kontrollen og de patogene HTT-D2-stammene opp i ung dag 4 nematoder, og ble enda viktigere på dag 10. Viktigere, hale nevroner var i stand til å takle giftig HTTQ97-D2 i unge nematoder, illustrerer at ulike samtidige PN mekanismer kan være på jobb for å fjerne HTT-D2 (Figur. 5B). Samlet sett ble PN-aktiviteten redusert over tid, muligens på grunn av skadelige effekter forårsaket av både aldring og tilstedeværelse av aggregater.

Figur 1: C. elegans uttrykte huntingtin exon-1 smeltet til Dendra2 i nervesystemet. (A) Ung, dag 4 C. elegans pan-neuronally uttrykker huntingtin exon-1 som inneholder 25 glutaminer, smeltet til Dendra2 i sin ukonverterte grønne eksitasjon / utslippstilstand. Skala bar = 100 μm. Innfelt viser et forstørret bilde av hodet (øverst) og halen (nederst) nevroner. Innfelt skala bar = 10 μm. (B) Ung, dag 4 C. elegans pan-neuronally uttrykker huntingtin exon-1 som inneholder 97 glutaminer, smeltet til Dendra2 i sin ukonverterte grønne eksitasjon / utslippstilstand. Skala bar = 100 μm. Innlegg viser et forstørret bilde av halen (øverst) og hodet (nederst) nevroner, og hodet på en dag 7 nematode (helt til høyre). Innfelt skala bar = 10 μm. Hvite pilspisser peker til HTTQ97-D2 foci, som viser huntingtin aggregater. (C) Kanalfletting bilde av HTTQ25-D2 med konvertering av hodet regionen. Box representerer den delen av hele C. elegans som har vært UV bestrålt. Vektstang = 100 μm. Innfelt viser Dendra2-utslippet på 488 nm (topp, grønn) og på 561 nm (bunn, rød). Skalalinje = 10 μm. (D) Kanalflettingsbilde av HTTQ97-D2 med konvertering av hodeområdet. Skala bar = 100 μm. Box representerer den delen av hele C. elegans som har blitt UV bestrålt. Innfelt viser Dendra2-utslippet på 488 nm (topp, grønn) og på 561 nm (bunn, rød). Skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Konvertert rød HTT-D2 redusert over tid i enkle nevroner. Halenevroner av HTTQ25-D2. To nevroner vises samtidig og uavhengig fotokonvertert. Bilder viser sekvensielt tre tidspunkter: (A) Før bestråling (før), (B) umiddelbart etter bestråling (konvertering), og (C) 2 timer etter bestråling (etter). Topppanel (grønn kanal) representerer HTT-D2-signalet som samles inn ved 486-553 nm eksitasjon/utslipp. Den hvite regionen av interesse avgrense nevroner som har blitt bestrålt. Det midterste panelet (rød kanal) viser det konverterte HTT-D2-signalet som samles inn ved 580-740 nm eksitasjon/utslipp. Det nederste panelet er en sammenslåing av de to kanalene. Skalalinje = 5 μm for alle bilder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Hode- og halenevroner viste forskjellige nedbrytningsrater. Kolonnestolpediagrammer viser prosentandelen av rød intensitet i forhold til startverdien på konverteringstidspunktet (dvs. 100 %). Konvertert rød Dendra2 signal redusert samlet over 2 h intervall som HTT-D2 ble degradert i nevronene i C. elegans. Innenfor nematodens nevronale undertyper i nervesystemet viste forskjellige nedbrytningsrater, med halenevroner som viste en mer aktiv omsetning, men bare i nematoder som bærer en ikke-patogen polyglutaminstrekning. (A) Kvantifisering av nedbrytning i HTTQ25-D2 hode versus halenevroner. Mener ± SD, unpaired to-tailed Student t-test. N = 23-28 prøver/nematoder avbildet per region, *P < 0,05. (B) Kvantifisering av nedbrytning i HTTQ97-D2 hode versus halenevroner. Mener ± SD, unpaired to-tailed Student t-test. N = 23-28 prøver/nematoder avbildet per region, ns = ikke-signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: HTTQ97-D2 ble ikke vesentlig ryddet etter 24 timer. Kolonnestolpediagrammer viser prosentandelen av rød intensitet i forhold til startverdien på konverteringstidspunktet (dvs. 100 %). Konvertert rød Dendra2 signal redusert som HTT-D2 ble degradert i nevronene i C. elegans. HTT-D2 viste ulike nedbrytningsrater. Selv over lengre perioder etter konvertering, kunne patogene HTT-D2 ikke fjernes sammenlignet med sin sunne kontroll. (A) Kvantifisering av nedbrytningshastigheten i HTTQ25-D2 på to tidspunkter etter konvertering (2 t og 24 h) i både hode- og halenevroner. Gjennomsnittlig ± SD, enveisanalyse av varians (ANOVA). N = 21-28 eksempler/nematoder avbildet per gang/region, *P < 0,05, ****P < 0,0001. (B) Kvantifisering av nedbrytningshastigheten i HTTQ97-D2 på to tidspunkter etter konvertering (2 t og 24 timer) i både hode- og halenevroner. Gjennomsnittlig ± SD, enveisanalyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukeys multippel sammenligningspost hoc-test.  N = 21-28 prøver/nematoder avbildet per gang/region, ns = ikke-signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Gamle og unge nematoder som uttrykker den patogene HTT-D2, forringet det ikke effektivt. Kolonnestolpediagrammer viser prosentandelen av rød intensitet i forhold til startverdien på konverteringstidspunktet (dvs. 100 %). Konvertert rød Dendra2 signal redusert som HTT-D2 ble degradert i nevronene. Som nematode alderen, dens evne til å degradere patogene HTT-D2 ble i tillegg svekket gjennom nervesystemet. (A) Kvantifisering av nedbrytningsraten i hodet nevroner av unge (dag 4) og gamle (dag 10) HTTQ25-D2 nematoder sammenlignet med alderstilpassede HTTQ97-D2 nematoder. Gjennomsnittlig ± SD, enveisanalyse av varians (ANOVA). N = 23-28 prøver/nematoder avbildet per belastning/dag, ****P < 0,0001. (B) Nedbrytningsgraderingsgrad 2 timer etter konvertering i halenevronene til unge (dag 4) og gamle (dag 10) HTTQ25-D2 nematoder, sammenlignet med alderstilpassede HTTQ97-D2 nematoder. Gjennomsnittlig ± SD, enveisanalyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukeys multippel sammenligningspost hoc-test. N = 23-28 prøver/nematoder avbildet per belastning/dag, *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

For å forstå et protein funksjon er det viktig å forstå sin syntese, plassering og nedbrytning. Med utviklingen av nye, stabile og lyse FPer har visualisering og overvåking av INTERESSEPUNKTER blitt enklere og mer effektivt. Genetisk uttrykte fusjon PAFPs som Dendra2 er unikt posisjonert for å studere stabiliteten til et INTERESSEPUNKT. Ved eksponering for lilla-blått lys, dendra2 bryter på et presist sted innenfor en triade av bevarte aminosyrer. Fluorophore gjennomgår en liten strukturell endring, noe som resulterer i et fullstendig skifte av spektra fra grønn til rød²³. Dette skiftet gjør det mulig å oppdage og overvåke ethvert POI knyttet til Dendra2. Faktisk ble disse fusjonskonstruksjonene først brukt til å lage en C. elegans reporter belastning for å studere ubiquitin-proteasome systemet in vivo¹⁶. Dendra2 ble også brukt til å forstå sårbarheten til selektive nevronale subtyper og deres evne til å håndtere ekspanderte polyglutaminproteiner²⁴, eller overvåke induksjon av autofagi i modeller av motor neuron sykdom²⁵.

En protokoll presenteres her for å overvåke in vivo nedbrytning av huntingtin, en sykdomsrelatert aggregasjonsutsatt protein på en ikke-invasiv måte. Etter vellykket generere en nevronal C. elegans modell av HS, uttrykker HTT-D2 pan-neuronally, frekvensen av nedbrytning av utvidet og patogen HTT sammenlignet med sin fysiologiske motstykke ble kvantifisert. Slående forskjeller ble observert mellom nevronale subtyper, mellom unge og aldrende nematoder, og mellom kapasiteten til PN for å håndtere giftige glutaminbelastninger over tid. Denne teknikken kan også brukes til å følge plasseringen og bevegelsen av huntingtin samt dens skjebne når perturbations til PN er innført. siRNA knockdown av viktige chaperones eller administrasjon av forbindelser som hemmer proteasom aktivitet kan avdekke funksjonen og betydningen av disse komponentene i aggregasjonsutsatte proteiner: for eksempel om PN aktiverer spesifikke noder for å kompensere for mangler²⁶. Det kan også forklare de skadelige effektene forårsaket av en sykdom sammenlignet med de av normal aldring.

Selv om mange forskjellige spørsmål kan løses ved hjelp av denne teknikken, må det opprettes riktige parametere for konvertering og deteksjon for å få pålitelige data når en ønsket modell er generert. Også avgjørende er å bestemme konverteringsinnstillinger som tillater tilstrekkelig utbytte av aktivert protein uten fotobleking eller fototoksisitet og uten uønsket konvertering. Videre, for hver studert protein i et bestemt modellsystem, enten ex vivo eller in vivo, er det nødvendig å eksperimentelt etablere en tidsperiode tilstrekkelig stor for å tillate nøyaktig kvantifisering av nedbrytningshastigheten.

Dendra2 tilbyr en rekke fordeler fremfor andre PAFPs: 1) det er monomerisk og veldig lyst; 2) den har en høy kontrast fotokonvertering og et stabilt fotokonvertert signal; 3) det kan aktiveres med lav fototoksisitet av en blå 488 nm laser, som er en del av de fleste confocal maskinvare oppsett; 4) det effektivt modnes ved 37 ° C for søknad i pattedyr celler; 5) Det har ingen toksiske bivirkninger når uttrykt i lengre perioder^23,27; og 6) systemet påvirkes ikke av variasjoner i uttrykksnivåer mellom eller i en organisme eller celle, da bare forholdet mellom Dendra2-signalet før og etter konvertering kvantifiseres. Alle oppførte egenskaper gjør Dendra2 til et ideelt fluorofore for sporing av proteindynamikk i sanntid og overvåking av celleskjebnen.

Dessverre lider Dendra2 fusjonsproteiner av noen vanlige begrensninger av fluorescerende proteinmerking. Konstruksjonen er en kimeriske arter som ofte er eksperimentelt overuttrykt i biologiske systemer, selv om endogene uttrykk kan etableres via genomisk ingeniørkunst. Nedbrytningsraten av Dendra2 selv påvirker potensielt nedbrytningen av målproteinet, selv om det har blitt beskrevet som et svært stabilt, langvarig protein²⁷. Videre er Dendra2 ikke egnet til å spore proteiner med svært rask omsetning, da det kanskje ikke har tid til sin egen riktigmodning. Til slutt, 405 nm lasere, som er uvanlige, foretrekkes for effektive fotowitching, selv om de er mer giftige for prøven. Faktisk kan mindre fototoksisk blått lys brukes til både å visualisere grønn Dendra2 og konvertere den når laserkraften har høy intensitet. Denne spesielle funksjonen bør alltid holdes i bakhodet, da langvarig eksponering vil gi uønsket konvertering og potensielt feil målinger. Til slutt kan det være problematisk å bruke Dendra2 i kombinasjon med grønn eller rød fluorofore. Imidlertid er mange forskjellige PAFPs tilgjengelig for å undersøke dynamikken i flere proteiner samtidig.

Eksperimenter som bruker Dendra2 og andre PAFPs har vært knyttet til fluorescens utvinning etter fotobleking (FRAP) og radioaktive puls-jage merking teknikker. I en FRAP-innstilling er det umulig å skille proteiner som kommer inn i en avkastning fra nydannet fluorescerende protein, og konstant overvåking og visualisering av prøven er nødvendig. Med Dendra2 genereres to klart skillelige populasjoner som kan observeres uavhengig over tid, slik at den erstattede og nylig synteiserte "inaktive" formen av grønn Dendra2 kan spores og kvantifiseres¹⁶. Dendra2 er også en nyttig sonde i superoppløsning mikroskopi som total intern refleksjon fluorescerende mikroskopi (TIRF)²⁸ og fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM)²⁹. I nær fremtid vil slike fremskritt tillate bedre lokalisering og potensielt enkeltmolekylsporing av ethvert POI, slik at man kan avdekke mer subtile forskjeller i og mellom prøver og til slutt gi ny informasjon om livet og skjebnen til ethvert POI i et biologisk system.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Mounting slide component
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		Analysis Software
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope	Leica Camera AG		Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2	this paper		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	this paper		C. elegans strain
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Nematode food source
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Confocal acquisition software